MX2014001020A - Producción de dha y otros lc-pufa en plantas. - Google Patents

Producción de dha y otros lc-pufa en plantas.

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Abstract

La invención provee organismos hospedadores recombinantes, genéticamente modificados, con un sistema de la sintasa del ácido graso poliinsaturado (PUFA), y una o más proteínas accesorias que permiten y/o mejoran la producción de los PUFA en el organismo hospedador. La presente invención también se refiere a los métodos para hacer y usar tales organismos, así como también los productos obtenidos a partir de tales organismos.

Description

Producción de DHA y otros LC-PUFA en plantas Campo de la Invención La presente invención se refiere generalmente a los organismos hospedadores recombinantes (por ejemplo, las plantas) genéticamente modificados, con un sistema de sintasa de ácido graso poliinsaturado (PUFA) y una o más proteínas accesorias que permiten y/o mejoran la producción de los PU FA en los organismos hospedadores. La presente invención también se refiere con los métodos para hacer y usar tales organismos (por ejemplo, para obtener los PUFA) , así como también con los productos obtenidos de tales organismos (por ejemplo, el aceite y la semilla).
Antecedentes de la i nvención Los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) son considerados de ser útiles para las aplicaciones nutricionales, las aplicaciones farmacéuticas, las aplicaciones industriales y para otros propósitos. Sin embargo, el suministro actual de los PUFA, a partir de fuentes naturales (por ejemplo, los aceites de pescado) y desde las síntesis qu ímicas, no es suficiente para las necesidades comerciales a largo plazo.
Los aceites vegetales derivados de las plantas (por ejemplo, los cultivos de semillas oleaginosas) son relativamente económicos, y no tienen los problemas de contaminación asociados con los aceites de pescado. Sin embargo, los PUFA que se encuentran en las plantas desarrolladas comercialmente y los aceites vegetales no incluyen, típicamente, más PU FA de cadena larga o saturados, y solamente incluyen, típicamente, los ácidos grasos tal como el ácido linoleico (de dieciocho carbonos con 2 enlaces dobles, en las posiciones delta 9 y 12 ~ 18:2 en posiciones delta 9.12) y el ácido linolénico ( 18: 3 en posiciones delta 9.12.15).
La producción de más PU FA de cadena larga o insaturados en las plantas, mediante la modificación de los ácidos grasos producidos, de forma endógena, por las plantas que han sido descritas. Por ejemplo, la modificación genética de las plantas con varios genes individuales, que codifica elongasa y/o desaturasas de ácidos grasos, han sido descritas como resultando en la generación de hojas y de semillas, que contiene niveles significativos de PUFA más insaturados y de cadena larga, tal como el ácido eicosapentaenoico (EPA), pero también que contiene niveles significativos de PUFA mezclados menos insaturados y de cadena corta (Qi et al. , Nature Biotech. 22: 739 (2004); WO 04/071467; Abbadi et al. , Plant Cell 16: 1 (2004); Napier and Sayanova, Proceedings of the Nutrition Society 64: 387-393 (2005); Robert et al. , Functional Plant Biology 32:473-479 (2005) ; Publicación de Solicitud de Patente norteamericana no. 2004/0172682, Solicitud de Patente norteamericana no. 61 /345.537, registrada en mayo de 2010) .
Fabaceae (o Leguminosae ) es una familia grande y económicamente importante vegetal de flores, la cual es comúnmente conocida como la familia de las leguminosas, la familia de los chícharos, la familia de los frijoles o pulse family (plantas y productos vegetales de importancia económica). Glycine es un género en la familia Fabaceae e incluye, por ejemplo, Glycine albicans, Glycine aphyonota, Glycine arenari, Glycine argyrea, Glycine canescens, Glycine clandestine, Glycine curvata, Glycine cyrtoloba, Glycine fálcate, Glycine gracei, Glycine hirticaulis, Glycine hirticaulis subsp. leptosa, Glycine lactovirens, Glycine latifolia, Glycine latrobeana, Glycine microphylla, Glycine montis-douglas, Glycine peratosa, Glycine pescadrensis, Glycine pindanica, Gycine pullenii, Glycine rubiginosa, Glycine stenophita, Glycine syndetika, Glycine tabacina, Glycine tomentella, Glycine soja, y Glycine max (el frijol de soya) . La familia Fabaceae tam bién incluye el cacahuate y los frijoles ( Phaseolus vulgaris), las habas frescas ( Vicia faba) o los chícharos ( Pisum sativum).
La mayoría del aceite de soya está en la forma de aceites vegetales producidos para el consumo humano. Existe también un mercado creciente para el uso del aceite de soya en las aplicaciones industriales.
Breve resumen de la invención Existe una necesidad en la téenica por un método relativamente económico para producir eficientemente y de forma efectiva las cantidades (por ejemplo, cantidades comerciales) de los PUFA más insaturados o de cadena más larga en las plantas, las semillas de las plantas o el aceite vegetal, así como también las cantidades de lípidos (por ejem plo, el triacilglicerol (TAG) y el fosfolípido (PL)) enriquecido en tales PUFA en las plantas, las semillas de las plantas o el aceite vegetal. Un sistema para proveer y mejorar la producción del PUFA en organismos hospedadores (por ejemplo, en las plantas) proveyendo organismos hospedadores recombinantes, genéticamente modificados con una sintasa del ácido graso poliinsaturado (PUFA) , y una o más proteínas accesorias, como descrito aqu í, es una alternativa significativa para las aproximaciones en la téenica.
La presente invención está dirig ida a las plantas (por ejemplo, las plantas de la familia Fabaceae o el género Glycine, tal como el frijol de soya), los descendientes, las semillas, las células, los tejidos o partes de ellos genéticamente modificados, que comprende (i) una secuencia del ácido nucleico que codifica una sintasa del ácido graso poliinsaturado (PUFA) (por ejemplo, una sintasa algácea del PU FA), que produce al menos un PUFA; y (ii) una secuencia del ácido nucleico que codifica una transferasa de fosfopanteteinilo (PPTasa), que transfiere un cofactor de fosfopanteteinilo a un sistema de sintasa del PU FA (por ejemplo, un sistema de sintasa algácea del PUFA) dominio ACP.
En algunas modalidades de la presente invención , la sintasa del PUFA comprende una secuencia de aminoácidos que es desde 80% hasta 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , ó comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 1 . En algunas modalidades, la secuencia del ácido nucleico que codifica la sintasa del PUFA, comprende una secuencia del ácido nucleico desde 80% hasta 99% idéntica a la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO:6, ó comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO:6. En algunas modalidades, la sintasa del PU FA comprende una secuencia de aminoácidos que es desde 80% hasta 99% idéntica a la secuencia de SEQ I D NO:2, ó comprende la secuencia aminoácido de SEQ I D NO:2. En algunas modalidades, la secuencia del ácido nucleico que codifica la sintasa del PU FA, comprende una secuencia del ácido nucleico que es desde 80% hasta 99% idéntica a la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO:7, ó comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO:7. En algunas modalidades, la sintasa del PU FA comprende una secuencia de aminoácidos que es desde 80% hasta 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO:3, ó comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 3. En algunas modalidades, la secuencia del ácido nucleico que codifica la sintasa del PU FA, comprende una secuencia del ácido nucleico que es desde 80% hasta 99% idéntica a la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO:8, ó comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO: 8. En algunas modalidades, la sintasa del PUFA comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 1 , 2, ó 3 ó cualquiera combinación de ellas. En algunas modalidades, la secuencia del ácido nucleico que codifica la sintasa del PUFA comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID NO: 6, 7 u 8 de cualquiera combinación de ellas.
En algunas modalidades, la PPTasa comprende una secuencia de aminoácidos que es desde 80% hasta 99% idéntica a SEQ I D NO: 5, ó comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. En algunas modalidades, la secuencia del ácido nucleico que codifica la PPTasa es desde 80% hasta 99% idéntica a la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO: 10, ó comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO: 10.
En algunas modalidades, las secuencias del ácido nucleico de (i) y (ii) están contenidas en un vector de expresión recombinante. En algunas modalidades, las secuencias del ácido nucleico de (i) y (ii) están contenidas en vectores de expresión recombinante diferentes. En algunas modalidades, las secuencias del ácido nucleico de (i) y/o (ii) son enlazadas, de forma operable, a un promotor específico de la semilla. En algunas modalidades, las secuencias del ácido nucleico de (i) y/o (ii) están enlazadas, de forma operable, a un promotor seleccionado entre PvDlec2, PvPhaseolin , LfKCS3, FAE 1 , BoACP y BnaNapinC. En algunas modalidades, las secuencias del ácido nucleico de (i) y/o (ii) están enlazadas, de forma operable, a un promotor específico de las hojas. En algunas modalidades, las secuencias del ácido nucleico de (i) y/o (ii) están enlazadas, de forma operable, a una ubiquitina o promotor CsVMV.
En algunas modalidades, la planta, el descendiente, la sem illa, la célula, el tejido o partes de ellos, genéticamente modificados, comprenden, además, (iii) una secuencia del ácido nucleico que codifica una sintasa de acil-CoA (ACoAS) , que cataliza la conversión de los ácidos grasos libres del PUFA (PFFA), de cadena larga, a acil-CoA. En algunas modalidades, la ACoAS comprende una secuencia de aminoácidos que es desde 80% hasta 99% idéntica a SEQ I D NO:4, ó comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 4. En algunas modalidades, la ACoAS comprende una secuencia del ácido nucleico que es desde 80% hasta 99% idéntica a la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID NO: 9, ó comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO:9. En algunas modalidades, la secuencia del ácido nucleico que codifica la ACoAS comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO: 34. En algunas modalidades, las secuencias del ácido nucleico de (i), (ii) y/o (iii) están contenidas en un vector de expresión recombinante individual. En algunas modalidades, las secuencias del ácido nucleico de (i) , (ii) y (iii) están contenidas en vectores de expresión recombinante diferentes. En algunas modalidades, las secuencias del ácido nucleico de (i) y (ii) están contenidas en un vector de expresión recombinante individual, y la secuencia del ácido nucleico de (iii) está contenida en un vector de expresión recombinante diferente. En algunas modalidades, las secuencias ácido nucleico de (i) y (iii) están contenidas en un vector de expresión recombinante individual, y la secuencia del ácido nucleico de (ii) está contenida en un vector de expresión recombinante diferente. En algunas modalidades, las secuencias del ácido nucleico de (ii) y (iii) están contenidas en un vector de expresión recombinante individual, y la secuencia del ácido nucleico de (i) está contenida en un vector de expresión recombinante diferente. En algunas modalidades, las secuencias del ácido nucleico (i), (ii) y/o (iii) están enlazadas, de forma operable, a un promotor específico de la semilla. En algunas modalidades, las secuencias del ácido nucleico de (i), (ii) y/o (iii) están enlazadas, de forma operable, a un promotor seleccionado entre PvDlec2 , LfKCS3, FAE 1 , BoACP y BnaNapinC. En algunas modalidades, las secuencias del ácido nucleico de (i), (ii) y/o (iii) están enlazadas, de forma operable, a un promotor específico de la hoja. En algunas modalidades, las secuencias del ácido nucleico de (i), (ii) y/o (iii) están enlazadas, de forma operable, a una ubiquitina o promotor CsVMV.
En algunas modalidades, la planta, el descendiente, la celula, el tej ido o parte de ellos, genéticamente modificados, comprenden , además, una secuencia del ácido nucleico que codifica una carboxilasa de acetil-CoA (ACCasa) y/o una secuencia del ácido nucleico que codifica un tipo de 2 diacilglicerol aciltransferasa (DGAT2) .
En algunas modalidades, la planta, el descendiente, la célula, el tejido, la sem illa o parte de ellos, genéticamente modificados, comprenden al menos uno de pDAB7361 , pDAB7362, PDAB7363, pDAB7368, pDAB7369, pDAB7370, pDAB 100518, pDAB1 01476, pDAB 101477, pDAB9166, pDAB9167, pDAB7379, pDAB7380, pDAB9323, pDAB9330, pDAB9337, pDAB9338, pDAB9344, pDAB9396, pDAB 101412, pDAB7733, pDAB7734, pDAB 101493, pDAB109507, pDAB 109508, pDAB 109509, pDAB9 151 , pDAB 108207 , pDAB 108208, pDAB108209, pDAB9159, PDAB9147, pDAB108224 y pDAB 108225.
En algunas modalidades, una planta, el descendiente, la celula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, o un aceite (por ejemplo, un aceite de semilla) obtenido de la planta , el descendiente, la semilla, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, comprenden cantidades detectables del DHA (ácido docosahexaenoico (C22:6, n-3)), DPA(n-6) (ácido docosapentaenoico ( C 22 : 5 , n-6)) y/o EPA (ácido eicosapentaenoico (C20: 5, n-3)). En algunas modalidades, la planta, el descendiente, la célula, el tej ido, la semilla, o parte de ellos, genéticamente modificados, o un aceite (por ejemplo, un aceite de semilla) obtenido de la planta, el descendiente, la semilla, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, comprenden desde 0.01 % hasta 1 5% del DHA en peso del total de los ácidos grasos, desde 0.05% hasta 10% del DHA en peso del total de los ácidos grasos, ó desde 0.05% hasta 5% del DHA en peso del total de los ácidos grasos. En algunas modalidades, la planta, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, o un aceite (por ejemplo, un aceite de semilla) obtenido de la planta, el descendiente, la semilla, la célula, el tejido, o parte de ellos, genéticamente modificados, comprenden desde 0.01 % hasta 10% del EPA en peso del total de los ácidos grasos, desde 0.05% hasta 5% del EPA en peso del total de los ácidos grasos, ó desde 0.05% hasta 1 % del EPA en peso del total de los ácidos grasos. En algunas modalidades, la planta, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, o un aceite (por ejemplo, aceite de semilla) obtenido de la planta, el descendiente, la semilla, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, comprenden desde 0.01 % hasta 10% del DPA(n-6) en peso del total de los ácidos grasos, desde 0.01 % hasta 5% del DPA(n-6) en peso del total de los ácidos grasos, ó desde 0.01 % hasta 1 % del DPA(n-6) en peso del total de los ácidos grasos. En algunas modalidades, la planta, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla, o parte de ellos, genéticamente modificados, o un aceite (por ejemplo, un aceite de sem illa) obtenido de la planta, el descendiente, la sem illa, la célula, el tejido, o parte de ellos, genéticamente modificados, comprenden una relación de EPA: DHA desde 1 : 1 hasta 1 : 10 ó desde 1 : 1 hasta 1 : 3 en peso del total de los ácidos grasos. En algunas modalidades, la planta, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla, o parte de ellos, genéticamente modificados, o un aceite (por ejemplo, un aceite de semilla) obtenido de la planta, el descendiente, la semilla, la célula, el tejido, o parte de ellos, genéticamente modificados, comprenden una relación de DPA(n-6): DHA desde 1 : 1 hasta 1 : 10 ó desde 1 : 1 hasta 1 :3 en peso de total de ácidos grasos. En algunas modalidades, el aceite (por ejemplo, un aceite de semilla) obtenido desde una planta, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla, o parte de ellos, genéticamente modificados, comprenden desde 70% hasta 99% de triglicéridos en peso del aceite.
En algunas modalidades, las cantidades detectables del DHA, DPA(n-6) y/o del EPA también se encuentran en el grano y/o la harina de trigo obtenida de la planta genéticamente modificada, el descendiente, el tej ido, o parte de ella.
La presente invención está dirigida a un aceite (por ejemplo, un aceite de sem illa) o una sem illa obtenida desde una planta (por ejemplo, el frijol de soya) , el descendiente, la célula, el tej ido o parte de ellos, genéticamente modificados, descritos aquí. La presente invención está dirigida a un producto alimentario que comprende un aceite (por ejemplo, un aceite de semilla) obtenido desde una planta (por ejemplo, frijol de soya) , el descendiente, la célula, el tejido, o parte de ellos, genéticamente modificados, descritos aquí. La presente invención también está dirigida a un alimento funcional que comprende un aceite (por ejemplo, un aceite de semilla) o una semilla obtenida a partir de una planta (por ejemplo, el frijol de soya), el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, descritos aqu í. La presente invención está dirigida a un producto farmacéutico que comprende un aceite (por ejemplo, un aceite de semilla) o una semilla obtenida desde una planta (por ejemplo, frijol de soya), el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, descritos aquí.
La presente invención está dirigida a un método para producir un aceite que comprende al menos un LC-PU FA, que comprende la recuperación del aceite desde una planta (por ejemplo, el frijol de soya), el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, descritos aquí, o desde una semilla de una planta (por ejemplo, el frijol de soya), el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, descritos aquí. La presente invención también está dirigida a un método para producir un aceite, que comprende al menos un LC-PUFA, que comprende el crecimiento de una planta (por ejemplo, el frijol de soya) , el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, descritos aquí. La presente invención también está dirigida a un método para producir al menos un LC-PUFA en un aceite de semilla, que comprende la recuperación del aceite desde una semilla de una planta (por ejemplo, el frijol de soya) , el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, descritos aquí.
La presente invención está dirigida a un método para producir al menos un PUFA en un aceite de semilla, que comprende el crecimiento de una planta (por ejemplo, el frijol de soya), el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, descritos aquí. La presente invención también está dirigida a un método para proveer un producto terapéutico o un suplemento, que contiene al menos un PUFA, para un individuo, que comprende la provisión a un individuo de una planta (por ejemplo, el frijol de soya) , el descendiente, la celula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, descritos aquí, un aceite descrito aquí, una sem illa descrita aquí, un producto alimentario descrito aqu í, un alimento funcional descrito aquí o un producto farmacéutico descrito aqu í. En algunas modalidades, un PUFA contenido en tales modalidades es el DHA, el DPA(n-6) y/o el EPA.
La presente invención está dirigida a un método para producir una planta (por ejemplo, el frijol de soya), el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, descritos aquí, que comprende la transformación de una planta o una célula vegetal con (i) una secuencia del ácido nucleico que codifica una sintasa del PUFA (por ejemplo, una sintasa algácea del PUFA) que produce al menos un ácido graso poliinsaturado (PUFA); y (¡i) una secuencia del ácido nucleico que codifica una de fosfopanteteinil transferasa (PPTasa), que transfiere un cofactor de fosfopanteteinilo a una sintasa del PUFA (por ejemplo, una sintasa algácea del PU FA) dom inio ACP. En algunas modalidades, el método comprende, además, la transformación vegetal o de la célula vegetal con (iii) una secuencia del ácido nucleico que codifica una sintetasa de acil-CoA (ACoAS) la cual cataliza la conversión de los ácidos grasos libres (FFA) del PUFA, de cadena larga, a acil-CoA.
Breve descri pción de los dibujos Las diferentes modalidades de la invención pueden ser entendidas más completamente, a partir de la siguiente descripción detallada, de las figuras y de las descripciones de secuencia acompañantes, las cuales forman una parte de esta solicitud .
La figura 1 representa el Clustal W (alineamientos en el Vector NTI) de las secuencias de DNA rediseñadas, que codifica cada uno de los 9 dominios repetidos del PUFA OrfA.
La figura 2 es un mapa del plásm ido de pDAB7362.
La figura 3 es un mapa del plásmido de pDAB7361 .
La figura 4 es un mapa del plásmido de pDAB7363.
La figura 5 es un mapa del plásmido de pDAB7365.
La figura 6 es un mapa del plásmido de pDAB7368.
La figura 7 es un mapa del plásmido de pDAB7369.
La figura 8 es un mapa del plásmido de pDAB7370.
La figura 9 es un mapa del plásmido de pDAB100518.
La figura 10 es un mapa del plásmido de pDAB 101476.
La figura 1 1 es un mapa del plásmido de pDAB 101477.
La figura 12 muestra el contenido del DHA y LC-PU FA de las semillas del frijol de soya T2 individual, a partir de las plantas T1 derivadas desde dos eventos del frijol de soya, transformadas con PDAB7362.
La figura 13 muestra la detección por transferencia Western de la sintasa del PUFA OrfA, la sintasa del PU FA OrfB y la sintasa quimérica del RUFA OrfC en los extractos de proteína del frijol de soya 12.
La figura 14 es un mapa de plásmido de pDAB9166.
La figura 15 es un mapa de plásm ido de pDAB9167.
La figura 16 es un mapa de plásm ido de pDAB7379.
La figura 17 es un mapa de plásmido de pDAB7380.
La figura 18 es un mapa de plásm ido de pDAB9323.
La figura 19 es un mapa de plásmido de pDAB9330.
La figura 20 es un mapa de plásmido de pDAB9337.
La figura 21 es un mapa de plásmido de pDAB9338.
La figura 22 es un mapa de plásmido de pDAB9344.
La figura 23 es un mapa de plásmido de pDAB9396.
La figura 24 es un mapa de plásmido de pDAB 101412.
La figura 25 es un mapa de plásmido de pDAB7733.
La figura 26 es un mapa de plásmido de pDAB7734.
La figura 27 es un mapa de plásmido de pDAB 101493.
La figura 28 es un mapa de plásmido de pDAB 109507.
La figura 29 es un mapa de plásmido de pDAB 109508.
La figura 30 es un mapa de plásmido de pDAB 109509.
La figura 31 es un mapa de plásm ido de pDAB9151 .
La figura 32 es un mapa de plásm ido de pDAB 108207.
La figura 33 es un mapa de plásmido de pDAB 108208.
La figura 34 es un mapa de plásmido de pDAB 108209.
La figura 35 es un mapa de plásm ido de pDAB9159.
La figura 36 es un mapa de plásmido de pDAB9147.
La figura 37 es un mapa del plásmido de pDAB 108224.
La figura 38 es un mapa del plásm ido de pDAB 108225.
La figura 39 muestra el contenido de DHA y LC-PUFA de la semilla T2 a partir de los eventos de Arabidopsis transgénicos individuales transformados con pDAB1 Q1493, pDAB7362, PDAB7369, pDAB 101412 ó pDAB7380.
Descripción detallada de la invención El térm ino "ácido graso poliinsaturado" o "PUFA" como es usado aqu í, se refiere a los ácidos grasos con una longitud de cadena de al menos 16 carbonos, al menos 18 carbonos, al menos 20 carbonos, ó 22 ó más carbonos, con al menos 3 ó más enlaces dobles, 4 ó más enlaces dobles, 5 ó más enlaces dobles, ó 6 ó más enlaces dobles, donde todos los enlaces dobles están en la configuración cis.
El término "ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga" o "LC-PUFA", como es usado aquí, se refiere a los ácidos grasos de 20 y más carbonos de longitud de cadena, que contiene 3 ó más enlaces dobles, ó 22 ó más carbonos, con al menos 3 ó más enlaces dobles, 4 ó más enlaces dobles, 5 ó más enlaces dobles, ó 6 ó más enlaces dobles. Los LC-PU FA de la serie omega-6 incluye, pero no están limitados a , el ácido dihomo-gamma-linolénico (C20: 3n-6), el ácido araquidónico (C20:4n-6), el ácido adrénico (también llamado ácido docosatetraenoico o DTA) (C22:4n-6) y el ácido docosapentaenoico (C22: 5n-6) . Los LC-PUFA de la serie omega-3 incluyen, pero no están lim itados a, el ácido eicosatrienoico (C20: 3n-3), el ácido eicosatetraenoico (C20:4n-3), el ácido eicosapentaenoico (C20: 5n-3), el ácido docosapentaenoico (C22: 5n-3) y el ácido docosahexaenoico (C22:6n-3). Los LC-PU FA tambien incluyen los ácidos grasos con más que 22 carbonos y 4 ó más enlaces dobles incluyendo, pero no limitado a C28: 8(n-3).
El término "sintasa del PUFA" como es usado aquí, se . refiere a una enzima que produce los ácidos grasos poliinsaturados (PU FA) y, particularmente, los PU FA de cadena larga (LC-PUFA), así como también cualquier dominio de tal una enzima en un complejo. El término sintasa del PU FA incluye, pero no está limitado a, los sistemas del PU FA PKS o los sistemas cono el PKS para la producción de los PUFA. Algunas sintasas del PUFA específicas son designadas aqu í mediante una notación adicional , por ejemplo, "SzPUFA" sintasa o "hSzThPUFA" sintasa, como definido en la solicitud. El término "sistema de la sintasa del PUFA" incluye un sintasa del PUFA y cualquier enzima accesorias que puede afectar la función de la sintasa del PUFA cuando es expresado en un organismo heterólogo (por ejemplo, un PPTasa o ACS).
El términos "fosfopanteteinil transferasa" y "PPTasa" como es usado aquí, se refiere a una enzima la cual activa un sintasa del PUFA mediante la transferencia de un cofactor (por ejemplo, 4-fosfopanteteina), desde una coenzima A (CoA) a uno o más dominios ACP presentes en el sintasa del PUFA. Un ejemplo de una PPTasa, la cual puede activar uno o más dominios ACP de una sintasa del PU FA descritos aquí, es la proteína Het I de Nostoc sp. PCC 7120 (anteriormente llamada Anabaena sp. PCC 7120) , designada aquí como "NoHetl".
Los térm inos "acil-CoA sintetasa", "ACoAS" y "ACS" como es usado aquí, se refieren a una enzima que cataliza la conversión de los ácidos grasos (FFA) libres de poliinsaturados, de cadena larga, a acil-CoA. Algunas acil-CoA sintetasas específicas son designadas aqu í mediante una notación adicional , por ejemplo, "SzACS-2", como definido en esta solicitud.
El térm ino "planta" como es usado aqu í, incluye cualquier descendiente, célula, tejido, semilla , aceite de colza, o parte de ellos.
"Nutracéutica" significa un producto aislado, purificado, concentrado o producido a partir de las plantas que proveen un beneficio fisiológico, o proveen una protección contra una enfermedad, incluyendo los alimentos procesados complementados con tales productos, junto con los alimentos producidos a partir de los cultivos que han sido genéticamente modificados, para contener los niveles aumentados de tales componentes fisiológicamente activos.
"Alimento funcional" significa un alimento que (a) es similar en apariencia a, o puede ser, un alimento convencional que es consumido como parte de una dieta habitual, y (b) tiene un valor nutricional aumentado y/o beneficios dietéticos específicos, basados en una modificación en la proporción de los componentes que existen, típicamente, en el alimento no modificado.
Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" son dirigidos para abarcar un ácido nucleico singular, así como también los ácido nucleicos plurales, una molécula o fragmento del ácido nucleico, una variante o un derivado de ellos, o un constructo, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) o ADN plasm ídico (ADN p). Un polinucleótido o ácido nucleico puede contener la secuencia de nucleótidos de la secuencia ADNc de longitud completa, o un fragmento de ella, incluyendo las secuencias 5' y 3' sin traducir y las secuencias codificantes. Un polinucleótido o ácido nucleico puede estar compuesto de cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, el cual puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Por ejemplo, un polinucleótido o ácido nucleico puede estar compuesto de un ADN de cadena doble y de cadena individual , el ADN que es una mezcla de regiones de cadena doble y de cadena individual, el ARN de cadena doble y de cadena individual , y el ARN q ue es una mezcla de regiones de cadena doble y de cadena individual, las moléculas híbridas que comprende ADN y ARN que pueden ser de cadena individual o, más típicamente, de cadena doble, o una mezcla de regiones de cadena doble y de cadena individual . Estos términos también abarcan las formas qu ím icamente, enzimáticamente o metabólicamente modificadas de un polinucleótido o ácido nucleico.
Una secuencia polinucleotídica o de ácido nucleico puede ser referida como "aislada" en la cual ha sido removida desde su ambiente natural. Por ejemplo, un polinucleótido o ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido o fragmento de polipéptido, teniendo actividad de dihidroxi-ácido dehidratasa contenida en un vector, es considerado aislado para los propósitos de la presente invención. Otros ejemplos de un polinucleótido o ácido nucleico aislado incluyen los polinucleótidos recombinantes, mantenidos en células hospedadoras heterólogas o un polinucleótido purificado (parcialmente o de forma sustancial) o el ácido nucleico en solución . Un polinucleótido o ácido nucleico aislado de acuerdo con la presente invención incluye, además, tales moléculas producidas sintéticamente. Un polinucleótido o ácido nucleico aislado en la forma de un polímero de AND, puede estar comprendido de uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético.
El término "gen" se refiere a un ácido nucleico o fragmento de él, que es capaz de ser expresado como una proteína específica incluyendo, opcionalmente, precediendo a las secuencias reguladoras (secuencias no codificantes en 5') y siguiendo (secuencias no codificantes en 3') la secuencia codificante.
Como es usado aquí, el término "región codificante" se refiere a una secuencia de ADN que es codificada para una para una secuencia de aminoácidos específico. "Secuencias reguladoras adecuadas” se refiere a las secuencias de nucleótidos colocadas secuencia arriba (secuencias no codificantes 5'), dentro, o secuencia abajo (secuencias no codificantes 3') de una secuencia codificante, y la cual tiene influencia sobre la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del ARN , o la translación de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir los promotores, las secuencias líderes de translación, los intrones, las secuencias de reconocimiento de la poliadenilación , el sitio de procesamiento del ARN , el sitio de unión del efector y la estructura de horquilla.
Como es usado aquí , el térm ino "polipéptido" está previsto para abarcar un "polipéptido" singular, así como también los "polipéptidos" plurales y los fragmentos de ellos, y se refiere a una molécula compuesta de monómeros (am inoácidos) enlazados linealmente mediante enlaces am ida (también conocidos como enlaces péptido) . El término "polipéptido" se refiere a cualquiera cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica del producto. Por consiguiente, los péptidos, los dipéptidos, los tripéptidos, los oligopéptidos, la proteína, la cadena de aminoácido, o cualquier otro término usado para referirse a una cadena o cadenas de dos o más am inoácidos, están incluidos dentro de la definición de "polipéptido", y el término "polipéptido" puede ser usado en lugar de, o intercambiablemente con cualquiera de, estos términos. Un polipéptido puede ser derivado a partir de una fuente biológica natural, o ser producido mediante teenología recombinante, pero no es necesariamente traducido desde una secuencia del ácido nucleico designada. Puede ser generado en cualquiera forma, incluyendo mediante la síntesis química.
Por un polipéptido aislado" o un fragmento, una variante o los derivados de ellos está previsto un polipéptido que no está en su medio natural . No es requerido un nivel de purificación particular. Por ejemplo, un polipéptido aislado puede ser removido desde su entorno natural u original. Los polipéptidos producidos de forma recombinante y las proteínas expresadas en las células hospedadoras, son consideradas aisladas para las propósitos de la invención, como lo son los polipéptidos recombinantes u originales, los cuales han sido separados, fraccionados o purificados parcialmente, o de forma sustancial, mediante cualquier técnica adecuada.
Como es usado aquí, "original" se refiere a la forma de un polinucleótido, un gen o un polipéptido como encontrado en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras, si están presentes.
Como es usado aquí, "endógeno" se refiere a la forma activa de un polinucleótido, un gen o un polipéptido en su ubicación natural en el organismo o en el genoma de un organismo. “Polinucleótido endógeno" incluye un polinucleótido nativo en su ubicación natural en el genoma de un organismo. "Gen endógeno" incluye un gen nativo en su ubicación natural en el genoma de un organismo. "Polipéptido endógeno" incluye un polipéptido original en su ubicación natural en el organismo.
Como es usado aq uí, "heterólogo" se refiere a un polinucleótido, un gen o un polipéptido no encontrado normalmente en los organismos hospedadores, pero que está introducido dentro del organismo hospedador. "Polinucleótido heterólogo" incluye una región codificante nativa, o una porción de ella, que es reintroducida dentro de la fuente del organismo en una forma que es diferente del polinucleótido nativo correspondiente. "Gen heterólogo" incluye una región codificante nativa, o una porción de ella, que es reintroducida dentro de la fuente del organismo en la forma que es diferente del gen nativo correspondiente. Por ejemplo, un gen heterólogo puede incluir una región codificante nativa que es una porción de un gen quimérico, incluyendo regiones reguladoras no nativas, que son reintroducidas dentro del hospedador nativo. "Polipéptido heterólogo" incluye un polipéptido original que es reintroducido dentro de la fuente del organismo en la forma que es diferente del polipéptido nativo correspondiente.
Como es usado aquí, el término "modificación" se refiere a un cambio en un polinucleótido revelado aquí, que tiene por resultado la activada reducida, eliminada sustancialmente o eliminada de un polipéptido codificado por el polinucleótido, así como también un cambio en un polipéptido revelado aquí, que tiene por resultado la actividad reducida, eliminada sustancialmente o eliminada de un polipéptido. Tales cambios pueden ser hechos mediante los métodos bien conocidos en la téenica, incluyendo, pero no limitado a, la deleción, la mutación (por ejemplo, la mutagénesis espontánea, la mutagénesis aleatoria, la mutagénesis causada por genes mutadores o la mutagénesis de transposón), sustituyendo, insertando, regulando de forma descendente, alterando la ubicación celular, alterando el estado del polinucleótido o polipéptido (por ejemplo, la metilación, la fosforilación o la ubiquitinación) , removiendo un cofactor, introducción de un ARN/ADN en contrasentido, la introducción de un ARN/ADN interferente, la modificación química, la modificación covalente, la irradiación por UV o con rayos X, la recombinación homóloga, la recombinación mitótica, los métodos de reemplazo del promotor, y/o las combinaciones entre sí. El asesoramiento para determinar cuáles residuos de nucleótidos o de aminoácido pueden ser modificados, pueden ser encontrados mediante la comparación de la secuencia de los polinucleótidos o polipéptidos particulares con aquel de los polinucleótidos o polipéptidos homólogos, por ejemplo, la levadura o la bacteria, y maximizando el número de modificaciones hechas en las regiones de alta homolog ía (regiones conservadas) o las secuencias de consenso.
El término "derivado" como es usado aqu í, se refiere a una modificación de una secuencia revelada en la presente invención. Un ejemplo de tales modificaciones, podría ser la sustitución , la inserción, y/o la deleción de una o más bases relacionas con una secuencia del ácido nucleico de una secuencia codificante revelada aquí que preserva, altera ligeramente o incrementa la función de una secuencia codificante revelada aquí, en las especies de cultivo de semillas oleaginosas. Tales derivados pueden ser determinados fácilmente por una persona experimentada en la téenica, por ejemplo, usando las técnicas de modelado por computadora, para la predicción y la optim ización de la estructura secuencial. El término "derivado" también incluye, por consiguiente, la secuencia del ácido nucleico teniendo una homolog ía de secuencia sustancial con las secuencias codificantes reveladas aquí, de manera que ellas son capaces de tener las funcionalidades reveladas, con el fin de usar en la producción de los LC-PU FA de la presente invención.
Como es usado aquí, el término "variante" se refiere a un polipéptido que difiere de un polipéptido mencionado, específicamente, de la invención mediante las inserciones , las deleciones, las mutaciones y las sustituciones de los aminoácidos, tal como la mutagénesis. El asesoramiento para determinar cuáles residuos de los aminoácidos pueden ser reemplazados, agregados o suprimidos, sin la abolición de las actividades de interés, puede ser encontrado mediante la comparación de la secuencia del polipéptido particular, con aquel de los polipéptidos homólogos y minimizando el número cambios de la secuencia de aminoácidos, hecha en las regiones de alta homología (regiones conservadas) , o mediante el reemplazo de los aminoácidos con secuencias de consenso.
Alternativamente, las variantes de polinucleótidos recombinantes, que codifica estos mismos o similares polipéptidos, pueden ser sintetizadas o seleccionadas haciendo uso de la "redundancia" en el código genético. Varias sustituciones de codones, tal como los cambios silenciosos, los cuales producen varios sitios de restricción, pueden ser introducidos para optimizar la clonación dentro del vector plasm ídico o viral para la expresión . Las mutaciones en la secuencia de polinucleótidos pueden ser reflejadas en el polipéptido o en los dominios de otros péptidos agregados al polipéptido, con el fin de modificar las propiedades de cualquier parte del polipéptido.
Las "sustituciones” de aminoácidos puede ser el resultado de el reemplazo de un aminoácido por otro aminoácido, teniendo propiedades químicas y/o estructurales similares, por ejem plo, los reemplazos de los am inoácido conservadores, o ellos pueden ser el resultado del reem plazo de un aminoácido por un aminoácido, teniendo propiedades quím icas y/o estructurales diferentes, por ejemplo, los reemplazos de los aminoácidos no conservadores. Las sustituciones de los aminoácidos "conservadores" pueden ser hechas en la base a la similitud en la polaridad, la carga, la solubilidad , la hidrofobicidad , la hidrofilicidad o la naturaleza antipática de los residuos involucrados. Por ejem plo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen la alanina, la leucina, la isoleucina, la valina, la prolina, la fenilalanina, el triptófano y la metionina; los aminoácidos neutrales polares incluyen la glicina, la serina, la treonina, la cisterna, la tirosina, la esparraguma y la glutamina ; los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen la arginina, la Usina y la histidina; y los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen el ácido aspártico y el ácido glutámico. Alternativamente, las sustituciones de los aminoácidos "no conservadores" pueden ser hechas mediante la selección de diferencias en la polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrofobicidad , la hidrofilicidad o la naturaleza antipática de cualquiera de estos aminoácidos. Las "inserciones" o "deleciones" pueden estar dentro del rango de la variación como tolerada funcionalmente, o de forma estructural, por las proteínas recombinantes. La variación permitida puede ser determinada, experimentalmente, mediante las inserciones, las deleciones o las sustituciones hechas de forma experimental de los aminoácidos en una molécula de polipéptido, usando una téenica de ADN recombinante y evaluando las variantes recombinantes resultantes para la actividad .
El término "promotor" se refiere a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia codificante o de ARN funcional. En general, una secuencia codificante está ubicada en 3’ con respecto a una secuencia promotora. Los promotores pueden ser derivados en su totalidad a partir de un gen nativo, o pueden ser compuestos de diferentes elementos, derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o todavía comprenden los segmentos de ADN sintéticos. Queda entendido por aquellas personas experimentadas en la téenica, que los diferentes promotores puede dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos de células, o en diferentes estados de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones medioambientales o fisiológicas. Los promotores, los cuales causan que un gen sea expresado en la mayoría de tipos de célula , en la mayoría del tiempo son referidos comúnmente como "promotores constitutivos." Es reconocido, además, puesto que en la mayoría de los casos los límites exactos de secuencias reguladoras no han sido definidos completamente, los fragmentos de ADN de diferentes longitudes, pueden tener una actividad promotora idéntica.
El término "enlazado operablemente" se refiere a la asociación de las secuencias del ácido nucleico en un fragmento del ácido nucleico individual, de manera que la función de uno es afectada por el otro. Por ejemplo, un promotor está enlazado operablemente con una secuencia codificante, cuando es capaz de afectar la expresión de aquella secuencia codificante (por ejem plo, que la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificantes pueden estar enlazadas operablemente con las secuencias reguladoras en orientación en sentido directo o en contrasentido.
El término "expresión" como es usado aquí , se refiere a la transcripción y a la acumulación estable de (ARNm) en sentido directo o ARN en contrasentido derivadas desde los fragmentos del ácido nucleico de la invención . La expresión también puede referirse a la translación del ARNm dentro de un polipéptido.
El término "sobreexpresión" como es usado aquí, se refiere a la expresión que es más alta que la expresión endógena de un mismo gen o de un gen relacionado. Un gen heterólogo está sobreexpresado, si su expresión es más alta que aquella de un gen endógeno comparable.
Como es usado aquí, el término "transformación" se refiere a la transferencia de un ácido nucleico o de un fragmento dentro de un organismo hospedador, teniendo por resultado una herencia genéticamente estable. Los organismos hospedadores que contienen los fragmentos del ácido nucleico transformados, son referidos como organismos "transgénico" o "recom binante" o "transformado".
Los términos "plásmido" y "vector" como son usados aquí, se refieren a un elemento cromosomal extra, a menudo portando genes, los cuales no son parte del metabolismo central de la célula y, usualmente, en la forma de moléculas de ADN de de cadena doble circular. Tales elementos pueden ser secuencias replicadas de forma autónoma, secuencias integrantes del genoma, secuencias de fago o nucleótido, ADN o ARN de cadena doble o individual, circular o lineal, derivada a partir de cualquier fuente, en la cual un número de secuencias de nucleótidos ha sido unido o recombinado dentro de una construcción única, la cual es capaz de introducir un fragmento promotor y una secuencia de ADN, para un producto de gen seleccionado junto con una secuencia sin traducir en 3’ apropiada dentro de una célula.
Como es usado aquí, el término "degeneración del codón" se refiere a la naturaleza en el código genético, permitiendo la variación de la secuencia de nucleótidos sin afectar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado. El téenico experimentado está bien enterado de la "preferencia codónica" exhibida por una célula hospedadora específica en el uso de codones nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Por lo tanto, cuando la sintetización de un gen , para una expresión mejorada en una célula hospedadora, es deseable diseñar el gen, de manera que sus frecuencias de uso de codón enfocando la frecuencia del uso del codón preferido de la célula hospedadora.
El término "codón optimizado" como se refiere a los genes o a las regiones codificantes de las moléculas del ácido nucleico para la transformación de varios hospedadores, se refiere a la alteración de los codones en los genes o en las regiones codificantes de las moléculas del ácido nucleico, con el fin de reflejar el uso del codón típico del organismo hospedador, sin alterar el polipéptido codificado por el ADN . Tales optimizaciones incluyen el reemplazo de al menos uno, más que uno, o un número significativo de codones con uno o más codones que son usados, más frecuentemente, en los genes de ese organismo.
Las desviaciones en la secuencia de nucleótidos, que comprenden los codones que codifica los aminoácidos de cualquiera cadena de polipéptidos, perm ite las variaciones en la secuencia codificante para el gen. Puesto que cada codón consta de tres nucleótidos, y los nucleótidos que comprende ADN están restringidos a cuatro bases específicas, existen 64 combinaciones de nucleótidos posibles, 61 de las cuales codifican los aminoácidos (los tres codones remanentes codifican las señales de traducción terminada). El "código genético", el cual m uestra cuales codones codifican a cuales aminoácidos, son reproducidos aqu í en la Tabla 1 . Como resultado, muchos aminoácidos son designados mediante más que un codón . Por ejemplo, los aminoácidos de alanina y de prolina son codificados por cuatro tripletes, los de serina y de arginina por seis, mientras que los de triptófano y de metionina son codificados por solamente un triplete. Esta degeneración permite a la composición base de ADN de variar en un amplio rango, sin alterar la secuencia de los aminoácidos de las proteínas codificadas por el ADN .
Tabla 1. El Código Genético Estándar Muchos organismos representan una preferencia para el uso de codones particulares, en la codificación durante la inserción de un aminoácido particular en una cadena peptídica en crecimiento. Las diferencias de la preferencia codónica, o codon bias, en el uso del codón entre organismos, son proporcionadas mediante la degeneración de código genético, y está bien documentado entre muchos organismos. La preferencia codónica a menudo está correlacionada con la eficiencia de la traducción de ARN mensajero (ARNm), el cual es, a su vez, creído de ser dependiente de, Ínter alia, las propiedades de los codones que están siendo traducidos, y de disponibilidad de las moléculas particulares de ARN transferente (ARNt). La predominancia de los ARNt seleccionados en una es, generalmente, un reflejo de los codones usados mayormente frecuentes en la síntesis peptídica. En consecuencia, los genes pueden ser hechos a la medida para una expresión de genes óptima en un organismo dado basado en la optim ización de codones.
Dado el gran número de secuencias de genes disponibles para una amplia variedad de especies animal, vegetal y microbiana, es posible de calcular las frecuencias relativas al uso de codones. Las tablas sobre el uso de codones están disponibles fácilmente, y pueden ser adaptadas en un número de formas. Vease Nakamura et al . , Nucí. Ácidos Res. 28:292 (2000) . Mediante la utilización de estas tablas o similares, una persona común experimentada en la téenica, puede aplicar las frecuencias a cualquiera secuencia de polipéptidos dada, y produce un fragmento del ácido nucleico de una región codificante del codón optimizado, el cual codifica el polipéptido, pero el cual usa los codones óptimos para una especie dada. La presente invención forma parte de las formas de codones optimizados de OrfA, OrfB, OrfC quimérica, PPTasa y/u otras proteínas accesorias, como descrito ulteriormente aquí.
El término "identidad en porcentaje" como es conocido en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptido o dos o más secuencias de polinucleótido, como determinado por la comparación de las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de capacidad de relación de secuencia entre las secuencias de polipéptidos o de polinucleótidos, como pueda ser el caso, como determinado por la comcidencia entre las cadenas de tales secuencias. La "identidad" y la "similitud" pueden ser calculadas, fácilmente, mediante los metodos conocidos, incluyendo, pero no limitado a aquellos revelados en : 1 ) Computational Molecular Biology ( Biología molecular computacional) (Lesk, A. M . , Ed. ) Oxford University: NY ( 1988) ; 2) Biocomputing : I nformatics and Genome Projects ( Biocomputación : Proyectos sobre la informática y el genoma) (Sm ith, D . W. , Ed . ) Academic: NY ( 1993); 3) Computer Analysis of Sequence Data, Part I ( Análisis computacional sobre datos de secuencias, Parte I) (Griffin , A. M . , and Griffin , H. G. , Eds.) Humania: NJ ( 1994); 4) Sequence Analysis in Molecular Biology ( Análisis de secuencias en biología molecular) (von Heinje, G. , Ed. ) Academic (1987) ; y 5) Sequence Analysis Primer ( Análisis de secuencias del cebador) (Gribskov, M . and Devereux, J . , Eds. ) Stockton: NY (1991 ).
Los métodos para determinar la identidad, están diseñados para entregar la mejor comcidencia entre las secuencias ensayadas. Los métodos para determinar la identidad y similitud están codificados en programas de computación públicamente disponibles. Los alineamientos de secuencia y los cálculos del identidad en porcentaje pueden ser realizados, por ejemplo, usando el programa AlignX de Vector NTI® suite (Invitrogen , Carlsbad, CA) o el programa MegAlign™ bioinformatics computing suite de LASERGENE (DNASTAR I n c . , Madison, Wl). La alineación múltiple de las secuencias es realizada usando el "Método Clustal de alineamiento" el cual abarca varias variedades del algoritmo, incluyendo el "Método Clustal V de alineamiento" correspondiendo al método marcado Clustal V de alineamiento (revelado por Higgins and Sharp, CABIOS. 5: 151 -1 53 ( 1989); Higgins, D. G . et al. , Comput. Appl. Biosci. , 8: 1 89-191 (1992)); y encontrado en el programa MegAlign™ biomformatics computing suite de LASERG ENE (DNASTAR I nc. ). Para los alineamientos múltiples, los valores por defecto corresponden a GAP PENALTY = 10 y GAP LENGTH PENALTY = 10. Los parámetros por defecto para los alineamientos pares y el cálculo del identidad en porcentaje de las secuencias de la proteína, usando el método Clustal, son KTU PLE-T, GAP PENALTY = 3, WTNDOW=5 y DIAGONALS SAVED = 5. Para los ácido nucleicos, estos parámetros son KTU PLE-2, GAP PENALTY-5, Wl NDOW=4 y DIAGONALS SAVED = 4. Después del alineamiento de las secuencias usando el programa Clustal V, es posible de obtener un “identidad en porcentaje” visualizando las tablas de “distancias de secuencia" en el mismo programa. Adicionalmente, el “método Clustal W de alineamiento” está disponible y corresponde al método marcado Clustal W de alineamiento” (descrito por H iggins and Sharp, CABIOS. 5: 151 -153 ( 1989); Higgins, D. G. et al. , Comput. Appl. Biosci. 8: 1 89-191 ( 1992)); y encontrado en el programa MegAlign™ v6.1 bioinformatics computing suite de LASERGENE (DNASTAR I nc. ) . Los parámetros por defecto para el alineamiento múltiple (GAP PENALTY™ 10, GAP LENGTH PENALTY = 0.2, Retraso secuencias divergentes (%) = 30, Peso de transición del ADN = 0.5, Matriz del peso de prote ína = Gonnet Series, Matriz del peso de ADN = I U B). Después del alineamiento de las secuencias usando el programa Clustal W, es posible de obtener un "identidad en porcentaje” visualizando la tabla de las “distancias de secuencia” en el mismo programa.
El término "soporte lógico de análisis de secuencia" se refiere a cualquier algoritmo de computadora o programa de soporte lóg ico, que es útil para el análisis de las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. El "soporte lógico de análisis de secuencia" puede estar disponible comercialmente o desarrollado de forma independiente. Los soportes lógicos de análisis de secuencia típicos incluirán, pero no están lim itado a: I .) la serie GCG de programas (Wisconsin Package Versión 9.0, Genetics Computer Group (GCG) , Madison , Wl) ; 2.) BLASTP, BLASTN , BLASTX (Altschul et al. , J. Mol. Biol. , 215:403-410 ( 1990)); 3. ) DNASTAR (DNASTAR, I nc. Madison, Wl); 4.) Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, M I); y 5. ) el programa FASTA incorporando el algoritmo Smith-Waterman (W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res. , [Proc. Int. Symp.] ( 1994) , Meeting Date 1992, 1 1 1 -20. Editor(s): Suhai, Sandor. Plenum : New York, NY) . Dentro del contexto de esta solicitud , se entenderá que cuando el soporte lógico de análisis de secuencias es usado para el análisis, los resultados del análisis estarán basados en los "valores por defecto” del programa referenciado, a menos q ue esté especificado de otra forma. Como es usado aquí "valores por defecto” significarán cualquiera de los valores o parámetros que son cargados originalmente con el soporte lógico cuando es iniciado la primera vez.
El ADN recombinante estándar y las téenicas de clonación molecular usadas aquí, son bien conocidas en la técnica y están descritas, por ejemplo, por Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual ( Clonación Molecular: Un manual de laboratorio), Third Edition, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, NY (2000); y por Silhavy et al. , Experiments with Gene Fusions ( Experimentos con fusiones de genes), Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, NY ( 1984) ; y por Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology ( Protocolos Actuales en Biología Molecular), publicado por Greene Publishing Assoc. y Wilcy-lnterscience (1987 to present).
Las manipulaciones genéticas de un hospedador recombinante reveladas aquí, pueden ser realizadas usando técnicas genéticas estándares y ensayadas, y pueden ser hechas en cualquiera célula hospedadora que es adecuada para la manipulación genética. En algunas modalidades, un hospedador recombinante puede ser, pero no está limitado a, cualquiera planta más alta, incluyendo ambas plantas, dicotiledónea y monocotiledónea, y plantas comestibles, incluyendo las plantas de cultivo y las plantas usadas para sus aceites. Por consiguiente, cualquiera especie vegetal o célula vegetal puede ser seleccionada, además, como descrito más adelante.
Los aceites de la presente invención , también pueden ser usados en las composiciones y procesos dietéticos o no culinarios. Algunos de estos usos, pueden ser industrial, cosmético o medicinal. Los aceites de la presente invención también pueden ser usados en cualquiera aplicación, para lo cual los aceites de la presente invención son apropiados. En general, los aceites de la presente invención, pueden ser usados para reemplazar, por ejemplo, los aceites minerales, los ésteres, los ácidos grasos, o las grasas animales en una variedad de aplicaciones, tal como los lubricantes, los aditivos de lubricantes, los líquidos para trabajar el metal, los l íquidos hidráulicos y los l íquidos hidráulicos resistentes al fuego. Los aceites de la presente invención, también pueden ser usados como materiales en un proceso de producción de aceites modificados. Los ejemplos de las téenicas para la modificación de los aceites de la presente invención incluyen el fraccionamiento, la hidrogenación, la alteración del contenido del ácido oleico o del ácido linolénico de los aceites, y otras técnicas de modificación conocidas por aquellas personas experimentadas en la técnica .
Los ejemplos de uso cosmético para los aceites de la presente invención, incluyen el uso como un emoliente en una composición cosmética; como un reemplazante de la vaselina; como que comprende parte de un jabón; o como un material en un proceso para la producción del jabón ; como que comprende parte de una solución de tratamiento bucal; como que comprende parte de una composición de tratamiento para el envejecimiento; y como que com prende parte de una preparación de espuma en aerosol para el cabello o la piel.
Adicionalmente, los aceites de la presente invención pueden ser usados en las aplicaciones médicas. Por ejemplo, los aceites de la presente invención pueden ser usados en una barrera de protección contra la infección, y los aceites altos en ácidos grasos omega-9 pueden ser usados para aumentar la supervivencia del injerto de trasplante (Patente norteamericana no. 6.210.700).
Debería quedar entendido que lo anterior son ejemplos sin limitación de usos no culinarios, para lo cual , los aceites de la presente invención son apropiados. Como previamente determinado, los aceites y los aceites modificados de la presente invención, pueden ser usados para reemplazar, por ejemplo, los aceites minerales, los ásteres, los ácidos grasos, o las grasas animales en todas las aplicaciones conocidas por aquellas personas experimentadas en la téenica.
Sintasa del PUFA La vía "estándar" o "clásica" para la síntesis de los PUFA de cadena larga (LC-PUFA) , en los organismos eucariotas, involucra la elongación y desaturación de los ácidos grasos saturados o mono-insaturados de cadena larga mediana y ha sido descrita. La vía para la síntesis de los PUFA de cadena larga a través de un sintasa del PUFA, también ha sido descrita, y es muy diferente de la vía “estándar”. Específicamente, las sintasas del PUFA utilizan malonil-CoA como una fuente de carbono, y produce el PU FA final sin la liberación de los intermediarios en cualquiera cantidad significativa. También, con las sintasas del PU FA, los enlaces dobles cis apropiados son agregados durante la síntesis, usando un mecanismo que no requiere oxígeno. En algunas modalidades, el NADPH (fosfato dinucleótido de adinina dicotinamida) es usado como un reductor durante los ciclos de la síntesis.
La presente invención se refiere a los organismos hospedadores (por ejemplo, las plantas tal como, el frijol de soya) que ha sido modificada, genéticamente, para expresar una sintasa del PUFA (tanto de forma endógena como mediante manipulación genética). En algunas modalidades, un organismo que ha sido modificado genéticamente, para expresar una sintasa del PUFA, donde el organismo no expresa naturalmente (de forma endógena, sin modificación genética) tal una enzima, o al menos esa sintasa del PUFA particular o porción de él, con la cual el organismo está siendo modificado genéticamente, puede ser referido aquí como un organismo hospedador “heterólogo", con respecto a la modificación del organismo con la sintasa del PU FA, o con otra proteína que no está expresada de forma endógena por el organismo. Las modificaciones genéticas de la presente invención, pueden ser usadas para mejorar la producción del PU FA en un organismo hospedador, que es expresado de forma endógena en una sintasa del PUFA, donde el organismo no es modificado ulteriormente con una sintasa del PU FA diferente, o una porción de él.
Una sintasa del PUFA, de acuerdo con la presente invención , puede comprender varias proteínas m ultifuncionales (y puede incluir proteínas de función individual, particularmente para la sintasa del PUFA desde una bacteria marina) , que pueden actuar juntas para conducir ambos procesamientos iterativos de la cadena del ácido graso, así como también el procesamiento no iterativo, incluyendo la isomerización trans-cis y las reacciones de la reducción de enoilo en ciclos seleccionados. Estas proteínas también pueden ser referidas aquí como el núcleo del complejo de enzima de la sintasa del PUFA. Las funciones generales de los dominios y motivos contenidos dentro de estas proteínas, son conocidas en la téenica individualmente, y han sido descritas en detalle con respecto a varias sintasas del PUFA a partir de una bacteria marina y de los organismos eucariotas (véase, por ejemplo, la Patente norteamericana no. 6.140.486; la Patente norteamericana no. 6.566.583; Metz et al. , Science 293:290-293 (2001 ); la publicación de la solicitud norteamericana N° 2002/0194641 ; la publicación de la solicitud norteamericana N° 2004/0235127 ; la publicación de la solicitud norteamericana N° 2005/0100995 y WO 2006/1 35866) . Los dominios pueden ser encontrados como una proteína individual (por ejemplo, el dominio y la proteína son sinónimos) o como uno de dos o más (múltiples) dominios en una proteína individual, como mencionado anteriormente. La arquitectura del dominio de varias sintasas del PU FA a partir de una bacteria marina y miembros de Thraustochytrium , y las características estructurales y funcionales de los genes y las proteínas que com prende tales sintasas del PUFA, han sido descritas (véase, por ejemplo, Patente norteamericana no. 6.140.486; Patente norteamericana no. 6.566.583; Metz et al. , Science 293:290-293 (2001 ); Publicación de Solicitud norteamericana no. 2002/0194641 ; Publicación de Solicitud norteamericana no. 2004/0235127; Publicación de Solicitud norteamericana no. 2005/0100995 y WO 2006/1 35866).
Numerosos ejemplos de polinucleótidos, genes y polipéptidos teniendo la actividad de la sintasa del PUFA son conocidos en la téenica, y pueden ser usados en un hospedador modificado genéticamente, revelado aquí. Las proteínas o dominios de la sintasa del PUFA que son útiles en la presente invención, pueden incluir ambos, las sintasas del PUFA bacteriano y no bacteriano. Una sintasa del PUFA no bacteriano es un sistema que es de o derivado de un organismo que no es bacteriano, tal como un eucariota. Las sintasas del PUFA bacterianas están descritas, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud norteamericana no. 2008/0050505. Las plantas genéticamente modificadas de la invención , pueden ser producidas porque incorporan los dominios funcionales de la sintasa del PU FA no bacteriana con los dominios funcionales de la sintasa del PUFA bacteriana, así como los dominios o proteínas funcionales de la sintasa del PUFA desde otros sistemas PKS (Tipo I iterativo o modular, Tipo I I ó Tipo II I) o los sistemas FAS .
En algunas modalidades, una sintasa del PU FA de la presente invención , comprende al menos los siguientes dom inios biológicamente activos, que están contenidos, típicamente, en tres, cuatro o más proteínas: (a) al menos un dominio de enoil-ACP reductasa (ER) ; (b) los dom inios múltiples de protema portando acilo (ACP) (por ejemplo, al menos desde uno hasta cuatro, o al menos cinco dominios ACP, y en algunas modalidades hasta seis, siete, ocho, nueve, diez o más que diez dominios ACP) ; (c) al menos dos dominios de b-cetoacil-ACP sintasa (KS); (d) al menos un dominio de aciltransferasa (AT); (e) al menos un dominio de b-cetoacil-ACP reductasa (KR); (f) al menos dos dominios de b-hidroxiacil-ACP dehidrasa como FabA (DH) ; (g) al menos un dominio de factor de longitud de cadena (CLF) ; y/o (h) al menos un dominio de malonil-CoA: ACP aciltransferasa (MAT). En algunas modalidades, una sintasa del PUFA de acuerdo con la presente invención , también comprende al menos una región q ue contiene un motivo conservado del sitio activo de dehidratasa (DH) En algunas modalidades, una sintasa del PUFA, comprende al menos los siguientes dominios biológicamente activos: (a) al menos un dominio enoil-ACP reductasa (ER) ; (b) al menos cinco dom inios de proteína portando acilo (ACP); (c) al menos dos dominios de b-cetoacil-ACP sintasa (KS); (d) al menos un dominio de aciltransferasa (AT); (e) al menos un dominio de b-cetoacil-ACP reductasa (KR); (f) al menos dos dominios de b-hidroxiacil-ACP dehidrasa como FabA (DH) ; (g) al menos un dominio de factor de longitud de cadena (CLF); y (h) al menos un dominio de malonil-CoA:ACP aciltransferasa (MAT) . En algunas modalidades, una sintasa del PU FA de acuerdo con la presente invención también comprende, al menos una región o un dominio que contiene un motivo conservado del sitio activo de dehidratasa (DH) , que no es parte de un dominio de DH como FabA. Las características estructurales y funcionales de cada uno de estos dominios, están descritos de forma más detallada en la Publicación de Solicitud norteamericana no. 2002/0194641 ; Publicación de Solicitud norteamericana no. 2004/0235127; Publicación de Solicitud norteamericana no. 2005/01 00995; publicación de la solicitud norteamericana de N .A. N° 2007/0245431 ; y WO 2006/135866.
Existen tres marcos de lectura abiertos que forman el núcleo de la sintasa del PUFA Schizochytrium y que han sido descritos previamente, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud norteamericana no. 2007/0245431 . La estructura de dominio de cada marco de lectura abierto es como sigue: Marco Abierto de Lectura A Schizochytrium (OrfA o Pfa1 ): OrfA es una secuencia de nucleótidos 8730 (no incluyendo el codón de terminación) la cual codifica una secuencia de aminoácidos 2910. Dentro de OrfA, existen doce dominios: (a) un dominio de b-cetoacil- ACP sintasa (KS) ; (b) un dom inio de malon¡l-CoA:ACP aciltransferasa (MAT) ; (c) nueve dominios de la proteína portadora de acilo (ACP); y (d) un dom inio cetorreductasa (KR). Los clones del ADN genómico (plásmidos) que codifica el OrfA desde am bas, Schizochytrium sp. ATCC 20888 y una cepa hermana de ATCC 20888, Schizochytrium sp. designada, cepa N230D, han sido aisladas y secuenciadas.
El clon genómico pJK1 126 (clon genómico OrfA pJK1 126 designado, en la forma de un vector plasm ídico E. col i que contiene un gen "OrfA" de Schizochytrium ATCC 20888) fue depositado en la American Type Culture Collection (ATCC) ( Colección americana de cultivos tipo) , 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 201 10-2209 EE. UU. , el 8 de Junio de 2006, y asignado como ATCC Accession No. PTA-7648.
El clon genómico pJK306 (clon genómico OrfA pJK306 designado, en la forma de un plásmido E. coli que contiene una porción en 5' de gen OrfA de Schizochytrium sp. N230D (2.2 kB sobrepuesto con pJK320)) fue depositado en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard , Manassas, Va. 201 10-2209 EE. UU. , el 8 de Junio de 2006, y asignado como ATCC Accession No. PTA-7641 .
El clon genómico pJK320 (clon genómico OrfA pJK320 designado, en la forma de un plásmido E. coli que contiene una porción en 3' de gen OrfA de Schizochytrium sp. N230D (2.2 kB sobrepuesto con pJ K306)) fue depositado en la American Type Culture Collection (ATCC) , 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 201 10-2209 E E . UU . , el 8 de Junio, 2006, y asignado como ATCC Accession No. PTA-7644.
Marco Abierto de Lectura B Schizochytrium (OrfB o Pfa2): OrfB es una secuencia de nucleótidos 6177 (no incluyendo el codón de terminación) , la cual codifica una secuencia de aminoácidos 2059. Dentro de OrfB, existen cuatro dominios: (a) un dominio de cetoacil-ACP sintasa (KS) ; (b) un dominio de factor de longitud de cadena (CLF); (c) un dominio de aciltransferasa (AT); y, (d) un dom inio de enoil-ACP-reductasa (ER) . Los clones genómicos del ADN (plásmidos) que codifica el OrfB de ambas, Schizochytrium sp. ATCC 20888 y una cepa hermana de ATCC 20888, Schizochytrium sp. designada, cepa N230D, han sido aisladas y secuenciadas.
El clon genómico pJ K1 129 (clon genómico OrfB pJK1 129 designado, en la forma de un vector plasmídico E. coli que contiene un gen "OrfB" de Schizochytrium ATCC 20888), fue depositado por la American Type Culture Collection (ATCC) , 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 201 10-2209 EE. UU. , el 8 de Junio de 2006, y asignado como ATCC Accession No. PTA-7649.
El clon genómico pJK324 (clon genómico pJK324 OrfB designado, en la forma de un plásmido E. coli q ue contiene la secuencia del gen OrfB de Schizochytrium sp. N230D), fue depositado por la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 201 10-2209 EE. UU. , el 8 de Junio de 2006, y asignado como ATCC Accession No. PTA-7643.
Marco Abierto de Lectura C Schizochytrium (OrfC o Pfa3) : OrfC es una secuencia de nucleótidos 4506 (no incluyendo el codón de term inación), la cual codifica una secuencia de aminoácidos 1502. Dentro del OrfC, existen tres dominios: (a) dos dominios de hidroxiacil-ACP dehidrasa (DH) como FabA; y (b) un dominio de enoil-ACP-reductasa (ER). Los clones del ADN genómico (plásmidos) que codifica OrfC desde ambas, Schizochytrium sp. ATCC 20888 y una cepa hermana de ATCC 20888, Schizochytrium sp. designada, cepa N230D, han sido aisladas y secuenciadas.
El clon genómico p J K 1 131 (clon genómico OrfC p J K 1 131 designado, en la forma de un vector plasm ídico E. coli que contiene un gen "OrfC" de Schizochytrium ATCC 20888) fue depositado por la American Type Culture Collection (ATCC), 1 0801 University Boulevard, Manassas, Va. 201 10-2209 EE. UU . , el 8 de Junio de 2006, y asignado como ATCC Accession No. PTA-7650.
El clon genómico pBR002 (clon genómico OrfC pBR002 designado, en la forma de un vector plasm ídico E. coli que contiene la secuencia del gen OrfC de Schizochytrium sp. N230D) fue depositado por la American Type Culture Collection (ATCC) , 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 201 10-2209 EE. UU. , el 8 de Junio de 2006, y asignado como ATCC Accession No. PTA-7642.
En adición, existen tres marcos abiertos de lectura que forman el núcleo de la sintasa del PUFA Thraustochytrium , que han sido descritos previamente. La estructura del dominio de cada marco abierto de lectura es como sigue: Marco Abierto de Lectura A Thraustochytrium 23 (OrfA) : OrfA es una secuencia de nucleótidos 8433 (no incluyendo el codón de terminación) , la cual codifica una secuencia de aminoácidos 281 1 . Los siguientes dom inios están presentes en Th. 23B OrfA: (a) un dominio de b-cetoacil-ACP sintasa (KS); (b) un dominio de malonil-CoA:ACP ac i I transfe ras a (MAT); (c) ocho dominios de proteína acarreadora de acilo (ACP) ; y (d) un dominio de b-cetoacil-ACP reductasa ( R).
El clon genómico Th23BOrfA_pBR8 12.1 (clon genómico Th23BOrfA_pBR81 2.1 designado, en la forma de un vector plasm ídico E. coli que contiene la secuencia del gen OrfA de Thraustochytrium 23 B), fue depositado por la American Type Culture Collection (ATCC), University Boulevard, Manassas, Va. 201 10-2209 EE. U U . , el 1 de Marzo de 2007, y asignado como ATCC Accession No. PTA-8232.
El clon genómico Th23BOrfA_pBR81 1 (clon genómico Th23BOrfA_pBR81 1 designado, en la forma de un vector plasm ídico E. coli q ue contiene la secuencia del gen OrfA de Thraustochytrium 23B), fue depositado por la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 201 10-2209 EE. U U . , el 1 de Marzo de 2007, y asignado como ATCC Accession No. PTA-8231 .
Marco Abierto de Lectura B Thraustochytrium 23B (OrfB): OrfB es una secuencia de nucleótidos 5805 (no incluyendo el codón de terminación) , que codifica una secuencia de am inoácidos 1935. Los siguientes dominios están presentes en Th. 23B OrfB: (a) un dominio de b-cetoacil-ACP sintasa (KS) ; (b) un dominio de factor de longitud de cadena (CLF) ; (c) un dominio de aciltransferasa (AT); y, (d) un dominio de enoil-ACP reductasa (ER). El clon genómico Th23BOrfB_pBR800 (clon genómico Th23BOrfB_pBR800 designado, en la forma de un vector plasm ídico E. coli que contiene la secuencia del gen OrfB de Thraustochytrium 23 B) , fue depositado por la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 201 10-2209 EE . U U. , el 1 de Marzo de 2007, y asignado como ATCC Accession No. PTA-8227.
Marco Abierto de Lectura C Thraustochytrium 23B (OrfC) : OrfC es una secuencia de nucleótidos 4410 (no incluyendo el codón de terminación) que codifica una secuencia de aminoácidos 1470. Los siguientes dominios están presentes en Th. 23B OrfC: (a) dos dominios de b-hidroxiacil-ACP dehidrasa (DH) como FabA, ambos con homolog ía a la proteína FabA (una enzima que cataliza la síntesis de trans-2-decenoil-ACP y la isomerización reversible de este producto con cis-3-decenoil-ACP); y (b) un dom inio de enoil-ACP reductasa (ER) con una homolog ía alta con respecto al dom inio ER de Schizochytrium OrfB. El clon genómico Th23BOrfC_pBR709A (el clon genómico Th23BOrfC_pBR709A designado, en la forma de un vector plasmídico E. coli que contiene la secuencia del gen OrfC de Thraustochytrium 23B), fue depositado por la American Type Culture Collection (ATCC) 1 0801 U niversity Boulevard, Manassas, Va. 201 10-2209 EE. UU . , el 1 de M arzo de 2007, y asignado como ATCC Accession No. PTA-8228.
Sintasa del PUFA quimerica o h íbrida: En algunas modalidades, la sintasa del PU FA com prende los dominios seleccionados entre cualquiera de aquellos descritos aquí, donde los dominios son combinados (por ejemplo, mezclados y combinados) para formar una sintasa del PUFA completa, cumpliendo el m ínimo de requerimientos descritos aquí. En algunas modalidades, el organismo modificado genéticamente de la invención , puede ser modificado, además, con al menos un dominio o fragmento biológicamente activo de ellos de otra sintasa del PUFA. En algunas modalidades, cualquiera de los dominios de una sintasa del PUFA puede ser modificado a partir de su estructura natural, para modificar o aumentar la función de ese dominio en el sistema de la sintasa del PU FA (por ejemplo, para modificar los tipos o las relaciones del PUFA entre ellos producidos mediante el sistema). Tales mezclas de dominios, para producir una sintasa del PU FA quimérica, están descritas en las patentes y publicaciones referenciadas aquí.
En algunas modalidades, la sintasa del PU FA comprende la sintasa del PUFA de Schizochytrium, donde OrfC de la sintasa del PU FA de Schizochytrium, es reemplazada por OrfC de Thraustochytrium 23B. En algunas modalidades, tal una OrfC quimérica de Thraustochytrium 23B, es codificada por una secuencia del ácido nucleico, que es optimizada para el uso del codón de Schizochytrium. Como un ejemplo sin limitación de tal una OrfC quimérica, pThOrfC-synPS plásmido (pThOrfC-synPS designada, en la forma de un vector plasmídico E. coli que contiene un codón B PUFA PKS OrfC 23 sintético de Thraustochytrium" de puntada perfecta", optimizado para la expresión en Schizochytrium u otro hospedador heterólogo), fue depositado por la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 201 10-2209 EE. UU · , el 1 de Marzo de 2007, y asignado como ATCC Accession No. PTA-8229 (véase también Publicación de Solicitud norteamericana no. . 2008/0022422).
Otros ejemplos de los genes de la sintasa del PUFA y de los polipéptidos que pueden ser usados, en un organismo modificado genéticamente de la invención incluyen , pero no están limitados a, las siguientes secuencias de codón optimizado, generado mediante los métodos descritos ulteriormente aquí: SEQ I D NQ: 1 (proteína SzPU FA OrfA v3); SEQ I D NO:2 (proteína SzPUFA OrfB v3) ; SEQ I D NO: 3 (proteína hSzThPUFA OrfC v3); SEQ I D NO:6 (gen SzPUFA OrfA); SEQ I D NO: 7 (gen SzPUFA OrfB v3), y SEQ ID NO:8 (gen hSzThPUFA OrfC v3) , así como también una variante, una porción , un fragmento activo o un derivado de tales secuencias, donde tal un gen que codifica, o tal un polipéptido o la proteína tiene, actividad de la sintasa del PUFA. La presente invención incluye un polinucleótido o un polipéptido aislados, que comprende o consistiendo de una o más de tales secuencias.
Otros ejemplos de genes de la sintasa del PUFA y de los polipéptidos que pueden ser usados en la invención incluyen, pero no están limitados a, los genes o los polipéptidos de la sintasa del PU FA teniendo al menos 80%, al menos 85% , al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% ó 100% de identidad de secuencia con cualquiera de uno de los genes o polipéptidos de la sintasa del PUFA descritos aqu í. Los rangos útiles pueden ser seleccionados entre cualquiera de estos valores (por ejemplo, desde 80% hasta 100% idéntico, desde 85% hasta 100% idéntico, desde 90% hasta 100% idéntico, desde 95% hasta 100% idéntico, desde 80% hasta 99% idéntico, desde 85% hasta 99% idéntico, desde 90% hasta 99% idéntico o desde 95% hasta 99% idéntico) . Aún otros ejemplos de los genes y de los polipéptidos de la sintasa del PUFA, que pueden ser usados en un organismo modificado genéticamente de la invención incluyen, pero no están limitados a, una variante, una porción, un fragmento activo de derivados de cualquiera una de las sintasas del PUFA o secuencias descritas aquí, donde tal un gen que codifica, o tal un polipéptido tiene, actividad de la sintasa del PUFA.
En algunas modalidades, la sintasa del PU FA puede ser una sintasa algácea del PUFA. En algunas modalidades, la sintasa del PU FA puede comprender una secuencia de aminoácidos que es desde 80% hasta 100% idéntica, desde 85% hasta 100% idéntica, desde 90% hasta 100% idéntica, desde 95% hasta 100% idéntica, desde 80% hasta 99% idéntica, desde 85% hasta 99% idéntica, desde 90% hasta 99% idéntica o desde 95% hasta 99% idéntica a la secuencia de am inoácidos de SEQ ID NO: 1 . En algunas modalidades, la sintasa del PUFA puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 1 . En algunas modalidades, la secuencia del ácido nucleico que codifica la sintasa del PU FA, puede com prender una secuencia del ácido nucleico que es desde 80% hasta 100% idéntica, desde 85% hasta 100% idéntica, desde 90% hasta 100% idéntica, desde 95% hasta 100% idéntica, desde 80% hasta 99% idéntica, desde 85% hasta 99% idéntica, desde 90% hasta 99% idéntica o desde 95% hasta 99% idéntica a la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO:6. En algunas modalidades, la secuencia del ácido nucleico que codifica la sintasa del PUFA, puede comprender la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO:6. En algunas modalidades, la sintasa del PUFA puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% , al menos 85%, al menos 90% , al menos 95% , al menos 96% , al menos 97% , al menos 98% ó al menos 99% idéntica a la secuencia de am inoácidos de SEQ ID NO:2. En algunas modalidades, la sintasa del PUFA puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO:2. En algunas modalidades, la secuencia del ácido nucleico que codifica la sintasa del PUFA, puede comprender una secuencia del ácido nucleico que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% ó al menos 99% idéntica a la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO:7. En algunas modalidades, la secuencia del ácido nucleico que codifica la sintasa del PUFA, puede comprender la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO:7. En algunas modalidades, la sintasa del PUFA puede comprender la secuencia de aminoácidos que es al menos 80% , al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% , al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% ó al menos 99% idéntica a la secuencia de am inoácidos de SEQ I D NO: 3. En algunas modalidades, la sintasa del PU FA comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 3. En algunas modalidades, la secuencia del ácido nucleico que codifica la sintasa del PUFA, comprende una secuencia del ácido nucleico que es al menos 80% , al menos 85%, al menos 90% , al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% ó al menos 99% idéntica a la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO: 8. En algunas modalidades, la secuencia del ácido nucleico que codifica la sintasa del PU FA, comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO:8.
En algunas modalidades, la sintasa del PU FA comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: I, 2, ó 3 ó cualquiera de las combinaciones entre sí. En algunas modalidades, la sintasa del PUFA comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO: 6, 7, u 8 ó cualquiera de las combinaciones entre sí. En algunas modalidades, la secuencia del ácido nucleico que codifica una secuencia de am inoácidos de SEQ I D NO: I, 2, ó 3, ó cualquiera de las combinaciones o identidad en porcentajes entre sí descritos aquí.
En algunas modalidades, las secuencias de otros genes y/o polipéptidos de la sintasa del PUFA, pueden ser identificadas en la literatura y en las bases de datos de la biomformática, bien conocidos por una persona experimentada, usando las secuencias reveladas aquí y disponibles en la téenica. Por ejemplo, tales secuencias pueden ser identificadas a través de la búsqueda BLAST de las bases de datos a disposición del público, conocido como secuencias de gen o polipéptido de la sintasa del PUFA. En tal un método, las identidades pueden estar basadas en el método Clustal W de alineamiento usando los parámetros por defecto de GAP PENALTY= 10, GAP LENGTH PENALTY-0. 1 , y las series Gonnet 250 de la matriz de peso de proteína.
Adicionalmente, la secuencia del gen o polipéptido de la sintasa del PUFA revelado aquí, o conocido en la técnica, puede ser usado para identificar otros homólogos de la sintasa del PUFA en la naturaleza. Por ejemplo, cada uno de los fragmentos del ácido nucleico de la sintasa del PU FA revelados aquí, puede ser usado para aislar los genes que codifica las proteínas homologas. El aislamiento de los genes homólogos usando protocolos dependientes de la secuencia, es bien conocido en la técnica. Los ejemplos de los protocolos dependientes de la secuencia incluyen, pero no están limitados a, ( 1 ) los métodos de hibridación del ácido nucleico; (2) los métodos de amplificación del ADN y del ARN, como ejem plificado mediante varios usos de las tecnolog ías de amplificación del ácido nucleico (por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , Mullís et al. , Patente de los EE. UU . N° 4.683.202; reacción en cadena de la ligasa (LCR) , Tabor, S. et al. , Proc. Acad. Sci. USA 82: 1074 ( 1985); o amplificación de desplazamiento de cadena (SDA), Walker et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. U . S.A. , 89: 392 ( 1992)); y (3) los métodos de construcción de librería y cribado por complementación.
Todos estos métodos pueden ser fácilmente practicados por una persona experimentada en la téenica, haciendo uso de las secuencias conocidas o identificadas que codifica las proteínas objetivo. En algunas modalidades, las secuencias del ADN relacionadas con una secuencia que codifica la sintasa del PU FA objetivo, también son útiles en algunos procedimientos de modificación y pueden ser fácilmente encontradas, por una persona experimentada en la técnica, en las bases de datos a disposición del público. Los métodos para crear mutaciones genéticas, son comunes y bien conocidas en la técnica y pueden ser aplicadas al ejercicio de crear mutantes.
Fosfopanteteinil Transferasa Las fosfopanteteinil transferasas (PPTasas) son una familia de enzimas que han sido bien caracterizadas en la síntesis del ácido graso, la síntesis de poliquétido y síntesis de péptido no ribosómico. En particular, los dominios ACP presentes en las enzimas de la sintasa del PUFA, requieren activación mediante el acoplam iento de un cofactor (4-fosfopanteteína) a partir de una coenzima A con la proteína portadora de acilo (ACP). El acoplam iento de este cofactor es llevado a cabo mediante las PPTasas. Si las PPTasas endógenas de los organismos hospedadores, son incapaces de activar los dominios ACP de la sintasa del PUFA, entonces es necesario de proveer una PPTasa que es capaz de llevar a cabo esa función. Las secuencias de muchas PPTasas son conocidas, y las estructuras cristalinas han sido determinadas (por ejemplo, Reuter et al. , EMBO J. 18:6823-31 ( 1999)) así como también el análisis mutacional de los residuos de aminoácido importantes para la actividad (Mofid et al. , Biochemistry 43:4128-36 (2004)) .
Un ejemplo de una PPTasa heteróloga, la cual ha sido demostrada previamente, para reconocer los dominios ACP de OrfA, descritos aquí como los substratos, es la proteína Het I de Nostoc sp. PCC 7120 (anteriormente llamada Anabaena sp. PCC 7120). Het I está presente en un grupo de genes Nostoc, conocido por ser responsable de la síntesis de los ácidos grasos hidroxilo de cadena larga, que son un compuesto de una capa glicolípida presentes en los heterocistos de ese organismo (Black and Wolk, J. Bacterio!. 775:2282-2292 ( 1994); Campbell et al. , Arch.
Microbiol. 7(57: 251 -258 (1997)). Het I es probablemente para activar los dominios ACP de una proteína Hgl E, presente en ese grupo. Los dos dominios ACP de Hgl E tienen un alto grado de homolog ía de secuencia con los dominios ACP encontrados en Schizochytrium Orf A y otras sintasas del PUFA.
En algunas modalidades, una sintasa del PUFA puede ser considerada de incluir al menos un dominio de 4'-fosfopanteteinil transferasa (PPTasa), o tal un dom inio puede ser considerado de ser un dominio accesorio o una proteína accesoria para la sintasa del PU FA. Las características estructurales y funcionales de las PPTasas han sido descritas en más detalle, por ejemplo, en la Publicación de la Solicitud de los EE. UU. N° 2002/0194641 ; la Publicación de la Solicitud norteamericana no. 2004/0235127; y la Publicación de la Solicitud norteamericana no. 2005/0100995.
Numerosos ejem plos de los genes y de los polipéptidos, que tienen la actividad de PPTasa, son conocidos en la téenica y podrían ser usados en los organismos genéticamente modificados de la invención , si ellos son capaces de la activación de los dom inios ACP de una sintasa del PUFA particular que está siendo usada. Los ejemplos de los genes y de los polipéptidos, que pueden ser usados en un organismo modificado genéticamente de la invención, pueden incluir, pero no están limitados a, las siguientes secuencias de codón optimizado descritas anteriormente aquí: SEQ I D NO: 5 (proteína NoHetl v3) y SEQ I D NO: 10 (gen NoHetl v3).
Otros ejemplos de los genes y de los polipéptidos de PPTasa, que pueden ser usados en un organismo modificado genéticamente de la invención incluyen , pero no están lim itados a, los genes o los polipéptidos de PPTasa que tienen al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% , al menos 95% , al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% , al menos 99% ó 1 00% de identidad de secuencia para cualquiera una de las PPTasas o secuencias descritas aquí. Los rangos útiles pueden ser seleccionados entre cualquiera de estos valores (por ejemplo, desde 80% hasta 100% idéntica, desde 85% hasta 100% idéntica, desde 90% hasta 100% idéntica, desde 95% hasta 100% idéntica, desde 80% hasta 99% idéntica, desde 85% hasta 99% idéntica, desde 90% hasta 99% idéntica o desde 95% hasta 99% idéntica) . Aún otros ejemplos de los genes y de los polipéptidos de PPTasa, que pueden ser usados en un organismo modificado genéticamente de la invención incluyen , pero no están limitados a, una variante, un fragmento, una porción o un derivado activos de cualquiera una de las secuencias de PPTasa descritas aquí, donde tal un gen codifica, o tal un pol i péptido tiene, la actividad de PPTasa.
En algunas modalidades, la PPTasa puede ser una PPTasa algácea. En algunas modalidades, la PPTasa puede comprender una secuencia de aminoácidos que es desde 80% hasta 100% idéntica, desde 85% hasta 100% idéntica, desde 90% hasta 100% idéntica, desde 95% hasta 100% idéntica, desde 80% hasta 99% idéntica, desde 85% hasta 99% idéntica, desde 90% hasta 99% idéntica o desde 95% hasta 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5. En algunas modalidades, la PPTasa puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO:5. En algunas modalidades, la secuencia del ácido nucleico que codifica la PPTasa, puede comprender una secuencia del ácido nucleico que es desde 80% hasta 100% idéntica, desde 85% hasta 100% idéntica, desde 90% hasta 100% idéntica, desde 95% hasta 100% idéntica, desde 80% hasta 99% idéntica, desde 85% hasta 99% idéntica, desde 90% hasta 99% idéntica o desde 95% hasta 99% idéntica a la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO: 10. En algunas modalidades, la secuencia del ácido nucleico que codifica la PPTasa, puede comprender la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID NO: 10. En algunas modalidades, la secuencia del ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO:5 o cualquiera de los porcentajes de identidad de ellas descritas aquí.
En algunas modalidades de la presente invención , una PPTasa puede ser provista para la producción y/o acumulación de PPTasa en un hospedador heterólogo.
En algunas modalidades, un gen y/o un polipéptido que codifica la PPTasa, puede ser usado para identificar otras secuencias de gen y/o polipéptido de PPTasa, y/o pueden ser usados para identificar una PPTasa homologa en otras células. Tales secuencias que codifica la PPTasa pueden ser identificadas, por ejemplo, en la literatura y/o en las bases de datos biomformáticos bien conocidos por una persona experimentada. Por ejemplo, la identificación de una secuencia que codifica una PPTasa en otro tipo de célula, usando la bioinformática, puede ser lograda a través de la búsqueda BLAST (como revelado anteriormente) en la bases de datos disponibles al público, con un conocido ADN que codifica la PPTasa y la secuencia de polipéptidos, tal como cualquiera de estos provistos aquí. Las identidades están basadas en el método Clustal W de alineamiento, usando los parámetros de por defecto de GAP PENALTY= 10, GAP LENGTH PENALTY = 0.1 , y las series Gonnet 250 de matriz de peso de proteína.
En algunas modalidades, la planta (por ejemplo, el frijol de soya), el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, contiene una sintasa del PU FA y una PPTasa. En algunas modalidades, la planta (por ejemplo, el frijol de soya), el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, contiene las secuencias del ácido nucleico de (i) y (ii), en un vector de expresión recombinante individual. En algunas modalidades, la planta (por ejemplo, el frijol de soya), el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, contiene las secuencias del ácido nucleico de (i) y (ii) en diferentes vectores de expresión recombinantes.
Acil-CoA Sintetasa La presente invención provee las proteínas de acil-CoA sintetasa (ACoAS), que cataliza la conversión de los ácidos grasos libres (FFA) del PUFA, de cadena larga, en acil-CoA. El producto endógeno de los PUFA por sintasa del PUFA, Schizochytrium , posee uno o más ACoASs que son capaces de convertir los productos de ácido graso libre de sus sintasa del PUFA en a c i I -CoA. Por lo tanto, Schizochytrium, así como también otros organismos que contienen de forma endógena una sintasa del PUFA (por ejemplo, otros Thraustochytrids) u otros organismos que pueden convertir el PUFA FFAs en acil-CoAs (tal como, Thalassiosira pseudonana o Crypthecodinium cohnii), pueden representar las fuentes para los genes, que codifica las enzimas que son útiles en permitir o incrementar la acumulación de los productos de una sintasa del PU FA, expresado en un hospedador heterólogo. Otras secuencias de AcoAS han sido descritas en la Publicación de Solicitud norteamericana no. 2007/0245431 .
Numerosos ejemplos de genes y de polipéptidos, que tienen actividad AcoAS, son conocidos en la téenica y pueden ser usados en un organismo modificado genéticamente de la invención . Los ejemplos de genes y de polipéptidos que pueden ser usados en un organismo modificado genéticamente de la invención, pueden incluir, pero no están limitados a, las siguientes secuencias de codón optimizado, descrito anteriormente aquí: SEQ I D NO:4 (proteína SzACS-2 v3) y SEQ I D NO:9 (gen hSzThACS-2 v3) .
Otros ejemplos de genes y de polipéptidos AcoAS, que pueden ser usados en un organismo modificado genéticamente de la invención incluyen, pero no están limitados a, los genes o polipéptidos ACoAS teniendo al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% ó 100% de identidad de secuencia con cualquiera uno de AcoAS, o las secuencias descritas aqu í. Los rangos útiles pueden ser seleccionados entre cualquiera de estos valores (por ejemplo, desde 80% hasta 100% idéntico, desde 85% hasta 100% idéntico, desde 90% hasta 100% idéntico, desde 95% hasta 100% idéntico, desde 80% hasta 99% idéntico, desde 85% hasta 99% idéntico, desde 90% hasta 99% idéntico o desde 95% hasta 99% idéntico). Aún otros ejemplos de los genes y de los polipéptidos AcoAS, que pueden ser usados en un organismo modificado genéticamente incluyen, pero no están limitados a, una variante, un fragmento, una porción o derivado activos de cualquiera una de las secuencias ACoAS descritas aquí, donde tal un gen codifica, o tal un polipéptido tiene, la actividad ACoAS.
En algunas modalidades, el ACoAS puede ser un ACoAS algáceo. En algunas modalidades, el ACoAS puede comprender una secuencia de aminoácidos que es desde 80% hasta 100% idéntica, desde 85% hasta 100% idéntica, desde 90% hasta 100% idéntica, desde 95% hasta 100% idéntica, desde 80% hasta 99% idéntica, desde 85% hasta 99% idéntica, desde 90% hasta 99% idéntica o desde 95% hasta 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO:4. En algunas modalidades, el ACoAS puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ I D N0.4. En algunas modalidades, la secuencia del ácido nucleico que codifica el AcoAS, puede comprender una secuencia del ácido nucleico que es desde 80% hasta 99% idéntica, desde 85% hasta 99% idéntica, desde 90% hasta 99% idéntica, desde 80% hasta 95% idéntica o desde 85% hasta 95% idéntica a la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO:9. En algunas modalidades, la secuencia del ácido nucleico que codifica el AcoAS, puede comprender la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO: 9. En algunas modalidades, la secuencia del ácido nucleico que codifica el AcoAS , comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO:34. En algunas modalidades, la secuencia del ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO:4 ó cualquier identidad en porcentaje de ellos descritos aqu í.
En algunas modalidades de la presente invención , el ACoAS puede ser provisto para la producción y/o la acumulación del AcoAS en un hospedador heterólogo, así como también para una producción mejorada y/o acumulación de ACoAS en un hospedador endógeno.
En algunas modalidades, un gen y/o un polipéptido que codifica el AcoAS , puede ser usado para identificar otras secuencias de gen y/o polipéptido del AcoAS, y/o puede ser usado para identificar un homólogo del ACoAS en otras células. Tales ACoAS que codifica las secuencias, pueden ser identificados, por ejemplo, en la literatura y/o en las bases de datos biomformáticas bien conocidas por la persona experimentada. Por ejemplo, la identificación de un ACoAS que codifica una secuencia en otro tipo de célula usando las bioinformáticas, puede ser lograda a través de la búsqueda BLAST (como revelado anteriormente) en las bases de datos disponibles al público, con un ACoAS conocido que codifica el ADN y la secuencia de polipéptido, tal como cualquiera de estos provistos aquí. Las identidades están basadas en el método Clustal W de alineam iento, usando los parámetros de defecto de GAP PENALTY= 1 Q, GAP LENGTH PENALTY = 0.1 , y las series Gonnet 250 de matriz de peso de proteína.
En algunas modalidades, la planta (por ejemplo, el frijol de soya), el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, comprende la sintasa del PU FA y un ACoAS, o una sintasa del PUFA, un PPTasa y un ACoAS. En algunas modalidades, la planta (por ejemplo, el frijol de soya) , el descendiente, la célula, el tejido, o parte de ellos, genéticamente modificados, comprende la secuencia del ácido nucleico de (i), (ii) ó (iii), o cualquiera combinación de ellos, contenida en un vector de expresión recombinante individual .. En algunas modalidades, las secuencias del ácido nucleico de (i), (ii) y (iii) están contenidas en diferentes vectores de expresión recombínantes. En algunas modalidades, las secuencias del ácido nucleico de (i) y (ii) están contenidas en un vector de expresión recombinante individual, y la secuencia del ácido nucleico de (iii) está contenida en un vector de expresión recom binante diferente. En algunas modalidades, las secuencias del ácido nucleico de (i) y (iii) están contenidas en un vector de expresión recombinante individual , y la secuencia del ácido nucleico de (ii) está contenida en un vector de expresión recombinante diferente. En algunas modalidades, las secuencias del ácido nucleico de (ii) y (iii) están contenidas en un vector de expresión recom binante individual, y la secuencia del ácido nucleico de (i) está contenida en un vector de expresión recombinante diferente.. En algunas modalidades, las secuencias del ácido nucleico de (i) , (ii) o ( i i i ) , o cualquiera de las combinaciones de ellos, están bajo el control de uno o más promotores de semilla específicos.
Metodos para Hacer Organismos Modificados Genéticamente Para producir rendimientos significativamente altos de uno o más ácidos grasos poliinsaturados deseados, una planta puede ser genéticamente modificada para introducir una sintasa del PUFA dentro vegetal. La presente invención también se refiere a los métodos para mejorar o aumentar la efectividad de tal modificación genética y, particularmente, para mejorar o aumentar la producción y/o la acumulación del producto final de una sintasa del PU FA, por ejemplo, los PUFA.
Los métodos para la expresión de los genes, en un organismo modificado genéticamente, incluyendo, pero no limitado a las plantas, son conocidos en la téenica. En algunas modalidades, la región codificante para los genes de la sintasa del PU FA a ser expresados, pueden ser un codón optimizado para la célula hospedadora objetivo, como descrito más adelante. La expresión de los genes en las células hospedadoras recombinantes, incluyen pero no limitado a las células vegetales, puede requerir un promotor operablemente enlazado a una región codificante de interés, y/o un terminador transcripcional . Un número de promotores pueden ser usados en la construcción de los vectores para los genes, incluyendo pero no limitado a, un promotor de semilla específica (por ejemplo, PvDlec2, LfKCS3, FAE 1 , BoACP, o BnaNapinC) o un promotor de hoja específica (por ejemplo, ubiquitina o CsVMV). Otros ejemplos sin limitación de promotores que pueden ser usados en la presente invención incluyen, el promotor de proteína portadora de acilo revelado en WO 1992/18634; el promotor de beta-faseolina Phaseolus vulgaris y las versiones truncadas reveladas en Slightom et al. ( Proc . Nati. Acad. Sci. U . S.A. 80: 1 897-1901 ; 1983); Sengupta-Gopalan et al.
(Proc. Nat. Acad. Sci. 82: 3320-3324; 1985); van der Geest et al.
( Plant Mol. Biol. 33: 553-557; 1997), y Bustos et al. ( EMBO J. 10: 1469-1479; 1991 ).
En algunas modalidades de la presente invención, un vector recombinante es una molécula del ácido nucleico diseñada (por ejemplo, producida de forma artificial) , que es usada como una herramienta para la manipulación de una secuencia del ácido nucleico elegido, y para introducir tal una secuencia del ácido nucleico dentro de la célula hospedadora.. El vector recombinante es, por eso, adecuado para usar en la clonación, en la secuenciación, y/o en la manipulación, de otra forma, de la secuencia del ácido nucleico elegido, tal como mediante la expresión y/o la entrega de la secuencia del ácido nucleico elegido dentro de una célula hospedadora, para formar una célula recombinante. Tal un vector contiene, típicamente, las secuencias del ácido nucleico heterólogo, que son unas secuencias del ácido nucleico, las cuales no han de ser encontradas de forma natural adyacentes a la secuencia del ácido nucleico, con el fin de ser clonado o entregado, aunque el vector también puede contener secuencias del ácido nucleico reguladoras (por ejemplo, promotores, regiones no traducida), las cuales son encontradas de forma natural adyacentes a las moléculas del ácido nucleico de la presente invención, o las cuales son útiles para la expresión de las moléculas del ácido nucleico de la presente invención. El vector puede ser, tanto ARN como ADN, ya sea, procariótico o eucariótico y, típicamente, es un plásmido. El vector puede ser mantenido como un elemento extracromosomal (por ejemplo, un plásm ido) , o puede ser integrado dentro del cromosoma de un organismo recombinante (por ejem plo, un microbio o una planta) . El vector entero puede permanecer en su lugar dentro de la célula hospedadora, o bajo ciertas condiciones, el ADN plasm ídico puede ser eliminado, dejando atrás la molécula del ácido nucleico de la presente invención. La molécula del ácido nucleico integrada, puede estar bajo el control de un promotor cromosomal, bajo un control de un promotor plasm ídico u orig inal, o bajo una combinación de varios controles del promotor. Las copias individuales o múltiples de la molécula del ácido nucleico, pueden ser integradas dentro de un cromosoma. Un vector recom binante de la presente invención, puede contener al menos un marcador seleccionable.
En algunas modalidades, un vector recombinante usado en una molécula del ácido nucleico recombinante, de la presente invención , es un vector de expresión. En tales modalidades, una secuencia del ácido nucleico que codifica el producto a ser producido (por ejemplo, una sintasa del PU FA), es insertada dentro del vector recombinante para producir una molécula del ácido nucleico recombinante. La secuencia del ácido nucleico que codifica la proteína a ser producido, es insertada dentro del vector en una manera que enlazan, de forma operativa, la secuencia del ácido nucleico con las secuencias reguladoras en el vector, que permite la transcripción y la traducción de la secuencia del ácido nucleico dentro de la célula hospedadora recom binante.
Los vectores útiles para la transformación de una variedad de organismos y células hospedadoras son comunes y están revelados en la literatura. El vector contiene, típicamente, un marcador seleccionable y permitiendo a las secuencias la integración cromosomal o replicación autónoma en el hospedador deseado. En adición, los vectores adecuados pueden comprender, una región promotora, la cual alberga los controles de iniciación transcripcional y una región de control transcripcional, entre la cual, una región que codifica un fragmento del ADN puede ser insertada, con el fin de proveer la expresión de la región de codificación insertada. Ambas regiones de control pueden ser derivadas desde genes homólogos hacia la célula hospedadora transformada , aunque debe quedar entendido que tales regiones de control, también pueden ser derivadas, desde genes que no son originales, hacia las especies específicas elegidas como un hospedador de producción.
La presente invención incluye la expresión de una o más a c i I -CoA sintetasas como descrito y ejemplificado aqu í, con una sintasa del PU FA como descrito aquí y con un PPTasa exógena , los cuales son utilizadas solas o en combinación con cualquiera una o más estrategias descritas aqu í (por ejemplo, cualquiera una, dos, tres o cuatro de: optimización de codón, reconocimiento del organelo, mejoramiento de la competencia de la sintasa del PUFA para malonil CoA (por ejemplo, mediante la inhibición de FAS) , y/o la expresión de una o más aciltransferasas o las enzimas relacionadas) , para incrementar la producción del PUFA y/o la acumulación en un hospedador heterólogo.
Algunas modalidades de la invención se refieren al objetivo de expresión de las enzimas de la sintasa del PUFA, de la PPTasa, y/o cualquiera una o más de las proteínas accesorias y/o las modificaciones genéticas reconocidas para uno o más organelos del hospedador. Por ejemplo, en algunas modalidades, el sistema de expresión de la sintasa del PUFA y de la PPTasa, puede ser reconocido hacia el plasto o hacia una planta. En algunas modalidades, la expresión de la sintasa del PUFA y de la PPTasa, es reconocida hacia el citosol. En algunas modalidades, la expresión de la sintasa del PUFA y de la PPTasa es reconocida hacia ambos, el plasto y el citosol de una planta. En cualquiera de estas modalidades, otros objetivos pueden ser dirigidos hacia el plasto o el citosol.
En algunas modalidades, las acil-CoA sintetasas son expresadas en el citosol para convertir el DHA y/u otros ácidos grasos libres LC-PU FA en acil-CoAs que, a su vez, pueden ser utilizadas por la aciltransferasas.
Una variedad de secuencias de reconocimiento de plastos son conocidas en la téenica, y pueden ser usadas en las modalidades, donde el hospedador heterólogo es una planta o célula vegetal, y dondel reconocimiento hacia el plasto es deseada.
La presente invención incluye el uso del reconocimiento de los organelos (por ejemplo, del plasto o del cloroplasto en las plantas), con la expresión de una sintasa del PU FA como descrito aquí y con un PPTasa exógena, los cuales son utilizados solo o en combinación con cualquiera de una o más estrategias descritas aquí (por ejemplo, cualquiera una, dos, tres o cuatro de optimización de codón, mejoramiento de la competencia de la sintasa del PUFA para malonil-CoA (por ejemplo, mediante la inhibición de FAS) , la expresión de una o más de acil-CoA sintetasas, y/o la expresión de una o más aciltransferasas o las enzimas relacionadas), para incrementar la producción del PUFA y/o la acumulación en un hospedador heterólogo.
El reconocimiento de los productos de genéticos con respecto al plasto o cloroplasto, es controlada mediante una secuencia de señal encontrada en el extremo terminal amino de varias proteínas, y la cual es separada durante el importe produciendo la proteína madura (por ejemplo, en consideración a el reconocimiento del cloroplasto, véase, por ejemplo, Comai et al. , J. Biol. Chem. 263: 1 51 04-15109 ( 1988)). Estas secuencias de señal pueden ser fundidas en productos de genéticos heterólogos para efectuar el importe de los productos heterólogos dentro del cloroplasto (van den Broeck et al. Nature 313:358-363 ( 1985)). La codificación del ADN para las secuencias de señal apropiadas, puede ser aislada desde los ADNcs que codifica la proteína RUBISCO, la proteína CAB, la enzima EPSP sintasa, la proteína GS2 y muchas otras proteínas, las cuales son conocidas por estar localizadas en el cloroplasto.
En algunas modalidades de la invención, la localización de las proteínas empleadas en la invención, está dirigida a una cámara subcelular, por ejemplo, al plásmido o cloroplasto. Las proteínas pueden ser dirigidas hacia el cloroplasto mediante la inclusión en su terminal amino un péptido de tránsito del cloroplasto (CTP). Similarmente, las proteínas pueden ser dirigidas hacia el plasto mediante la inclusión en su terminal N de un péptido de tránsito o de señalización del plasto.
Las proteínas reconocidas del cloroplasto, que se presentan de forma natural , sintetizadas como las proteínas precursoras más grandes que contienen un péptido de reconocimiento del cloroplasto en terminal amino, dirigiendo el precursor hacia la maqumaria de importe del cloroplasto, son bien conocidos en la téenica. Los péptidos de reconocimiento del cloroplasto son separados, generalmente, mediante las endoproteasas específicas ubicadas dentro del organelos del cloroplasto, liberando así el maduro reconocido y puede activar la enzima del precursor dentro del medio del cloroplasto. Los ejemplos de las secuencias codificantes de peptidos, los cuales son adecuados para la dirección del gen o producto de gen hacia el cloroplasto o plasto de la células vegetales, incluyen la petunia EPSPS CTP, el Arabidopsis EPSPS CTP2 y el intrón, y otros conocidos por aquellas personas experimentadas en la téenica. Tales secuencias de reconocimiento, provistas para la proteína expresada deseada con el fin de ser transferida a la estructura de la célula, en la cual funciona mayormente efectiva, o mediante la transferencia de la proteína expresada deseada hacia las áreas de la célula, en la cual , están concentrados los procesos celulares necesarios para la función fenotípica deseada. Los ejemplos específicos de los péptidos de reconocimiento del cloroplasto son bien conocidos en la técnica, e incluyen el péptido de tránsito ats 1 A de subunidad pequeña de ribulosa bisfosfato-carboxilasa de Arabidopsis thaliana, un péptido de tránsito EPSPS de Arabidopsis thaliana, y un péptido de tránsito de de subunidad pequeña de ribulosa bisfosfato-carboxilasa de Zea maize.
Un péptido de tránsito optimizado como descrito, por ejemplo, por van den Broeck et al. , Nature, 313: 358-363 ( 1985). Las secuencias de señal procariótica y eucariótica están reveladas, por ejemplo, por Michaelis et al. , Ann. Rev. Microbiol. 36:425 ( 1982). Los ejemplos adicionales de los péptidos de tránsito que pueden ser usados en la invención incluyen, los peptidos de tránsito del cloroplasto, tal como aquellos descritos en Von Heijne et al. , Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126 (1991 ) ; Mazur et al. , Plant Physiol. 85: 1 1 10 (1987) ; Vorst et al. , Gene 65:59 ( 1988). Chen & Jagendorf ( J . Biol. Chem. 268:2363-2367 (1 993)) han descrito el uso de un péptido de tránsito del cloroplasto para el importe de un transgén heterólogo. Este péptido usado, es el péptido de tránsito del gen rbcS de Nicotiana plumbaginifolia (Poulsen et al. Mol. Gen. Genet. 205: 1 93-200 ( 1986)). Un CTP que ha funcionado aquí para localizar las proteínas heterólogas con el cloroplasto, fue derivado de la acil-ACP tioesterasa de Brassica napus.
Un medio alternativo para la localización de los genes hacia el cloroplasto o plasto incluyen la transformación del cloroplasto o del plasto. Las plantas recom binantes pueden ser producidas donde solamente el ADN del cloroplasto ha sido alterado, con el fin de incorporar las moléculas previstas en esta solicitud. Los promotores que funcionan en los cloroplastos son conocidos en la téenica (Hanlcy- Bowden et al. , Trends in Biochemical Sciences 12:67-70 (1987)) . Los métodos y las composiciones para obtener la células que contienen cloroplastos en donde el ADN heterólogo ha sido insertado, han sido descritos, por ejemplo, por Daniell et al. (Patente norteamericana no. 5.693.507) y Maliga et al. (Patente norteamericana no. 5.451.513) .
Combinaciones de Estrategias De acuerdo con la presente invención, en la producción de un hospedador heterólogo para la producción y la acumulación de uno o más PUFA objetivo, puede ser usada cualquiera una o más (cualquiera combinación) de las estrategias descritas aqu í para el mejoramiento de la producción y/o de la acumulación de los PU FA en el hospedador. De hecho, se prevé que varias combinaciones de estrategias serán aditivas o sinérgicas y proveen la producción y/o la acumulación de los PU FA mejorada en com paración con la ausencia de una o más de tales estrategias. De hecho, los Ejemplos proveen estrategias ejemplares para la producción de los PUFA en un organismo hospedador.
Cualquiera planta o células vegetales usando estas combinaciones o modificaciones, o cualquiera otra modificación o combinación de modificaciones descritas aquí, están abarcados por la invención . En algunas modalidades, tal una planta ha sido modificada, además genéticamente, para expresar una proteína accesoria como descrito aquí, para el mejoramiento de la producción y/o acumulación de los PU FA (u otros productos bioactivos de la sintasa del PUFA) por el hospedador (por ejemplo, ACoAS, GPAT, LPAAT, DAGAT o acetil CoA carboxilasa (ACCasa)) . Además, cualquier célula u organismo hospedador usando cualquiera de las modificaciones o combinación de las modificaciones descritas aquí, están abarcados por la invención, como son cualquiera de los productos derivados de tal célula u organismos, Incluyendo la semilla o el aceite que comprende los PUFA objetivos.
En algunas modalidades, las plantas para modificar genéticamente de acuerdo con la presente invención (por ejemplo, las células hospedadoras vegetales) incluyen , pero no está limitado a, cualquiera de las plantas más altas, incluyendo ambas plantas las dicotiledóneas y las monocotiledóneas y, particularmente, las plantas comestibles, incluyendo las plantas de cultivo y, especialmente, las plantas usadas por sus aceites. Tales plantas pueden incluir, pero no están limitadas a, por ejemplo: el frijol de soya, la colza, la linaza, el maíz, el cártamo, el girasol y el tabaco. Por consiguiente, cualquiera especie vegetal o célula vegetal puede ser seleccionada . En algunas modalidades, la planta es de la familia Fabaceae ( Leguminosae , familia de las leguminosas, familia de los chícharos, familia de los frijoles o pulse family) . En algunas modalidades, la planta es del género Glycine. En algunas modalidades, la planta es Glycine albicans, Glycine aphyonota, Glycine arenari , Glycine argyrea , Glycine canescens, Glycine clandestine, Glycine curvata, Glycine cyrtoloba, Glycine fálcate, Glycine gracei, Glycine hirticaulis, Glycine hirticaulis subsp. leptosa, Glycine lactovirens, Glycine latifolia, Glycine latrobeana, Glycine microphylla, Glycine montis-douglas, Glycine peratosa, Glycine pescadrensis, Glycine pindanica, Gycine pullenii, Glycine rubiginosa, Glycine stenophita, Glycine syndetika, Glycine tabacina, Glycine tomentella, Glycine soja, o Glycine max (el frijol de soya). En algunas modalidades, la planta es el cacahuate, el poroto ( Phaseolus vulgaris), el haba ( Vicia faba) o la arveja ( Pisum sativum) .
"Partes vegetales," como es usado aquí, incluye cualquiera de las partes de una planta, incluyendo, pero no limitado a, las semillas (incluyendo las sem illas maduras y las semillas inmaduras), el polen, los embriones, las flores, las frutas, los brotes, las hojas, las raíces, los tallos, los explantes, etc. En algunas modalidades, una planta que ha sido genéticamente modificada tiene un genoma, el cual es modificado (por ejemplo, mutado o cambiado) a partir de su forma normal (por ejemplo, tipo silvestre o que se presenta de forma natural), de manera que el resultado deseado es logrado (por ejemplo, una sintasa del PUFA incrementada o modificada y/o la producción y/o la acumulación de un producto deseado usando la sintasa del PU FA). En algunas modalidades, la modificación genética de una planta puede ser lograda usando el un desarrollo de cepa clásico y/o las téenicas de genética molecular. Los métodos para la producción de una planta transgénica, donde una molécula del ácido nucleico recombinante que codifica una secuencia de aminoácidos deseada, es incorporada dentro del genoma vegetal, son conocidos en la técnica. En algunas modalidades, una planta para modificar genéticamente de acuerdo con la presente invención , es una planta adecuada para el consumo de los animales, incluyendo los seres humanos.
Las líneas vegetales a partir de estas plantas, optimizada para un rasgo particularmente deseable, por ejemplo, resistencia a las enfermedades, fácil transformación vegetal , contenido de aceite o perfil , etc. , pueden ser producidas, seleccionadas o identificadas. En algunas modalidades, las líneas vegetales pueden ser seleccionadas a través de la reproducción vegetal, o a través de los métodos, tal como la reproducción asistida por marcadores y la labranza. En algunas modalidades, los cultivos de células vegetales pueden ser usados y, por ejemplo, y no son producidos dentro de las plantas diferenciadas y cultivadas usando las prácticas agrícolas comunes, pero en su lugar se producen y se mantienen en un medio líquido.
En algunas modalidades, la planta puede ser una planta de semilla oleaginosa, donde las semillas oleaginosas, y/o el aceite en las sem illas oleaginosas contienen los PUFA producidos por la sintasa del PUFA. En algunas modalidades, tales aceites pueden contener una cantidad detectable de al menos un PU FA primario u objetivo, que es el producto de la sintasa del PUFA. En algunas modalidades, tales aceites pueden estar sustancialmente libres de un intermediario o sub-productos, que no son productos del PUFA primario u objetivo, y que no son producidos de forma natural mediante un sistema FAS endógeno, en las plantas de tipo silvestre (por ejemplo, plantas de tipo silvestre que producen algunos PU FA de largo de cadena mediano o más corta, tal como los PUFA de 18 carbonos, a través del sistema FAS, pero ellos serán ácidos grasos nuevos o adicionales, producidos en la planta como un resultado de modificación genética con una sintasa del PU FA).
Con respecto a la producción de las plantas modificadas genéticamente, los métodos para la manipulación genética de las plantas son bien conocidos en la téenica. Por ejemplo, numeroso métodos para la transformación vegetal han sido desarrollados, incluyendo los protocolos de transformación biológica y física para las plantas dicotiledóneas, así como también las plantas monocotiledóneas (por ejemplo, Goto-Fumiyuki et al. , Nature Biotech 17:282-286 ( 1999); Miki et al. , Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology ( Métodos en biología molecular vegetal y biotecnología) , Glick, B. R. and Thompson, J . E. Eds. , CRC Press, Inc. , Boca Ratón, pp. 67-88 (1993). En adición, los vectores y los métodos de cultivo in vitro para la células vegetales o la transformación del tej ido y la regeneración de las plantas, están disponibles, por ejemplo, en Gruber et al. , Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology ( Métodos en biología molecular vegetal y biotecnología), Glick, B. R. y Thompson, J . E. Eds. , CRC Press, I nc. , Boca Ratón, pp. 89-1 19 (1993).
La presente invención concierne a una molécula de ácido nucleico aislada, que comprende una secuencia del ácido nucleico seleccionado desde SEQ I D NO: 6-10, así como también a una molécula de ácido nucleico aislada, que comprende una modificación o mutación de tal una secuencia, como descrito aquí. La presente invención concierne a los polipéptidos aislados, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado desde SEQ ID NO: 1 -5, así como también un polipéptido aislado, que comprende una modificación o mutación, o tal una secuencia como descrito aquí.
La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB7361 . La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB7362. La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB7363. La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB7365. La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB7368. La presente invención incluye, un vector de expresión recom binante pDAB7369. La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB7370. La presente invención incluye, un vector de expresión recom binante pDAB 100518. La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB101476. La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB9166. La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB9167. La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB7379. La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB7380. La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB9323. La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB9330. La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB9337. La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB9338. La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB9344. La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB9396. La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB101412. La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB7733. La presente invención incluye, un vector de expresión re combinante pDAB7734. La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB101493. La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB 109507. La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB 109508. La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB109509. La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB9151 . La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB 108207. La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB 108208. La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB108209. La presente invención incluye, un vector de expresión recom binante pDAB9159. La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB9147. La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB108224. La presente invención incluye, un vector de expresión recombinante pDAB 1 08225.
La presente invención incluye, una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB7361 . La presente invención incluye, una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB7362. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recom binante pDAB7363. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB7365. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB7368. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB7369. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB7370. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB100518. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB101476. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB9166. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB91 67.
La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB7379. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB7380. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB9323. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB9330. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB9337. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB9338. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB9344. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB9396. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB101412. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tej ido, la sem illa o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB7733. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB7734.
La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB101493. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB109507. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB109508. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB 109509. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tej ido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recom binante pDAB9151 . La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB 108207. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tej ido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB 108208. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB 108209. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB9159. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB9147. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recombinante pDAB 108224. La presente invención incluye una planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, que comprende un vector de expresión recom binante pDAB108225.
Como es usado aquí, el término "transfección" es usado para referirse a cualquiera de los métodos, mediante los cuales una molécula de ácido nucleico exógena (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico recombinante), puede ser insertada dentro de la célula. El término "transformación" puede ser usado de forma intercambiable con el término "transfección", cuando tal término es usado para referirse a la introducción de las moléculas del ácido nucleico dentro de las células microbianas, tal como las algas, las bacterias y la levadura, o dentro de las células vegetales. En el sistema vegetal y en el sistema microbiano, el término "transformación" es usado para describir un cambio hereditario, debido a la adquisición de los ácido nucleicos exógenos mediante los microorganismos o plantas, y es esencialmente sinónimo con el término "transfección." En algunas modalidades, las téenicas de la transfección incluyen, pero no están limitados a, la transformación, el bombardeo de partículas, la difusión, el transporte activo, la sonicación de baño, la electroporación, la micromyección, la lipofección, la adsorción , la infección y la fusión de protoplastos.
U n método ampliamente utilizado para la introducción de un vector de expresión dentro de las plantas, está basado en el sistema de transformación natural de Agrobacterium . Horsch et al. , Science 227: 1229 ( 1985). A. tumefaciens y A. rhizogenes son bacterias de suelo patógenas vegetales, conocidas por ser útiles para las células vegetales transformadas genéticamente. Los plásmidos Ti y Ri de A. tumefaciens y A. rhizogenes, respectivamente, portan los genes responsables para la transformación genética vegetal. Kado, C. I . , Crit. Rev. Plant. Sci. 10: 1 ( 1991 ). Las descripciones de los sistemas de vector de Agrobacterium y los métodos para transferir el gen mediado por Agrobacterium, también están disponibles, por ejemplo, Gruber et al. , supra, Miki et al. , supra, Moloncy et al. , Plant Cell Reports 8: 238 ( 1989), y las patentes norteamericanas nos. N° 4.940.838 y 5.464.763.
Otro método conocido para la transformación vegetal, es la transformación mediada por microproyectiles, donde el ADN es portado en la superficie de los microproyectiles. En este método, el vector de expresión es introducido dentro de los tejidos vegetales con un dispositivo biolistico, que acelera los microproyectiles a velocidades suficientes para penetrar las paredes de la células vegetales y de las membranas. Sanford et al. , Part. Sci. Technol. 5:27 ( 1987) , Sanford, J. C, Trends Biotech. 6:299 ( 1988) , Sanford, J . C, Physiol. Plant 79:206 ( 1990), Klein et al. , Biotechnology 10: 268 (1992).
Aún otro método para la entrega física del ADN a las plantas, es la sonicación de las células objetivo. Zhang et al. , Bio/Technology 9:996 (1991 ). También, la fusión del liposoma o del esferoplasto, ha sido usada con el fin de introducir los vectores de expresión dentro de las plantas. Deshayes et al. , EMBO J. , 4:2731 ( 1985) , Christou et al. , Proc Nati. Acad. Sci. USA 84:3962 ( 1987) . La captación directa del ADN dentro del protoplasto usando la precipitación de CaCI2, el polivinilalcohol o la po li-L-orn ¡tina , también han sido reportados. Hain et al. , Mol. Gen. Genet. 199: 161 (1985) y Draper et al., Plant Cell Physiol. 23:451 (1982). La electroporación de los protoplastos y de las células y de los tej idos enteros, también han sido descritos. Donn et al. , Abstráete of Vl lth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC ( Abstractos del Vil Congreso Internacional sobre Células vegetales y Cultivo de Tejidos), A2-38, p. 53 ( 1990); D'Hallum et al. , Plant Cell 4: 1495-1505 (1992) y Spencer et al. , Plant Mol. Biol. 24: 51 -61 (1 994). Adicionalmente, los estambres de carburo de silicio (Kaepler et al. , 1990, Plant Cell Reports) y en la transformación vegetal, por ejemplo, también puede ser usada una metodolog ía de inmersión floral (Clough and Bent, Plant J . 16:735-743 ( 1998)). La metodolog ía exacta de la transformación vegetal, puede variar de alguna manera dependiendo de las especies de las plantas seleccionadas y el tipo de células vegetales seleccionada para la transformación (por ejemplo, los tipos de célula derivados de las plántulas, tal como los hipocotiledóneos y los cotiledóneos o el tejido embriónico) .
Siguiendo la introducción de la construcción genética dentro de las células vegetales, las células vegetales se pueden desarrollar hasta que aparezca el tejido de diferenciación , tal como los brotes y las raíces, entonces pueden ser generadas las plantas maduras. En algunas modalidades, puede ser generada una pluralidad vegetal. Las metodolog ías para la regeneración de las plantas, son conocidas por aquellas personas experimentadas en la téenica, y pueden ser encontradas, por ejemplo, en: Plant Cell and Tissue Culture, ( Cultivo de células y tejidos vegetales) 1994, Vasil and Thorpe Eds. Kluwer Academic Publishers y en : Plant Cell Culture Protocols ( Protocolos de cultivo de células vegetales) (Methods ¡n Molecular Biology) ( Métodos en Biología Molecular) 1 1 1 , 1999 Hall Eds Humana Press).
En algunas modalidades, una planta genéticamente modificada descrita aquí, puede ser cultivada en un medio de fermentación, o desarrollada en un medio adecuado, tal como tierra. En algunas modalidades, un medio de crecimiento adecuado para las plantas más altas, puede incluir cualquier medio de cultivo para las plantas, incluyendo, pero no limitado a, tierra, arena, cualquier otro medio particular que soporte el crecimiento de la raíz (por ejemplo, la vermiculita, la perlita, etc. ) o un cultivo hidropónico, así como la luz apropiada, el agua y los suplementos nutricionales, los cuales optimizan el crecim iento vegetal más alta.
Será apreciado por una persona experimentada en la téenica, que el uso de las tecnolog ías del ADN recombinante, pueden mejorar el control de la expresión de las moléculas del ácido nucleico, transformado mediante la manipulación , por ejemplo, el número de copias de las moléculas del ácido nucleico dentro de la célula hospedadora, la eficiencia con la cual estas moléculas del ácido nucleico son transcritas, la eficiencia con la cual las transcripciones resultantes son traducidas, y la eficiencia de las modificaciones posteriores a la traducción. Adicionalmente, la secuencia promotora puede ser manipulada genéticamente para mejorar el nivel de expresión en comparación con el promotor original. Las técnicas recombinantes útiles para el control de la expresión de las moléculas del ácido nucleico incluyen, pero no están limitados a, la integración de las moléculas del ácido nucleico en uno o más cromosomas de la célula hospedadora, la adición de las secuencias de estabilidad del vector para los plásmidos, las sustituciones o las modificaciones de las señales de control de la transcripción (por ejemplo, los promotores, los operadores, los potenciadores), las sustituciones o las modificaciones de las señales de control de la traducción (por ejemplo, los sitios de enlace del ribosoma, las secuencias de Shine-Dalgarno) , la modificación de las moléculas del ácido nucleico que corresponde con el uso del codón de la célula hospedadora, y la eliminación de las secuencias que desestabilizan las transcripciones.
En algunas modalidades, una planta puede incluir aquellas plantas que son conocidas de producir compuestos, usados como agentes farmacéuticos, agentes saborizantes, agentes nutracéutícos, ingredientes de los alimentos funcionales o agentes cosméticamente activos, o las plantas que son manipuladas genéticamente para producir estos compuestos/agentes.
Todas estas modalidades de la invención , se aplican a la discusión de cualquier de los organismos genéticamente modificados y los métodos de producción y el uso de tales organismos como descrito aquí.
Productos a partir de los Organismos Modificados Genéticamente En algunas modalidades, un organismo modificado genéticamente de la invención produce uno o más ácidos grasos poliinsaturados incluyendo, pero no limitado a, EPA (C20:5, n-3), DHA ( C 22 : 6 , n-3), DPA (C22: 5, n-6 ó n-3) , ARA (C20:4, n-6) , GLA (Cl 8:3, n-6) , ALA (C 18: 3, n-3) , y/o SDA (C 18:4, n-3)), y en algunas modalidades, uno o más PUFA de cadena más larga, pero no limitado a, EPA (C20: 5, n-3), DHA (C22: 6, n-3) , DPA (C22: 5, n-6 ó n-3), o DTA (C22 :4, n-6), o cualquiera combinación entre ellos. En algunas modalidades, una planta genéticamente modificada de la invención, produce uno o más ácidos grasos poliinsaturados incluyendo, pero no limitado, EPA (C20:5, n-3), DHA (C22:6, n-3) , y/o DPA ( C 22 : 5 , n-6 ó n-3), o cualquiera combinación entre sí. En algunas modalidades, una planta genéticamente modificada de la invención, no tiene propiedades oleicas.
En algunas modalidades, un organismo modificado genéticamente es una planta que ha sido genéticamente modificados para expresar, de forma recombinante, una sintasa del PUFA y un PPTasa, como descrito aqu í. En algunas modalidades, tal una planta, ha sido genéticamente modificada, además, para expresar una proteína accesoria como descrito aquí, para el mejoramiento de la producción y/o de la acumulación de los PU FA (u otros productos bioactivos de la sintasa del PUFA) por el hospedador (por ejemplo, ACoAS, GPAT, LPAAT, DAGAT o ACCasa) .
Algunas modalidades de la presente invención incluyen la producción de los ácidos grasos poliinsaturados de longitud de cadena deseada, y los números deseados de enlaces dobles y, por extensión, de las semillas de aceite y de los aceites obtenidos a partir vegetal genéticamente modificada descrita aqu í, (por ejemplo, obtenida a partir del aceite o de las semillas de tales plantas) que comprende estos PUFA. Los ejemplos de los PUFA que pueden ser producidos mediante la presente invención incluyen, pero no están limitados a, DHA (ácido docosahexaenoico (C22:6, n-3)), ARA (ácido eicosatetraenoico o ácido araquidónico (C20:4, n-6)), DPA (ácido docosapentaenoico (C22: 5, n-6 ó n-3)), y EPA (ácido eicosapentaenoico (C20:5, n-3)), y cualquiera combinación entre ellos. La presente invención permite para realizar la producción de los lípidos disponibles comercialmente, enriquecidos en un uno o más de los PUFA deseados (primario u objetivo), mediante el desarrollo de las plantas modificadas genéticamente a través del uso de una sintasa del PUFA que produce los PUFA.
En algunas modalidades, una sintasa del PUFA dada, derivada a partir de un organismo particular, producirá los PUFAparticulares, de manera que la selección de una sintasa del PUFA, a partir de un organismo particular, tendrá por resultado la producción de los PUFA primarios u objetivos especificados. En algunas modalidades, la relación de los PUFA puede diferir dependiendo de la selección de la sintasa del PU FA particular, y en cómo ese sistema responde a las condiciones especificas en la cual está expresado. Por ejemplo, el uso de la sintasa del PUFA de Thraustochytrium 23 B (ATCC No. 20892) también puede tener por resultado la producción del DHA y del DPA(n-6) como los PUFA primario u objetivo; sin em bargo, en el caso de Thraustochytrium 23B, la relación del DHA con respecto al DPA(n-6) es 10: 1 (y puede estar en el rango desde 8: 1 hasta 40: 1 ), mientras que en Schizochytrium, la relación es, típicamente, 2.5: 1 . En algunas modalidades, una sintasa del PUFA dada, puede ser modificada mediante la combinación de las proteínas y de los dominios desde diferentes sintasas del PUFA, o bien uno puede modificar un dominio o proteína de una sintasa del PUFA dado, con el fin de cambiar el producto PUFA objetivo y/o las relaciones.
En algunas modalidades, con referencia a "productos intermediarios" o "productos secundarios" de un sistema de enzima que produce los PUFA, se refiere a cualquiera de los productos y, particularmente, a los productos de los ácidos grasos, que son producidos mediante el sistema de enzima, como un resultado de la producción de los PUFAprimario u objetivo del sistema, pero los cuales no son los PUFAprimarios u objetivos. En algunas modalidades, el intermediario y los productos secundarios, pueden incluir los ácidos grasos no objetivos, que son producidos de forma natural mediante una planta de tipo silvestre, o mediante la planta madre usada como un receptor para la modificación genética indicada, pero son ahora clasificados como intermediario o productos secundarios, debido a que ellos producen en niveles más altos, como un resultado de la modificación genética, en comparación con los niveles producidos por la planta de tipo silvestre, o mediante la planta madre usada como un receptor para la modificación genética indicada. En algunas modalidades, un PU FA primario u objetivo de un sistema de enzima, puede ser un intermediario de un sistema de enzima diferente, donde el producto primario u objetivo, es un PUFA diferente. Por ejemplo, cuando es usado una vía estándar con el fin de producir el EPA, los ácidos grasos tal como GLA, DGLA y SDA son producidos como productos intermediarios en cantidades significativas (por ejemplo, Publicación de Solicitud norteamericana no. 2004/0172682). Sim ilarmente, y también ilustrado por la Publicación de Solicitud norteamericana no. 2004/0172682, cuando es usado una vía estándar para producir el DHA, en adición a los ácidos grasos mencionados anteriormente, el ETA y el EPA (principalmente, el PU FA objetivo en el primer ejemplo indicado anteriormente) puede ser producido en cantidades significativas y puede estar presente en cantidades significativamente más grandes en relación con el producto total del ácido graso que el PU FA objetivo propiamente tal.
En algunas modalidades, para producir los rendimientos significativamente altos de uno o más ácidos grasos poliinsaturados deseados, una planta puede ser genéticamente modificada para introducir un sistema de sintasa del PUFA dentro vegetal . Las plantas no son conocidas de contener de forma endógena una sintasa del PU FA y, por consiguiente, la presente invención representa una oportunidad para producir plantas con capacidades únicas de producción de ácido graso. La presente invención provee plantas manipuladas genéticamente para producir uno o más PU FA en la misma planta, incluyendo, pero no limitado a, EPA, DHA, DPA (n3 ó n6), ARA, GLA, SDA y otras, incluyendo cualquiera combinación entre ellos. La presente invención ofrece la capacidad de crear cualquiera uno de un número de "aceites de diseñador" en varias relaciones y formas. En algunas modalidades, el uso de una sintasa del PU FA, a partir de organismos marinos particulares descritos aqu í, pueden extender el rango de la producción del PU FA y producir satisfactoriamente tales PUFA, dentro de rangos de temperatura usados para el crecimiento de la mayoría de las plantas de cultivo.
En algunas modalidades, con el fin de estar "sustancialmente libre" de intermediario o de productos secundarios del sistema para la sintetización de los PUFA, o no tener intermediario o productos secundarios presentes en cantidades sustanciales, significa que cualquier intermediario o producto secundarios de los ácidos grasos (PUFA no objetivos), que son producidos en la planta genéticamente modificada (y/o partes de las plantas y/o fracción de aceite de semilla), como un resultado de la introducción o la presencia del sistema de enzima para la producción de los PUFA (por ejemplo, que no son producidos mediante la planta de tipo silvestre, o la planta madre usada como un receptor para la modificación genética indicada), puede estar presente en una cantidad que es menos que 10% en peso del total de los ácidos grasos, menos que 9% en peso del total de los ácidos grasos, menos que 8% en peso del total de los ácidos grasos, menos que 7% en peso del total de los ácidos grasos, menos que 6% en peso del total de los ácidos grasos, menos que 5% en peso del total de los ácidos grasos, menos que 4% en peso del total de los ácidos grasos, menos que 3% en peso del total de los ácidos grasos, menos que 2% en peso del total de los ácidos grasos, menos que 1 % en peso del total de los ácidos grasos, o menos que 0.5% en peso del total de los ácidos grasos.
En algunas modalidades, una planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, de la invención o un aceite o una semilla obtenidos a partir de una planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, de la invención , comprende cantidades detectables del DHA (ácido docosahexaenoico (C22:6, n-3)), del DPA(n-6) (ácido docosapentaenoico (C22: 5 n- 6)) o del EPA (ácido eicosapentaenoico (C20:5, n-3)) . En algunas modalidades, una planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, de la invención , o un aceite o una semilla obtenidos a partir de una planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, de la invención, comprende al menos 0.01 % , al menos 0.02%, al menos 0.03%, al menos 0.04%, al menos 0.05%, al menos 0.06%, al menos 0.07%, al menos 0.08% , al menos 0.09% , al menos 0.1 % , al menos 0.2%, al menos 0.3%, al menos 0.4% , al menos 0.5%, al menos 0.6% , al menos 0.7% , al menos 0.8% , al menos 0.9%, al menos 1 %, al menos 1 .5%, al menos 2%, al menos 2.5%, al menos 3%, al menos 3.5%), al menos 4%, al menos 4.5%, al menos 5%, al menos 5.5%, al menos 6%, al menos 6.5% , al menos 7%, al menos 7.5%, al menos 8% , al menos 8.5%, al menos 9% , al menos 9.5% , al menos 10% , al menos 10.5%, al menos 1 1 %, al menos 1 1.5%, al menos 12%, al menos 12.5%, al menos 13%, al menos 13.5% , al menos 14% , al menos 14.5% ó al menos 1 5% del DHA en peso del total de los ácidos grasos. Los rangos útiles pueden ser seleccionados entre cualquiera de estos valores, por ejemplo, desde 0.01 % hasta 15%, desde 0.05% hasta 10% y desde 1 % hasta 5% del DHA en peso del total de los ácidos grasos.
En algunas modalidades, una planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, de la invención, o un aceite o una semilla obtenidos a partir de una planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, de la invención, comprende al menos 0.01 %, al menos 0.02%, al menos 0.03%, al menos 0.04%, al menos 0.05%, al menos 0.06%, al menos 0.07%, al menos 0.08%, al menos 0.09% , al menos 0.1 %, al menos 0.2% , al menos 0.3%, al menos 0.4%, al menos 0.5%, al menos 0.6% , al menos 0.7%, al menos 0.8% , al menos 0.9%, al menos 1 %, al menos 1 .5%, al menos 2%, al menos 2.5%, al menos 3%, al menos 3.5%, al menos 4%, al menos 4.5%, al menos 5%, al menos 5.5%, al menos 6%, al menos 6.5%, al menos 7%, al menos 7.5%, al menos 8%, al menos 8.5%, al menos 9%, al menos 9.5% ó al menos 10% del EPA en peso del total de los ácidos grasos. Los rangos útiles pueden ser seleccionados entre cualquiera de estos valores, por ejemplo, desde 0.01 % hasta 10%, desde 0.05% hasta 5% y desde 0.1 % hasta 5% del EPA en peso del total de los ácidos grasos.
En algunas modalidades, una planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, de la invención o un aceite o la semilla obtenidos a partir de una planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, de la invención, comprende al menos 0.01 %, al menos 0.02%, al menos 0.03%, al menos 0.04%, al menos 0.05%, al menos 0.06%, al menos 0.07%, al menos 0.08%, al menos 0.09%, al menos 0.1 %, al menos 0.2%, al menos 0.3%, al menos 0.4%, al menos 0.5%, al menos 0.6%, al menos 0.7%, al menos 0.8%, al menos 0.9%, al menos 1 %, al menos 1 .5%, al menos 2%, al menos 2.5%, al menos 3%, al menos 3.5%, al menos 4%, al menos 4.5%, al menos 5%, al menos 5.5%, al menos 6%, al menos 6.5%, al menos 7%, al menos 7.5%, al menos 8%, al menos 8.5%, al menos 9%, al menos 9.5% ó al menos 10% del DPA(n-6) en peso del total de los ácidos grasos. Los rangos útiles pueden ser seleccionados entre cualquiera de estos valores, por ejemplo, desde 0.01 % hasta 10%, desde 0.01 % hasta 5%, desde 0.01 % hasta 1 %, desde 0.01 % hasta 0.05%, desde 0.05% hasta 5% y desde 0.1 % hasta 5% del DPA(n- 6) en peso del total de los ácidos grasos.
En algunas modalidades, una planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, de la invención, o un aceite o la semilla obtenidos a partir de una planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, de la invención, comprende la relación de EPA:DHA de al menos 1:1, al menos 1:1.5, al menos 1:2, al menos 1:2.5, al menos 1:3, al menos 1:3.5, al menos 1:4, al menos 1:4.5, al menos 1:5, al menos 1:5.5, al menos 1:6, al menos 1:6.5, al menos 1:7, al menos 1:7.5, al menos 1:8, al menos 1:8.5, al menos 1:9, al menos 1:10, al menos 1:11, al menos 1:12, al menos 1:13, al menos 1:14, al menos 1:15, al menos 1:16, al menos 1:17, al menos 1:18, al menos 1:19, al menos 1:20, al menos 1:21, al menos 1:22, al menos 1:23, al menos 1:24, al menos 1:25, al menos 1:26, al menos 1:27, al menos 1:28, al menos 1:29 ó al menos 1:30 en peso del total de los ácidos grasos. Los rangos útiles pueden ser seleccionados entre cualquiera de estos valores, por ejemplo, una relación de EPA:DHA desde 1:1 hasta 1:30, desde 1:1 hasta 1:25, desde 1:1 hasta 1:20, desde 1:1 hasta 1:15, desde 1:1 hasta 1:10, desde 1:1 hasta 1:5, desde 1:1 hasta 1:3 y desde 1:1 hasta 1:2 en peso del total de los ácidos grasos.
En algunas modalidades, una planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, de la invención, o un aceite o la semilla obtenidos a partir de una planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, de la invención, comprende una relación de DPA(n- 6):DHA de al menos 1:1, al menos 1:1.5, al menos 1:2, al menos 1:2.5, al menos 1:3, al menos 1:3.5, al menos 1:4, al menos 1:4.5, al menos 1:5, al menos 1:5.5, al menos 1:6, al menos 1:6.5, al menos 1:7, al menos 1:7.5, al menos 1:8, al menos 1:8.5, al menos 1:9 ó al menos 1:10 en peso del total de los ácidos grasos. Los rangos útiles pueden ser seleccionados entre cualquiera de estos valores, por ejemplo, una relación de DPA(n-6):DHA desde 1:1 hasta 1:10, desde 1:1 hasta 1:5, desde 1:1 hasta 1:3 y desde 1:1 hasta 1:2 en peso del total de los ácidos grasos.
En algunas modalidades, un aceite obtenido a partir de una planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, o la semilla de la invención, comprende al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% ó al menos 99% de triglicéridos en peso del aceite. En algunas modalidades, un aceite obtenido a partir de una planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, o la semilla de la invención, comprende desde 70% hasta 99% de triglicéridos en peso del aceite, desde 75% hasta 99% de triglicéridos en peso del aceite, desde 80% hasta 99% de triglicéridos en peso del aceite, desde 85% hasta 99% de triglicéridos en peso del aceite o desde 90% hasta 99% de triglicéridos en peso del aceite. Los métodos para la purificación y el análisis de un triglicérido, han sido descritos (por ejemplo, Ruiz-Gutierrez V and Barron LJ, J. Chromatogr. B. Biomed. Appl., 671:133-168, 1995).
En algunas modalidades, cuando el producto objetivo de un sistema de sintasa del PUFA es un PUFA de cadena larga, tal como el DHA, el DPA (n-6 ó n-3), o el EPA, los productos intermediarios y los productos secundarios que no están presentes en cantidades sustanciales en el total de lípidos de las plantas modificadas genéticamente, con tal un sistema de sintasa del PUFA puede incluir, pero no están limitados a: el ácido gamma-linolénico (GLA; 18:3, n-6); el ácido estearidónico (STA o SDA; 18:4, n-3); el ácido dihomo-gamma-linolénico (DGLA o HGLA; 20:3, n-6), el ácido araquidónico (ARA, C20:4, n-6); el ácido eicosatrienoico (ETA; 20:3, n-9) y varios otros productos intermediarios o secundarios, tal como 20:0; 20: 1 (D5); 20: 1 (D 1 1 ) ; 20:2 (D8.1 1 ); 20:2 (D1 1 .14); 20:3 (D5.1 1.14); 20:3 (D1 1.14.17); ácido de Mead (20:3; D5.8.1 1 ); ó 20:4 (D5.1 .14.17).
La modificación genética de una planta, de acuerdo con la presente invención, puede tener por resultado la producción de uno o más PUFA mediante la planta. En algunas modalidades, el perfil del PUFA y la relación de los PUFA producidos por la planta, no son necesariamente el mismo como el perfil del PUFA o la relación de los PUFA, producidos por los organismos a partir de los cuales la sintasa del PUFA fue derivado.
En algunas modalidades, una planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, de la presente invención, pueden ser manipulados con el fin de producir los PUFA a través de la actividad de la sintasa del PUFA. En algunas modalidades, los PUFA pueden ser recuperados a través de los procesos de purificación, los cuales extraen los compuestos de la planta, el descendiente, la celula, el tejido o parte de ellos. En algunas modalidades, los PUFA pueden ser recuperados mediante la cosecha de la planta , el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos. En algunas modalidades, los PUFA pueden ser recuperados mediante la cosecha del aceite de la planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos (por ejemplo, desde las semillas de aceite) o las semillas vegetales, el descendiente, la célula, el tejido, o parte de ellos. En algunas modalidades, la planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, también pueden ser consumidos en sus estados naturales o bien procesados ulteriormente en productos comestibles.
En algunas modalidades, una planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, de la invención, pueden producir uno o más ácidos grasos poliinsaturados. En algunas modalidades, la planta, el descendiente, la célula, el tejido, o parte de ellos, pueden producir (por ejemplo, en sus semillas maduras, si es una planta de semilla de aceite, o en el aceite de las semillas de una planta de semillas de aceite) al menos un PUFA (el PUFA objetivo), y donde el perfil total del ácido graso en la planta, o la parte vegetal que acumula los PUFA (por ejemplo, las semillas maduras, si la planta es una planta de semillas de aceite o el aceite de las semillas de una planta de semillas de aceite), comprende una cantidad detectadle de este PUFA o de estos PUFA. En algunas modalidades, el PUFA objetivo es al menos un PUFA de 20 carbonos y comprende al menos 3 enlaces dobles, al menos 4 enlaces dobles o al menos 5 enlaces dobles. En algunas modalidades, el PUFA objetivo puede ser un PUFA que no es producido de forma natural por la planta. En algunas modalidades, el perfil total del ácido graso en la planta, o en la parte vegetal que acumulan los PUFA (incluyendo el aceite de semilla vegetal), comprende al menos 0.1 % de los PUFAobjetivos en peso del total de los ácidos grasos, al menos 0.2%, al menos 0.3%, al menos 0.4%, al menos 0.5%, al menos 1 %, al menos 1 .5%, al menos 2%, al menos 2.5%, al menos 3%, al menos 3.5%, al menos 4%, al menos 4.5%, al menos 5%, al menos 5.5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, más que 75% de al menos un ácido graso poliinsaturado (el PUFA o PUFA objetivos) en peso del total de los ácidos grasos, o cualquier porcentaje desde 0.1 % hasta 75%, o más grande que 75% (de hasta 100% ó 100%), en incrementos de 0.1 %, de los PUFAobjetivo.
Como es usado aquí, con referencia a un porcentaje de la cantidad del PUFA, es el porcentaje en peso del total de los ácidos grasos extraídos, a menos que esté determinado de otra forma. En algunas modalidades, el total de los ácidos grasos son determinados mediante el análisis de cromatografía de gas (GC) de una preparación de metiléster del ácido grado (FAME), aunque la determinación del total de los ácidos grasos no está limitado a este método.
En algunas modalidades, el total de los ácidos grasos en una planta de la invención, (y/o el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos o fracción del aceite de semilla), pueden contener menos que 10% en peso del total de los ácidos grasos producidos por la planta, menos que 9% en peso del total de los ácidos grasos producidos por la planta, menos que 8% en peso del total de los ácidos grasos producidos por la planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, menos que 7% en peso del total de los ácidos grasos producidos por la planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, menos que 6% en peso del total de los ácidos grasos producidos por la planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, menos que 5% en peso del total de los ácidos grasos producidos por la planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, menos que 4% en peso del total de los ácidos grasos producidos por la planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, menos que 3% en peso del total de los ácidos grasos producidos por la planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, menos que 2% en peso del total de los ácidos grasos producidos por la planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, menos que 1 % en peso del total de los ácidos grasos producidos por la planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos de un ácido graso seleccionado entre el ácido gamma-linolénico (GLA; 18:3, n-6); el ácido estearidónico (STA o SDA; 18:4, n-3); el ácido dihomo-ga ma-linolénico (DGLA o HGLA; 20:3, n-6), el ácido araquidónico (ARA, C20:4, n-6); el ácido eicosatrienoico (ETA; 20:3, n-9) y varios otros ácidos grasos, tal como 20:0; 20: 1 (D5) ; 20: 1 (D1 1 ); 20:2 (D8.1 1 ); 20:2 (D1 1 .14); 20:3 (A5.1 1.14); 20:3 (D1 1 .14.17); ácido de Mead (20:3; D5.8.1 1 ); ó 20:4 (D5.1 .14.17).
La presente invención incluye cualquiera semilla producida por las plantas, los descendientes, las células, los tejidos o partes de ellos descritos aquí, así como cualquier aceite producido por una planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos o semilla de la presente invención. La presente invención también incluye cualquiera de los productos producidos usando las plantas, los descendientes, las células, los tejidos o partes de ellos, las semillas o los aceites, como descrito aquí.
Los usos y productos relacionados con los orqanismos modificados genéticamente de la invención La presente invención incluye un método para producir los PUFA mediante el crecimiento o cultivo de una planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, (por ejemplo, el frijol de soya) de la presente invención descrita en detalle anteriormente. En algunas modalidades, tal un método incluye, por ejemplo, el crecimiento en un medio ambiente adecuado, tal como tierra, una planta que tiene una modificación genética, como descrito previamente aquí y de acuerdo con la presente invención.
La presente invención incluye un método para producir un aceite, que comprende al menos un PUFA, que comprende la recuperación del aceite desde una planta, el descendiente, la celula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, de la invención, o desde una semilla de una planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, de la invención.
La presente invención incluye un método para producir un aceite, que comprende al menos un PUFA, que comprende el crecimiento de una planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, de la invención. La presente invención incluye un método para producir al menos un PUFA en un aceite de semilla, que comprende la recuperación de un aceite desde una semilla de una planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, de la invención. La presente invención incluye un método para producir al menos un PUFA en un aceite de semilla, que comprende el crecimiento de una planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, de la invención.
La presente invención incluye un método para proveer un suplemento o producto terapéutico, que contiene al menos un PUFA a un individuo en necesidad de él, que comprende la provisión al individuo en necesidad de él, de una planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, de la invención, un aceite de la invención, una semilla de la invención, un producto alimentario de la invención, un alimento funcional de la invención o un producto farmacéutico de la invención. La presente invención también incluye un método para producir una planta, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, de la invención, que comprende la transformación de una planta o células vegetales con (i) una secuencia del ácido nucleico que codifica un sistema de sintasa algácea del PUFA, que produce al menos un ácido graso poliinsaturado (PUFA); y (ii) una secuencia del ácido nucleico que codifica un fosfopanteteinil transferasa (PPTasa) que transfiere un cofactor de fosfopanteteinilo a un sistema de sintasa algácea del PUFA de dominio ACP. En algunas modalidades, el método comprende, además, la transformación vegetal o células vegetales con (iii) una secuencia del ácido nucleico que codifica un acil-CoA sintetasa (ACoAS) que cataliza la conversión de un PUFA de cadena larga de los ácidos grasos libres (FFA) en acil-CoA.
En algunas modalidades, el PUFA de tales métodos de la invención es el DHA, el DPA(n-6) y/o el EPA. En algunas modalidades, el aceite producido mediante tales métodos de la invención, es un aceite de soya. En algunas modalidades, el aceite producido mediante tales métodos de la invención, comprende desde 0.05% hasta 15% del DHA en peso del total de los ácidos grasos, o cualquiera cantidad o rango de ellos descritos ulteriormente aquí. En algunas modalidades, el aceite producido mediante tales métodos de la invención comprenden, además, desde 0.01 % hasta 5% del EPA en peso del total de los ácidos grasos, o cualquiera cantidad o rango de ellos descritos ulteriormente aquí. En algunas odalidades, el aceite producido mediante tales métodos de la invención comprende, además, desde 0.01 % hasta 5% del DPA(n-6) en peso del total de los ácidos grasos, o cualquiera cantidad o rango de ellos descritos ulteriormente aquí. En algunas modalidades, el aceite producido mediante tales métodos de la invención, comprende una relación de EPA: DHA desde 1 : 1 hasta 1 :30 en peso del total de los ácidos grasos, una relación de EPA: DHA desde 1 : 1 hasta 1 :3 en peso del total de los ácidos grasos, o cualquiera cantidad o rango de ellos descritos ulteriormente aquí. En algunas modalidades, el aceite producido mediante tales métodos de la invención comprende, además, una relación de DPA(n-6): DHA de 1 : 1 ó 1 : 10 en peso del total de los ácidos grasos, una relación de DPA(n-6): DHA desde 1 : 1 hasta 1 :3 en peso del total de los ácidos grasos, o cualquiera cantidad o rango de ellos descritos ulteriormente aquí.
La presente invención incluye, además, cualquiera de los organismos o partes de ellos descritos aquí (por ejemplo, las plantas, los descendientes, las células, los tejidos, las semillas, o partes de ellos (por ejemplo, semillas de aceite), o las preparaciones o fracciones de ellos), así como cualquiera de los aceites producidos por los organismos descritos aquí. La invención también incluye cualquiera de los productos producidos usando los organismos, partes de ellos, o los aceites descritos aquí.
La presente invención se refiere a un método para modificar un producto que contiene al menos un ácido graso, que comprende la adición al producto de un organismo, parte de él, o un aceite producido por un organismo modificado genéticamente, de acuerdo con la invención y como descrito aquí (por ejemplo, una planta, el descendiente, la célula, la semilla, el tejido o parte de ellos, que han sido genéticamente modificados, como descrito aquí). Cualquiera de los productos producidos mediante este método o, generalmente, que contiene cualquiera de los organismos, partes de ellos, o los aceites a partir de los organismos descritos aquí, también están abarcados por la invención.
En algunas modalidades, el producto es seleccionado desde los suplementos alimenticios y dietéticos, una formulación farmacéutica, una leche animal humanizada, una fórmula infantil, un alimento nutracéutico y un alimento funcional. Las formulaciones farmacéuticas adecuadas incluyen, pero no están limitados a, una formulación anti-inflamatoria, un agente quimioterapéutico, un excipiente activo, un fármaco para la osteoporosis, un antidepresivo, un anti-convulsionante, un fármaco anti -Helicobacter pylori, un fármaco para el tratamiento de la enfermedad neurodegenerativa, un fármaco para el tratamiento de la enfermedad degenerativa del hígado, un antibiótico y una formulación para reducir el colesterol. En algunas modalidades, el producto es usado para tratar una condición seleccionada entre la inflamación crónica, la inflamación aguda, el trastorno gastromtestinal, el cáncer, la caquexia (pérdida de peso producida por el cáncer), restenosis cardíaca, trastorno neurodegenerativo, trastorno degenerativo del hígado, trastorno de lípidos en la sangre, la osteoporosis, la osteoartritis, la enfermedad autommune, la preclampsia, el parto prematuro, la maculopatía relacionada con la edad, el trastorno pulmonar y el trastorno del peroxlsoma.
En algunas modalidades, el producto es un producto alimentario o producto de alimento funcional. Los productos alimentarios adecuados incluyen, pero no están limitados a, los productos de panadería fina, pan y panecillos, cereales de desayuno, queso procesado y sin procesar, los condimentos (ketchup, mayonesa, etc.), los productos dietéticos (leche, yogurt), budines y postres de gelatina, bebidas carbonatadas, los tés, mezclas de bebidas en polvo, productos de pescado procesado, bebidas basadas en frutas, goma de mascar, caramelo duro, productos dietéticos congelados, productos de carne procesados, nuez y unturas basadas en nueces, pasta, productos de aves procesados, jugos de carne y salsas, papas fritas y otras papas y frituras, chocolate y otros caramelos, sopas y mezclas de sopa, productos basados en soya (por ejemplo, leches, bebidas, cremas, sustitutos), unturas basadas en aceite vegetal y bebidas basadas en vegetales.
En algunas modalidades de la invención, el producto es una composición de alimento o comida, o un aditivo para una composición de alimento o comida, para un animal. El término "animal" incluye a los seres humanos y los no humanos. Los ejemplos sin limitación de animales son los no rumiantes (por ejemplo, los cerdos, las aves de corral o los peces) y los rumiantes (por ejemplo, las vacas, las ovejas y los caballos). El término alimento o composición de alimento significa cualquier compuesto, preparación, mezcla o composición adecuada para, o prevista para la ingesta por un animal.
En algunas modalidades, la invención está dirigida a una mezcla de aceite que comprende un aceite obtenido a partir de una planta, el descendiente, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, descritos aquí y otro aceite. En algunas modalidades, el otro aceite, es un aceite de semilla, aceite vegetal, aceite de pescado, aceite microbiano o las mezclas entre ellos.
En algunas modalidades, un aceite obtenido a partir de una planta, el descendiente, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, descrita aquí, puede ser procesada, además, para modificar los LC-PUFA en el aceite, por ejemplo, para formar ásteres y/o para purificar los LC-PUFA para propósitos medicinales.
Algunas modalidades de la presente invención, están dirigidas a un aceite de soya, que comprende desde 0.05% hasta 15% del DHA en peso del total de los ácidos grasos, o cualquier rango de ellos descritos ulteriormente aquí. En algunas modalidades, el aceite de soya comprende, además, desde 0.05% hasta 5% del EPA en peso del total de los ácidos grasos. En algunas modalidades, el aceite de soya comprende, además, desde 0.01 % hasta 5% del DPA(n-6) en peso del total de los ácidos grasos. En algunas modalidades, el aceite de soya tiene un perfil de ácido graso más grande que 3.5% del ácido alfa-linolenico en peso del total de los ácidos grasos, o cualquier rango de ellos descritos ulteriormente aquí. Algunas modalidades de la presente invención, están dirigidas a una composición que comprende un aceite de soya descrito aquí. En algunas modalidades, la composición que comprende un aceite de soya que comprende uno o más aceites. En algunas modalidades, la composición no contiene un PUFA (por ejemplo, DHA) desde una fuente que no es el frijol de soya.
Los objetivos adicionales, las ventajas y las nuevas características de esta invención, serán aparentes para aquellas personas experimentadas en la téenica, a partir de la examinación de los siguientes ejemplos de ellos, los cuales no están previstos de ser limitadores.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 La optimización del codón del OrfA de la sintasa del PUFA, el OrfB de la sintasa del PUFA, el OrfC de la sintasa del PUFA, la Acil-CoA sintetasa y el Hetl de 4’ fosfopanteteinil transferasa El análisis de las secuencias del ADN que codifica el OrfA de la sintasa del PUFA de Schizochytrium sp. ATCC_20888 (GenBank ID: AF378327, Gl: 158518688), el OrfB de la sintasa del PUFA de Schizochytrium sp. ATCC 20888 (GenBank ID: AF378328, Gl : 158518690), el OrfC quimérico de la sintasa del PUFA de Schizochytrium sp. ATCC 20888 y Thraustochytrium (Publicación de Solicitud norteamericanas nos. 2008/0022422) (también descrito como "OrfC híbrido”), la acil-CoA sintetasa de Schizochytrium sp.
ATCC 20888 (Publicación de Solicitud norteamericanas nos. 2007/0245431 ) y el Hetl de 4’ fosfopanteteinil transferasa de Nostoc sp. PCC 7120 (GenBank I D: P37695, Gl :20141367) revelaron la presencia de varios motivos de secuencias que contienen composiciones de codón no óptimas, que pueden ser perjudiciales para la expresión óptima vegetal. El diseño de los genes que codifica el OrfA de la sintasa del PUFA, el OrfB de la sintasa del PUFA, el OrfC quimérico de la sintasa del PUFA, la acil-CoA sintetasa y las proteínas del Hetl de 4’ fosfopanteteinil transferasa, fue optimizado para generar una secuencia de ADN que es más "como la planta" en la naturaleza, y en la cual, las modificaciones de secuencia no impiden la traducción o crean inestabilidad de ARNm a través de una composición de codón no óptimo.
Debido a la plasticidad, permitió mediante la redundancia/degeneración del código genético (por ejemplo, algunos aminoácidos son especificados por más que un codón), la evolución de los genomas en diferentes organismos o clases de organismos, ha tenido por resultado el uso diferencial de codones sinónimos. Esta "preferencia codónica" está reflejada en una composición base promedio de regiones que codifica la proteína. Por ejemplo, los organismos teniendo genomas con contenidos de G + C relativamente bajos, utiliza más codones teniendo A o T en la tercera posición de codones sinónimos, mientras que aquellos teniendo contenidos de G + C más altos, utilizan más codones teniendo G o C en la tercera posición. Además, es considerado que la presencia de codones "menores" dentro de un ARNm, puede reducir la tasa de traducción absoluta de ese ARNm, especialmente, cuando la abundancia relativa del ARNt cargado, correspondiendo a los codones menores, es baja. Una extensión de este razonamiento es que la disminución de la tasa de traducción por codones menores individuales, podría ser al menos aditivo para los codones menores múltiples. Por consiguiente, los ARNms teniendo contenidos relativos altos de codones menores, podrían tener tasas de traducción correspondientemente bajas de la proteína codificada.
En la ingeniería de los genes que codifica un OrfA de la síntasa del PUFA, un OrfB de la sintasa del PUFA, un OrfC quimérico de la sintasa del PUFA, una acil-CoA sintetasa y la proteína del Hetl de 4’ fosfopanteteinil transferasa, para la expresión en las plantas dicotiledóneas (tal como el tabaco, la soya, el algodón o la cañóla), los usos de los codones para la cañóla fueron accedidos desde las bases de datos disponibles para el público. (Tabla 1 ).
Tabla 1. Representación de un codón sinónimo en las regiones de codificación de las plantas dicotiledóneas de los genes Brassica napus (cañóla) (Columnas C y G). Valores para un conjunto de representación de codón preferido equilibrado para un diseño de gen sintético optimizado a la planta están en las Columnas D y H.
DNU - No se usa Para equilibrar la distribución de las elecciones de codón remanente para un aminoácido, fue calculada una representación de Promedio Ponderado para cada codón (Tabla 1 ) , usando la fórmula: % de Promedio Ponderado de C 1 = 1 /( % C 1 + %C2 + %C3 + etc. , ) x %C 1 x 100, donde C 1 es el codón en cuestión , y %C2 , %C3, etc. , representan los promedios de los valores en % la cañóla de los codones sinónimos remanentes (los valores en % promedio para los codones relevantes, son tomados desde las Columnas C y G) de la Tabla 1 . El valor en % del Promedio Ponderado para cada codón , está dado en las Columnas D y H de la Tabla 1 .
En el diseño de las regiones de codificación para la expresión de una planta, los codones primarios ("primera elección") preferidos por la planta, fue determinado, así como también la segunda , tercera, cuarta, etc. , elecciones de codones preferidos, cuando existen elecciones múltiples. Una nueva secuencia de ADN fue entonces diseñada, la cual codifica, esencialmente, la misma secuencia de aminoácidos de un OrfA de la sintasa del PUFA, un OrfB de la sintasa del PUFA, un OrfC de la sintasa del PUFA, una acil-CoA sintetasa y un Hetl de 4’ fosfopanteteinil transferasa, pero la cual difiere de la secuencia de ADN original (que codifica el OrfA de la sintasa del PUFA, el OrfB de la sintasa del PU FA, el OrfC quimérico de la sintasa del PU FA, la acil-CoA sintetasa y el Hetl de 4’ fosfopanteteinil transferasa) mediante la sustitución de los codones vegetales (primer preferido, segundo preferido, tercer preferido, o cuarto preferido, etc. , ) para especificar el aminoácido en cada posición dentro de la secuencia de aminoácidos.
Las nuevas secuencias fueron entonces analizadas con respecto a la restricción de sitos de enzima, creados mediante las modificaciones en la secuencia. Los sitios identificados fueron entonces modificados mediante el reemplazo de los codones por los codones preferidos elegidos primero, segundo, tercero o cuarto. La secuencia fue entonces analizada ulteriormente y modificada para reducir la frecuencia de dobletes TA o GC.
El análisis de estas secuencias revelaron que las nuevas secuencias de ADN que codifica esencialmente la secuencia de aminoácidos del OrfA de la sintasa del PU FA, el OrfB de la sintasa del PUFA, el OrfC quimérico de la sintasa del PUFA, la acil-CoA sintetasa y las proteínas del Hetl de 4’ fosfopanteteinil transferasa, pero que fueron diseñadas, respectivamente, para una expresión óptima en las plantas de dicotiledóneas, usando una distribución de codón equilibrada de codones usados frecuentemente, encontrados en los genes de cañóla. En particular, las nuevas secuencias de ADN difieren de las secuencias de ADN originales que codifica un OrfA de la sintasa del PU FA, un OrfB de la sintasa del PU FA, un OrfC quimérico de la sintasa del PUFA , una acil-CoA sintetasa y el Hetl de 4’ fosfopanteteinil transferasa mediante la sustitución de los codones vegetales (primero preferido, segundo preferido, tercer preferido, o cuarto preferido) para especificar el aminoácido apropiado en cada posición dentro de la secuencia de la proteína del aminoácido.
El diseño de las secuencia de ADN optimizada vegetal fue iniciado mediante traducción inversa de las secuencias de la proteína del OrfA de la sintasa del PUFA (SEQ I D NO: 1 ) , el OrfB de la sintasa del PU FA (SEQ I D NO: 2) , el OrfC quimérico de la sintasa del PUFA (SEQ I D NO: 3), la acil-CoA sintetasa (SEQ ID NO: 4) y el Hetl de 4’ fosfopanteteinil transferasa (SEQ I D NO: 5) usando una tabla de la preferencia codónica de la cañóla construida a partir de la Tabla 1 , Columnas D y H . La secuencia de la proteína para la acil-CoA sintetasa (SEQ I D NO: 4) fue alterada a partir de la secuencia original; donde el segundo aminoácido Alanina fue removido desde la proteína. Las secuencias iniciales fueron entonces modificadas mediante la compensación de cambios de codón (mientras se realizaba la retención de la representación de codón promedio general) , con el fin de remover o agregar los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción, remover las estructuras secundarias intracatenarias altamente estables y remover otras secuencias que podrían ser perjudiciales para las manipulaciones de clonación, o la expresión del gen diseñado en las plantas. Las secuencias de ADN fueron entonces analizadas nuevamente respecto a los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción , que podrían haber sido creados por las modificaciones. Los sitios identificados fueron modificados, además, mediante el reemplazo de los codones relevantes con la primera, segunda, tercera o cuarta elecciones preferidas de los codones. Otros sitios en las secuencias que podrían afectar la transcripción o la traducción del gen de interés incluye los empalmes de exones e intrones (5' ó 3'), señales de adición de poli A o señales de terminación de ARN polimerasa. La secuencia modificada fue, además, analizada y modificada ulteriormente con el fin de reducir la frecuencia de los dobletes de TA ó CG, y para incrementar la frecuencia de los dobletes de TG ó CT. En adición a estos dobletes, los bloques de secuencias que tienen más que aproximadamente seis residuos consecutivos de [G + C] ó [A + T] pueden afectar la transcripción o la traducción de la secuencia. Por lo tanto, estos bloques de secuencias también fueron modificados mediante el reemplazo de los codones de la primera o la segunda elección, etc. , con otros codones preferidos de elección . Los codones raramente usados no están incluidos en una medida sustancial en el diseño del gen, siendo usado solamente cuando es necesario de acomodar un criterio de diseño diferente que las composiciones de codones per se (por ejemplo, la adición o la deleción de los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción) .
La proteína codificada por el OrfA de la sintasa del PUFA comprende 10 dominios repetidos de “Prolina-Alanina" que se encuentran en un rango de tamaño desde 17 hasta 29 aminoácidos. Intermezclado entre las repeticiones de Prolina-Alanina había 9 dominios de secuencia repetidos más largos que comprende 87 aminoácidos. Las secuencias de aminoácidos de estas repeticiones varía en solamente 4 posiciones, y había solamente dos elecciones de codones en cada una de las posiciones variantes. Los análisis de las secuencias de am inoácidos de las 9 repeticiones usando el programa computacional Clustal W generando un valor de homología de 100%, y un valor de identidad de 95.4%. En el nivel del ADN , las secuencias que codifica las 9 repeticiones son 100% homologas, 89.7% idénticas, variando en solamente 27 posiciones en las 261 bases que codifica cada repetición (23 de los 27 cambios son diferencias "silentes", en los cuales los codones sinónimos para el mismo aminoácido son intercambiados).
Los procesos de diseño de genes estándares no pueden acomodar fácilmente el desarrollo de nuevas secuencias de ADN, de preferencia codónica, para múltiples repeticiones de este tamaño, puesto que uno debe equilibrar continuadamente todas las elecciones de codones, en una repetición individual, con las elecciones de codones hecha en la misma posición en las otras 8 repeticiones, con el fin de evitar la generación de las secuencias de ADN altamente relacionadas. Para cada una de las 87 repeticiones de residuos, habían más que 4.5 x 1043 posibles secuencias de ADN para codificar la misma secuencia de aminoácidos (calculado como el producto del número de codones sinónimos para cada aminoácido en la secuencia). Por consiguiente, había un espacio computacional muy grande disponible para generar secuencias de ADN que codifica idénticamente. El siguiente protocolo describe un método usado para generar (in silico) múltiples diseños de secuencias para cada repetición individual, seguidamente mediante la comparación de todas las versiones de secuencias con gran intensidad, con el fin de identificar un conj unto que representa las secuencias, altamente divergidas, que codifica las repeticiones: Paso 1 : la extracción de la secuencia de ADN nativa que codifica cada dominio de aminoácido repetido como una secuencia separada.
Paso 2: la im portación de la secuencias de ADN repetidas individuales como secuencias separadas dentro de un programa de diseño de genes (por ejemplo, OPTGEN™, Ocimum Biosolutions, Hyderabad , India) . Los pasos desde el 3 hasta el 5 son realizados en cada secuencia de forma separada.
Paso 3: I traducción de la secuencia de ADN usando el código genético estándar.
Paso 4: la traducción inversa de la secuencia de proteínas traducidas, usando el código genético estándar y la tabla de preferencia codónica apropiada. En este ejemplo, fue usada una tabla de preferencia codónica, compilada a partir de 530 regiones codificantes de proteínas de Brassica napus, y cada secuencia generada fue codificada con el nombre de "nap" (por "napus") más el número de la versión . Por consiguiente, la primera secuencia de preferencia codónica, de traducción inversa, para Repeat 1 ( Repetición D fue llamada "rpt1 nap 1". En esta ilustración, este proceso fue realizado 10 veces, para generar 10 versiones de secuencia de ADN que codifica la secuencia de proteínas de Repeat 1 .
Paso 5: la exportación de las 10 versiones de secuencia dentro del correspondiente número de archivos de texto.
Paso 6: la repetición de los pasos desde el 3 hasta el 5, para cada uno de los otros dominios de secuencia repetidos. En esta ilustración , fueron generados un total de 90 versiones de secuencias de "nap" ( 10 para cada elemento repetido).
Paso 7: la importación de los 90 archivos de secuencias dentro del programa Clustal W Mega 3.1 (con acceso en Megasoftware), y la realización de un alineamiento de secuencia múltiple usando todas las 90 secuencias como entrada. Debido a que estas secuencias son segmentos de las regiones codificantes de proteínas, los alineamientos son realizados sin permitir huecos. Después del alineamiento de Clustal W, un árbol a Neighbor-Joming ( método del vecino más próximo) es ensamblado y visualizado, y una de las diez secuencias con codones optimizados, para cada uno de los nueve dominios repetidos en la proteína, es escogida visualmente. Cada versión de secuencia seleccionada es elegida entre una sección del árbol que es el más profundamente ramificado.
Paso 8: la secuencia elegida para cada dom inio repetido es incorporada dentro de la secuencia de ADN, con codones optimizados, que codifica la proteína entera, en la posición apropiada para cada repetición particular.
Paso 9: el análisis final de la completa secuencia de codones optimizados, incluyendo los elementos de repetición divergentes diseñados de forma separada, son realizados para asegurar la ausencia de motivos indeseados, los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción, etc.
Empleando este metodo con la optim ización del codón del OrfA de la sintasa del PUFA que codifica la secuencia, tuvo como resultado la selección de las secuencias Prolina-Alanina repetidas que están suficientemente divergidas para evitar la inestabilidad de la secuencia repetida. Estas secuencias fueron elegidas entre las ramas más profundas del árbol Neighbor-Joming (por ejemplo, ellas son las mayormente distantes relacionadas la una con la otra en este conjunto de secuencias) , los alineamientos globales de Smith-Wasserman fueron hechos para todas las combinaciones a pares y el rango de homología fue desde 74% hasta 81 % con una mediana probable desde 76% hasta 77% (Tabla 2) .
Tabla 2. Homologías de Smith- Wasserman de las secuencias con codones optimizados seleccionadas de las repeticiones del OrfA del PUFA.
Un alineamiento Clustal W (Vector NTI, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) de las elegidas 9 regiones codificantes, diseñadas nuevamente, para los 9 dominios repetidos se muestra en la Fig. 1. En general, las secuencias son 93.1 % homologas, 61.7% idéntica en comparación con las secuencias originales, las cuales fueron 100% homologas y 89.7% idénticas. Las divergencias más grandes de las secuencias pudieron ser logradas mediante el uso de más que 10 iteraciones de secuencias, y empleando un programa computacional o un algoritmo matemático con el fin de seleccionarlas entre estas secuencias (en lugar de escoger las secuencias visualmente) . No obstante, las secuencias ejemplificadas son altamente divergentes, y han producido fragmentos poli-nucleótidos.
Las secuencias del ADN, nuevamente diseñadas, del OrfA de la sintasa del PUFA, el OrfB de la sintasa del PUFA, el OrfC quimérico de la sintasa del PU FA, la acil-CoA sintetasa y el Hetl de 4’ fosfopanteteinil transferasa de la cañóla optimizada, están listadas, respectivamente, en SEQ I D NO: 6, SEQ I D NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ I D NO: 9 y SEQ I D NO: 10. Estas secuencias con codones optimizados son identificadas como la versión 3 (v3) a través de toda la especificación, mientras que las secuencias las cuales no son con codones optimizados, son referidas como la versión 2 (v2) a través de toda la especificación.
Las secuencias de ADN resultantes tienen un grado más alto de diversidad de codón, una composición base deseada, contienen los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción ubicados estratégicamente, y la falta de las secuencias que podrían interferir con la transcripción del gen, o la traducción del producto ARNm, Tabla 3, Tabla 4, Tabla 5, Tabla 6 y Tabla 7 presentes, las comparaciones de las composiciones de codón de las regiones de codificación para el OrfA de la sintasa del PUFA, el OrfB de la sintasa del PU FA, el OrfC quimérico de la sintasa del PUFA, la acil-CoA sintetasa y las proteínas del Hetl de 4’ fosfopanteteinil transferasa encontradas en el gen original, las versiones vegetales optimizada y las recomendaciones de la composición de codón para una secuencia optimizada vegetal, como calculado en la Tabla 1 , Columnas D y H .
Tabla 3. Composiciones del codón del OrfA del PUFA Totales 1566 1566 Totales 1345 1345 Tabla 4. Composiciones del Codón del OrfB del PUFA Totales 1079 1079 Totales 981 981 Tabla 5. Composiciones del codón del OrfC quimérico del PUFA Tabla 6. Composiciones del codón de la Acil-CoA sintetasa Composiciones del codón del Hetl de fosfopanteteinil transferasa Totales 116 116 Totales 122 122 Después de que la optimización de codones de las secuencias de regiones codificantes fue completada, las adicionales secuencias de nucleótidos fueron agregadas a la ; secuencia optimizada de región codificante. Los sitios de restricción para la facilitación de la clonación , una secuencia de ; Kozak y los codones de parada adicionales, fueron agregados a la ; secuencia codificante vegetal optimizada. En adición , una segunda serie de secuencias de codificación del OrfA de la sintasa del PUFA, el OrfB de la sintasa del PUFA, el OrfC quimérico de la sintasa del PUFA, la acil-CoA sintetasa y el Hetl de fosfopanteteinil transferasa fue diseñada, la cual contenía una secuencia de cloroplasto objetivo desde la cadena pequeña 1 A de ribulosa bifosfato carboxilasa de Arabidopsis thaliana (GenBank ID: NM_202369.2). Esta secuencia, SEQ I D NO: 28, fue agregada a las secuencias de codificación descritas previamente para el OrfA de la sintasa del PUFA, el OrfB de la sintasa del PUFA, el OrfC quimérico de la sintasa del PU FA y el Hetl de fosfopanteteinil transferasa, La metionina inicial de SEQ I D NO: 6, SEQ I D NO: 7, SEQ I D NO: 8 y SEQ I D NO: 10, fue removida y reemplazada por la secuencia de cloroplasto objetivo. Las secuencias las cuales contenían la secuencia de cloroplasto objetivo, están identificadas como la versión 4 (v4) en toda la especificación .
Un segundo péptido de tránsito de cloroplasto fue agregado a las secuencias de codificación del OrfA de la sintasa del PUFA, el OrfB de la sintasa del PUFA, el OrfC quimérico de la sintasa del PU FA, la acil-CoA sintetasa y el Hetl de fosfopanteteinil transferasa. Estas secuencias de codificación fueron diseñadas para contener una secuencia de cloroplasto objetivo de la acil-ACP-tioesterasa (GenBank I D: X73849.1 ) . Esta secuencia, SEQ I D NO: 29, fue agregada a las secuencias de codificación descritas previamente para el OrfA de la sintasa del PUFA, el OrfB de la sintasa del PUFA, el OrfC quimérico de la sintasa del PU FA y el Hetl de fosfopanteteinil transferasa. La metionina inicial de SEQ I D NO: 6, SEQ I D NO: 7, SEQ I D NO: 8 y SEQ I D NO: 10, fue removida y reemplazada con la secuencia de cloroplasto objetivo. Las secuencias, las cuales contienen la secuencia de cloroplasto objetivo, están identificadas como la versión 5 (v5) en toda la especificación.
Una versión alternativa del gen acil-CoA sintetasa de Schizochytrium sp, fue creado mediante la modificación de la secuencia del gen original para remover los marcos abiertos de lectura superfluos. Esta versión fue marcada como "SzACS-2 v4" y listada como SEQ I D NO: 30. El gen resultante es usado para reemplazar la secuencia de expresión del gen de acil-CoA sintetasa, descrita anteriormente como "SzACS-2 v3".
Una secuencia de ADN de una planta optimizada ha sido diseñada en papel o in silico, las moléculas de ADN actuales pueden ser sintetizadas en el laboratorio para comcidir, precisamente, con la secuencia diseñada. Tales moléculas de ADN sintéticas pueden ser clonadas y manipulas de otra forma, exactamente como si ellas fueran derivadas desde fuentes naturales o fuentes originales. La síntesis de los fragmentos de ADN , que comprende SEQ I D NO: 6, SEQ I D NO: 7 , SEQ I D NO: 8, SEQ I D NO: 9 y SEQ I D NO: 1 0, que contiene las secuencias adicionales descritas anteriormente, fueron realizadas por proveedores comerciales (Genart Ag, Regensburg , Alemania). El ADN sintetico fue entonces clonado en vectores de expresión y transformados en Agrobacterium y frijol de soya, como descrito en los Ejemplos 2 y 3.
EJEMPLO 2 Construcción Plasmídica para pDAB7362 El plásmido binario pDAB7362 (figura 2; SEQ I D NO: 1 I) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R, pDAB7362 contiene tres PTU de la sintasa del PUFA (cuyos genes expresan el OrfA de la sintasa del PU FA, el OrfB de la sintasa del PUFA, el OrfC quimérico de la sintasa del PU FA descritos anteriormente) , un PTU de acil-CoA síntetasa, un PTU del Hetl de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PUFA contiene un promotor truncado de gen fitohemaglutinina-L de Phaseolus vulgaris (promotor v2 de PvDlec2; GenBank Accession Number X06336), región no traducida en 5’ de gen AT2S3 de Arabidopsis thaliana (2S 5' UTR; GenBank Accession Number NM_1 18850), el marco abierto de lectura A de la sintasa del ácido graso poliinsaturado de Schizochytrium sp.
(SzPUFA OrfA v3) y terminador de la región no traducida en 3’ de gen de albúmina 2S de Arabidopsis thaliana (el terminador v1 de At2S SSP; Gen Bank Accession Number M22035). El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, el marco abierto de lectura B de la sintasa del ácido graso poliinsaturado de Schizochytrium sp. (SzPU FA OrfB v3) y el terminador v1 de At2S SSP. El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, el marco abierto de lectura C de la sintasa del ácido graso poliinsaturado de Schizochytrium y Thraustochytrium sp. (hSzThPUFA OrfC v3) y terminador v1 de At2S SSP. El PTU de la acil-CoA sintetasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, la acil-CoA sintetasa de Schizochytrium sp. (SzACS-2 v3) y el terminador v 1 de At2S SSP. El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, el PTU de Hetl de 4' fosfopanteteinil transferasa de Nostoc sp. (No Hetl v3) y el terminador v1 de At2S SSP.
Los plásmidos pDAB7334, pDAB7335, pDAB7336, pDAB7339 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB7362. Específicamente, los cinco PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola dentro del borde de las regiones del ADN de cadena T del pDAB7333 binario de transformación vegetal . El orden de los gens es: SzPUFA OrfA v3, SzPU FA OrfB v3, hSzTh PUFA OrfC v3, SzACS-2 v3, NoHetl v3. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor del virus del mosaico de las nervaduras de la casava (promotor v2 de CsVMV; Verdaguer et al. , Plant Molecular Biology 31 : 1 129-1 1 39; 1996), fosfinotricinacetil transferasa (PAT v5; Wohlleben et al. , Gen 70:25-37; 1988) y región no traducida en 3' de ORF1 de Agrobacterium tumefaciens (AtuORF I 3' UTR v4; Huang et al., J, Bacteriol, 172: 1814- 1822; 1990) , en adición con otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación (Toro et al. , PNAS 85(22) : 8558-8562; 1988) y las secuencias del borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T; Gardner et al. , Science 231 :725-727; 1986 y la Publicación Internacional N° WO 2001 /025459 A1 ) . Los plásmidos recombinantes que contienen los cinco PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los cinco PTU , con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
EJEMPLO 2.1 : Construcción de los plásmidos adicionales los cuales usan el pydlec2 promotor para activar la expresión Las construcciones adicionales fueron diseñadas y construidas, las cuales usan el promotor PvDlec2 para activar la expresión de los transgenes del OrfA de la sintasa del PU FA, el OrfB de la sintasa del PU FA, el OrfC quimérico de la sintasa del PUFA, la acil-CoA sintetasa y el Hetl de 4’ fosfopanteteinil transferasa. Varias alteraciones a estas construcciones han sido hechas para incrementar los niveles de expresión . Estos cambios incluyen el uso de secuencias de gen sin codón optimizado, la incorporación del péptido de tránsito de cloroplasto y la remoción del PTU de la acil-CoA sintetasa.
Los plásmidos construidos recientemente son usados para transformar de manera estable las plantas de soya. Las plantas de soya transgénicas son aisladas y caracterizadas molecularmente. El uso de estas construcciones alternativas tienen por resultado las plantas de soya, las cuales contienen cantidades más grandes del DHA y de los LC-PU FA. La acumulación del LC-PUFA resultante está determ inada y las plantas de soya las cuales producen desde 0.01 % hasta 15% del DHA ó desde 0.01 % hasta 1 5% del LC-PUFA, son identificadas.
EJEMPLO 2.2: Construcción de PDAB7361 pDAB7361 es un plásmido binario que fue construido para contener una versión sin codón optimizada, original de SzPU FA OrfA v2, las secuencias de gen remanente, son los codones optimizados (SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzACS-2 v 3, y NoHetl v3. El plásmido pDAB7361 (figura 3; SEQ I D NO: 31 ) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB7361 contienen tres PTU de la sintasa del PUFA, un PTU de la acil-CoA sintetasa, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PU FA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v2 y el terminador v1 de At2S SSP. El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfB v 3 y el terminador v1 de At2S SSP. El tercer PTU de la sintasa del PU FA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y el terminador v1 de At2S SSP. El PTU de la acil-CoA sintetasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, gen SzACS-2 v3 y el term inador v1 de At2S SSP. El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, NoHetl v3 y el terminador v1 de At2S SSP.
Los plás idos pDAB7355, pDAB7335, pDAB7336, pDAB7339 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB7361 . Específicamente, los cinco PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola, dentro de las regiones del borde de ADN de cadena T del pDAB7333 binario de transformación vegetal. El orden de los gens es: SzPUFA OrfA v2, SzPU FA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzACS-2 v3 NoHetl v3. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF I 3 'UTR v4 en adición a otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de los bordes de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T). Los plásmidos recombinantes que contienen los seis PTU , fueron aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los seis PTU dentro de la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
EJ EMPLO 2.3: Construcción de DAB7363 pDAB7363 es un plásmido binario que fue construido para contener las versiones reconstruidas de codón optimizado de SzPU FA OrfA v4, SzPUFA OrfB v4, hSzTh PU FA OrfC v4, y NoHetl v4, todos de los cuales contienen la cadena pequeña 1A de ribulosa bifosfato carboxilasa (marcada como SSU-TP v1 ), la cual está fundida con el término amino de la secuencia codificante. En adición, este plásmido contiene una versión reconstruida de codón optimizado de SzACS-2 v3. El plásm ido pDAB7363 (figura 4; SEQ ID NO:32) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB7363 contiene tres PTU de la sintasa del PUFA, un PTU de la acil-CoA sintetasa, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PU FA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v 4 y el ter inador v1 de At2S SSP. El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPU FA OrfB v4 y el terminador v1 de At2S SSP. El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v4 y el terminador v1 de At2S SSP. El PTU de la acil-CoA sintetasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, gen SzACS-2 v3 y el terminador v1 de At2S SSP. El PTU de fosfopanteteinil transferasa contienen el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, NoHetl v4 y el term inador v1 de At2S SSP.
Los plásm idos pDAB7340, pDAB7341 , pDAB7342, pDAB7344 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB7363. Específicamente, los cinco PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola, dentro de las regiones del borde de ADN de cadena T de pDAB7333 binario de la transformación vegetal. El orden de los gens es: SzPUFA OrfA v4, SzPU FA OrfB v4, hSzThPUFA OrfC v4, SzACS-2 v3, NoHetl v4. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v 2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF I 3'UTR v4, en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T). Los plásmidos recombinantes que contienen los seis PTU, fueron aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los seis PTU , con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN.
EJEMPLO 2.4: Construcción de PDAB7365 pDAB7365 es un plásm ido binario que fue construido para contener las versiones originales de codón optimizado de SzPU FA OrfA v2, SzPU FA OrfB v2 , hSzThPUFA OrfC v2, SzACS-2 v2, y NoHetl v2. El plásmido pDAB7365 (figura 5; SEQ ID NO:33) fue construido usando una reacción de recombinación Gateway L-R de sitios múltiples. pDAB7365 contiene tres PTU de la sintasa del PUFA, un PTU de la acil-CoA sintetasa, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PU FA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPU FA OrfA v2 y el terminador v1 de At2S SSP. El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfB v2 y el terminador v 1 de At2S SSP. El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPU FA OrfC v2 y el ter inador v1 de At2S SSP. El PTU de la acil-CoA sintetasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, gen SzACS-2 v2 y el terminador v1 de At2S SS P. El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, NoHetl v2 y el terminador v1 de At2S SSP.
Los plásmidos pDAB7355, pDAB7356, pDAB7357, pDAB7360 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB7365. Específicamente, los cinco PTU descritos anteriormente fueron colocados en una orientación de cabeza a cola, dentro de las regiones del borde de ADN de cadena T de pDAB7333 binario de la transformación vegetal . El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v2, SzPUFA OrfB v2, SzPU FA OrfC v2, SzACS-2 v2, NoHetl v2. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORFI 3'UTR v4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T) . Los plásm idos recom binantes que contienen los cinco PTU, fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los seis PTU , con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN.
EJEMPLO 2.5: Construcción de pDAB7368 es un plásmido binario que fue construido para contener las versiones originales sin codón optimizado de SzPU FA OrfA v2, SzPUFA OrfB v2, hSzThPUFA OrfC v2, y NoHetl v2. Esta construcción no contiene la secuencia codificante de SzACS-2. El plásmido pDAB7368 (figura 6; SEQ ID NO: 34) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB7368 contienen tres PTU de la sintasa del PUFA, un PTU de la acil-CoA sintetasa, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2 , 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v2 y el terminador v1 de At2S SSP. El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPU FA OrfB v2 y el terminador v1 de At2S SSP. El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfC v2 y el terminador v1 de At2S SSP. El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, NoHetl v2 y el terminador v1 de At2S SSP.
Los plásmidos pDAB7355, pDAB7356, pDAB7357 , pDAB7359 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB7368. Específicamente, los cuatro PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola, dentro de las regiones del borde ADN de cadena T de pDAB7333 binario de la transformación vegetal. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v2, SzPU FA OrfB v2, SzPUFA OrfC v2, NoHetl v2. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORFI 3 'UTR v4 en adición con los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T). Los plásm idos recombinantes que contienen los cinco PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los cinco PTU, con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
EJ EMPLO 2.6: Construcción de PDAB7369 pDAB7369 es un plásmido binario que fue construido para contener las versiones reconstruidas de codón optimizado de SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, y NoHetl v 3, esta construcción no contiene la secuencia codificante de SzACS-2 PTU . El plásmido pDAB7369 (figura 7; SEQ I D NO:35) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB7369 contienen tres PTU de la sintasa del PUFA, un PTU de la acil-CoA sintetasa, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPU FA OrfA v3 y el terminador v1 de At2S SSP. El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 y el terminador v1 de At2S SSP. El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y el terminador v1 de At2S SSP. El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor 2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, NoHetl v3 y el terminador v1 de At2S SSP.
Los plásm idos pDAB7334, pDAB7335, pDAB7336, pDAB7338 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB7369. Específicamente, los cuatro PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola, dentro de las regiones del borde de ADN de cadena T de pDAB7333 binario de la transformación vegetal . El orden de los genes es: SzPU FA OrfA v3, SzPU FA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3 , NoHetl v3. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORFI 3' UTR v4 en adición con los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T). Los plásmidos recombinantes que contienen los cinco PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los cinco PTU, con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
EJEMPLO 2.7: Construcción de PDAB7370 pDAB7370 es un plásm ido binario que fue construido para contener las versiones reconstruidas de codón optimizado de SzPUFA OrfA v4, SzPUFA OrfB v4, hSzThPUFA OrfC v4, y NoHetl v4, el cual contiene la cadena pequeña 1A de ribulosa bifosfato carboxilasa (marcada como SSU-TP v 1 ) , la cual está fundida con el término amino de la secuencia codificante. Esta construcción no contiene la secuencia codificante de SzACS-2 PTU. El plásmido pDAB7370 (figura 8; SEQ I D NO: 36) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB7370 contiene tres PTU de la sintasa del PUFA, un PTU de la acil-CoA sintetasa, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPU FA OrfA v4 y el terminador v1 de At2S SSP. El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, SzPUFA OrfB v4 y el terminador v1 de At2S SSP. El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v4 y el terminador v1 de At2S SSP. El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, NoHetl v4 y el terminador v1 de At2S SSP.
Los plásm idos pDAB7340, pDAB7341 , pDAB7342, pDAB7343 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB7370. Específicamente, los cuatro PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola, dentro de las regiones del borde de ADN de cadena T, de pDAB7333 binario de la transformación vegetal. El orden de los genes es: SzPU FA OrfA v4, SzPUFA OrfB v4, hSzThPUFA OrfC v4, NoHetl v4. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotrielnacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF I 3'UTR v4 en adición con los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T) . Los plásmidos recombinantes que contienen los cinco PTU , fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los cinco PTU , con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
EJEMPLO 2.8. Construcción de PDAB100518 PÜAB 100518 es un plásmido binario que fue construido para contener las versiones reconstruidas de codón optimizado de SzPUFA OrfA v5, SzPUFA OrfB v5, hSzThPUFA OrfC v5, y NoHetl v5, los cuales contienen el péptido de tránsito de cloroplasto desde acil-ACP-tioesterasa (marcado como, péptido de transito de tioesterasa) el cual es fundido con el término amino de la secuencia codificante. En adición, el plásmido contiene un SzACS-2 v3 de la secuencia codificante PTU, la cual no posee un péptido de tránsito de cloroplasto. El plásmido pDAB10051 8 (figura 9; SEQ I D NO: 37) fue construido usando una reacción de recom binación con Multisite Gateway L-R. pDAB 100518 contienen tres PTU de la sintasa del PUFA, un PTU de la acil-CoA sintetasa, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v5 y el term inador v1 de At2S SSP. El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPU FA OrfB v5 y el terminador v1 de At2S SSP. El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v5 y el terminador v1 de At2S SSP. El PTU de la acil-CoA sintetasa contiene el promotor v 2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, gen SzACS-2 v3 y el terminador v1 de At2S SSP. El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, NoHetl v5 y el terminador v1 de At2S SSP.
Los plásmidos pDAB100517, pDAB 100514, pDAB 10051 1 , pDAB100515 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB 100518. Específicamente, los cinco PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola, dentro de las regiones del borde de ADN de cadena T, de pDAB7333 binario de la transformación vegetal. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v5, SzPUFA OrfB v5, hSzTh PUFA OrfC v5, SzACS-2 v3, NoHetl v5. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF I 3'UTR v4 en adición con los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T) . Los plásmidos recombinantes que contienen los seis PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los seis PTU , con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
EJEMPLO 2.9: Construcción de PDAB101476 pDAB 101476 es un plásmido binario que fue construido para contener las versiones reconstruidas de codón optimizado de SzPU FA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPU FA OrfC v3, y NoHetl v3. La secuencia de gen SzACS-2 v 2, es la versión original sin codón optimizado. El plásmido pDAB 101476 (figura 10; SEQ I D NO: 38) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB 101476 contienen tres PTU de la sintasa del PU FA, un PTU de la acil-CoA sintetasa, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricmacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PU FA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPU FA OrfA v 3 y el terminador v1 de At2S SSP. El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v 2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfB v 3 y el terminador v1 de At2S SSP. El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v 2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y el terminador v 1 de At2S SSP. El PTU de la acil-CoA sintetasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, gen SzACS-2 v2 y el terminador v1 de At2S SSP. El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, NoHetl v3 y el term inador v1 de At2S SSP.
Los plásmidos pDAB7334, pDAB7335, pDAB7336, pDAB101471 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB101476. Específicamente, los cinco PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola, dentro de las regiones del borde de ADN de cadena T, de pDAB7333 binario de la transformación vegetal. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, SzPU FA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzACS-2 v2, NoHetl v3. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORFI 3'UTR v4 en adición con los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T). Los plásmidos recombinantes que contienen las seis PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los seis PTU , con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
EJEMPLO 2.1 0: Construcción de PDAB101477 pDAB 101477 es un plásmido binario que fue construido para contener las versiones reconstruidas de codón optim izado de SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, y NoHetl v3. El plásmido pDAB101477 (figura 1 1 ; SEQ I D NO:39) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB101477 contiene tres PTU de la sintasa del PUFA, un PTU de la acil-CoA sintetasa, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PU FA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPU FA OrfA v3 y el terminador v1 de At2S SSP. El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 y el terminador v1 de At2S SSP. El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y el terminador v1 de At2S SSP. El PTU de la acil-CoA sintetasa contiene el promotor v 2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, gen SzACS-2 v4 y el terminador v1 de At2S SSP. El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, NoHetl v3 y el term inador v1 de At2S SSP.
Los plásmidos pDAB7334, pDAB7335, pDAB7336, pDAB 101472 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB 101477. Específicamente, los cinco PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola, dentro de las regiones del borde de ADN de cadena T, de pDAB7333 binario de la transformación vegetal. El orden de los genes es: SzPU FA OrfA v3, SzPU FA OrfB v 3, hSzThPUFA OrfC v3, SzACS-2 v 4, NoHetl v3. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF I 3'UTR v4 en adición con los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T). Los plásmidos recombinantes que contienen los seis PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los seis PTU , con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
EJEMPLO 3 Transformación de la soya La soya transgénica ( Glycine max ) fue generada a través de la transformación mediada de Agrobacterium de los explantes de nodo de cotiledones de la soya. La cepa Agrobacterium DA2552 desarmada (Solicitud norteamericanas nos. 61 /368.965, registrada el 29 de Julio de 201 0) portando los vectores binarios descritos anteriormente como pDAB7362, fue usada para iniciar la transformación.
La transformación mediada de Agrobacterium, fue llevada a cabo usando un procedimiento de nodo de cotiledón ½ modificado de Zeng et al, (Zeng P. , Vadnais D.A. , Zhang Z. , Polacco J . C.. (2004), Plant Cell Rep. , 22(7): 478-482), En pocas palabras, las semillas de la soya (cv, Maverick) fueron germinadas sobre un medio basal, y los nodos de cotiledón fueron aislados e infectados con Agrobacterium. La iniciación del brote, y el medio de enraizamiento fueron complementados con cefotaxima, timentina y vancomicina para la remoción de Agrobacterium. La selección de glufosinato fue empleado para inhibir el crecimiento de los brotes transformados. Los brotes seleccionados fueron transferidos a un medio de enraizamiento para el desarrollo de la raíz, y después transferidos a una mezcla de tierra para la climatización de las plántulas.
Los folíolos terminales de plántulas seleccionados fueron tratados localmente (téenica de pintado foliar) con glufosinato para examinar respecto a los transformantes putativos. Las plántulas examinadas fueron transferidas al invernadero, permitidas de aclimatarse y después sometidas a pintado foliar con glufosinato para reconfirmar la tolerancia. Estas plantas T0 transformadas putativas fueron muestreadas, y el análisis molecular fue usado para confirmar la presencia de PAT y los transgenes del OrfA de la sintasa del PUFA, el OrfB de la sintasa del PUFA, el OrfC quimérico de la sintasa del PUFA, la acil-CoA sintetasa y el Hetl de 4' fosfopanteteinil transferasa. Las plantas fueron permitidas de auto-fertilizarse en el invernadero para producir la semilla TY Un segundo método de transformación de ía soya fue usado para producir plantas de soya transgénicas adicionales. La cepa Agrobacterium DA2552 desarmada (Solicitud de Patente Provisional norteamericanas nos. 61 /368.965) portando el vector binario descrito anteriormente como pDAB7362, fue usado para iniciar la transformación.
La transformación mediada de Agrobacterium fue llevada a cabo usando un procedimiento de mitad de semilla modificada de Paz et al. , (Paz M. , Martínez J. , Kalvig A. , Fonger T , y Wang K. , (2005) Plant Cell Rep. , 25: 206-213), En pocas palabras, las semillas de la soya maduras, fueron esterilizadas durante la noche con gas de cloro, y absorbidas con H2O estéril veinte horas antes de la transformación vegetal mediada de Agrobacterium. Las semillas fueron cortadas en la mitad por un corte longitudinal, a lo largo del hilio para separar la semilla y remover la capa de la semilla. El eje embriónico fue extirpado y cualquiera de los brotes/capullos axiales fue removido desde el nodo de cotiledón. Los explantes de la mitad de semilla resultante, fueron infectados con Agrobacterium. La iniciación del brote, la elongación del brote, y el medio de enraizamiento fueron complementados con cefotaxima, timentina y vancomicina para la remoción de Agrobacterium. La selección de glufosinato fue empleado para inhibir el crecimiento de los brotes no transformados. Los brotes seleccionados fueron transferidos a un medio de enraizamiento, para desarrollar la raíz y, después, transferidos a una mezcla de tierra para la climatización de las plántulas.
Los folíolos terminales de las plántulas seleccionadas, fueron tratados localmente (téenica de pintado foliar) con glufosinato para exam inar con respecto a los transformantes putativos. Las plántulas examinadas fueron transferidas a un invernadero, permitidas de aclimatarse y después sometidas a pintado foliar con glufosinato para reconfirmar la tolerancia. Estas plantas T0 transformadas putativas fueron sometidas a muestreo y el análisis molecular fue usado para confirmar la presencia de PAT, y de los transgenes del OrfA de la sintasa del PU FA, el OrfB de la sintasa del PUFA, el OrfC quimérico de la sintasa del PUFA, la acil-CoA sintetasa y el Hetl de 4’ fosfopanteteinil transferasa. Los siete eventos fueron identificados que contienen los transgenes de pDAB7362. Estas plantas T0 fueron avanzadas para un análisis ulterior y permitidas de auto-fertilizarse en el invernadero, con el fin de dar curso a la semilla T\.
EJ EMPLO 4 Análisis Molecular de las Eventos de la Soya Los números de copia de los transgenes de los eventos de la soya pDAB7362 seleccionado, fueron cuantificados usando un método comparativo de PCR en tiempo real cuantitativo (q PCR). Las muestras de tejido de la hoja fueron tomadas desde las hojas de la parte superior y del fondo de una planta de soya madura, estas muestras fueron combinadas y el ADN genómico fue aislado. El ADN genómico fue aislado usando el BioSprint 96 ADN Plant Kit y una plataforma de automatización de partículas magnéticas BioSprint 96 (Qiagen, Valencia, CA, EE. U U.) según las instrucciones del fabricante. El ADN genómico extraído fue diluido 1 : 5 con ddH20 para usar como un patrón en reacciones de PCR en tiempo real cuantitativo (qPCR) .
Los ensayos de qPCR fueron diseñados para detectar los transgenes SzPU FA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hThSzPUFA OrfCv3, SzACS-2 v3, NoHetl v3, y PAT v5 en las plantas de soya pDAB7362 mediante el uso del Roche Assay Design Center (www, universalprobelibrary.com). Los cebadores y las sondas usados en los ensayos están descritos en la Tabla 8. Las presencias de los genes objetivos fueron detectadas mediante las sondas U PL marcadas con fluoresceína-amidita (FAM) (Roche Diagnostics, Indianapolis, I N, EE. U U .) . Estos ensayos fueron ejecutados en reacciones dúplex con una referencia interna de la soya GMFL01 -25-J 19, GenBank: AK286292.1 (referenciado como GMS 1 16 en la Tabla 8) el cual fue marcado con el colorante fluorescente de Cianina-5 (Ci-5).
Tabla 8: Ensayo de PCR cuantitativo (q PCR) de cebadores y sondas Las reacciones de PCR en tiempo real fueron realizadas sobre un termocielador LC480I I de PCR en tiempo real (Roche, Indianapolis, IN , EE. UU. ) usando los protocolos estándares. Los datos para SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hThSzPUFA OrfCv3, SzACS-2 v3, NoHetl v 3, y PAT v5, los ensayos marcados FAM fueron recolectados usando un filtro de emisión de 533 nm y una señal de excitación de 483 nm . Los datos para el ensayo de referencia marcado Cy5 GMS 1 .16, fueron recolectados usando un filtro de 660 nm y una señal de excitación de 618 nm . Los valores del punto de intersección (valores Cp) y el objetivo con respecto a las relaciones de referencia, fueron calculados de forma automática usando el análisis del flujo de trabajo "Advanced Relative Quantification" (cuantificación relativa avanzada) del soporte lógico LC480I I . Una relación de objetivo con respecto a la referencia para cada m uestra, fue calculada usando el método estándar "delta-delta-Ct". El número de copia estimado fue determinado mediante la normalización de las relaciones de objetivo con respecto a referencia de la muestra con la relación de objetivo con respecto a la referencia de la referencia interna de la soya GMFL01 -25-J 19.
El número de copia estimado del PAT v5 de marcador seleccionable y los transgenes del ácido docosahexaenoico (DHA) (SzPUFA OrfA v3, SzPU FA OrfB v3, hThSzPU FA OrfC v3, SzACS- 2 v3, y NoHetl v3) fue determinado en las plantas Ti desde los siete eventos pDAB7362. Las plantas de dos eventos, 7362[710] - 71006 y 7362[710] - 101 0, no conten ían, ya sea el de marcador seleccionable PAT v5 o las secuencias de gen objetivo del DHA. Las plantas de los eventos remanentes; 7362[710]-70903, 7362 [710] - 71005, 7362 [ 710 ] -71008 y 7362[710]-71009 , contenían el marcador seleccionable PAT v5 y los cinco transgenes del DHA con un rango de números de copias desde 1 hasta 10. El evento 7362[708]-70801 produjo plantas T1 con 0.1 ó 2 copias del gen PAT v5 indicando un locus de segregación individual y el evento 7362 [710]-71 005 produjo las plantas T1 con números de copias de PAT v5 entre 0 y 4 sugiriendo una segregación de dos locis disociados.
EJEMPLO 5 Análisis Lípido de Cotiledones Ti de las Plantas de Soya T ransgénicas Para evitar un análisis destructivo de cantidades limitadas de semillas T1 el análisis de metilésteres del ácido graso (FAME) , fue realizado en cotiledones verdes posteriores a la germinación de las plantas Ti . Los metodos para la purificación y el análisis de los FAME han sido descritos (por ejemplo, Nightingale, ZD, et al, (1999) Purification pf fatty acid methyl esters by high-performance liquid chromatography ( Purificación de los metilésteres de ácido graso mediante cromatografía de alto rendimiento) . J Chromatogr. B. Biomed. Sel. Appl. 732(2):495-500; y "Gas chromatography and lipids: a practical guide" ( Cromatografía de gas y lípidos: una guía práctica) by W.W Christie, 1989, The Oily Press) . La caracterización del perfil del aceite en los cotiledones Ti es representativa del perfil del aceite en la semilla Ti seca (Wilson, RF and Kwanyuen, P. , (1986) Triacylglycerol synthesis and metabolism in germinating soybean cotyledons ( Síntesis y metabolismo del triacilglicerol en la germinación de los cotiledones de soja). Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Lipids and Lipid Metabolism, 877(2):231 -237).
EJ EMPLO 5.1 : Validación de la detección posterior a la germinación del DHA en los cotiledones T a través del análisis de la cañóla transaénica La validación y la detección de los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFA) en las cotiledones verdes posterior a la germinación, fue realizada con semilla de cañóla produciendo el DHA, con el fin de evaluar si la caracterización del perfil de aceite en las cotiledones TT es representativo de la presencia de un perfil de aceite dentro de la semilla ? madura. La semilla de cañóla transgénica albergando el plásmido binario, pDAB7362, fue germinada a la temperatura am biente sobre toallas de papel saturados de agua, y cosechadas después de 3 d ías, en cuyo punto el tejido fue liofilizado. El tejido fue transmetilado, directamente, y no fue pre-extraído con hexano. El contenido de LC-PU FA (% de FAME en peso) fue calculado y comparado con la semilla madura. El contenido del DHA promedio de las cotiledones que han emergido de 30 cañólas, fue de 0.71 % (total LC-PUFA = 0.97%) con un contenido de aceite de 53.0%. El contenido del DHA promedio de 48 semillas de cañóla maduras antes de la germinación , fue de 0.49% (total LC-PUFA = 0.73%) con un contenido de aceite de 44.3%. Este estudio demuestra que los LC-PUFA pueden ser detectados posterior a la germinación en las cotiledones verdes que han emergido, y que la detección de los LC-PUFA en las cotiledones verdes que han emerg ido, indican que el LC-PUFA está presente en la sem illa.
EJ EMPLO 5.2: Detección posterior a la germinación del DHA en los cotiledones de sova T El análisis del FAME fue realizado en un cotiledón verde extirpado de la plántula de frijol de soya muestreada desde 3 hasta 5 días después del plantado. El material vegetal fue liofilizado, homogeneizado usando una bola de acero y un molino de bolas y desgrasado 3 veces con hexano, La fracción del hexano acumulado fue evaporada y el residuo seco fue sopesado y reconstituido en heptano. Una cantidad conocida de residuo de aceite fue transmetilada con 0.25 M de metóxido de sodio recientemente preparado (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. U U .) en metanol en la presencia de el sucedáneo, triheptadecanoma (Nu-Chek Prep, Elysian , MN , EE. UU.) . La reacción fue conducida bajo un calor leve (40 °C) y constante agitación, y los FAME extraídos con heptano. La completación de la reacción fue verificada mediante la recuperación del sucedáneo de metilester de heptadecanoato reaccionado. Los extractos de los FAME fueron analizados mediante cromatografía de gas con detector de ionización de llama (GC-FI D), usando un cromatógrafo de gas Agilent 6890 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) y una columna de capilares BPX 70 de 15 m x 0.25 mm x 0.25 mm de SGE (Austin, TX, EE. U U . ), Cada punta del FAME fue identificada mediante su tiempo de retención, y cuantificada mediante la inyección de una mezcla de referencia de aceite de colza de Matrcya LLC (Pleasant Gap, PA, EE. UU .) , El estándar de calibración contenido individualmente se agregó a los estándares de los metilésteres del DHA, del EPA y del DPA(n-6) de Nu-Chek. El análisis de los datos fue realizado usando el soporte lógico ChemStation4 de (Agilent). Los cotiledones de Ti de dos eventos contenían el DHA; pDAB73 62 [708J-70801 .001 y pDAB7362[710J-71005.001 (Tabla 9).
Cuarenta semillas del evento pDAB7362[708]-70801 .001 fueron germinados y examinados respecto a la presencia del LC-PUFA en cotiledón verde extirpado. Los cotiledones de seis de las cuarenta semillas contenían LC-PUFA en un rango desde 0.78% hasta 1 .58% (con una media de 1 .12%) . El contenido del DHA estaba en el rango desde 0.48% hasta 0.93% (con una media de 0.68%), y el contenido del DPA (n-6) estaba en el rango desde 0.3% hasta 0.65% (con una media de 0.44%).
Treinta y nueve semillas del evento pDAB7362[71 0]- 71005.001 fueron germinados y examinado con respecto a la presencia de LC-PU FA en cotiledón verde extirpado. Los cotiledones de treinta y siete semillas contenían el LC-PUFA en el rango desde 0.70% hasta 1 1 .98% (con una media de 3.91 %). Del total del LC-PUFA, el contenido del DHA estuvo en el rango desde 0.36% hasta 8.00% (con una media de 2.24%), y el contenido del DPA(n-6) estaba en el rango desde 0.34% hasta 3.98% (con una media de 1 .68%) .
La identificación del LC-PUFA fue confirmada mediante la evaluación de la fragmentación específica de los metilésteres del PU FA estándares (Nu-Chek Prep, Elysian, MN, EE. U U.) usando un Pegasus I I I GC-TOF- MS (Leco, St. Joseph , M I , EE. U U .) comparado con un control negativo.
Tabla 9: Contenido del LC-PU FA en peso por porcentaje del total ácidos grasos de ? germinada \ cotiledones de semilla de soya EJ EMPLO 6 Análisis de lípidos de semilla T2 madura a partir de eventos de la soya transgénica Las plantas T? de dos eventos 7362[708]-70801 .001 y 7362[710]-71 005.001 fueron cultivadas hasta la madurez en el invernadero. Las plantas fueron seleccionadas que conten ían altos niveles de los LC- PU FA en el cotiledón T\ y una o dos copias de PAT v5, y los cinco genes acompañantes para la producción del DfHA. Estas plantas fueron auto-fertilizadas y la semilla T2 cosechada en la madurez. Las semillas individuales fueron analizadas a través de la GC-FI D de los FAME, con el fin de determ inar el contenido del LC-PU FA y del DHA en la semilla de soya T2. Doce semillas completamente maduras por planta fueron analizadas individualmente, mediante el machacado de la semilla con una prensa, la homogeneización usando una bola de acero y un molino de bolas. El tej ido fue desgrasado tres veces con hexano, las fracciones del hexano acumuladas fueron evaporadas a la sequedad y el residuo fue sopesado y reconstituido en heptano, para el análisis del FAME realizado como descrito en el ejemplo previo.
Las semillas T2 individuales a partir de una planta T del evento 7362[708]-70801 .001 (descrita como 7362(708]-70801 . Sx.021 en la figura 12), que estaba en posesión de una copia individual de PAT v5 conten ía desde 0% hasta 0.73% del DHA (desde 0% hasta 1 .19% del LC-PU FA total). Las semillas T2 individuales a partir de dos plantas ? del evento 7362(710]-71005.001 (descritas como 7362[710]-71005. Sx.006 y 7362(710]-71005. Sx.0.35 en la figura 12) poscyendo una copia individual de PAT v5 contenía desde 0% hasta 2.08% del DHA (desde 0% hasta 3.56% del LC-PUFA total). Las semillas T2 individuales a partir de siete plantas T·, del evento 7362(710] - 71005.001 (descritas como 7362[710]-71005. Sx.01 0, 7362(710]-71005. Sx.01 2, 7362(710]-71005. Sx.013, 7362(710]-71 005. Sx.016, 7362(710]-71005. Sx.018, 7362[710]-71005. Sx.025 y 7362(710]-71005 Sx.031 en la figura 12) que contiene dos copias de PAT v5 que contenía desde 0% hasta 2.84% DHA (desde 0% hasta 4.77% del LC-PU FA total). El contenido medio del DHA de las semillas T2 a partir de la línea más alta de producción del DHA (7362(710]- 71005. Sx.025) fue de 1 .83% (3.1 1 % del LC-PUFA total). El contenido del DHA de cada semilla T2 a partir de las plantas individuales se muestra en la figura 12, El DHA comprendió 60% del contenido total del LC-PUFA en aquellas semillas T2 que contenían el LC- PUFA. Solamente los dos nuevos LC-PUFA, el DHA y el DPA(n-6) , fueron detectados en las semillas T2 de soya. Los ácidos grasos los cuales se espera de ser encontrados en las semillas de soya, fueron detectados en los niveles normales, con la excepción de que el total de los ácidos grasos Cl 8 eran proporcionalmente más bajos, debido a la presencia de los LC-PUFA. No fueron detectados otros ácidos grasos diferentes a estas semillas de soya transgénicas distintos al DHA y el DPA(n-6) . El contenido de aceite (suma de las masas de los FAME individuales dividido por la masa de la semilla) de las semillas transgénicas, y el número de las semillas producidas las líneas transgénicas, no fue significativamente diferente de aquella del cultivar de control Williams 82 no transgénico, cultivado en el invernadero en el mismo tiempo y bajo las mismas condiciones.
Los perfiles completos de los FAME de las semillas T2 individuales a partir de los eventos de la soya 7362[708]-70801.001 y 7362[710]-71005.001 se muestran en la Tabla 10.
Tabla 10: Perfiles de los FAME de las semillas de soya T2 individuales de dos eventos 7362[708]-70801 .001 y 7362[710]-71005.001 . Los valores son porcentajes del contenido total del FAME a partir de las 10 hasta 1 2 sem illas de soya T2, El LC-PUFA total es la suma de C22:5 (DPA n-6) y C22:6 (DHA) del porcentaje de FAME.
EJEMPLO 6.1 : Análisis de lípidos se semilla madura a partir de dos eventos de sova transaenica Dos eventos vegetales de soya T2, 7362[708]-70801 .001 y 7362[710] - 71005.001 , fueron cultivadas hasta la madurez en el Invernadero. Múltiples plantas de cada evento fueron cultivadas en el invernadero, y fueron examinadas para identificar las plantas individuales que produjeron altos niveles de los LC-PU FA en el cotiledón T2 y que contenían una inserción homogénea e individual de los transgenes. Las plantas identificadas fueron auto-fertilizadas y la semilla T3 resultante fue cosechada cuando la semilla alcanzó la madurez. Las semillas T3 maduras individuales fueron analizadas través de la GC-FID de los FAME, con el fin de determinar el contenido del DHA y del LC-PU FA in la sem illa de la soya T3 (Figure 12a). Doce semillas completamente maduras por planta fueron analizadas individualmente mediante el machacado de la semilla con una prensa, y la homogeneización del material de sem illa machacado usando una bola de acero y un molino de bolas. El tejido fue desgrasado tres veces con hexano, las fracciones del hexano acumuladas fueron evaporadas a la sequedad, y el residuo fue sopesado y reconstituido en heptano para el análisis del FAME realizado como descrito en el ejemplo previo. Los niveles del DHA fueron determinados a partir de la semilla T3 y comparado con los niveles del DHA de T2, los cuales han sido ensayados previamente (Tabla 1 1 ) .
Tabla 11 : Contenido en % del DHA promedio a partir de la sem illa de soya madura, elegida aleatoriamente elegida, en la generación T2 y T3 de dos eventos 7362[708]70801 .001 y 7362[710]-71005.001 .
Como se indica en la Tabla 1 1 , el porcentaje relativo del DHA en las semillas de soya permaneció constante o incrementó en las generaciones subsiguientes de la soya (a partir del T2 y del T3). Las semillas T3 individuales producidas por la auto-fertilización de una planta T2 del evento 7362[708]-70801 .001 (esta línea fue molecularmente caracterizada y encontrada de poseer un copia homocigota individual de PAT), fueron sometidas a ensayo por la vía del análisis de los FAME, y las semillas fueron determinadas para contener desde 0% hasta 0.93% del DHA (desde 0% hasta 1 .37% del LC-PUFA total) . Comparativamente, las semillas T2 individuales producidas a partir del evento 7362[708]-70801 .001 fueron sometidas a ensayo por la vía del análisis de los FAME , y las semillas fueron determinadas para contener desde 0% hasta 0.73% DHA. Las semillas T3 individuales a partir de la auto- fertilización de un evento vegetal T2 7362[710] -71005.001 -1 -35 (esta línea fue molecularmente caracterizada y encontrada de poseer una copia homocigota individual de PAT), fueron sometidas a ensayo por la vía del análisis de los FAME , y las semillas fueron determinadas para contener desde 0% hasta 3.10% del DHA (desde 0% hasta 5.45% del LC-PUFA total). Comparativamente, las semillas T2 producidas a partir del evento 7362[710]-71005.001 - 1 -35, fueron sometidas a ensayo por la vía del análisis de los FAME, y las semillas fueron determinadas para contener desde 0% hasta 2.84% del DHA, En adición, las semillas T3 individuales producidas a partir de los eventos 7362[710]-71005.001 -1 -13, 7362(710]- 71005.001 -1 -18 y 7362(710]-71005.001 - 1 -25 (cada evento fue determinado para contener una copia homocigota individual de PAT) conten ían desde 0.79% hasta 4.24% del DHA (desde 1 .26% hasta 6.5% del LC-PUFA total). Comparativamente, las semillas T2 producidas a partir de los eventos 7362(710]-71005.001 -1 -13, 7362(710]-71005.001 -1 -18 y 7362(710]-71005.001 - 1 -25 fueron sometidas a ensayo por la vía de el análisis de los FAME, y las semillas fueron determinadas para contener desde 0.79% hasta 2.84% del DHA. Los eventos transgénicos fueron comparados con las plantas de control, el rendimiento por planta (número de semillas) y el contenido total (%) de aceite fue encontrado de ser similar al control Williams 82 en condiciones similares como las líneas transgénicas.
Para todas las líneas sometidas a ensayo, el porcentaje del DHA y del LC-PUFA, los cuales fueron producidos y mensurados en la semilla de soya, para las generaciones de T2 y de T3, fue tanto consistente como incrementado en los niveles de la generación T2 con respecto a la generación T3. Estos resultados indican que las características son heredables, y que la transmisión de las características a generaciones ulteriores no tiene por resultado la producción reducida del DHA.
EJEM PLO 7 Detección por transferencia western de las proteínas de la sintasa del PU FA en semillas de soya transgénicas El OrfA de la sintasa del PU FA (codificado por el gen SzPU FA OrfA v3) , el OrfB de la sintasa del PUFA (codificado por el gen SzPU FA OrfB v3) , el OrfC quimérico de la sintasa del PUFA (codificado por el gen hThSzPUFA OrfC v3) y el Hetl (de Nostoc sp, PCC 7120, GenBank I D: P37695, GL20141367), fueron detectados en muestras de semillas transgénicas maduras mediante el análisis de transferencia western. Las muestras de torta de semillas T2 de soya residual fueron retenidas después de la extracción por hexano para el análisis del FAME. La torta de semillas pulverizada fue colocada en un tubo con una bola de acero inoxidable de 4.5 mm individual, y fue agregado un tampón de extracción (50 mM de Tris, 10 mM de EDTA, SDS (dodecilsulfato sódico) al 2%) . Los tubos de muestra fueron balanceados suavemente durante 30 minutos, sometidos a centrifugado durante 1 5 minutos a 3.000 rcf ( fuerza centrífuga relativa ), y el supernadante fue usado para análisis. La cantidad del total de la proteina soluble en el extracto de semilla, fue determ inado mediante 660 nm de Protein Assay (Thermo Fisher, Rockford, IL, EE. U U .). Las muestras fueron normalizadas a 1 .25 mg/ml de proteína soluble total, y preparadas en tampón de muestra de LDS (I nvitrogen , Carlsbad, CA, EE. UU .) con 50 mM de DTT para una carga normalizada de 16.25 mg de proteína soluble total por pista. Las muestras fueron sometidas a electroforesis en geles de tris-acetato al 3%-8% (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU. ), y transferidas a las membranas de nitrocelulosa para la detección del OrfA de la sintasa del PUFA, el OrfB de la sintasa del PUFA y el OrfC quimérico de la sintasa del PUFA. Las muestras fueron sometidas a electroforesis en geles de Bis-Tris al 4%-12% (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. U U .) , y transferidas a las membranas de nitrocelulosa para la detección del Hetl .
Las transferencias fueron incubadas en tampón bloqueador, después sometidas a sondaje con anticuerpos contra los diferentes polipéptidos del OrfA de la sintasa del PU FA, el OrfB de la sintasa del PU FA, el OrfC quimérico de la sintasa del PU FA y del Hetl . Fueron usados el conejo anti-A2-A el cual es dirigido contra la región A2 de Schizochytrium del OrfA de la sintasa del PUFA (SzPUFS-A), el conejo anti-B3-A el cual es dirigido contra la región B3 de Schizochytrium del OrfB de la sintasa del PUFA (SzPUFS-B), y el conejo anti-Hetl el cual es dirigido contra el polipéptido de Hetl de longitud completa. La región B3 incluye el dominio Enoil Reductasa (ER) del OrfB. Como también es un dominio ER homólogo en el OrfC quimérico de la sintasa del PU FA, este antisuero reconoce a ambos, el OrfB de la sintasa del PUFA y el OrfC quimérico de la sintasa del PU FA en una transferencia western. Un anticuerpo secundario marcado fluorescente anticonejo (Cabra anti-conejo AF 633 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. U U . )) fue usado para la detección. Las transferencias fueron visualizadas en un computador de imágenes fluorescentes Typhoon Trio Plus (GE Healthcare, New Brunswick, NJ , EE . UU .).
Las transferencias western de SDS-PAGE ( gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio) de los extractos de proteína, a partir de los sem illas T2 maduras de los eventos 7362[708]-70801 y 7362[71 0]-71005, mostró bandas en los tamaños apropiados cuando fue sometida a sondaje con los antisueros específicos para el OrfA de la sintasa del PUFA, el OrfB de la sintasa del PUFA, el OrfC quimérico de la sintasa del PU FA y el Hetl (Fig. 13). Las bandas para el OrfA de la sintasa del PUFA, el OrfB de la sintasa del PU FA y el OrfC quimérico de la sintasa del PUFA también podría ser visto mediante el teñido directo con azul de Coomassie.
EJEMPLO 8 Expresión de un conjunto de genes de la sintasa algácea del PU FA usando promotores alternativos El uso de elementos reguladores transcripcionales adicionales para expresar los genes que codifica las proteínas del OrfA de la sintasa del PUFA, el OrfB de la sintasa del PU FA, el OrfC quimérico de la sintasa del PUFA, la acil-CoA sintetasa y el Hetl de 4’ fosfopanteteinil transferasa pueden incrementar, además, el contenido del LC- PUFA y del DHA dentro de las semillas de soya. La identificación y el uso de los elementos reguladores transcripcionales, los cuales se expresan tempranamente en el desarrollo durante la biosíntesis de triacilglicerol y la depositación, y durante los períodos de tiempo extendidos, pueden incrementar los niveles del LC-PUFA y del DHA dentro de la semilla de soya, mediante la promoción de la transcripción de unos genes biosintéticos del LC-PUFA y del DHA, en etapas más tempranas del desarrollo de la semilla (por ejemplo, en 15 hasta 25 DAP) y, por lo tanto, extiende el tiempo de producción del LC-PU FA y del DHA. Los ejemplos de tales regiones reguladoras transcripcionales incluyen , pero no están limitados a, el promotor KCS (LfKCS3) de Lesquerella fendleri (Patente norteamericana no. 7.253.337) el promotor FAE 1 (Patente norteamericana no. 6.784.342) , y el promotor de Acil Carrier Protein (BoACP) de Brassica olerácea (Publicación Internacional N° WO 1992/18634). En adición, otros promotores específicos de semilla, tal como el promotor de faseolina de Phaseolus vulgarls (Patente norteamericana no. 5.504.200), puede ser usado para activar robustamente la expresión de los genes heterólogos durante períodos de tiempo extendido, durante el desarrollo de la semilla, para incrementar los niveles del LC-PUFA y del DHA dentro de la semilla de soya. Finalmente, los promotores constitutivos fuertes, tal como el promotor del virus del mosaico de las nervaduras de la casava (promotor v2 de CsVMV), puede ser usado para activar la expresión de los genes heterólogos, a través de todas las etapas del desarrollo, incrementando de esa forma los niveles del LC-PUFA y del DHA dentro de la sem illa de soya y otros tejidos vegetales.
Estos promotores son usados singularmente o en combinación, con el fin de activar la expresión de los casetes de expresión del OrfA de la sintasa del PU FA, el OrfB de la sintasa del PUFA, el OrfC quimérico de la sintasa del PUFA, la acil-CoA sintetasa y el Hetl de 4’ fosfopanteteinil transferasa, los cuales fueron previamente descritos en plásmido pDAB7362. Los métodos para reemplazar las regiones reguladoras transcripcionales dentro de un plásmido, son bien conocidos dentro de la téenica. Como tal, un fragmento polinucleótido que comprende el promotor v 2 de PvDlec2, es removido desde pDAB7362 (o los plásmidos precedentes para construir pDAB7362), y reemplazado por regiones de promotores nuevas. Los plásmidos construidos nuevamente son usados para transformar establemente las plantas de soya. Las plantas de soya transgénicas son aisladas y caracterizadas molecularmente. La acumulación del LC-PUFA resultante es determinada mediante el análisis de los perfiles de lípidos (FAME), usando los métodos descritos aquí, y las plantas de soya, las cuales producen desde 0.01 % hasta 15% del DHA en peso total ácidos grasos, desde 0.01 % hasta 10% del DPA(n-6) en peso total ácidos grasos, o desde 0.01 % hasta 10% del EPA en peso total ácidos grasos, son identificadas.
Uso de Promotores en el Desarrollo de la Semilla EJ EMPLO 8.1 : Construcción de PDAB9166 El plásmido pDAB9166 (Fig . 14; SEQ ID NO:40) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB9166 contienen tres PTU de la sintasa del PU FA, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v1 de LfKCS3, SzPUFA OrfA v3 y AtuORF23 3' UTR v1 . El segundo PTU de la sintasa del PU FA contiene el promotor v1 de LfKCS3, SzPUFA OrfB v3 y AtuOrf23 3' UTR v1 . El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v1 de Lf CS3, hSzTh PU FA OrfC v3 y AtuORF23 3' UTR v1 . The PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v 1 de LfKCS3, NoHetl v3 y AtuORF23 3' UTR v1 .
Los plásm idos pDAB9161 , pDAB9162, pDAB9163, PDAB 101484 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB9166. Específicamente, los cuatro PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola, dentro de las regiones de borde del ADN de cadena T, del PDAB7333 binario de transformación vegetal. El orden de los genes es: SzPU FA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetl v3. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF I 3 'UTR v4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T) . Los plásmidos recombinantes que contienen los cinco PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los cinco PTU, con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
EJ EMPLO 8.2: Construcción de PDAB9167 El plásmido pDAB9167 (Fig. 15; SEQ ID NO:41 ) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB9167 contiene tres PTU de la sintasa del PUFA, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v1 de LfKCS3, SzPUFA OrfA v3 y AtuORF23 3' UTR v1 . El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v1 de BoACP, BoACP 5' UTR v 1 , SzPU FA OrfB v3 y AtuOrf23 3' UTR v1 . El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v1 de LfKCS3, hSzThPUFA OrfC v3 y AtuORF23 3' UTR v1 . El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v1 de BoACP, BoACP 5' UTR v1 , NoHetl v3 y AtuORF23 3' UTR v1 .
Los plásm idos pDAB9161 , pDAB9165, pDAB9163, PDAB 101485 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB9167. Específicamente, los cuatro PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola, dentro de las regiones de borde del ADN de cadena T, del pDAB7333 binario de transformación vegetal. El orden de los genes es: SzPU FA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetl v3. pDAB7333 tambien contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF I 3'UTR v4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T). Los plásmidos recombinantes que contienen los cinco PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los cinco PTU , con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
Los plásmidos que contienen el promotor de faseolina EJ EMPLO 8.3: Construcción de PDAB7379 pDAB7379 es un plásm ido binario que fue construido para contener las versiones reconstruidas de codón optimizado de SzPU FA OrfA, SzPUFA OrfB, hSzThPUFA OrfC y NoHetl . La secuencia del gen SzACS-2 no está incluida en este constructo. El plásmido pDAB7379 (Fig . 16; SEQ I D NO:42) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB7379 contienen tres PTU de la sintasa del PUFA, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 y AtuORF23 3' UTR v1 . El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 y AtuORF23 3' UTR v1 . El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y AtuORF23 3' UTR v1 . El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, NoHetl v3 y AtuORF23 3' UTR v1 .
Los plásmidos pDAB7371 , pDAB7372, pDAB7373, pDAB7374 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB7379. Específicamente, los cuatro PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola, dentro de las regiones de borde del ADN de cadena T, del pDAB7333 binario de transformación vegetal . El orden de los genes es: SzPU FA OrfA v3, SzPU FA Orf B v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetl v3. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF I 3'UTR v4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T) . Los plásmidos recombinantes que contienen los cinco PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los cinco PTU, con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
EJEMPLO 8.4: Construcción de DAB7380 pDAB7380 es un plásmido binario que fue construido para contener las versiones reconstruidas de codón optimizado de SzPUFA OrfA, SzPUFA OrfB, hSzThPUFA OrfC y NoHetl . La secuencia del gen SzACS-2 no está contenida en este constructo. La versión del promotor de faseolina usada en este constructo, fue modificada esencialmente como descrito en Bustos et al., 1989 (The Plant Cell , Vol, 1 ; 839-853), donde la porción en 5’ del promotor fue truncada, y la región no traducida de faseolina en 5’ fue dejada intacta. El plásmido pDAB7380 (Fig . 17; SEQ I D NO:43) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB7380 contiene tres PTU de la sintasa del PUFA, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 y AtuORF23 3' UTR v1. El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 y AtuORF23 3' UTR v1 . El tercer PTU de la sintasa del PU FA contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y AtuORF23 3' UTR v1 . El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor de PvPhas, PvPhas 5' UTR, NoHetl v3 y AtuORF23 3’ UTR v1 .
Los plásmidos pDAB7375, pDAB7376, pDAB7377, pDAB7378 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB7380. Específicamente, los cuatro PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola, dentro de las regiones de borde del ADN de cadena T, del pDAB7333 binario de transformación vegetal. El orden de los genes es: SzPU FA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetl v3. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v 2 de CsVMV, PAT v5, AtuORFI 3'UTR v4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T) . Los plásmidos recombinantes que contienen los cinco PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los cinco PTU, con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
EJ EMPLO 8.5: Construcción de DAB9323 pDAB9323 es un plásmido binario que fue construido para contener las versiones originales sin codón optimizado de SzPU FA OrfA, SzPU FA OrfB, hSzThPU FA OrfC, SzACS-2 y NoHetl. El plásmido pDAB9323 (Fig . 18; SEQ I D NO:44) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB9323 contienen tres PTU de la sintasa del PUFA, un PTU de la acil-CoA sintetasa, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa.
Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PU FA contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzPU FA OrfA v2, PvPhas 3' UTR v1 and PvPhas 3' MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido). El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzPU FA OrfB v2, PvPhas 3' UTR v1 y PvPhas 3' MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido) . El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, SzPU FA OrfC v2 , PvPhas 3' UTR v1 y PvPhas 3' MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido) . El PTU de la acil-CoA sintetasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzACS-2 v2 gen, PvPhas 3' UTR v1 y PvPhas 3' MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido) . El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, NoHetl v2, PvPhas 3' UTR v1 y PvPhas 3' MAR v2 (no anotado en el mapa del plásm ido), Los plásmidos pDAB9307, pDAB931 1 , pDAB931 5, pDAB9322 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB9323. Específicamente, los cinco PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola, dentro de las regiones de borde del ADN de cadena T, del pDAB7333 binario de transformación vegetal. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v2, SzPUFA OrfB v 2, SzPU FA OrfC v2, NoHetl v2. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v 2 de CsVMV, PAT v5, AtuORFI 3 'UTR v4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T) . Los plásmidos recombinantes que contienen los seis PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los seis PTU , con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
EJEMPLO 8.6: Construcción de PDAB9330 pDAB9330 es un plásmido binario que fue construido para contener las versiones reconstruidas de codón optimizado de SzPUFA OrfA, SzPUFA OrfB, hSzThPU FA OrfC, SzACS-2 y NoHetl .
El plásmido pDAB9330 (Fig. 19; SEQ I D NO:45) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. El pDAB9330 contiene tres PTU de la sintasa del PU FA, un PTU de la acil-CoA sintetasa, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzPU FA OrfA v3, PvPhas 3' UTR v1 y PvPhas 3’ MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido). El segundo PTU de la sintasa del PU FA contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzPUFA Orf B v3, PvPhas 3' UTR and PvPhas 3' MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido). El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3, PvPhas 3' UTR v1 y PvPhas 3’ MAR v2 (no anotado en el mapa del plásm ido) . El PTU de la acil-CoA sintetasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzACS-2 v3 gen, PvPhas 3' UTR v1 y PvPhas 3' MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido). El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, NoHetl v3, PvPhas 3' UTR v1 y PvPhas 3' MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido), Los plásm idos pDAB9324, pDAB9325, pDAB9326, pDAB9329 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB9330. Específicamente, los cinco PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola, dentro de las regiones de borde del ADN de cadena T, del pDAB7333 binario de transformación vegetal . El orden de los genes es: SzPU FA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzACS-2 v3, NoHetl v3. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORFI 3' UTR v4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivacíón y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T). Los plásmidos recombinantes que contienen los seis PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los seis PTU , con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
EJ EMPLO 8.7: Construcción de PDAB9337 El pDAB9337 es un plásmido binario que fue construido para contener las versiones reconstruidas de codón optimizado de SzPU FA OrfA, SzPU FA OrfB, hSzThPUFA OrfC y NoHetl , expresión la cual es activada mediante el promotor de faseolina. El plásmido pDAB9337 (Fig . 20; SEQ I D NO:46) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R.
El pDAB9337 contiene tres PTU de la sintasa del PUFA, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PU FA contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfA v3, PvPhas 3' UTR v1 y PvPhas 3' MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido). El segundo PTU de la sintasa del PU FA contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzPU FA OrfB v 3, PvPhas 3' UTR v1 y PvPhas 3' MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido). El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, hSzTh PUFA OrfC v3, PvPhas 3' UTR v 1 y PvPhas 3' MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido). El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, NoHetl v3, PvPhas 3’ UTR v1 y PvPhas 3' MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido), Los plásmidos pDAB9324, pDAB9325, pDAB9326, pDAB9328 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB9337. Específicamente, los cuatro PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola, dentro de las regiones de borde del ADN de cadena T, del pDAB7333 binario de transformación vegetal. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, SzPU FA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetl v3. El pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORFI 3' UTR v4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T). Los plásmidos recombinantes que contienen los cinco PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los cinco PTU, con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
EJEMPLO 8.8: Construcción de PDAB9338 pDAB9338 es un plásmido binario que fue construido para contener las versiones reconstruidas de codón optimizado de SzPUFA OrfA, SzPUFA OrfB, hSzThPUFA OrfC y NoHetl . El promotor de faseolina es usado para activar la expresión de SzPUFA OrfA, y el promotor PvDlec2 es usado para activar los otros transgenes. El plásmido pDAB9338 ( F i g . 21 ; SEQ I D NO:47) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB9338 contiene tres PTU de la sintasa del PUFA, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfA v3, PvPhas 3' UTR v1 y PvPhas 3' MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido) . El segundo PTU de la sintasa del PU FA contiene el promotor v 2 de PvDlec2, 2S 5‘ UTR, SzPUFA OrfB v3 y terminador v1 de At2S SSP. El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, hSzThPU FA OrfC v3 y terminador v 1 de At2S SSP. El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, NoHetl v3 y terminador v1 de At2S SSP.
Los plásmidos pDAB9324, pDAB7335, pDAB7336, pDAB7338 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB9338. Específicamente, los cuatro PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola, dentro de las regiones de borde del ADN de cadena T, del pDAB7333 binario de transformación vegetal . El orden de los genes es: SzPU FA OrfA v3, SzPU FA OrfB v3, hSzThPU FA OrfC v3, NoHetl v3. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v 2 de CsVMV, PAT v5, AtuORFI 3' UTR v 4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T). Los plásmidos recombinantes que contienen los cinco PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los cinco PTU, con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
EJEMPLO 8.9: Construcción de PDAB9344 pDAB9344 es un plásmido binario que fue construido para contener las versiones reconstruidas de codón optimizado de SzPU FA OrfA, SzPUFA OrfB, hSzThPUFA OrfC y NoHetl todos de los cuales contienen la cadena pequeña 1 A de ribulosa bifosfato carboxilasa (marcada como SSU-TP v 1 ) , la cual está fundida con el terminal amino de la secuencia codificante. El promotor de faseolina es usado para activar la expresión de SzPUFA OrfA, y el promotor de PvDlec2 es usado para activar los otros transgenes.
El plásmido pDAB9344 (Fig . 22; SEQ I D NO:48) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB9344 contiene tres PTU de la sintasa del PUFA, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfA v4, PvPhas 3' UTR v 1 y PvPhas 3’ MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido). El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v 3 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzPU FA OrfB v4, PvPhas 3’ UTR v1 y PvPhas 3' MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido) . El tercer PTU de la sintasa del PU FA contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v4, PvPhas 3' UTR v1 y PvPhas 3’ MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido). El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, NoHetl v4, PvPhas 3' UTR v1 y PvPhas 3' MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido).
Los plásm idos pDAB9343, pDAB9342, pDAB9340, pDAB9331 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB9344. Específicamente, los cuatro PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola , dentro de las regiones de borde del ADN de cadena T, del pDAB7333 binario de transformación vegetal. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v4, SzPU FA OrfB v4, hSzThPUFA OrfC v4, NoHetl v4. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF I 3 'UTR v4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T). Los plásmidos recombinantes que contienen los seis PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los cinco PTU, con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
EJ EMPLO 8.10: Construcción de DAB9396 pDAB9396 es un plásmido binario que fue construido para contener las versiones reconstruidas de codón optimizado de SzPUFA OrfA, SzPUFA OrfB, hSzThPUFA OrfC, SzACS-2 y NoHetl. El promotor de faseolina es usado para activar la expresión de SzPUFA OrfA y SzPU FA OrfB. El promotor de PvDlec2 es usado para activar los otros transgenes; hSzThPUFA OrfC, SzACS- 2 y NoHetl .
El plásm ido pDAB9396 (Fig. 23; SEQ I D NO:49) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB9396 contiene tres PTU de la sintasa del PUFA, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PU FA contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfA v3, PvPhas 3' UTR v1 y PvPhas 3' MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido). El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 y terminador v1 de At2S SSP. El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y terminador v1 de At2S SSP. El PTU de la acil-CoA sintetasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzACS-2 v3 gen , PvPhas 3' UTR v1 y PvPhas 3' MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido) . El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v 2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, NoHetl v3 y terminador v1 de At2S SSP.
Los plásmidos pDAB9324, pDAB7335, pDAB7336, pDAB7339 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB9338.
Específicamente, los cinco PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola, dentro de las regiones de borde del ADN de cadena T, del pDAB7333 binario de transformación vegetal. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPU FA OrfC v3, SzACS-2 v3, NoHetl v3. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORFI 3' UTR v4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T) . Los plásmidos recombinantes que contienen los cinco PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los seis PTU , con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN.
EJEMPLO 8.1 1 : Construcción de pDAB 101412 pDAB 101412 es un plásmido binario que fue construido para contener las versiones reconstruidas de codón optimizado de SzPU FA OrfA, SzPUFA OrfB, hSzThPU FA OrfC, SzACS-2 y NoHetl . La versión del promotor de faseolina usada en este constructo, fue modificada esencialmente como descrito en Bustos et al. , 1989 ( The Plant Cell, Vo 1 , 1 ; 839-853), donde la porción en 5’ del promotor fue truncada, y la región no traducida de faseolina en 5’ fue dejada intacta. Las secuencias del promotor de faseolina truncado están identificadas a través de toda esta solicitud como versión 4 (v4), versión 5 (v5), y versión 6 (v6). El plásmido pDAB1 01412 (Fig. 24; SEQ I D NO:50) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB 101412 contiene tres PTU de la sintasa del PUFA, un PTU de la acil-CoA sintetasa, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa . Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PU FA contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 y AtuORF23 3' UTR v1 . El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzPU FA OrfB v3 y AtuORF23 3' UTR v1 . El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, hSzThPU FA OrfC v3 y AtuORF23 3' UTR v1 . El PTU de la acil-CoA sintetasa contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, 2S 5’ UTR, gen SzACS-2 v3 y AtuORF23 5' UTR v1 . El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor de PvPhas, PvPhas 5' UTR, NoHetl v3 y AtuORF23 3' UTR v1 .
Los plásm idos pDAB7375, pDAB7376, pDAB7377, pDAB7398 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB 101412. Específicamente, los cinco PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola, dentro de las regiones de borde del ADN de cadena T, del pDAB7333 binario de transformación vegetal. El orden de los genes es: SzPU FA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzACS-2 v3, NoHetl v3. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v 2 de CsVMV, PAT v5, AtuORFI 3'UTR v4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T). Los plásmidos recombinantes que contienen los cinco PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los seis PTU , con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN. Transformación de la Sova con Promotores que se Expresan Tempranamente en el Desarrollo de la Semilla Los plásmidos son usados para transformar de forma estable las plantas de soya usando los protocolos descritos anteriormente. Las plantas de soya transgénicas están aisladas y caracterizadas molecularmente. El uso de constructos alternativos tiene por resultado las plantas de soya, las cuales contienen cantidades más grande del DHA y de los LC-PU FA. La acumulación del LC-PU FA resultante es determinada y las plantas de soya, las cuales producen desde 0.01 % hasta 15% del DHA o desde 0.01 % hasta 1 5% del LC-PUFA, son identificadas.
EJEMPLO 9 Expresión del conjunto de genes de la sintasa algácea del PU FA usando diseños de constructos alternativos Introducción de la diversidad de promotores para reducir la duplicación de los elementos reguladores El silenciamiento de genes es un fenómeno, el cual ha sido observado en las generaciones de progenie de los eventos de la soya transgénica. Varios artículos de revista discuten el silenciamiento de genes transcripcional (TGS) y el silenciamiento de genes post-transcripcional (PTGS), tal como aquellos de Waterhouse I . , 2001 ( Nature 41 1 :834-842) , Vaucheret y Fagard, 2001 ( Trends in Gentíos 17(1): 29-35, y Okamoto y Hirochika, 2001 ( Trends in Plant Sci. 6 ( 1 1 ) : 527-534). En las plantas, el silenciamiento de genes puede ser accionado mediante la duplicación de las secuencias de polinucleótidos transgénicas (las secuencias transgénicas de repetición en tándem , las secuencias transgénicas de repetición invertida o las inserciones múltiples dentro del cromosoma), o cuando una secuencia homologa con respecto a las secuencias de genes objetivo, es llevada a cabo tanto mediante un virus vegetales infeccioso como mediante el ADN-T de Agrobacterium tumefaciens.
En adición, la duplicación de las secuencias de polinucleótidos transgénicas puede actuar como activadores para la inestabilidad del constructo. Las secuencias transgénicas múltiples, las cuales comparten los altos niveles de similitud de secuencias, pueden replegarse el uno en el otro. Los rea condicionamientos pueden ocurrir por la vía de la recombinación homologa, donde las secuencias intercaladas del ADN son extirpadas. Como un resultado, los fragmentos del ADN los cuales están ubicados entre las secuencias de polinucleótidos repetidas transgénicas son extirpados.
Una estrategia en el diseño de los vectores plasmídicos, es la de introducir la diversidad del promotor dentro de un constructo, mediante la incorporación de los promotores específicos de la semilla, únicos y múltiples, los cuales mantienen un alto nivel de expresión de cada transgén. I ntroduciendo la diversidad de secuencia de promotores dentro de los vectores plasmídicos, puede reducir el silenciamiento de genes y mejorar la estabilidad plasmídica. Los múltiples promotores específicos de la semilla incluyen PvDlec2, Faseolina, y Napina (Patente norteamericana no. 5.608.152). Estos promotores son relativamente comparables en la actividad promotora, tal como la especificidad del tejido, los niveles de expresión, la duración de la expresión, etc.
EJEMPLO 9.1 : Construcción de PDAB7733 El plásmido binario pDAB7733 (Fig . 25; SEQ I D NO: 51 ) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB7733 contiene tres PTU de la sintasa del PUFA, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PU FA contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzPU FA OrfA v3 y AtuORF23 3' UTR v1 . El segundo PTU de la sintasa del PU FA contiene el promotor v1 de BnaNapinC, BnaNapinC 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 y BnaNapinC 3' UTR v1 . El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5’ UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y terminador v1 de At2S SSP. El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v5 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, NoHetl v3 y AtuOrf23 3' UTR v1 .
Los plásmidos pDAB7375, pDAB7731 , pDAB7336, pDAB7378 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB7733.
Específicamente, los cuatro PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola, dentro de las regiones de borde del ADN de cadena T, del pDAB7333 binario de transformación vegetal. El orden de los genes es: SzPU FA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPU FA OrfC v3 , NoHetl v3. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORFI 3 'UTR v4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T) . Los plásmidos recombinantes que contienen los cinco PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los cinco PTU, con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
EJEMPLO 9.2: Construcción de PDAB7734 El plásmido binario pDAB7734 (Fig. 26; SEQ I D NO:52) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB7734 contiene tres PTU de la sintasa del PUFA, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 y terminador v1 de At2S SSP. El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 y AtuORF23 3’ UTR v1 . El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v1 de BnaNapinC, BnaNapinC 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y BnaNapinC 3' UTR v1 . El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, NoHetl v3 y terminador v1 de At2S SSP.
Los plásmidos pDAB7334, pDAB7376, pDAB7732, pDAB7338 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB7734. Específicamente, los cuatro PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola, dentro de las regiones de borde del ADN de cadena T, del pDAB7333 binario de transformación vegetal. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPU FA OrfC v3, NoHetl v3. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORFI 3' UTR v4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T) . Los plásmidos recom binantes que contienen los cinco PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los cinco PTU, con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
EJ EMPLO 9.3: Construcción de PDAB101493 El plásmido binario pDAB101493 (Fig. 27; SEQ I D NO:53) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB 101493 contiene tres PTU de la sintasa del PUFA, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 y terminador v1 de At2S SSP. El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5 UTR, SzPUFA OrfB v 3 y AtuORF23 3' UTR v1 . El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v 2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, hSzThPU FA OrfC v3 y terminador v1 de At2S SSP. El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v5 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, NoHetl v3 y AtuOrf23 3' UTR v1 .
Los plásmidos pDAB7334, pDAB7376, pDAB7336, pDAB7378 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB101493. Específicamente, los cuatro PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola, dentro de las regiones de borde del ADN de cadena T, del pDAB7333 binario de transformación vegetal . El orden de los genes es: SzPU FA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetl v3. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORFI 3 'UTR v4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T). Los plásmidos recom binantes que contienen los cinco PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los cinco PTU, con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
EJ EMPLO 9.4: Construcción de ODAB109507 El plásmido pDAB109507 (Fig . 28; SEQ I D NO: 54) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB 1 09507 contiene tres PTU de la sintasa del PUFA, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 y PvPhas 3' UTR v1 y PvPhas 3' MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido) . El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v1 de BnaNapinC, BnaNapinC 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 y BnaNapinC 3' UTR v1. El tercer PTU de la sintasa del PU FA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y terminador v1 de At2S SSP. El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor de BoACP/5' UTR vi , NoHetl v3 y AtuOrf23 3' UTR v1 .
Los plásmidos pDAB9324, pDAB7731 , pDAB7336, pDAB 101485 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB109507. Específicamente, los cuatro PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola, dentro de las regiones de borde del ADN de cadena T, del pDAB7333 binario de transformación vegetal. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, SzPU FA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v 3, NoHetl v3. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v 2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF 1 3 'UTR v4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T) . Los plásmidos recombinantes que contienen los cinco PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los cinco PTU , con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
EJ EMPLO 9.5: Construcción de PDAB109508 El plásmido pDAB 109508 (Fig . 29; SEQ I D NO: 55) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB 109508 contiene tres PTU de la sintasa del PU FA, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PU FA contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzPU FA OrfA v3 y PvPhas 3' UTR v1 y PvPhas 3' MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido) . El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v1 de BnaNapinC , BnaNapinC 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 y BnaNapinC 3' UTR v1 . El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v 2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y terminador v1 de At2S SSP. El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, NoHetl v3 y terminador v1 de At2S SSP.
Los plásmidos pDAB9324, pDAB7731 , pDAB7336, pDAB7338 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB 109508. Específicamente, los cuatro PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola, dentro de las regiones de borde del ADN de cadena T, del pDAB7333 binario de transformación vegetal. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, SzPU FA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetl v3. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORFI 3' UTR v4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T) . Los plásm idos recombinantes que contienen los cinco PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los cinco PTU, con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
EJ EMPLO 9.6: Construcción de PDAB1 09509 El plás ido pDAB 109509 (Fig . 30; SEQ I D NO: 56) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB 109509 contiene tres PTU de la sintasa del PUFA, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v 2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 y terminador v1 de At2S SSP. El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR5 SZP U FA OrfB v3 y terminador v1 de At2S SSP. El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, hSzThPU FA OrfC v3 y terminador v1 de At2S SSP. El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor de BoACP/5' UTR v1 , NoHetl v3 y AtuOrf23 3' UTR v1.
Los plásmidos pDAB7334, pDAB7335, pDAB7336, pDAB 101485 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB109509. Específicamente, los cuatro PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola, dentro de las regiones de borde del ADN de cadena T, del PDAB7333 binario de transformación vegetal. El orden de los genes es: SzPU FA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPU FA OrfC v3, NoHetl v3. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF I 3'UTR v4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T). Los plásmidos recombinantes que contienen los cinco PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los cinco PTU, con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
Transposición del orden de los ptu del constructo binario para reducir la fragmentación de las secuencias largas de genes El PTU de SzPUFA OrfA fue colocado en el extremo 3’ del constructo binario, con el fin de ensayar si el orden de los casetes de PTU podría reducir la fragmentación y las transposiciones, en los eventos transgénicos aislados. SzPU FA OrfA es un marco de lectura abierto grande (~8.700 b. p.), que contiene nueve repeticiones de proteína portadora de acilo en tándem . En la primera serie de los constructos completados, el PTU de SzPUFA OrfA fue posicionado para ser integrado primero dentro del cromosoma vegetal. El PTU de SzPUFA OrfA fue seguido subsiguientemente por los remanentes PTU de gen relacionado con la síntesis del PUFA, cuando ellos decrecieron en el tamaño molecular. El análisis molecular de la región codificante de SzPU FA OrfA indicó, que algunos eventos de cañóla transgénica y de Arabidopsis thaliana , contenían inserciones fragmentadas, Los diseños de constructos alternativos están descritos, donde el orden de los PTU de la sintasa del PUFA ha sido cambiado a la siguiente configuración; PTU de hSzThPUFA OrfC, PTU de SzPUFA OrfB, PTU de NoHetl , PTU de SzPUFA OrfA y PTU de PAT. Cambiando la ubicación del PTU de SzPU FA OrfA en el constructo binario, es completado para reducir la fragmentación y la transposición en los eventos transgénicos aislados.
EJ EMPLO 9.7: Construcción de PDAB9151 El plásmido pDAB9151 (Fig. 31 ; SEQ ID NO: 57) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB9151 contiene tres PTU de la sintasa del PUFA, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 y term inador v1 de At2S SSP. El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, hSzThPU FA OrfC v3 y terminador v1 de At2S SSP. El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, NoHetl v3 y terminador v1 de At2S SSP. El PTU final de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 y terminador v1 de At2S Los plásmidos pDAB9148, pDAB7335, pDAB9149, pDAB9150 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB9151 . Específicamente, los cuatro PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola, dentro de las regiones de borde del ADN de cadena T, del pDAB7333 binario de transformación vegetal. El orden de los genes es: hSzThPUFA OrfC v3, SzPUFA OrfB v3, NoHetl v3, SzPUFA OrfA v3. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF I 3'UTR v4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T). Los plásmidos recombinantes que contienen los cinco PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los cinco PTU, con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
Cambio de la dirección transcripcional de los ptu del constructo binario para introducir la diversidad del constructo Un diseño de constructo alternativo incluye el cambio del orden de los PTU de la sintasa del PUFA, y la dirección transcripcional de los casetes de expresión del gen. En la primera serie de los constructos completados, cada casete de expresión del gen fue posicionado en la misma dirección ("de cabeza a cola" donde el promotor de un casete de expresión del gen está ubicada adyacente a la UTR en 3’, de un segundo casete de expresión del gen). Los siguientes constructos describen una estrategia donde, los casetes de expresión del gen están posicionados en diferentes direcciones, y utilizan promotores alternativos: En estos ejemplos, el casete de expresión del gen está ubicado en trans con respecto a un segundo casete de expresión del gen, de manera que los promotores de ambos casetes de expresión del gen, están diseñados adyacentes el uno con el otro. Esta configuración está descrita como una configuración “cabeza con cabeza”. Otras configuraciones están descritas en los ejemplos, donde uno de los casetes de expresión del gen está ubicado en trans con respecto al segundo casete de expresión del gen , de manera que las UTRs en 3' de ambos casetes de expresión del gen, están diseñadas adyacentes el uno con el otro. Esta configuración está descrita como una configuración "cola con cola". Con el fin de mitigar una translectura potencial de tal un diseño, el terminador bidireccional de Orf 23/24 ha sido colocado entre estos dos PTU . Estas configuraciones son propuestas para incrementar la expresión de los transgenes, resultando de ese modo en concentraciones y contenido más altos de ácido graso en el LC-PUFA y en el DHA. EJEMPLO 9.8: Construcción de PDAB1 08207 El plásmido pDAB 108207 (Fig. 32; SEQ I D NO: 58) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB 108207 contiene tres PTU de la sintasa del PU FA, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v 2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 y terminador v1 de At2S SSP. El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v6 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, NoHetl v3, PvPhas 3' UTR v1 y PvPhas 3' MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido) . El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v 2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3, el terminador v1 de At2S SSP and AtuORF23 3' UTR v1 . El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v6 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzPU FA OrfB v3, PvPhas 3' UTR y PvPhas 3' MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido) y AtuORF23 3’ UTR v1 .
Los plásmidos pDAB7334, pDAB101489, pDAB108205, pDAB 108206 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB 108207. Específicamente, el SzPU FA OrfA v3 y NoHetl v3 están colocados en una orientación cola con cola; NoHetl v3 y hSzThPUFA OrfC v3 están colocados en una orientación cabeza con cabeza; hSzThPU FA OrfC v3 y SzPU FA OrfB están colocados en una orientación cola con cola dentro de las regiones de borde del ADN de cadena T, del pDAB7333 binario de transformación vegetal. El orden de los genes es: SzPU FA OrfA v3, NoHetl v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzPUFA OrfB v3. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v 2 de CsVMV, PAT v 5, AtuORFI 3 'UTR v4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T) . Los plásmidos recombinantes que contienen los cinco PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los cinco PTU, con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
EJEMPLO 9.9: Construcción de PDAB108208 El plásmido pDAB 108208 (Fig . 33; SEQ I D NO: 59) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB 108208 contiene tres PTU de la sintasa del PU FA, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPU FA OrfA v3 y el term inador v1 de At2S SSP. El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, NoHetl v3 y AtuORF23 3' UTR v1 . El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v 2 de PvDlec2, 2S 5‘ UTR, hSzThPU FA OrfC v3 y el terminador v1 de At2S SSP. El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v5 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzPU FA OrfB v3, PvPhas 3' UTR, PvPhas 3" MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido) y AtuORF23 3’ UTR v1 .
Los plásmidos pDAB 108200, pDAB 1 01490, pDAB 108201 , pDAB 108202 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB 108208. Específicamente, el SzPUFA OrfA v3 y el NoHetl v3 están colocados en una orientación cabeza con cabeza; NoHetl v3 y hSzThPUFA OrfC v3 están colocados en una orientación cola con cola; hSzThPUFA OrfC v3 y SzPUFA OrfB están colocados en una orientación cabeza con cabeza dentro de las regiones de borde del ADN de cadena T, del pDAB7333 binario de transformación vegetal. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, NoHetl v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzPUFA OrfB v3. pDAB7333 tambien contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORFI 3 'UTR v4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T). Los plásmidos recombinantes que contienen los cinco PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los cinco PTU, con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
EJ EMPLO 9.10: Construcción de PDAB 108209 El plásmido pDAB108209 (Fig. 34; SEQ I D NO: 60) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB108209 contiene tres PTU de la sintasa del PUFA, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5 UTR, SzPUFA OrfA v3 y el term inador v1 de At2S SSP. El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, NoHetl v3 y AtuORF23 3' UTR v1 . El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y el terminador v1 de At2S SSP. El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v5 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzPU FA OrfB v3, PvPhas 3' UTR and PvPhas 3' MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido) y espaciador de ADN aleatorio Los plásmidos pDAB108200, pDAB 108204, pDAB108201 , pDAB 108202 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB 108209. Específicamente, el SzPU FA OrfA v3 y NoHetl v3 están colocados en una orientación cabeza con cabeza; NoHetl v3 y hSzTh PUFA OrfC v3 están colocados en una orientación cola con cola; hSzThPUFA OrfC v3 y SzPUFA OrfB están colocados en una orientación cabeza con cabeza dentro de las regiones de borde del ADN de cadena T, del pDAB7333 binario de transformación vegetal. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, NoHetl v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzPUFA OrfB v3. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v 2 de CsVMV, PAT v5, AtuORFI 3 'UTR v4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T). Los plásmidos recombinantes que contienen los cinco PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los cinco PTU, con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN.
Duplicación de los UTRs en 3' e Incluyendo ADN Espaciador para Minimizar la I nterferencia La interferencia transcripcional puede ocurrir cuando múltiples genes están apilados en una serie teniendo, de esa forma, por resultado la expresión reducida de los genes secuencia descendente. Este fenómeno resulta de la translectura transcripcional del terminador y de la UTR en 3' dentro de la próxima unidad de transcripción del promotor. Los diseños alternativos del constructo constan de dos estrategias, con el fin de minimizar la interferencia transcripcional y la interferencia transcripcional está descrita. La primera estrategia aplica el uso de dos terminador/UTRs en 3', los cuales están apilados entre los casetes de expresión del gen individual del DHA, con el fin de limitar la translectura dentro del próximo casete de expresión del gen. La segunda estrategia introduce aproximadamente un mil apareamientos de bases del ADN espaciador, entre los casetes de expresión del gen, minim izando de esa forma la interferencia transcripcional.
EJEMPLO 9.1 1 : Construcción de PDAB 108207 El plásmido pDAB 108207 (Fig . 32; SEQ I D NO: 58) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB 108207 contiene tres PTU de la sintasa del PUFA, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPU FA OrfA v3 y el terminador v1 de At2S SSP. El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzPU FA OrfB v3, PvPhas 3' UTR, PvPhas 3' MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido), y AtuORF23 3' UTR v1 . El tercer PTU de la sintasa del PU FA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3, el terminador v1 de At2S SSP and AtuORF23 3' UTR v1 . El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v6 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, NoHetl v3, PvPhas 3' UTR v1 y PvPhas 3' MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido) .
Los plásmidos pDAB7334, pDAB101489, pDAB108205, pDAB 108206 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB 108207. Específicamente, el SzPU FA OrfA v3 y NoHetl v3 están colocados en una orientación cola con cola, y un AtuORF23 3 ' UTR está colocado entre los dos PTU ; NoHetl v3 y hSzThPUFA OrfC v3 están colocados en una orientación cabeza con cabeza; hSzThPUFA OrfC v 3 y SzPUFA OrfB están colocados en una orientación de cabeza a cola, y un AtuORF23 3 'UTR está colocado entre los dos PTU dentro de las regiones de borde del ADN de cadena T, del pDAB7333 binario de transformación vegetal . El orden de los genes es: SzPU FA OrfA v3, NoHetl v3, hSzTh PUFA OrfC v3, SzPUFA OrfB v3. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF 1 3' UTR v4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T) . Los plásmidos recombinantes que contienen los cinco PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los cinco PTU , con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
EJEMPLO 9.12: Construcción de PDAB 108208 El plásmido pDAB108208 (Fig . 33; SEQ I D NO: 59) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB 108208 contiene tres PTU de la sintasa del PU FA, un PTU de la acil-CoA sintetasa, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPU FA OrfA v3 y el terminador v1 de At2S SSP. El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v5 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfB v3, PvPhas 3' UTR, PvPhas 3' MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido) y AtuORF23 3' UTR v1 . El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y el terminador v1 de At2S SSP. El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5’ UTR, NoHetl v3 y AtuORF23 3’ UTR v1 .
Los plásmidos pDAB 108200, pDAB 101490, pDAB 108201 , pDAB 108202 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB 108208. Específicamente, el SzPU FA OrfA v 3 y NoHetl v 3 están colocados en una orientación cabeza con cabeza; NoHetl v3 y hSzThPU FA OrfC v 3 están colocados en una orientación cola con cola, y un AtuORF23 3 'UTR está colocado entre los dos PTU ; hSzThPUFA OrfC v3 y SzPU FA OrfB están colocados en una orientación cabeza con cabeza dentro de las regiones de borde del ADN de cadena T, del pDAB7333 binario de transformación vegetal. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, NoHetl v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzPUFA OrfB v3. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v 5, AtuORFI 3' UTR v4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T) . Los plásmidos recombinantes que contienen los cinco PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los cinco PTU, con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN.
EJEMPLO 9.1 3: Construcción de PDAB 108209 El plásmido pDAB 108209 (Fig . 34; SEQ I D NO:60) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB 108209 contiene tres PTU de la sintasa del PUFA, un PTU de la acil-CoA sintetasa, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPU FA OrfA v3 y el terminador v1 de At2S SSP. El segundo PTU de la sintasa del PU FA contiene el promotor v5 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfB v3, PvPhas 3' UTR, PvPhas 3' MAR v2 (no anotado en el mapa del plásmido), y espaciador ADN aleatorio. El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v 2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y el terminador v1 de At2S SSP. El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, NoHetl v3 y AtuORF23 3’ UTR v1.
Los plásmidos pDAB 108200, pDAB 108204, pDAB 108201 , pDAB 108202 y pDAB7333 fueron recom binados para formar pDAB108209. Específicamente, el SzPU FA OrfA v3 y NoHetl v3 están colocados en una orientación cabeza con cabeza; NoHetl v3 y hSzThPUFA OrfC v3 están colocados en una orientación cola con cola, y un espaciador de un m il apareamientos de bases está colocado entre los dos PTU; hSzThPU FA OrfC v3 y SzPU FA OrfB están colocados en una orientación cabeza con cabeza dentro de las regiones de borde del ADN de cadena T, del pDAB7333 binario de transformación vegetal. El orden de los genes es: SzPU FA OrfA v3, NoHetl v3, hSzThPUFA OrfC v3, SzPUFA OrfB v3. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORFI 3'UTR v4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T). Los plásmidos recombinantes que contienen los cinco PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los cinco PTU , con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
Usando el Terminador de UTR en 3’ Alternativo para Limitar la Translectura Transcripcional.
El term inador de UTR en 3’ de ORF 23 de Agrobacterium es usado, principalmente, para determinar la transcripción en muchos de los constructos anteriores. Fue mostrado recientemente que el terminador de UTR en 3’ de Zm Lipase es más efectivo en la terminación de la translectura transcripcional en Arabidopsis thaliana. Como tal , una versión de los constructos utiliza el terminador de UTR en 3’ de ZmLipase en combinación con el promotor de PvDlec2 , con el fin de someter a ensayo con respecto a si esta UTR en 3' puede reducir la translectura transcripcional de los genes secuencia ascendente, reduciendo de esa forma la interferencia transcripcional.
EJEMPLO 9.14: Construcción de PDAB9159 El plásmido pDAB9159 (Fig. 35; SEQ ID NO:61 ) fue construido usando una reacción de recombinación con M u Itisite Gateway L-R. pDAB9159 contiene tres PTU de la sintasa del PU FA, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2 , 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 y ZmLip 3' UTR v1 . El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, SzPUFA OrfB v3 y ZmLip 3' UTR v1 . El tercer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y ZmLip 3’ UTR v1 . El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v3 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, NoHetl v3 y ZmLip 3' UTR v1.
Los plásm idos pDAB9152, pDAB91 53, pDAB91 54, pDAB9155 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB9159. Específicamente, los cuatro PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola, dentro de las regiones de borde del ADN de cadena T, del pDAB7333 binario de transformación vegetal . El orden de los genes es: SzPU FA OrfA v3, SzPUFA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetl v3. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORFI 3' UTR v4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T) . Los plásmidos recombinantes que contienen los cinco PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los cinco PTU, con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
EJEMPLO 9.1 5: Construcción de PDAB9147 El plásm ido pDAB9147 (Fig . 36; SEQ I D NO:62) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB9147 contiene tres PTU de la sintasa del PUFA, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v 2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v3, terminador v 1 de At2S SSP y ZmLip 3' UTR v1 . El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPU FA OrfB v3 y el terminador v1 de At2S SSP. El tercer PTU de la sintasa del PU FA contiene el promotor v 2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, hSzThPUFA OrfC v3 y el terminador v1 de At2S SSP. El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, NoHetl v3 y el terminador v1 de At2S SSP.
Los plásmidos pDAB9146, pDAB7335, pDAB7336, pDAB7338 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB9147. Específicamente, los cuatro PTU descritos anteriormente, fueron colocados en una orientación de cabeza a cola, dentro de las regiones de borde del ADN de cadena T, del pDAB7333 binario de transformación vegetal. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, SzPU FA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3, NoHetl v3. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORF I 3' UTR v4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T). Los plásmidos recombinantes que contienen los cinco PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los cinco PTU, con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
Entrega de Genes del DHA en dos ADN-Ts Separados.
Un diseño de constructo alternativo consta de la construcción de dos vectores binarios separados, que contiene el primer vector un sub-conjunto de los genes de la síntasa del PUFA en un ADN-T, y que contiene el segundo vector binario los remanentes genes de la sintasa del PU FA en un segundo ADN-T. Estos vectores binarios son usados individualmente para transformar las plantas, las cuales son cruzadas sexualmente, resultando así en progenie que contiene todos los constructos de expresión de gen de la sintasa del PUFA. Un metodo alternativo para producir plantas transgénicas, podría ser de co-transformar ambos vectores binarios dentro del tejido de la soya, y seleccionar o examinar respecto a una planta individual la cual contiene ambas cadenas de T.
EJEMPLO 9.16: Construcción de PDAB108224 El plásmido pDAB 108224 (Fig . 37; SEQ I D NO:63) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB 108224 contiene un PTU de la sintasa del PU FA, un PTU de fosfopanteteinil transferasa y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTR, SzPUFA OrfA v3 y el terminador v1 de At2S SSP. El PTU de fosfopanteteinil transferasa contiene el promotor v4 de PvPhas, PvPhas 5' UTR, NoHetl v3 y AtuORF23 3' UTR v1 .
Los plásmidos pDAB108216, pDAB108221 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB 108224. Específicamente, el SzPUFA OrfA v3 y NoHetl v3 están colocados en una configuración cabeza con cabeza dentro de las regiones de borde del ADN de cadena T, del pDAB7333 binario de transformación vegetal. El orden de los genes es: SzPUFA OrfA v3, NoHetl v3. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORFI 3' UTR v4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T). Los plásmidos recombinantes que contienen los cinco PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los tres PTU, con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN .
EJ EMPLO 9.17: Construcción de PDAB 108225 El plásmido pDAB 108225 (Fig . 38; SEQ I D NO: 64) fue construido usando una reacción de recombinación con Multisite Gateway L-R. pDAB 108225 contiene dos PTU de la sintasa del PU FA y un PTU de fosfinotricinacetil transferasa. Específicamente, el primer PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v2 de PvDlec2, 2S 5' UTRS SzPUFA OrfB v 3 y el terminador v1 de At2S SSP. El segundo PTU de la sintasa del PUFA contiene el promotor v4 de PvPhas, SzPUFA OrfB v3 y Atu ORF23 3' UTR v1 .
Los plásmidos pDAB108217, pDAB108222 y pDAB7333 fueron recombinados para formar pDAB 108225. Específicamente, el SzPUFA (MB v3 y hSzThPUFA OrfC v3 están colocados en una orientación cabeza con cabeza dentro de las regiones de borde del ADN de cadena T, del pDAB7333 binario de transformación vegetal . El orden de los genes es; SzPU FA OrfB v3, hSzThPUFA OrfC v3. pDAB7333 también contiene el PTU de fosfinotricinacetil transferasa: promotor v2 de CsVMV, PAT v5, AtuORFI 3'UTR v4 en adición a los otros elementos reguladores, tal como la sobreactivación y las secuencias de borde de cadena T (Borde A del ADN-T y Borde B del ADN-T). Los plásmidos recombinantes que contienen los cinco PTU fueron entonces aislados y sometidos a ensayos para la incorporación de los tres PTU, con la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación del ADN. Transformación de la soya con los constructos que contienen los diseños alternativos Estos plásmidos son usados para transformar de forma estable las plantas de soya, usando los protocolos descritos anteriormente. Las plantas de soya transgénicas están aisladas y caracterizadas molecularmente. El uso de los constructos alternativos tiene por resultado las plantas de soya, las cuales contienen cantidades más grandes del DHA y de los LC-PUFA. La acumulación del LC-PUFA resultante es determinada y las plantas de soya, las cuales producen desde 0.01 % hasta 15% del DHA o desde 0.01 % hasta 15% LC-PUFA, son identificadas.
EJEMPLO 10 Diseños de constructos alternativos usados para la transformación de Arabidopsis thaliana y producción subsiguiente del LC-PUFA y del DHA Las plantas de Arabidopsis thaliana fueron transformadas con cepas de Agrobacterium tumefaciens, que contiene los vectores binarios pDAB 101493, pDAB7362, pDAB7369, pDAB 101412 ó pDAB7380. Un protocolo de la transformación mediante la inmersión floral, descrito por Clough and Bent ( 1998), fue usado para la transformación. Clough and Bent, "Floral dip: a simplified method for agrobacterium-mediated transfor ation of Arabidopsis thalia" , ( Inmersión floral: un método simplificado para la transformación mediada por agrobacterium de Arabidopsis thalia )" Plant J. , 16:735-743, 1998. Fueron obtenidas las plantas transformadas de Arabidopsis, y fue completada la confirmación molecular de la presencia de transgén. Las plantas Ti a partir de los eventos transgénicos de Arabidopsis fueron cultivadas hasta la madurez en el invernadero. Estas plantas fueron auto-fertilizadas y la semilla T2 resultante fue cosechada en la madurez, las semillas T2 (10 mg) fueron analizadas por la vía de la GC-FID de los FAM E, con el fin de determinar el contenido del LC-PUFA y del DHA en la semilla T2 de Arabidopsis. El tejido fue analizado por la vía del método de la GC-FI D de los FAME, como descrito en los ejemplos previos. Las semillas T2 a partir de una planta T\ de las plantas de Arabidopsis que contenían desde 0% hasta 0.95% del DHA y desde 0% hasta 1 .50% del total del LC-PUFA. El contenido del LC-PUFA y del DHA de las semillas T2, a partir de las plantas individuales, se muestra en la figura 39.
EJEMPLO 1 1 Co-Expresión de DGAT2 ó de ACCasa con el conjunto de genes de la sintasa algácea del PU FA dentro de la soya El contenido de aceite dentro de las plantas de soya es modificado, ulteriormente, mediante la transformación de las moléculas de ADN quiméricas, las cuales codifican y expresan una acetil CoA carboxilasa (ACCasa) o una diacilglicerol aciltransferasa del tipo 2 (DGAT2) . Estos genes están coexpresados con los genes de la sintasa algácea del PUFA descritos anteriormente, tanto a traves de la reproducción de las plantas de soya, que contiene el casete de expresión de la ACCasa o de la DGAT2, con las plantas de soya que contiene los genes de la sintasa del PUFA; como mediante la transformación de las plantas de soya con un apilamiento de genes, que contiene la ACCasa o la DGAT2 y los genes de la sintasa del PUFA. Los elementos reguladores necesarios para la expresión de una secuencia codificante de la ACCasa o de la DGAT2, pueden incluir aquellos elementos descritos anteriormente. También pueden ser usadas las secuencias de expresión de los elementos reguladores adicionales conocidas en la téenica. Los casetes de expresión de la ACCasa y de la DGAT2 son transformados en la soya, usando los protocolos de la transformación descritos anteriormente. La transformación puede tener lugar como los apilamientos moleculares del casete de expresión de la ACCasa o de la DGAT2, combinado con los casetes de expresión del OrfA de la sintasa del PUFA, el OrfB de la sintasa del PUFA, el OrfC de la sintasa del PUFA, la acil-CoA sintetasa y el Hetl de 4’ fosfopanteteinil transferasa; o como los casetes de expresión independientes de la ACCasa de la DGAT2, enlazados a un marcador seleccionable y entonces cruzados de forma subsiguiente con las plantas de soya, las cuales contienen los casetes de expresión del OrfA de la sintasa del PUFA, el OrfB de la sintasa del PUFA, el OrfC de la sintasa del PUFA, la acil-CoA sintetasa y el Hetl de 4’ fosfopanteteinil transferasa. Los transformantes positivos están aislados y caracterizados de forma molecular. Las plantas de soya son identificadas las cuales contienen una acumulación incrementada de los LC-PUFA en la planta, la semilla vegetal o las concentraciones del aceite vegetal comparado con las plantas de soya de control no transformadas. Tales incrementaciones se pueden encontrar en el rango desde un incremento de 1 .2 veces hasta un incremento de 20 veces.
La sobre expresión de la ACCasa en el citoplasma puede producir niveles altos de malonil-CoA. Las plantas o las semillas de soya, que contiene niveles incrementados de malonil-CoA citoplásmico, pueden producir subsiguientemente niveles más altos del ácido graso poliinsaturado de cadena larga (LC-PUFA), cuando los genes de la sintasa algácea del PU FA están presentes y expresados. Los genes de la DGAT2, los cuales están expresados dentro de las plantas de soya, pueden ser capaces de la incorporación, de forma preferencial, de las cantidades significativas del ácido docosahexaenoico (DHA) y del ácido eicosapentaenoico (EPA) dentro del tri acilg I ice rol . Los genes de la DGAT2 con preferencia de substrato hacia los LC-PUFA (vease, por ejemplo, la Publicación I nternacional PCT WO 2009/085169 A2) pueden incrementar la incorporación de estos ácidos grasos dentro del triacilglicerol (TAG). Tales genes de la DGAT son útiles para la dirección de la incorporación del LC-PUFA, particularmente del DHA, dentro del TAG y para la incrementación de la producción del TAG en las plantas y en los otros organismos.
EJEMPLO 12 Producción del DHA en aemillas de Arabidopsis Transformadas con diseños de constructos alternativos para la expresión de los genes de la sintasa del PU FA Los eventos T, de Arabidopsis transformados con plásmidos albergando Agrobacterium tumefaciens que codifica los genes de la sintasa del PUFA y de Hetl (y en algunos casos SzACS-2) , bajo el control de varios elementos de expresión vegetal, fueron generados usando el método de la inmersión floral, esencialmente como descrito en Clough and Bent ( Plant J. , 1 998 16(6):735-43). La resultante semilla TT fue cosechada y sem brada. Las plantas ? transformadas fueron seleccionadas mediante la atomización con fosfinotricina, con el fin de seleccionar aquellas plantas que contienen un gen de PAT funcional, como un marcador seleccionable. El tejido de la hoja de las plantas Ti sobrevivientes fueron muestreadas y analizadas mediante las reacciones de PCR cuantitativas específicas para el gen de PAT, con el fin de identificar aquellas plantas que contienen una copia individual del marcador seleccionable (y los transgenes asociados) . Estas plantas fueron cultivadas hasta la madurez, la semilla T2 cosechada y analizada con respecto al contenido del LC-PUFA (como % del total de los FAME extra ¡bles). Un resumen de los datos de los eventos generados con varios constructos que codifica los genes de la sintasa del PUFA, se muestra en Tabla 12. Tabla 12: Eventos de Arabidopsis que contienen una copia individual del transgén de PAT produciendo el LC-PU FA en las semillas T2 y los niveles del DHA y del EPA para cada evento, mostrados como un porcentaje del total de aceite. 1 . Número de eventos con un contenido del LC-PUFA de > 1 % del total de los FAME en la semilla con un porcentaje del total de eventos entre paréntesis. 2. Contenido promedio total del LC-PU FA (DHA(n-3) + EPA(n-3) + DPA (n-6)) de todas las muestras de semilla T2 como % del total los FAME en la sem illa 3. Contenido máximo del DHA de todas las muestras de semilla T2 analizadas como % del total de los FAME 4. Contenido máximo del EPA de todas las muestras de semilla T2 analizadas como % del total de los FAME 5. Contenido promedio del LC-PUFA n-3 (DHA + EPA)/Total LC- PU FA a través de todos los eventos produciendo LC-PU FA (como %) Estos datos muestran que ciertas configuraciones de constructos y combinaciones de promotores, generan una proporción más alta de eventos que contienen el LC-PU FA en la semilla T2 (77% de todos los eventos de copia individual para pDAB 109507 produjeron el DHA, y 86% de todos los eventos de copia individual para pDAB108207 produjeron el DHA) . También ciertos constructos generaron una proporción más alta de eventos produciendo un contenido del > 1 % del LC-PUFA (33% de todos los eventos de copia individual para pDAB 109507, y 34% de todos los eventos de copia individual para pDAB 108207) . El contenido máximo del LC-PUFA de la semilla T2 a partir de varios eventos que se encontraron en el rango desde 0.24% hasta 2.03% para los constructos diferentes. De igual modo, ciertos constructos producen niveles más altos de los LC-PU FA omega-3. El contenido máximo de DHA se encontró en el rango desde 0.17% hasta 1 .45% y el contenido máximo del EPA se encontró en el rango desde 0% hasta 0.26% a través de todos los constructos y eventos generados. Estos datos indican que la alteración de los diseños de los constructos, donde las configuraciones del promotor fueron cambiadas, tuvieron por resultado las plantas transgénicas que exhibieron un incrementado LC-PUFA, en comparación con las plantas transgénicas, las que fueron transformadas con pDAB7362. Como tal, estos constructos, en los cuales fue alterado el diseño del constructo son deseables para las transformaciones de cultivos.
La semilla T2 de eventos produciendo LC-PUFA altos fue plantada y el tejido de la hoja de las plantas en crecimiento fue muestreado, usando la PCR cuantitativa para el ensayo del gen de PAT y otros transgenes. Las plantas que contienen dos copias de los transgenes (por ejemplo, homócigas) fueron identificadas y cultivadas hasta la madurez. La resultante semilla T3 fue cosechada y analizada con respecto al contenido del LC-PU FA. Algunos constructos, tal como pDAB7362 y pDAB109509, los cuales contenían elementos de expresión promotor/3’ UTR repetidos, mostraron una estabilidad pobre de los rasgos del LC-PUFA en la generación de semilla T3 subsiguiente. Sin embargo, algunos eventos transformados con configuraciones diferentes de constructos y/o elementos de expresión diversificados (por ejemplo, pDAB 108207, 109508 y 7734) produjeron estabilidad significativamente mejorada de los rasgos del LC-PUFA dentro de la generación de semilla T3, como se muestra en la Tabla 13. Estos datos indican que ciertos constructos pueden mantener la estabilidad de los rasgos del DHA en las generaciones subsiguientes, y que tales constructos son preferidos para las transformaciones de cultivos.
Tabla 13: Análisis del LC-PUFA de la progenie de semilla T3 a partir de las líneas T2 produciendo el DHA de Arabidopsis transgénico seleccionado Contenidos del LC-PUFA y contenidos de DHA totales son en % del total de los FAME 1 . Semilla a granel T3 fue analizada a partir de 5 hasta 20 plantas homócigas individuales La descripción anterior de la invención ha sido presentada para los propósitos de la ilustración y de la descripción. Además, la descripción no está prevista para limitar la invención con respecto a la forma revelada.
Todos de los varios aspectos, modalidades y opciones descritas aquí, pueden ser combinados con cualquiera variación y con todas las variaciones.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes mencionadas en esta especificación, son incorporadas aquí como referencia en la misma extensión como si cada publicación, patente o solicitud de patente individual fue indicada específicamente, y de forma individual, de estar incorporada como referencia.

Claims (73)

REIVINDICACION ES
1 . Una planta de soya, un descendiente, una célula, un tejido, una sem illa o parte de ellos, genéticamente modificados, caracterizada porque comprende: (i) una molécula del ácido nucleico que comprende una secuencia del ácido nucleico, que codifica una sintasa del ácido graso poliinsaturado (PUFA), que produce al menos un PU FA; y (ii) una molécula del ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una fosfopanteteinil transferasa (PPTasa).
2. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según la reivindicación 1 , caracterizada porque la sintasa del PU FA comprende una secuencia de aminoácidos, que es al menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 1 .
3. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según la reivindicación 1 , caracterizada porque la sintasa del PU FA comprende la secuencia de am inoácidos de SEQ ID NO: 1 .
4. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según la reivindicación 1 , caracterizada porque la secuencia del ácido nucleico que codifica la sintasa del PU FA, comprende una secuencia del ácido nucleico al menos 80% idéntica a la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO:6.
5. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según la reivindicación 4, caracterizada porque la secuencia del ácido nucleico que codifica la sintasa del PU FA comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO: 6.
6. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 5, caracterizada porque la sintasa del PUFA comprende una secuencia de aminoácidos, que es al menos 80% idéntica a la secuencia de am inoácidos de SEQ I D NO: 2.
7. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según la reivindicación 6, caracterizada porque la sintasa del PUFA comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2.
8. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 5, caracterizada porque la secuencia del ácido nucleico que codifica la sintasa del PU FA, comprende una secuencia del ácido nucleico, que es al menos 80% idéntica a la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO:7.
9. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según la reivindicación 8, caracterizada porque la secuencia del ácido nucleico que codifica la sintasa del PUFA, comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO:7.
10. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 9, caracterizada porque la sintasa del PUFA comprende una secuencia de aminoácidos, que es al menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 3.
1 1 . La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según la reivindicación 10, caracterizada porque la sintasa del PUFA comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO:3.
12. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 9, caracterizada porque la secuencia del ácido nucleico que codifica la sintasa del PU FA, comprende una secuencia del ácido nucleico, que es al menos 80% idéntica a la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID NO:8.
1 3. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según la reivindicación 12, caracterizada porque la secuencia del ácido nucleico que codifica la sintasa del PU FA, comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO: 8.
14. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según la reivindicación 1 , caracterizada porque la sintasa del PUFA comprende las secuencia de aminoácidos de SEQ I D NOs:l-3.
15. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según la reivindicación 1 , caracterizada porque la secuencia del ácido nucleico que codifica la sintasa del PU FA comprende las secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NOs:6-8.
16. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 15, caracterizada porque la PPTasa comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a SEQ I D NO: 5.
17. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según la reivindicación 16, caracterizada porque la PPTasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 5.
18. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 17, caracterizada porque la secuencia del ácido nucleico, que codifica la PPTasa, es al menos 80% idéntica a la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO: 10.
19. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según la reivindicación 18, caracterizada porque la secuencia del ácido nucleico, que codifica la PPTasa, comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO: 10.
20. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 19, caracterizada porque las secuencias del ácido nucleico de (i) y (ii) están contenidas en un vector de expresión recom binante individual.
21 . La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 20, caracterizada porque la secuencia del ácido nucleico de (i) ó (ii) está operablemente enlazada con un promotor específico de sem illa o un promotor específico de hoja .
22. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 20, caracterizada porque la secuencia del ácido nucleico de (i) ó (ii) está operablemente enlazada con promotor PvDlec2, LfKCS3, FAE 1 , BoACP, BnaNapinC, ubiquitina o CsVMV.
23. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 22, caracterizada porque comprende, además: (i i i) una molécula del ácido nucleico que comprende una secuencia del ácido nucleico que codifica una acil-CoA sintetasa (ACoAS).
24. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según la reivindicación 23, caracterizada porque la ACoAS comprende una secuencia de aminoácidos q ue es al menos 80% idéntica a SEQ I D NO:4.
25. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según la reivindicación 24, caracterizada porque la ACoAS comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4.
26. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según la reivindicación 23, caracterizada porque la secuencia del ácido nucleico, que codifica la AcoAS, comprende una secuencia del ácido nucleico que es al menos 80% idéntica a la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO:9.
27. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según la reivindicación 26, caracterizada porque la secuencia del ácido nucleico, que codifica la AcoAS, comprende la secuencia del ácido nucleico de SEQ I D NO: 9.
28. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 23 a la 27, caracterizada porque las secuencias del ácido nucleico de (i) , (ii) y (iii) están contenidas en un vector de expresión recombinante individual.
29. La planta de soya, el descendiente, la celula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 23 a la 27, caracterizada porque la secuencia del ácido nucleico de (i), (ii) ó (iii) está operablemente enlazada con un promotor específico de semilla o un promotor específico de hoja.
30. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 23 a la 27, caracterizada porque la secuencia del ácido nucleico de (i), (ii) ó (iii) está operablemente enlazada con el promotor PvDlec2, LfKCS3, FAE 1 , BoACP, BnaNapinC, ubiquitina o CsVMV.
31 . La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 30, caracterizada porque comprende, además, una secuencia del ácido nucleico que codifica una acetil CoA carboxilasa (ACCasa), o una secuencia del ácido nucleico que codifica una diacilglicerol aciltransferasa tipo 2 (DGAT2).
32. Una planta de soya, un descendiente, una célula, un tejido, una semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, caracterizada porque com prende al menos uno de pDAB7361 , PDAB7362, pDAB7363, pDAB7368, pDAB7369, pDAB7370, pDAB1 00518, pDAB 101476, pDAB101477, pDAB9166, pDAB9167, pDAB7379, pDAB7380, pDAB9323, pDAB9330, pDAB9337, PDAB9338, pDAB9344, pDAB9396, pDAB 101412, pDAB7733, PDAB7734, pDAB 101493, pDAB109507, pDAB 109508, pDAB 109509, pDAB9151 , pDAB1 08207, pDAB108208, pDAB 108209, pDAB9159, pDAB9147, pDAB 108224 y pDAB 108225.
33. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 32, caracterizada porque la planta, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos comprende las cantidades detectables del DHA (ácido docosahexaenoico (C22:6, n - 3 ) ) , del DPA(n-6) (ácido docosapentaenoico (C22:5, n - 6 ) ) , o del EPA (ácido eicosapentaenoico (C20.5, n-3)).
34. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según la reivindicación 33, caracterizada porque la planta, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos comprende desde 0, 01 % hasta 15% del DHA en peso del total de los ácidos grasos.
35. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según la reivindicación 34, caracterizada porque la planta, el descendiente, la célula, el tejido, la sem illa o parte de ellos comprende desde 0, 05% hasta 10% del DHA en peso del total de los ácidos grasos.
36. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según la reivindicación 35, caracterizada porque la planta, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos comprende desde 0, 05% hasta 5% del DHA en peso del total de los ácidos grasos.
37. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 36, caracterizada porque la planta, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos comprende desde 0,01 % hasta 10% del EPA en peso del total de los ácidos grasos.
38. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según la reivindicación 37, caracterizada porque la planta, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos comprende desde 0,05% hasta 5% del EPA en peso del total de los ácidos grasos.
39. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según la reivindicación 38, caracterizada porque la planta, el descendiente, la célula, el tej ido, la semilla o parte de ellos comprende desde 0,05% hasta 1 % del EPA en peso del total de los ácidos grasos.
40. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 39, caracterizada porque la planta, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos comprende desde 0,01 % hasta 10% del DPA(n-6) en peso del total de los ácidos grasos.
41 . La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según la reivindicación 40, caracterizada porque la planta, el descendiente, la célula, el tej ido, la semilla o parte de ellos comprende desde 0,01 % hasta 5% DPA(n-6) en peso del total de los ácidos grasos.
42. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 34 y de la 39 a la 47, caracterizada porque la planta, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos comprende desde 0,01 % hasta 1 % del DPA(n-6) en peso del total de los ácidos grasos.
43. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 33, caracterizada porque la planta, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos comprende una relación de EPA: DHA desde 1 : 1 hasta 1 : 30 en peso del total de los ácidos grasos.
44. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según la reivindicación 43, caracterizada porque la planta, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos comprende una relación de EPA: DHA desde 1 : 1 hasta 1 : 3 en peso del total de los ácidos grasos.
45. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 33, caracterizada porque la planta, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos comprende una relación de DPA(n-6): DHA desde 1 : 1 hasta 1 : 10 en peso del total de los ácidos grasos.
46. La planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según la reivindicación 45, caracterizada porque la planta, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos comprende una relación de DPA(n-6) : DHA desde 1 : 1 hasta 1 : 3 en peso del total de los ácidos grasos.
47. Un aceite, caracterizado porque es obtenido a partir de la planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 46.
48. Una semilla, caracterizada porque es obtenida a partir de la planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 46.
49. Un producto alimenticio, caracterizado porque comprende un aceite obtenido a partir de la planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 46, o una semilla obtenida a partir de la planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos , genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 46.
50. Un alimento funcional, caracterizado porque comprende un aceite obtenido a partir de la planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 46, o una semilla obtenida a partir de la planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 46.
51 . Un producto farmacéutico, caracterizado porque comprende un aceite obtenido a partir de la planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 46, o una semilla obtenida a partir de la planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos , genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 46.
52. Un método para producir un aceite que comprende al menos un PU FA, caracterizado porque comprende la recuperación de un aceite a partir de la planta de soya, el descendiente, la célula, el tej ido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 46, o a partir de una semilla de la planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 46.
53. Un método para producir un aceite que comprende al menos un PU FA, caracterizado porque comprende el cultivo de la planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 46.
54. Un método para producir al menos un PUFA en un aceite de semilla, caracterizado porque la recuperación el aceite a partir de una semilla de la planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 46.
55. Un método para producir al menos un PU FA en un aceite de semilla, caracterizado porque comprende el cultivo de la planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 46.
56. Un método para proveer un suplemento o un producto terapéutico conteniendo al menos un PUFA a un individuo, caracterizado porque comprende la provisión al individuo de la planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 46, el aceite según la reivindicación 47, la semilla según la reivindicación 48, el producto alimenticio según la reivindicación 49, el alimento funcional según la reivindicación 50 o el producto farmaceutico según la reivindicación 51 .
57. El método según cualquiera una de las reivindicaciones de la 53 a la 56, caracterizado porque el PU FA es DHA.
58. El método según cualquiera una de las reivindicaciones de la 53 a la 56, caracterizado porque el PU FA es EPA.
59. El método según cualquiera una de las reivindicaciones de la 53 a la 56, caracterizado porque el PU FA es DPA(n-6) .
60. Un método para producir la planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 46, caracterizado porque comprende la transformación de una planta de soya o célula de planta con (i) una molécula del ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una sintasa algácea del PUFA; y (ii) una molécula del ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una fosfopanteteinil transferasa (PPTasa).
61 . El método según la reivindicación 60, caracterizado porque comprende, además, la transformación la planta de soya o la célula de planta con (iii) una molécula del ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una acil-CoA sintetasa (ACoAS).
62. Un aceite de soya, caracterizado porque comprende desde 0, 05% hasta 15% del DHA en peso del total de los ácidos grasos.
63. El aceite de soya según la reivindicación 62, caracterizado porque comprende desde 0,05% hasta 5% del EPA en peso del total de los ácidos grasos.
64. El aceite de soya según la reivindicación 62 ó 63, caracterizado porque comprende desde 0,01 % hasta 5% del DPA(n-6) en peso del total de los ácidos grasos.
65. Un aceite de soya, caracterizado porque comprende una relación de EPA: DHA desde 1 : 1 hasta 1 : 30 en peso del total de los ácidos grasos.
66. El aceite de soya según la reivindicación 65, caracterizado porque comprende una relación de EPA: DHA desde 1 : 1 hasta 1 :3 en peso del total de los ácidos grasos.
67. U n aceite de soya, caracterizado porque com prende una relación de DPA(n-6): DHA desde 1 : 1 hasta 1 : 10 en peso del total de los ácidos grasos.
68. El aceite de soya según la reivindicación 67, caracterizado porque comprende una relación de DPA(n-6): DHA desde 1 : 1 hasta 1 : 3 en peso del total de los ácidos grasos.
69. U na composición, caracterizada porque comprende el aceite según cualquiera una de las reivindicaciones 47 y de la 58 a la 68.
70. Un método para producir la planta de soya, el descendiente, la célula, el tejido, la semilla o parte de ellos, genéticamente modificados, según cualquiera una de las reivindicaciones de la 1 a la 42, caracterizado porque comprende la transformación de una planta de soya o la célula de planta con un casete de expresión que com prende: (i) una molécula del ácido nucleico que comprende una secuencia del ácido nucleico que codifica una sintasa del PU FA; (ii) una molécula del ácido nucleico que comprende una secuencia del ácido nucleico que codifica una acil-CoA sintetasa (ACoAS); y (iii) una molécula del ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una fosfopanteteinil transferasa (PPTasa).
71 . Una mezcla de aceite, caracterizada porque comprende el aceite según cualquiera una de las reivindicaciones 47 y de la 58 a la 68, y otro aceite.
72. La mezcla de aceite según la reivindicación 71 , caracterizada porque el otro aceite es un aceite vegetal , un aceite de pescado, un aceite microbiano o las mezclas entre ellos.
73. U na composición de alimento o de comida, caracterizada porque comprende el aceite según cualquiera una de las reivindicaciones 47 y de la 58 a la 68.
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