CN104024403B - 植物中dha和其它lc‑pufa的生成 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用多不饱和脂肪酸(PUFA)合酶系统和一种或多种容许和/或改善PUFA在宿主生物体中生成的辅助蛋白质遗传修饰的重组宿主生物体。本发明还涉及生成和使用此类生物体的方法以及从此类生物体获得的产物。

Description

植物中DHA和其它LC-PUFA的生成
发明背景
发明领域
本发明一般涉及用多不饱和脂肪酸(PUFA)合酶系统和一种或多种容许和/或改善PUFA在宿主生物体中生成的辅助蛋白质遗传修饰的重组宿主生物体(例如植物)。本发明还涉及生成和使用此类生物体(例如以获得PUFA)的方法以及从此类生物体获得的产物(例如油和种子)。
背景技术
认为多不饱和脂肪酸(PUFA)可用于营养应用，药物应用，工业应用，及其它目的。然而，目前从天然来源(例如鱼油)及从化学合成供应PUFA对于长期商业需要是不充分的。
源自植物(例如含油种子作物)的植物油相对便宜，而且没有与鱼油有关的污染问题。然而，存在于商业开发的植物和植物油中的PUFA通常不包含较为饱和的或较长链的PUFA，而是通常仅包含脂肪酸，诸如亚油酸(在δ9和12位置中具有2个双键的18个碳，即18：2δ9，12)和亚麻酸(18：3δ9，12，15)。
已经描述了在植物中生成较为不饱和的或较长链的PUFA，其通过修饰由植物内源生成的脂肪酸进行。例如，用编码脂肪酸延长酶(elongase)和/或去饱和酶的各种单独基因遗传修饰植物已经描述为导致叶或种子的生成，所述叶或种子含有显著水平的较长链且较为不饱和的PUFA，诸如二十碳五烯酸(EPA)，而且还含有显著水平的混合的较短链且较小程度不饱和的PUFA(Qi等，Nature Biotech.22：739(2004)；WO04/071467；Abbadi等，PlantCell16：1(2004)；Napier和Sayanova，Proceedings of the Nutrition Society64：387-393(2005)；Robert等，Functional Plant Biology32：473-479(2005)；美国申请公开文本No.2004/0172682，美国申请No.61/345,537，2010年5月17曰提交)。
壳斗科(Fabaceae)(或豆科(Leguminosae))是一种较大的且经济上重要的有花植物科，其通常称为豆科作物(legume)科，豌豆(pea)科，扁豆(bean)科或豆(pulse)科。大豆属(Glycine)是壳斗科中的属，并且包括例如Glycine albicans，Glycine aphyonota，Glycine arenari，Glycine argyrea，Glycine canescens，澎湖大豆(Glycineclandestine)，Glycine curvata，Glycine cyrtoloba，Glycine falcate，Glycinegracei，Glycine hirticaulis，Glycine hirticaulis subsp.leptosa，Glycinelactovirens，Glycine latifolia，Glycine latrobeana，Glycine microphylla，Glycinemontis-douglas，Glycine peratosa，Glycine pescadrensis，Glycine pindanica，Gycinepullenii，Glycine rubiginosa，Glycine stenophita，Glycine syndetika，烟豆(Glycinetabacina)，短绒野大豆(Glycine tomentella)，劳豆(Glycine soja)，和大豆(Glycinemax)(大豆)。科壳斗科还包括花生，扁豆(菜豆(Phaseolus vulgaris))，蚕豆(broad bean)(蚕豆(Viciafaba))或豌豆(豌豆(Pisum sativum))。
大部分大豆油为生产用于人消费的植物油形式。工业应用中使用大豆油的市场也在不断增加。
发明概述
本领域中需要相对便宜的方法来高效且有效生成植物、植物种子或植物油中大量(例如商业量)的较长链或较为不饱和的PUFA，以及植物、植物种子或植物油中此类PUFA中富含的大量脂质(例如三酰甘油(TAG)和磷脂(PL))。通过提供用多不饱和脂肪酸(PUFA)合酶和一种或多种如本文中描述的辅助蛋白遗传修饰的重组宿主生物体来提供并改善宿主生物体(例如植物)中PUFA生成的系统是本领域中办法的一种有意义的备选。
本发明涉及经遗传修饰的植物(例如壳斗科或大豆属的植物，诸如大豆)、其后代、种子、细胞、组织、或部分，其包含：(i)编码生成至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)的多不饱和脂肪酸合酶(例如藻PUFA合酶)的核酸序列；和(ii)编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)的核酸序列，所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)将磷酸泛酰巯基乙胺基辅因子转移至PUFA合酶系统(例如藻PUFA合酶系统)ACP域。
在本发明的一些实施方案中，PUFA合酶包含与氨基酸序列SEQ ID NO：1为80％至99％相同的氨基酸序列或者包含氨基酸序列SEQ ID NO：1。在一些实施方案中，编码PUFA合酶的核酸序列包含与核酸序列SEQ ID NO：6为80％至99％相同的核酸序列或者包含核酸序列SEQ ID NO：6。在一些实施方案中，PUFA合酶包含与氨基酸序列SEQ ID NO：2为80％至99％相同的氨基酸序列或者包含氨基酸序列SEQ ID NO：2。在一些实施方案中，编码PUFA合酶的核酸序列包含与核酸序列SEQ ID NO：7为80％至99％相同的核酸序列或者包含核酸序列SEQ ID NO：7。在一些实施方案中，PUFA合酶包含与氨基酸序列SEQ ID NO：3为80％至99％相同的氨基酸序列或者包含氨基酸序列SEQ ID NO：3。在一些实施方案中，编码PUFA合酶的核酸序列包含与核酸序列SEQ ID NO：8为80％至99％相同的核酸序列或者包含核酸序列SEQ ID NO：8。在一些实施方案中，PUFA合酶包含氨基酸序列SEQ ID NO：1，2，或3或其任何组合。在一些实施方案中，编码PUFA合酶的核酸序列包含核酸序列SEQ ID NO：6，7或8或其任何组合。
在一些实施方案中，PPT酶包含与SEQ ID NO：5为80％至99％相同的氨基酸序列或者包含氨基酸序列SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，编码PPT酶的核酸序列与核酸序列SEQID NO：10是80％至99％相同的或者包含核酸序列SEQ ID NO：10。
在一些实施方案中，(i)和(ii)的核酸序列包含在单一重组表达载体中。在一些实施方案中，(i)和(ii)的核酸序列包含在不同重组表达载体中。在一些实施方案中，(i)和/或(ii)的核酸序列与种子特异性启动子可操作连接。在一些实施方案中，(i)和/或(ii)的核酸序列与选自下组的启动子可操作连接：PvDlec2，PvPhaseolin，LfKCS3，FAE1，BoACP和BnaNapinC。在一些实施方案中，(i)和/或(ii)的核酸序列与叶特异性启动子可操作连接。在一些实施方案中，(i)和/或(ii)的核酸序列与泛素或CsVMV启动子可操作连接。
在一些实施方案中，经遗传修饰的植物、其后代、种子、细胞、组织、或部分进一步包含(iii)编码酰基-CoA合成酶(ACoAS)的核酸序列，所述酰基-CoA合成酶(ACoAS)催化长链PUFA游离脂肪酸(PFFA)转化成酰基-CoA。在一些实施方案中，ACoAS包含与SEQ ID NO：4为80％至99％相同的氨基酸序列或者包含氨基酸序列SEQ ID NO：4。在一些实施方案中，编码ACoAS的核酸序列包含与核酸序列SEQ ID NO：9为80％至99％相同的核酸序列或者包含核酸序列SEQ ID NO：9。在一些实施方案中，编码ACoAS的核酸序列包含核酸序列SEQ IDNO：34。在一些实施方案中，(i)，(ii)和/或(iii)的核酸序列包含在单一重组表达载体中。在一些实施方案中，(i)，(ii)和(iii)的核酸序列包含在不同重组表达载体中。在一些实施方案中，(i)和(ii)的核酸序列包含在单一重组表达载体中，且(iii)的核酸序列包含在不同重组表达载体中。在一些实施方案中，(i)和(iii)的核酸序列包含在单一重组表达载体中，且(ii)的核酸序列包含在不同重组表达载体中。在一些实施方案中，(ii)和(iii)的核酸序列包含在单一重组表达载体中，且(i)的核酸序列包含在不同重组表达载体中。在一些实施方案中，(i)，(ii)和/或(iii)的核酸序列与种子特异性启动子可操作连接。在一些实施方案中，(i)，(ii)和/或(iii)的核酸序列与选自下组的启动子可操作连接：PvDlec2，LfKCS3，FAE1，BoACP和BnaNapinC。在一些实施方案中，(i)，(ii)和/或(iii)的核酸序列与叶特异性启动子可操作连接。在一些实施方案中，(i)，(ii)和/或(iii)的核酸序列与泛素或CsVMV启动子可操作连接。
在一些实施方案中，经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织或部分进一步包含编码乙酰CoA羧化酶(ACCase)的核酸序列和/或编码2型二酰基甘油酰基转移酶(DGAT2)的核酸序列。
在一些实施方案中，经遗传修饰的植物，其后代、细胞、组织、种子或部分包含下列至少一项：pDAB7361，pDAB7362，pDAB7363，pDAB7368，pDAB7369，pDAB7370，pDAB100518，pDAB101476，pDAB101477，pDAB9166，pDAB9167，pDAB7379，pDAB7380，pDAB9323，pDAB9330，pDAB9337，pDAB9338，pDAB9344，pDAB9396，pDAB101412，pDAB7733，pDAB7734，pDAB101493，pDAB109507，pDAB109508，pDAB109509，pDAB9151，pDAB108207，pDAB108208，pDAB108209，pDAB9159，pDAB9147，pDAB108224和pDAB108225。
在一些实施方案中，经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织、种子或部分或自经遗传修饰的植物、其后代、种子、细胞、组织、或部分获得的油(例如种子油)包含可检测量的DHA(二十二碳六烯酸(C22：6，n-3))，DPA(n-6)(二十二碳五烯酸(C22：5，n-6))和/或EPA(二十碳五烯酸(C20：5，n-3))。在一些实施方案中，经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织、种子或部分或自经遗传修饰的植物、其后代、种子、细胞、组织、或部分获得的油(例如种子油)包含按总脂肪酸重量计0.01％至15％DHA，按总脂肪酸重量计0.05％至10％DHA，或按总脂肪酸重量计0.05％至5％DHA。在一些实施方案中，经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织、种子或部分或自经遗传修饰的植物、其后代、种子、细胞、组织、或部分获得的油(例如种子油)包含按总脂肪酸重量计0.01％至10％EPA，按总脂肪酸重量计0.05％至5％EPA，或按总脂肪酸重量计0.05％至1％EPA。在一些实施方案中，经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织、种子或部分或自经遗传修饰的植物、其后代、种子、细胞、组织、或部分获得的油(例如种子油)包含按总脂肪酸重量计0.01％至10％DPA(n-6)，按总脂肪酸重量计0.01％至5％DPA(n-6)，或按总脂肪酸重量计0.01％至1％DPA(n-6)。在一些实施方案中，经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织、种子或部分或自经遗传修饰的植物、其后代、种子、细胞、组织、或部分获得的油(例如种子油)包含按总脂肪酸重量计1∶1至1∶30或1∶1至1∶3的EPA∶DHA比率。一些实施方案中，经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织、种子或部分或自经遗传修饰的植物、其后代、种子、细胞、组织、或部分获得的油(例如种子油)包含按总脂肪酸重量计1∶1至1∶10或1∶1至1∶3的DPA(n-6)∶DHA比率。在-些实施方案中，自经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织、种子或部分获得的油(例如种子油)包含按油重量计70％至99％甘油三酯。
在一些实施方案中，可检测量的DHA，DPA(n-6)和/或EPA也存在于自经遗传修饰的植物、其后代、组织、种子、或部分获得的谷物和/或粗粉中。
本发明涉及自本文中描述的经遗传修饰的植物(例如大豆)、其后代、细胞、组织或部分获得的油(例如种子油)或种子。本发明涉及食物产品，其包含自本文中描述的经遗传修饰的植物(例如大豆)、其后代、细胞、组织或部分获得的油(例如种子油)。本发明还涉及功能性食物，其包含自本文中描述的经遗传修饰的植物(例如大豆)、其后代、细胞、组织或部分获得的油(例如种子油)或种子。本发明涉及药用产品，其包含自本文中描述的经遗传修饰的植物(例如大豆)、其后代、细胞、组织或部分获得的油(例如种子油)或种子。
本发明涉及生成包含至少一种LC-PUFA的油的方法，其包括从本文中描述的经遗传修饰的植物(例如大豆)、其后代、细胞、组织或部分或从本文中描述的经遗传修饰的植物(例如大豆)、其后代、细胞、组织或部分的种子回收油。本发明还涉及生成包含至少一种LC-PUFA的油的方法，其包括种植本文中描述的经遗传修饰的植物(例如大豆)、其后代、细胞、组织或部分。本发明还涉及生成种子油中的至少一种LC-PUFA的方法，其包括从本文中描述的经遗传修饰的植物(例如大豆)、其后代、细胞、组织或部分的种子回收油。
本发明涉及生成种子油中的至少一种LC-PUFA的方法，其包括种植本文中描述的经遗传修饰的植物(例如大豆)、其后代、细胞、组织或部分。本发明还涉及对个体提供含有至少一种PUFA的补充物或治疗性产品的方法，其包括对个体提供本文中描述的经遗传修饰的植物(例如大豆)、其后代、细胞、组织或部分，本文中描述的油，本文中描述的种子，本文中描述的食物产品，本文中描述的功能性食物，或本文中描述的药用产品。在一些实施方案中，此类实施方案中含有的PUFA是DHA，DPA(n-6)和/或EPA。
本发明涉及生成本文中描述的经遗传修饰的植物(例如大豆)、其后代、细胞、组织或部分的方法，其包括用(i)编码生成至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)的PUFA合酶(例如藻PUFA合酶)的核酸序列；和(ii)编码将磷酸泛酰巯基乙胺基辅因子转移至PUFA合酶(例如藻PUFA合酶)ACP域的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)的核酸序列转化植物或植物细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括用(iii)编码酰基-CoA合成酶(ACoAS)的核酸序列转化植物或植物细胞，所述酰基-CoA合成酶(ACoAS)催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基-CoA。
附图简述
通过以下详细描述、图、和所附序列描述(其形成本申请的一部分)可以更全面了解本发明的各个实施方案。
图1描绘了编码PUFA OrfA的9个重复域中每个的重新设计的DNA序列的Clustal W(Vector NTI中的比对)。
图2是pDAB7362的质粒图。
图3是pDAB7361的质粒图。
图4是pDAB7363的质粒图。
图5是pDAB7365的质粒图。
图6是pDAB7368的质粒图。
图7是pDAB7369的质粒图。
图8是pDAB7370的质粒图。
图9是pDAB100518的质粒图。
图10是pDAB101476的质粒图。
图11是pDAB101477的质粒图。
图12显示了来自源自用pDAB7362转化的两个大豆事件的T1植物的单一T2大豆种子的DHA和LC-PUFA含量。
图13显示了T2大豆种子蛋白质提取物中PUFA合酶OrfA，PUFA合酶OrfB，和PUFA合酶嵌合OrfC的Westem印迹检测。
图14是pDAB9166的质粒图。
图15是pDAB9167的质粒图。
图16是pDAB7379的质粒图。
图17是pDAB7380的质粒图。
图18是pDAB9323的质粒图。
图19是pDAB9330的质粒图。
图20是pDAB9337的质粒图。
图21是pDAB9338的质粒图。
图22是pDAB9344的质粒图。
图23是pDAB9396的质粒图。
图24是pDAB101412的质粒图。
图25是pDAB7733的质粒图。
图26是pDAB7734的质粒图。
图27是pDAB101493的质粒图。
图28是pDAB109507的质粒图。
图29是pDAB109508的质粒图。
图30是pDAB109509的质粒图。
图31是pDAB9151的质粒图。
图32是pDAB108207的质粒图。
图33是pDAB108208的质粒图。
图34是pDAB108209的质粒图。
图35是pDAB9159的质粒图。
图36是pDAB9147的质粒图。
图37是pDAB108224的质粒图。
图38是pDAB108225的质粒图。
图39显示了来自用pDAB101493，pDAB7362，pDAB7369，pDAB101412或pDAB7380转化的个体转基因拟南芥事件的T2种子的DHA和LC-PUFA含量。
发明详述
如本文中使用的，术语“多不饱和脂肪酸”或“PUFA”指具有至少16个碳，至少18个碳，至少20个碳，或22或更多个碳的碳链长度，且具有至少3或更多个双键，4或更多个双键，5或更多个双键，或6或更多个双键的脂肪酸，其中所有双键为顺式构型。
如本文中使用的，术语“长链多不饱和脂肪酸”或“LC-PUFA”指含有3或更多个双键的20和更多个碳链长度，或具有至少3或更多个双键，4或更多个双键，5或更多个双键，或6或更多个双键的22或更多个碳的脂肪酸。omega-6系列的LC-PUFA包括但不限于二-高-λ-亚麻酸(di-homo-gamma-亚麻酸，C20：3n-6)，花生四烯酸(C20：4n-6)，肾上腺酸(又称作二十二碳四烯酸或DTA)(C22：4n-6)，和二十二碳五烯酸(C22：5n-6)。omega-3系列的LC-PUFA包括但不限于二十碳三烯酸(C20：3n-3)，二十碳四烯酸(C20：4n-3)，二十碳五烯酸(C20：5n-3)，二十二碳五烯酸(C22：5n-3)，和二十二碳六烯酸(C22：6n-3)。LC-PUFA还包括具有大于22个碳和4或更多个双键的脂肪酸，包括但不限于C28：8(n-3)。
如本文中使用的，术语“PUFA合酶”指生成多不饱和脂肪酸(PUFA)且特别是长链PUFA(LC-PUFA)的酶以及复合物中此类酶的任何域。术语PUFA合酶包括但不限于用于生成PUFA的PUFA PKS系统或PKS样系统。一些特定的PUFA合酶在本文中通过别的符号指定，例如，“SzPUFA”合酶或“hSzThPUFA”合酶，如本申请中定义的。术语“PUFA合酶系统”包括PUFA合酶和在异源生物体中表达时可以影响PUFA合酶功能的任何辅助酶(例如PPT酶或ACS)。
如本文中使用的，术语“磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶”和“PPT酶”指通过将辅因子(例如4-磷酸泛酰巯基乙胺)从辅酶A(CoA)转移至PUFA合酶中存在的一个或多个ACP域而活化PUFA合酶的酶。能活化本文中描述的PUFA合酶的一个或多个ACP域的PPT酶的一个例子是念珠藻(Nostoc sp.)PCC7120(以前称作鱼腥藻(Anabaena sp.)PCC7120)的Het I蛋白，本文中称为“NoHetI”。
如本文中使用的，术语“酰基-CoA合成酶”、“ACoAS”和“ACS”指催化将长链多不饱和游离脂肪酸(FFA)转化成酰基-CoA的酶。一些特定的酰基-CoA合成酶在本文中以别的符号指定，例如“SzACS-2”，如本申请中定义的。
如本文中使用的，术语“植物”包括其任何后代、细胞、组织、种子、种子油、或部分。
“保健食品(nutraceutical)”意指从提供生理学益处或提供保护免于疾病的植物分离，纯化，浓缩，或生成的产品，包括补充有此类产品的加工食物，以及从已经遗传工程化改造为含有增强的此类生理学活性组分水平的作物生成的食物。
“功能性食物”意指如下的食物，该食物(a)与作为日常饮食一部分消耗的常规食物外观相似或者可以是该常规食物，且(b)基于通常存在于未修饰食物中的组分的比例修改，具有增强的营养价值和/或特定的饮食益处。
术语“多核苷酸”和“核酸”意图涵盖单数个核酸及复数个核酸，核酸分子或其片段、变体、或衍生物，或构建体，例如信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸或核酸可以含有全长cDNA序列的核苷酸序列，或其片段，包括非翻译5’和3’序列和编码序列。多核苷酸或核酸可以由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸构成，其可以是未修饰的RNA或DNA或经修饰的RNA或DNA。例如，多核苷酸或核酸可以由单链和双链DNA，作为单链和双链区的混合物的DNA，单链和双链RNA，和作为单链和双链区的混合物的RNA，包含可以为单链或更通常为双链或单链和双链区的混合物的DNA和RNA的杂合分子组成。这些术语还涵盖多核苷酸或核酸的化学、酶法、或代谢修饰的形式。
多核苷酸或核酸序列可以称为“分离的”，其中它已经从其天然环境中取出。例如，出于本发明的目的，认为载体中含有的编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽或多肽片段的异源多核苷酸或核酸是分离的。分离的多核苷酸或核酸的其它例子包括异源宿主细胞中维持的重组多核苷酸或溶液中的(部分或基本上)纯化的多核苷酸或核酸。依照本发明的分离的多核苷酸或核酸进一步包含合成生成的此类分子。DNA聚合物形式的分离的多核苷酸或核酸可以由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个区段组成。
术语“基因”指能够以特定蛋白质表达的核酸或其片段，任选地包括编码序列之前(5’非编码序列)和之后(3’非编码序列)的调节序列。
如本文中使用的，术语“编码区”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调节序列”指位于编码序列上游(5’非编码序列)，之内，或下游(3’非编码序列)，且影响关联编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子、多聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应器结合位点、和茎-环结构。
如本文中使用的，术语“多肽”意图涵盖单数个“多肽”及复数个“多肽”及其片段，且指通过酰胺键(又称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”指任何一条或多条具有两个或更多个氨基酸的链，而不是指特定长度的产物。如此，肽、二肽、三肽、寡肽、蛋白质、氨基酸链、或用于指一条或多条具有两个或更多个氨基酸的链的任何其它术语包括在“多肽”的定义内，且术语“多肽”可以替换这些中任一项术语使用，或者与这些中任一项术语可互换使用。多肽可以源自天然生物学来源或者通过重组技术生成，但是不一定从指定的核酸序列翻译。它可以以任何方式生成，包括通过化学合成。“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物意图指不在其天然环境中的多肽。不需要特定的纯化水平。例如，分离的多肽可以从其天然或自然环境中取出。出于本发明的目的，认为在宿主细胞中表达的重组生成的多肽和蛋白质是分离的，已经通过任何合适的技术分离，分级，或部分或实质性纯化的天然或重组多肽亦然。
如本文中使用的，“天然的”指如自然存在的具有其自身调节序列(若存在的话)的多核苷酸、基因或多肽形式。
如本文中使用的，“内源”指在生物体中或在生物体的基因组中在其天然位置中的多核苷酸、基因或多肽的天然形式。“内源多核苷酸”包括在生物体的基因组中其天然位置中的天然多核苷酸。“内源基因”包括生物体的基因组中其天然位置中的天然基因。“内源多肽”包括生物体中其天然位置中的天然多肽。
如本文中使用的，“异源”指通常不存在于宿主生物体中，但是引入宿主生物体中的多核苷酸，基因或多肽。“异源多核苷酸”包括以与相应的天然多核苷酸不同的形式再引入来源生物体中的天然编码区，或其部分。“异源基因”包括以与相应的天然基因不同的形式再引入来源生物体中的天然编码区，或其部分。例如，异源基因可以包括作为再引入天然宿主中的嵌合基因的一部分的天然编码区，所述嵌合基因包含非天然调节区。“异源多肽”包括以与相应的天然多肽不同的形式再引入来源生物体中的天然多肽。
如本文中使用的，术语“修饰”指导致由多核苷酸编码的多肽的活性降低、基本上消除或消除的本文公开的多核苷酸中的变化，以及导致多肽的活性降低、基本上消除或消除的本文公开的多肽中的变化。此类变化可以通过本领域中公知的方法做出，包括但不限于缺失、突变(例如自发诱变，随机诱变，由增变基因引起的诱变，或转座子诱变)，取代，插入，下调，改变细胞位置，改变多核苷酸或多肽的状态(例如甲基化，磷酸化或泛素化)，除去辅因子，引入反义RNA/DNA，引入干扰RNA/DNA，化学修饰，共价修饰，用UV或X射线照射，同源重组，有丝分裂重组，启动子置换方法，和/或其组合。测定哪些核苷酸或氨基酸残基可以修饰的指导可以如下找到，即比较特定多核苷酸或多肽的序列与同源多核苷酸或多肽(例如酵母或细胞的)序列，并使高同源性的区域(保守区)或共有序列中做出的修饰的数目最大化/最小化。
如本文中使用的，术语“衍生物”指本发明中公开的序列的修饰。此类修饰的例示会是保持，略微改变，或提高含油种子作物物种中本文中公开的编码序列的功能的一个或多个碱基的取代、插入和/或缺失，所述碱基涉及本文中公开的编码序列的核酸序列。例如，本领域技术人员可以使用用于预测和优化序列结构的计算机建模技术容易地确定此类衍生物。如此，术语“衍生物”还包括与本文中公开的编码序列具有实质性序列同源性，使得它们能够具有公开的功能性以用于生成本发明的LC-PUFA的核酸序列。
如本文中使用的，术语“变体”指通过使用例如重组DNA技术，诸如诱变创建的氨基酸插入、缺失、突变和取代而与本发明的明确叙述的多肽有差别的多肽。测定哪些氨基酸残基可以在不消除感兴趣的活性的情况下替换、添加或删除的指导可以如下找到，即比较特定多肽的序列与同源多肽的序列，并且使高同源性区域(保守区)中进行的氨基酸序列变化数目最小化或通过用共有序列替换氨基酸。
或者，可以通过利用遗传密码中的“冗余”合成或选择编码这些相同或相似的多肽的重组多核苷酸变体。可以将各种密码子取代，诸如生成各种限制性位点的沉默变化引入以优化对表达用的质粒或病毒载体的克隆。多核苷酸序列的突变可以在多肽或添加至多肽以修饰多肽的任何部分的性质的其它肽的域中得到反映。
氨基酸“取代”可以是将一种氨基酸用具有相似结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换的结果，即保守氨基酸替换，或者它们可以是将一种氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的氨基酸替换的结果，即非保守氨基酸替换。“保守的”氨基酸取代可以基于涉及残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、或两亲性性质的相似性进行。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、和谷氨酰胺；带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、和组氨酸；且带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。或者，“非保守”氨基酸取代可以通过选择这些中任一种氨基酸的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、或两亲性性质的差异进行。“插入”或“缺失”可以在重组蛋白在结构上或功能上容许的变异范围内。容许的变异可以通过对多肽分子中的氨基酸系统性进行插入、缺失或取代经实验确定，其使用重组DNA技术并对所得的重组变体测定活性进行。
术语“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的DNA序列。一般地，编码序列位于启动子序列的3’。启动子完全源自天然基因，或者由源自自然存在的不同启动子的不同元件组成，或者甚至包含合成的DNA区段。本领域技术人员应当理解，不同启动子可以指导基因在不同组织或细胞类型中，或者在发育的不同阶段，或者响应不同环境或生理学条件表达。引起基因在大多数时间在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。进一步认可由于在大多数情况中，调节序列的精确边界尚未完全限定，不同长度的DNA片段可以具有相同的启动子活性。
术语“可操作连接的”指单一核酸片段上核酸序列的关联，使得一种核酸序列的功能受到另一种影响。例如，在启动子能够影响编码序列表达时(例如编码序列在启动子的转录控制下)，启动子与所述编码序列可操作连接。编码序列可以以有义或反义取向与调节序列可操作连接。
如本文中使用的，术语“表达”指源自本发明的核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达还可以指mRNA翻译成多肽。
如本文中使用的，术语“过表达”指高于相同或相关基因的内源表达的表达。异源基因在其表达高于相当的内源基因的表达时是过表达的。
如本文中使用的，术语“转化”指将核酸或片段转移至宿主生物体中，导致遗传稳定的遗传力。含有经转化的核酸片段的宿主生物体称为“转基因”或“重组”或“经转化的”生物体。
如本文中使用的，术语“质粒”和“载体”指经常携带不作为细胞中心代谢一部分的基因，且通常为环状双链DNA分子形式的染色体外元件。此类元件可以是源自任何来源的单链或双链DNA或RNA的自主复制序列，基因组整合序列，噬菌体或核苷酸序列(线性或环状)，其中许多核苷酸序列已经连接或重组成独特的构造，其能够与合适的3’非翻译序列一起将启动子片段和选定基因产物的DNA序列导入细胞中。
如本文中使用的，术语“密码子简并”指在不影响编码多肽的氨基酸序列的情况中容许核苷酸序列变异的遗传密码性质。熟练技术人员完全知道特定宿主细胞在使用核苷酸密码子以规定给定氨基酸中展现的“密码子偏爱”。因此，在合成基因以在宿主细胞中实现改善的表达时，期望设计基因，使得其密码子选择频率接近宿主细胞的优选密码子选择的频率。
术语“经密码子优化的”在其提及用于转化各种宿主的核酸分子的基因或编码区时指改变核酸分子的基因或编码区中的密码子以在不改变由DNA编码的多肽的情况中反映宿主生物体的典型密码子选择。此类优化包括用更通常用于所述生物体基因的一种或多种密码子替换至少一种，超过一种，或大量的密码子。
包含编码任何多肽链的氨基酸的密码子的核苷酸序列的偏差容许编码基因的序列的变异。由于每个密码子由三个核苷酸组成，且构成DNA的核苷酸限于4种特定的碱基，存在有64种可能的核苷酸组合，其中61种编码氨基酸(剩余3种密码子编码结束翻译的信号)。显示哪些密码子编码哪些氨基酸的“遗传密码”在本文中以表1再现。因此，许多氨基酸以超过一种密码子指定。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由四种三联体编码，丝氨酸和精氨酸由6种编码，而色氨酸和甲硫氨酸仅由一种三联体编码。此简并性容许DNA碱基组成在较宽的范围里变化而不影响由DNA编码的蛋白质的氨基酸序列。
表1：标准遗传密码
许多生物体展现出使用特定密码子以在生长的肽链中编码特定氨基酸插入的偏爱。密码子优选，或密码子偏爱(生物体间密码子选择的差异)由遗传密码的简并性提供，并且在许多生物体间充分记录。密码子偏爱经常与信使RNA(mRNA)的翻译效率关联，继而认为其依赖于翻译的密码子的特性和特定转移RNA(tRNA)分子的利用度等。细胞中选择的tRNA的优势一般反映最常用于肽合成的密码子。因而，可以基于密码子优化修改基因以在给定生物体中实现最佳基因表达。
鉴于可用于极其多种动物、植物和微生物物种的大量基因序列，有可能计算密码子选择的相对频率。密码子选择表是容易得到的，并且可以以多种方式改编。参见Nakamura等，Nucl.Acids Res.28：292(2000)。通过利用这种或类似的表达，本领域普通技术人员可以将频率应用于任何给定的多肽序列，并且生成编码多肽，但是使用对于给定物种最佳的密码子的经密码子优化的编码区的核酸片段。本发明属于OrfA、OrfB、嵌合OrfC、PPT酶和/或本发明的其它辅助蛋白质的经密码子优化的形式，如本文中进一步描述的。
如本领域中已知的，术语“百分比同一性”是两种或更多种多肽序列或两种或更多种多核苷酸序列之间的关系，如通过比较序列测定的。在本领域中，“同一性”还意指多肽或多核苷酸序列之间的序列关联性程度(根据具体情况而定)，如通过此类序列串间的匹配测定的。“同一性”和“相似性”可以通过已知方法容易计算，包括但不限于那些披露于：1)Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.编)Oxford University：NY(1988)；2)Biocomputing：Informatics and Genome Projects(Smith，D.W.编)Academic：NY(1993)；3)Computer Analysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.编)Humania：NJ(1994)；4)Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje，G.编)Academic(1987)；及5)Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.编)Stockton：NY(1991)的。
测定同一性的方法设计为给出测试序列之间的最佳匹配。测定同一性和相似性的方法在公众可得到的计算机程序中编码。例如，可以使用Vector 套件(Invitrogen，Carlsbad，CA)的AlignX程序或LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的MegAlignTM程序实施序列比对和百分比同一性计算。使用“Clustal比对方法”实施序列的多重比对，所述“Clustal比对方法”涵盖几种算法，包括“Clustal V比对方法”，其对应于标记为Clustal V的比对方法(由Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191(1992)披露)；且存在于LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTAR Inc.)的MegAlignTM程序中。对于多重比对，缺省数值对应于缺口罚分＝10和缺口长度罚分＝10。使用Clustal方法进行蛋白质序列的成对比对和百分比同一性计算的缺省参数是K元组＝1，缺口罚分＝3，窗口＝5和保存的对角线(DIAGONALS SAVED)＝5。对于核酸，这些参数是KTUPLE＝2，缺口罚分＝5，窗口＝4和保存的对角线＝4。在使用ClustalV程序比对序列后，有可能通过观察相同程序中的“序列距离”表获得“百分比同一性”。另外，“Clustal W比对方法”是可用的，且对应于标记为Clustal W的比对方法(由Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等，Comput.Appl.Biosci.8：189-191(1992)描述)；且存在于LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTAR Inc.)的MegAlignTM v6.1程序中。多重比对的缺省参数(缺口罚分TM＝10，缺口长度罚分＝0.2，延迟趋异序列(DelayDivergen Seqs)(％)＝30，DNA转换权重(Transition Weight)＝0.5，蛋白质权重矩阵(Protein Weight Matrix)＝Gonnet系列，DNA权重矩阵＝IUB)。在使用Clustal W程序比对序列后，有可能通过观察相同程序中的“序列距离”表获得“百分比同一性”。
术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可以是商品化的或者独立开发。典型的序列分析软件会包括但不限于：1.)GCG程序套件(Wisconsin Package Version9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；2.)BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul等，J. Mol.Biol.，215：403-410(1990))；3.)DNASTAR(DNASTAR，Inc.Madison，WI)；4.)Sequencher(Gene CodesCorporation，Ann Arbor，MI)；和5.)并入Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson编，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date1992，111-20.：Suhai，Sandor.Plenum New York，NY)。在本申请的上下文内，应当理解，在序列分析软件用于分析的情况中，分析结果会基于提及的程序的“缺省数值”，除非另有规定。如本文中使用的，“缺省数值”会指在第一次初始化时最初给软件加载的任何数值或参数集。
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域中公知的，并且由例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(2000)；及Silhavy等，Experiments withGene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1984)；及Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAssoc.and Wiley-Interscience出版(1987至现在)描述。
本文中公开的重组宿主的遗传操作可以使用标准的遗传技术和筛选实施，并且可以在适合于遗传操作的任何宿主细胞中进行。在一些实施方案中，重组宿主可以是但不限于任何高等植物，包括双子叶和单子叶植物两者，和可食用植物，包括作物植物和为了得到其油的植物。如此，可以选择任何植物物种或植物细胞，如下文进一步描述的。
本发明的油也可以在非烹饪或饮食过程和组合物中使用。这些中的一些用途可以是工业的，化妆用的或医用的。本发明的油也可以用于本发明的油适合的任何应用。一般地，可以使用本发明的油替换例如多种应用，诸如滑润剂、滑润剂添加剂、金属加工流体、液压流体和耐火液压流体中的矿物油，酯，脂肪酸，或动物脂肪。本发明的油也可以作为生成改性油方法中的材料使用。用于改性本发明的油的技术的例子包括分级，氢化，改变油的油酸或亚麻酸含量，和本领域技术人员已知的其它改性技术。
本发明的油的化妆品用途的例子包括在用作化妆品组合物中的润肤剂；用作石油膏(petroleum jelly)替换物；用作肥皂的构成部分或用作生产肥皂的方法中的材料；用作口服处理溶液的构成部分；用作老化处理组合物的构成部分；及用作皮肤或毛发气溶胶泡沫制剂的构成部分。
另外，本发明的油可以用于医学应用。例如，本发明的油可以用于针对感染的保护性屏障，并且omega-9脂肪酸含量高的油可以用于增强移植物嫁接存活(美国专利No.6,210,700)。
应当理解，上述内容是本发明的油适合的非烹饪用途的非限制性例子。如先前所述，本发明的油和改性油可以用于替换例如本领域技术人员已知的所有应用中的矿物油，酯，脂肪酸，或动物脂肪。
PUFA合酶
在真核生物体中合成长链PUFA(LC-PUFA)的“标准”或“经典”途径涉及中等链长度饱和或单不饱和脂肪酸的延长和去饱和，并且已经得到描述。经由PUFA合酶合成长链PUFA的途径也已经有记载，并且非常不同于“标准”途径。具体地，PUFA合酶利用丙二酰-CoA作为碳源，并且在不释放任何显著量的中间体的情况下生成最终的PUFA。还有，凭借PUFA合酶，在使用不需要氧的代谢进行合成期间添加合适的顺式双键。在一些实施方案中，NADPH在合成周期期间用作还原剂。
本发明涉及已经遗传修饰为表达PUFA合酶(内源或通过遗传操作)的宿主生物体(例如植物，诸如大豆)。在一些实施方案中，如下的生物体就用PUFA合酶或用不由生物体内源表达的另一种蛋白质修饰生物体而言可以在本文中称为“异源”宿主生物体，所述生物体已经遗传修饰为表达PUFA合酶，其中该生物体不天然(内源，在没有遗传修饰的情况下)表达此类酶，或至少遗传修饰生物体的所述特定PUFA合酶或其部分。在生物体不用不同PUFA合酶或其部分进一步修饰的情况中，本发明的遗传修饰可以用于改善内源表达PUFA合酶的宿主生物体中的PUFA生成。
依照本发明的PUFA合酶可以包含几种多功能性蛋白质(并且可以包括单一功能蛋白质，特别是对于来自海洋细菌的PUFA合酶)，其可以共同起作用以既进行脂肪酸链的重复加工又进行非重复加工，包括选择周期的反式-顺式异构化和烯酰基还原反应。这些蛋白质在本文中又可以称为核心PUFA合酶酶复合物或核心PUFA合酶。这些蛋白质内含有的域和基序的一般功能是本领域中个别已知的，并且就来自海洋细菌和真核生物体的各种PUFA合酶而言已经详细描述(参见例如美国专利No.6,140,486；美国专利No.6,566,583；Metz等，Science293：290-293(2001)；美国申请公开文本No.2002/0194641；美国申请公开文本No.2004/0235127；美国申请公开文本No.2005/0100995，及WO2006/135866)。域可以以单一蛋白质(例如域和蛋白质是同义的)或者以单一蛋白质中的两个或更多个(多个)域之一找到，如上文提及的。已经描述了来自海洋细菌和破囊壶菌属(Thraustochytrium)成员的各种PUFA合酶的域构造，和包含此类PUFA合酶的基因和蛋白质的结构和功能特征(参见例如美国专利No.6,140,486；美国专利No.6,566,583；Metz等，Science293：290-293(2001)；美国申请公开文本No.2002/0194641；美国申请公开文本No.2004/0235127；美国申请公开文本No.2005/0100995和WO2006/135866)。
具有PUFA合酶活性的多核苷酸，基因和多肽的许多例子是本领域中已知的，并且可以在本文中公开的遗传修饰宿主中使用。可用于本发明的PUFA合酶蛋白质或域可以包括细菌和非细菌PUFA合酶两者。非细菌PUFA合酶是一种来自或源自不是细菌的生物体，诸如真核生物的系统。细菌PUFA合酶记载于例如美国申请公开文本No.2008/0050505。可以生成本发明的经遗传修饰的植物，其掺入非细菌PUFA合酶功能域与细菌PUFA合酶功能域，及来自其它PKS系统(I型重复或模块，II型，或III型)或FAS系统的PUFA合酶功能域或蛋白质。
在一些实施方案中，本发明的PUFA合酶至少包含通常在三种，四种，或更多种蛋白质上含有的下列生物学活性域：(a)至少一个烯酰基-ACP还原酶(ER)域；(b)多个酰基载体蛋白(ACP)域(例如至少1至4，或至少5个ACP域，且在一些实施方案中多达6、7、8、9、10或超过10个ACP域)；(c)至少两个β-酮脂酰-ACP合酶(KS)域；(d)至少一个酰基转移酶(AT)域；(e)至少一个β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)域；(f)至少两个FabA样β-羟基酰基-ACP脱水酶(DH)域；(g)至少一个链长度因子(CLF)域；和/或(h)至少一个丙二酰-CoA：ACP酰基转移酶(MAT)域。在一些实施方案中，依照本发明的PUFA合酶还包含至少一个含有脱水酶(DH)保守活性位点基序的区域。
在一些实施方案中，PUFA合酶至少包含下列生物学活性域：(a)至少一个烯酰基-ACP还原酶(ER)域；(b)至少5个酰基载体蛋白(ACP)域；(c)至少两个β-酮脂酰-ACP合酶(KS)域；(d)至少一个酰基转移酶(AT)域；(e)至少一个β-酮脂酰-ACP还原酶(KR)域；(f)至少两个FabA样β-羟基酰基-ACP脱水酶(DH)域；(g)至少一个链长度因子(CLF)域；和(h)至少一个丙二酰-CoA：ACP酰基转移酶(MAT)域。在一些实施方案中，依照本发明的PUFA合酶还包含至少一个含有不作为FabA样DH域一部分的脱水酶(DH)保守活性位点基序的区或域。这些域中每一个的结构和功能特征详细记载于美国申请公开文本No.2002/0194641；美国申请公开文本No.2004/0235127；美国申请公开文本No.2005/0100995；美国申请公开文本No.2007/0245431；及WO2006/135866。
存在有3个开读框，其形成核心裂殖壶菌(Schizochytrium)PUFA合酶，并且先前已经记载于例如美国申请公开文本No.2007/0245431。每个开读框的域结构如下。
裂殖壶菌开读框A(OrfA或Pfal)：OrfA是一种8730个核苷酸的序列(不包含终止密码子)，其编码2910个氨基酸的序列。在OrfA内，存在有12个域：(a)一个β-酮脂酰-ACP合酶(KS)域；(b)一个丙二酰-CoA：ACP酰基转移酶(MAT)域；(c)9个酰基载体蛋白(ACP)域；和(d)一个酮还原酶(KR)域。已经将编码来自裂殖壶菌ATCC20888和ATCC20888的子代菌株(表示为裂殖壶菌菌株N230D)两者的OrfA的基因组DNA克隆(质粒)分离并测序。
基因组克隆pJK1126(表示为pJK1126OrfA基因组克隆，形式为含有来自裂殖壶菌ATCC20888的“OrfA”基因的大肠杆菌(E.coli)质粒载体)在2006年6月8曰保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209USA，并且指定ATCC登录号PTA-7648。
基因组克隆pJK306(表示为pJK306OrfA基因组克隆，形式为含有来自裂殖壶菌N230D的OrfA基因5’部分的大肠杆菌质粒(与pJK320重叠2.2kB))在2006年6月8曰保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209USA，并且指定ATCC登录号PTA-7641。
基因组克隆pJK320(表示为pJK320OrfA基因组克隆，形式为含有来自裂殖壶菌N230D的OrfA基因3’部分的大肠杆菌质粒(与pJK306重叠2.2kB)在2006年6月8曰保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209USA，并且指定ATCC登录号PTA-7644。
裂殖壶菌开读框B(OrfB或Pfa2)：OrfB是一种6177个核苷酸的序列(不包含终止密码子)，其编码2059个氨基酸的序列。在OrfB内，存在有4个域：(a)1个酮脂酰-ACP合酶(KS)域；(b)1个链长度因子(CLF)域；(c)1个酰基转移酶(AT)域；和(d)1个烯酰基ACP-还原酶(ER)域。已经将编码来自裂殖壶菌ATCC20888和ATCC20888的子代菌株(表示为裂殖壶菌菌株N230D)两者的OrfB的基因组DNA克隆(质粒)分离并测序。
基因组克隆pJK1129(表示为pJK1129OrfB基因组克隆，形式为含有来自裂殖壶菌ATCC20888的“OrfB”基因的大肠杆菌质粒载体)在2006年6月8曰保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209USA，并且指定ATCC登录号PTA-7649。
基因组克隆pJK324(表示为pJK324OrfB基因组克隆，形式为含有来自裂殖壶菌N230D的OrfB基因序列的大肠杆菌质粒)在2006年6月8曰保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209USA，并且指定ATCC登录号PTA-7643。
裂殖壶菌开读框C(OrfC或Pfa3)：OrfC是一种4506个核苷酸的序列(不包含终止密码子)，其编码1502个氨基酸的序列。在OrfC内，存在有3个域：(a)2个FabA样-羟基酰基-ACP脱水酶(DH)域；和(b)1个烯酰基ACP-还原酶(ER)域。已经将编码来自裂殖壶菌ATCC20888和ATCC20888的子代菌株(表示为裂殖壶菌菌株N230D)两者的OrfC的基因组DNA克隆(质粒)分离并测序。
基因组克隆pJK1131(表示为pJK1131OrfC基因组克隆，形式为含有来自裂殖壶菌ATCC20888的“OrfC”基因的大肠杆菌质粒载体)在2006年6月8曰保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209USA，并且指定ATCC登录号PTA-7650。
基因组克隆pBR002(表示为pBR002OrfC基因组克隆，形式为含有来自裂殖壶菌N230D的OrfC基因序列的大肠杆菌质粒载体)在2006年6月8曰保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209USA，并且指定ATCC登录号PTA-7642。
另外，存在有3个开读框，其形成先前已经描述的核心破囊壶菌PUFA合酶。每个开读框的域结构如下。
破囊壶菌23B开读框A(OrfA)：OrfA是一种8433个核苷酸的序列(不包含终止密码子)，其编码2811个氨基酸的序列。以下域存在于Th.23B OrfA中：(a)1个β-酮脂酰-ACP合酶(KS)域；(b)1个丙二酰-CoA：ACP酰基转移酶(MAT)域；(c)8个酰基载体蛋白(ACP)域；和(d)1个β-酮脂酰-ACP还原酶(R)域。
基因组克隆Th23BOrfA_pBR812.1(表示为Th23BOrfA_pBR812.1基因组克隆，形式为含有来自破囊壶菌23B的OrfA基因序列的大肠杆菌质粒载体)在2007年3月1曰保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209USA，并且指定ATCC登录号PTA-8232。基因组克隆Th23BOrfA_pBR811(表示为Th23BOrfA_pBR811基因组克隆，形式为含有来自破囊壶菌23B的OrfA基因序列的大肠杆菌质粒载体)在2007年3月1曰保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209USA，并且指定ATCC登录号PTA-8231。
破囊壶菌23B开读框B(OrfB)：OrfB是一种5805个核苷酸的序列(不包含终止密码子)，其编码1935个氨基酸的序列。以下域存在于Th.23B OrfB中：(a)1个β-酮脂酰-ACP合酶(KS)域；(b)1个链长度因子(CLF)域；(c)1个酰基转移酶(AT)域；和(d)1个烯酰基-ACP还原酶(ER)域。基因组克隆Th23BOrfB_pBR800(表示为Th23BOrfB_pBR800基因组克隆，形式为含有来自破囊壶菌23B的OrfB基因序列的大肠杆菌质粒载体)在2007年3月1曰保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209USA，并且指定ATCC登录号PTA-8227。
破囊壶菌23B开读框C(OrfC)：OrfC是一种4410个核苷酸的序列(不包含终止密码子)，其编码1470个氨基酸的序列。以下域存在于Th.23B OrfC中：(a)2个FabA样β-羟基酰基-ACP脱水酶(DH)域，两者与FabA蛋白(即一种催化反式-2-癸烯酰基-ACP合成和此产物可逆异构化成顺式-3-癸烯酰基-ACP的酶)都具有同源性；和(b)1个烯酰基-ACP还原酶(ER)域，其与裂殖壶菌OrfB的ER域具有高同源性。基因组克隆Th23BOrfC_pBR709A(表示为Th23BOrfC_pBR709A基因组克隆，形式为含有来自破囊壶菌23B的OrfC基因序列的大肠杆菌质粒载体)在2007年3月1曰保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801UniversityBoulevard，Manassas，Va.20110-2209USA，并且指定ATCC登录号PTA-8228。
嵌合或杂合PUFA合酶：在一些实施方案中，PUFA合酶包含选自本文中描述的那些域中任一种的域，其中将域组合(例如混合并匹配)以形成完整的PUFA合酶，其满足本文中描述的最小要求。在一些实施方案中，本发明的经遗传修饰的生物体可以用另一种PUFA合酶的至少一个域或其生物学活性片段进一步修饰。在一些实施方案中，PUFA合酶的任何域可以从其天然结构修饰以修饰或增强所述域在PUFA合酶系统中的功能(例如以修饰由系统生成的其PUFA类型或比率)。在本文中提及的专利和出版物中描述了生成嵌合PUFA合酶的此类域混合。
在一些实施方案中，PUFA合酶包含裂殖壶菌PUFA合酶，其中来自裂殖壶菌PUFA合酶的OrfC用来自破囊壶菌23B的OrfC替换。在一些实施方案中，来自破囊壶菌23B的此类嵌合OrfC由经过优化以实现裂殖壶菌密码子选择的核酸序列编码。作为此类嵌合OrfC的非限制性例子，质粒pThOrfC-synPS(表示为pThOrfC-synPS，形式为大肠杆菌质粒载体，其含有经过优化以在裂殖壶菌或其它异源宿主中表达的“完全缝合”合成破囊壶菌23B PUFAPKSOrfC密码子)在2007年3月1曰保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209USA，并且指定ATCC登录号PTA-8229(还可见美国申请公开文本No.2008/0022422)。
可以用于本发明的经遗传修饰的生物体的PUFA合酶基因和多肽的其它例子包括但不限于通过本文中进一步描述的方法生成的下列经密码子优化的序列：SEQ ID NO：1(SzPUFA OrfA v3蛋白)；SEQ ID NO：2(SzPUFA OrfB v3蛋白)；SEQ ID NO：3(hSzThPUFAOrfC v3蛋白)；SEQ ID NO：6(SzPUFA OrfA基因)；SEQ ID NO：7(SzPUFA OrfB v3基因)；和SEQ ID NO：8(hSzThPUFA OrfC v3基因)，及此类序列的活性变体、部分、片段、或衍生物，其中此类基因编码PUFA合酶活性，或者此类多肽或蛋白质具有PUFA合酶活性。本发明包括分离的多核苷酸或多肽，其包含一种或多种此类序列或由一种或多种此类序列组成。
可以用于本发明的PUFA合酶基因和多肽的其它例子包括但不限于与本文中描述的任一种PUFA合酶基因或多肽具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的PUFA合酶基因或多肽。有用的范围可以在这些数值中任一项之间选择(例如80％至100％相同的，85％至100％相同的，90％至100％相同的，95％至100％相同的，80％至99％相同的，85％至99％相同的，90％至99％相同的，或95％至99％相同的)。可以用于本发明的经遗传修饰的生物体的PUFA合酶基因和多肽的又一些例子包括但不限于本文中描述的任一种PUFA合酶或序列的活性变体、部分、片段、或衍生物，其中此类基因编码PUFA合酶活性，或者此类多肽具有PUFA合酶活性。
在一些实施方案中，PUFA合酶可以是藻PUFA合酶。在一些实施方案中，PUFA合酶可以包含与氨基酸序列SEQ ID NO：1为80％至100％相同，85％至100％相同，90％至100％相同，95％至100％相同，80％至99％相同，85％至99％相同，90％至99％相同，或95％至99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，PUFA合酶可以包含氨基酸序列SEQ ID NO：1。在一些实施方案中，编码PUFA合酶的核酸序列可以包含与核酸序列SEQ ID NO：6为80％至100％相同，85％至100％相同，90％至100％相同，95％至100％相同，80％至99％相同，85％至99％相同，90％至99％相同，或95％至99％相同的核酸序列。在一些实施方案中，编码PUFA合酶的核酸序列可以包含核酸序列SEQ ID NO：6。在一些实施方案中，PUFA合酶可以包含与氨基酸序列SEQ ID NO：2为至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，PUFA合酶可以包含氨基酸序列SEQ ID NO：2。在一些实施方案中，编码PUFA合酶的核酸序列可以包含与核酸序列SEQ IDNO：7为至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％相同的核酸序列。在一些实施方案中，编码PUFA合酶的核酸序列可以包含核酸序列SEQID NO：7。在一些实施方案中，PUFA合酶可以包含与氨基酸序列SEQ ID NO：3为至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，PUFA合酶包含氨基酸序列SEQ ID NO：3。在一些实施方案中，编码PUFA合酶的核酸序列包含与核酸序列SEQ ID NO：8为至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％相同的核酸序列。在一些实施方案中，编码PUFA合酶的核酸序列包含核酸序列SEQ ID NO：8。
在一些实施方案中，PUFA合酶包含氨基酸序列SEQ ID NO：1，2，或3或其任何组合。在一些实施方案中，PUFA合酶包含核酸序列SEQ ID NO：6，7，或8或其任何组合。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO：1，2，或3或本文中描述的其任何组合或百分比同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，其它PUFA合酶基因和/或多肽的序列可以使用本文中公开的且本领域中可用的序列在文献中及在技术人员公知的生物信息学数据库中鉴定。例如，此类序列可以经由用已知PUFA合酶基因或多肽序列用BLAST搜索公众可用的数据库鉴定。在此类方法中，同一性可以基于Clustal W比对方法，其使用缺省参数缺口罚分＝10，缺口长度罚分-0.1，和蛋白质权重矩阵Gonnet250系列进行。
另外，可以使用本文中公开的或本领域中已知的PUFA合酶基因或多肽序列来鉴定天然的其它PUFA合酶同系物。例如，可以使用本文中公开的每种PUFA合酶核酸片段来分离编码同源蛋白质的基因。使用序列依赖性方案分离同源基因是本领域中公知的。序列依赖性方案的例子包括但不限于(1)核酸杂交方法；(2)DNA和RNA扩增方法，如以核酸扩增技术的各种用途例示的(例如聚合酶链式反应(PCR)，Mullis等，美国专利No.4,683,202；连接酶链式反应(LCR)，Tabor，S.等，Proc.Acad.Sci.USA82：1074(1985)；或链置换扩增(SDA)，Walker等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：392(1992))；及(3)文库构建和通过互补筛选的方法。
利用编码靶蛋白的已知或鉴定的序列，本领域技术人员可以容易地实施所有这些方法。在一些实施方案中，靶PUFA合酶编码序列周围的DNA序列也可用于一些修饰方法，并且本领域技术人员可以在公众可用的数据库中容易地找到。用于创建遗传突变的方法是本领域中常见且公知的，并且可以适用于创建突变体的实行。
磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶
磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)是一个已经在脂肪酸合成，酮化合物合成，和非核糖体肽合成中充分表征的酶家族。特别地，存在于酶PUFA合酶中的ACP域需要通过来自辅酶A的辅因子(4-磷酸泛酰巯基乙胺)附着酰基载体蛋白(ACP)实现的活化。此辅因子的附着由PPT酶实施。若宿主生物体的内源PPT酶不能活化PUFA合酶ACP域，则有必要提供能够实施所述功能的PPT酶。许多PPT酶的序列是已知的，并且已经测定晶体结构(例如Reuter等，EMBO J.18：6823-31(1999))以及突变分析对活性重要的氨基酸残基(Mofid等，Biochemistry43：4128-36(2004))。
先前已经证明识别本文中描述的OrfAACP域作为底物的异源PPT酶的一个例子是念珠藻PCC7120(以前称作鱼腥藻PCC7120)的Het I蛋白。Het I存在于念珠藻的基因簇中，已知该基因簇负责合成长链羟基脂肪酸，该长链羟基脂肪酸是所述生物体异形胞中存在的糖脂层组分(Black和Wolk，J. Bacteriol.775：2282-2292(1994)；Campbell等，Arch.Microbiol.7(57：251-258(1997))。Het I可能活化存在于所述簇中的蛋白质Hgl E的ACP域。Hgl E的两个ACP域与存在于裂殖壶菌OrfA和其它PUFA合酶中的ACP域具有高度序列同源性。
在一些实施方案中，可以认为PUFA合酶包含至少1个4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)域，或者此类域可以认为是PUFA合酶的辅助域或蛋白质。PPT酶的结构和功能特征已经详细记载于例如美国申请公开文本No.2002/0194641；美国申请公开文本No.2004/0235127；及美国申请公开文本No.2005/0100995。
具有PPT酶活性的基因和多肽的许多例子是本领域中已知的，并且若它们能够活化使用的特定PUFA合酶的ACP域，则可以用于本发明的经遗传修饰的生物体。可以用于本发明的经遗传修饰的生物体的基因和多肽的例子可以包括但不限于本文中进一步描述的以下经密码子优化的序列：SEQ ID NO：5(NoHetI v3蛋白)和SEQ ID NO：10(NoHetI v3基因)。
可以用于本发明的经遗传修饰的生物体的PPT酶基因和多肽的其它例子包括但不限于与本文中描述的任一种PPT酶或序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的PPT酶基因或多肽。有用的范围可以在这些中任一个数值之间选择(例如80％至100％相同的，85％至100％相同的，90％至100％相同的，95％至100％相同的，80％至99％相同的，85％至99％相同的，90％至99％相同的，或95％至99％相同的)。可以用于本发明的经遗传修饰的生物体的PPT酶基因和多肽的又一些例子包括但不限于本文中描述的任一种PPT酶序列的活性变体，片段，部分或衍生物，其中此类基因编码PPT酶活性，或者此类多肽具有PPT酶活性。
在一些实施方案中，PPT酶可以是藻PPT酶。在一些实施方案中，PPT酶可以包含与氨基酸序列SEQ ID NO：5为80％至100％相同，85％至100％相同，90％至100％相同，95％至100％相同，80％至99％相同，85％至99％相同，90％至99％相同，或95％至99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，PPT酶可以包含氨基酸序列SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，编码PPT酶的核酸序列可以包含与核酸序列SEQ ID NO：10为80％至100％相同，85％至100％相同，90％至100％相同，95％至100％相同，80％至99％相同，85％至99％相同，90％至99％相同，或95％至99％相同的核酸序列。在一些实施方案中，编码PPT酶的核酸序列可以包含核酸序列SEQ ID NO：10。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO：5或本文中描述的其任何百分比同一性的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，可以提供用于在异源宿主中生成和/或积累PPT酶的PPT酶。
在一些实施方案中，编码PPT酶的基因和/或多肽可以用于鉴定另一种PPT酶基因和/或多肽序列和/或可以用于鉴定其它细胞中的PPT酶同系物。例如，可以在文献中和/或在技术人员公知的生物信息学数据库中鉴定此类PPT酶编码序列。例如，可以通过用已知的PPT酶编码DNA和多肽序列(诸如本文中提供的那些)用BLAST(如上文公开)搜索公众可用的数据库实现使用生物信息学鉴定另一种细胞类型中的PPT酶编码序列。同一性基于ClustalW比对方法，其使用缺省参数缺口罚分＝10，缺口长度罚分＝0.1，和蛋白质权重矩阵Gonnet250系列进行。
在一些实施方案中，经遗传修饰的植物(例如大豆)、其后代、细胞、组织或部分含有PUFA合酶和PPT酶。在一些实施方案中，经遗传修饰的植物(例如大豆)、其后代、细胞、组织或部分含有单一重组表达载体中(i)和(ii)的核酸序列。在一些实施方案中，经遗传修饰的植物(例如大豆)、其后代、细胞、组织或部分含有不同重组表达载体中(i)和(ii)的核酸序列。
酰基-CoA合成酶
本发明提供了酰基-CoA合成酶(ACoAS)蛋白质，其催化长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基-CoA。通过PUFA合酶得到PUFA的内源生产者(裂殖壶菌)拥有一种或多种能够将其PUFA合酶的游离脂肪酸产物转化成酰基-CoA的ACoAS。因此，内源含有PUFA合酶的裂殖壶菌及其它生物体(例如其它Thraustochytrids)或能将PUFA FFA转化成酰基-CoA的其它生物体(诸如假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)或寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii))可以代表编码酶的基因的来源，该酶可用于容许或提高异源宿主中表达的PUFA合酶产物的积累。其它ACoAS序列已经记载于美国申请公开文本No.2007/0245431。
具有ACoAS活性的基因和多肽的许多例子是本领域中已知的，并且可以用于本发明的经遗传修饰的生物体。可以用于本发明的经遗传修饰的生物体的基因和多肽的例子可以包括但不限于本文中进一步描述的以下经密码子优化的序列：SEQ ID NO：4(SzACS-2v3蛋白)和SEQ ID NO：9(hSzThACS-2v3基因)。
可用于本发明的经遗传修饰的生物体的ACoAS基因和多肽的其它例子包括但不限于与本文中描述的任一种ACoAS或序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的ACoAS基因或多肽。有用的范围可以在这些中任一个数值之间选择(例如80％至100％相同的，85％至100％相同的，90％至100％相同的，95％至100％相同的，80％至99％相同的，85％至99％相同的，90％至99％相同的，或95％至99％相同的)。可以用于本发明的经遗传修饰的生物体的ACoAS基因和多肽的又一些例子包括但不限于本文中描述的任一种ACoAS序列的活性变体，片段，部分或衍生物，其中此类基因编码ACoAS活性，或者此类多肽具有ACoAS活性。
在一些实施方案中，ACoAS可以是藻ACoAS。在一些实施方案中，ACoAS可以包含与氨基酸序列SEQ ID NO：4为80％至100％相同，85％至100％相同，90％至100％相同，95％至100％相同，80％至99％相同，85％至99％相同，90％至99％相同，或95％至99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，ACoAS可以包含氨基酸序列SEQ ID NO：4。在一些实施方案中，编码ACoAS的核酸序列可以包含与核酸序列SEQ ID NO：9为80％至99％相同，85％至99％相同，90％至99％相同，80％至95％相同，或85％至95％相同的核酸序列。在一些实施方案中，编码ACoAS的核酸序列可以包含核酸序列SEQ ID NO：9。在一些实施方案中，编码ACoAS的核酸序列包含核酸序列SEQ ID NO：34。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO：4或本文中描述的其任何百分比同一性的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，可以提供ACoAS，用于在异源宿主中生成和/或积累ACoAS及用于内源宿主中改善的ACoAS生成和/或积累。
在一些实施方案中，编码ACoAS的基因和/或多肽可以用于鉴定另一种ACoAS基因和/或多肽序列和/或可以用于鉴定其它细胞中的ACoAS同系物。例如，可以在文献中和/或在技术人员公知的生物信息学数据库中鉴定此类ACoAS酶编码序列。例如，可以通过用已知的ACoAS编码DNA和多肽序列(诸如本文中提供的那些)用BLAST(如上文公开)搜索公众可用的数据库实现使用生物信息学鉴定另一种细胞类型中的ACoAS编码序列。同一性基于Clustal W比对方法，其使用缺省参数缺口罚分＝10，缺口长度罚分＝0.1，和蛋白质权重矩阵Gonnet250系列进行。
在一些实施方案中，经遗传修饰的植物(例如大豆)、其后代、细胞、组织或部分包含PUFA合酶和ACoAS，或PUFA合酶，PPT酶和ACoAS。在一些实施方案中，经遗传修饰的植物(例如大豆)、其后代、细胞、组织或部分包含单一重组表达载体中含有的(i)，(ii)或(iii)，或其任何组合的核酸序列。在一些实施方案中，(i)，(ii)和(iii)的核酸序列包含在不同重组表达载体中。在一些实施方案中，(i)和(ii)的核酸序列包含在单一重组表达载体中，而(iii)的核酸序列包含在不同重组表达载体中。在一些实施方案中，(i)和(iii)的核酸序列包含在单一重组表达载体中，而(ii)的核酸序列包含在不同重组表达载体中。在一些实施方案中，(ii)和(iii)的核酸序列包含在单一重组表达载体中，而(i)的核酸序列包含在不同重组表达载体中。在一些实施方案中，(i)，(ii)或(iii)，或其任何组合的核酸序列在一种或多种种子特异性启动子的控制下。
制成经遗传修饰的生物体的方法
为了产生一种或多种期望的多不饱和脂肪酸的显著较高的产率，植物可以遗传修饰为将PUFA合酶引入植物中。本发明还涉及改善或增强此类遗传修饰的效率，且特别是改善或增强PUFA合酶的终产物(例如PUFA)的生成和/或积累的方法。
用于在经遗传修饰的生物体(包括但不限于植物)中的基因表达的方法是本领域中已知的。在一些实施方案中，可以针对靶宿主细胞对要表达的PUFA合酶基因的编码区进行密码子优化，如下文描述的。重组宿主细胞(包括但不限于植物细胞)中的基因表达会需要与感兴趣的编码区可操作连接的启动子和/或转录终止子。许多启动子可以在构建基因的载体中使用，包括但不限于种子特异性启动子(例如PvDlec2，LfKCS3，FAE1，BoACP，或BnaNapinC)或叶特异性启动子(例如泛素或CsVMV)。可以用于本发明的启动子的其它非限制性例子包括WO1992/18634中披露的酰基载体蛋白启动子；菜豆(Phaseolus vulgaris)β-菜豆蛋白启动子及截短型式，其披露于Slightom等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：1897-1901；1983)；Sengupta-Gopalan等(Proc.Nat.Acad.Sci.82：3320-3324；1985)；van derGeest等(Plant Mol.Biol.33：553-557；1997)，及Bustos等(EMBO J.10：1469-1479；1991)。
在本发明的一些实施方案中，重组载体是工程化(例如人工生成的)核酸分子，其作为用于操作选择的核酸序列及用于将此类核酸序列导入宿主细胞中的工具使用。因此，重组载体适合于用于克隆，测序和/或以其他方式操作选择的核酸序列，诸如通过对宿主细胞表达和/或递送选择的核酸序列以形成重组细胞进行。此类载体通常含有异源核酸序列，其是在天然条件下在要克隆或递送的核酸序列附近找不到的核酸序列，尽管载体也可以含有调节核酸序列(例如启动子，非翻译区)，该调节核酸序列在天然条件下载本发明的核酸分子附近找到或者可用于表达本发明的核酸分子。载体可以是RNA或DNA(原核的或真核的)，且通常是质粒。载体可以以染色体外元件(例如质粒)维持或者它可以整合入重组生物体(例如微生物或植物)的染色体中。整个载体可以适当在宿主细胞内或在某些条件下保持，可以将质粒DNA删除，留下本发明的核酸分子。整合的核酸分子可以在染色体启动子控制下，在天然的或质粒启动子控制下，或者在几种启动子组合控制下。单一或多个拷贝的核酸分子可以整合入染色体中。本发明的重组载体可以含有至少一种选择标志物。
在一些实施方案中，用于本发明的重组核酸分子的重组载体是表达载体。在此类实施方案中，将编码要生成的产物(例如PUFA合酶)的核酸序列插入重组载体中以生成重组核酸分子。以如下的方式将编码要生成的蛋白质的核酸序列插入载体中，使得将核酸序列与载体中的调节序列可操作连接，所述调节序列实现核酸序列在重组宿主细胞内的转录和翻译。
可用于转化多种宿主生物体和细胞的载体是常见的且文献中披露的。通常，载体含有选择标志物和序列，其容许在期望的宿主中自主复制或染色体整合。另外，合适的载体可以包含携带转录启动控制的启动子区和转录终止控制区，在它们之间可以插入编码区DNA片段，以提供插入编码区的表达。这两种控制区可以源自与经转化的宿主细胞同源的基因，尽管应当理解此类控制区也可以源自对于作为生产宿主选择的特定物种而言非天然的基因。
本发明包括与如本文中描述的PUFA合酶及与外源PPT酶一起表达如本文中描述并例示的一种或多种酰基-CoA合成酶，其单独或与本文中描述的任一种或多种策略组合利用(例如下列任一项、两项、三项或四项：密码子优化，细胞器靶向，增强PUFA合酶对丙二酰CoA的竞争(例如通过抑制FAS)，和/或表达一种或多种酰基转移酶或相关酶)，以提高异源宿主中PUFA生成和/或积累。
本发明的一些实施方案涉及酶PUFA合酶、PPT酶、和/或任一种或多种辅助蛋白质的表达和/或靶向的遗传修饰靶向至宿主的一种或多种细胞器。例如，在一些实施方案中，可以PUFA合酶系统和PPT酶的表达靶向至植物的质体。在一些实施方案中，PUFA合酶和PPT酶的表达靶向至胞质溶胶。在一些实施方案中，PUFA合酶和PPT酶的表达靶向至植物的质体和胞质溶胶两者。在这些中任一个实施方案中，可以将其它靶物引导至质体或胞质溶胶。
在一些实施方案中，在胞质溶胶中表达酰基-CoA合成酶以将DHA和/或其它LC-PUFA游离脂肪酸转化成酰基-CoA，其继而可以被酰基转移酶利用。
多种质体靶向序列是本领域中已知的，并且可以在异源宿主是植物或植物细胞，且期望对质体的靶向的实施方案中使用。
本发明包括与如本文中描述的PUFA合酶的表达及与外源PPT酶一起使用细胞器靶向(例如至植物中的质体或叶绿体)，其单独或与本文中描述的任一种或多种策略组合利用(例如下列任一项、两项、三项或四项：密码子优化，增强PUFA合酶对丙二酰CoA的竞争(例如通过抑制FAS)，表达一种或多种酰基-CoA合成酶，和/或表达一种或多种酰基转移酶或相关酶)，以提高异源宿主中PUFA生成和/或积累。
通过信号序列控制基因产物靶向至质体或叶绿体，所述信号序列存在于多种蛋白质的氨基端末端，且在输入过程中被切割，产生成熟的蛋白质(例如就叶绿体靶向而言，参见例如Comai等，J.Biol.Chem.263：15104-15109(1988))。这些信号序列可以与异源基因产物融合以实现异源产物对叶绿体的输入(van den Broeck等Nature313：358-363(1985))。编码合适信号序列的DNA可以从编码RUBISCO蛋白，CAB蛋白，酶EPSP合酶，GS2蛋白和已知定位于叶绿体的许多其它蛋白质的cDNA分离。
在本发明的一些实施方案中，本发明中采用的蛋白质的定位指向亚细胞区室，例如指向质体或叶绿体。可以将蛋白质通过在其氨基端包含叶绿体运输肽(CTP)将蛋白质引导至叶绿体。类似地，可以将蛋白质通过在其N端包含质体运输或信号传导肽引导至质体。
本领域中公知天然存在的叶绿体靶向蛋白质，其以较大的前体蛋白质合成，该前体蛋白含有氨基端叶绿体靶向肽，其将前体引导至叶绿体输入装置。叶绿体靶向肽一般被位于叶绿体细胞器内的特定内切蛋白酶切割，如此将来自前体的靶向性成熟的且可以为活性的酶释放到叶绿体环境中。适合于编码肽的序列的例子包括矮牵牛EPSPS CTP、拟南芥EPSPS CTP2和内含子，和本领域技术人员已知的其它序列，所述肽适合于将基因或基因产物靶向引导至植物细胞的叶绿体或质体。此类靶向序列规定将期望的表达蛋白转移至其最有效发挥功能的细胞结构，或者通过将期望的表达蛋白转移至期望的表型功能必需的细胞过程集中的细胞区域。叶绿体靶向肽的具体例子是本领域中公知的，并且包括拟南芥(Arabidopsis thaliana)二磷酸核酮糖羧化酶小亚基atslA运输肽，拟南芥EPSPS运输肽，和玉蜀黍二磷酸核酮糖羧化酶小亚基运输肽。
例如，经优化的运输肽由van den Broeck等，Nature，313：358-363(1985)描述。例如，原核和真核信号序列由Michaelis等，Ann.Rev.Microbiol.36：425(1982)披露。可以用于本发明的运输肽的其它例子包括叶绿体运输肽，诸如那些记载于Von Heijne等，PlantMol.Biol.Rep.9：104-126(1991)；Mazur等，Plant Physiol.85：1110(1987)；Vorst等，Gene65：59(1988)的。Chen&Jagendorf(J.Biol.Chem.268：2363-2367(1993))已经描述了叶绿体运输肽用于输入异源转基因的用途。使用的此肽是来自皱叶烟草(Nicotianaplumbaginifolia)的rbcS基因的运输肽(Poulsen等Mol.Gen.Genet.205：193-200(1986))。一种在本文中发挥功能以将异源蛋白定位至叶绿体的CTP源自欧洲油菜(Brassica napus)酰基-ACP硫酯酶。
一种用于将基因定位至叶绿体或质体的备选手段包括叶绿体或质体转化。可以生成重组植物，其中仅仅叶绿体DNA经过改变以掺入本申请中涵盖的分子。在叶绿体中发挥功能的启动子是本领域中已知的(Hanley-Bowden等，Trends in Biochemical Sciences12：67-70(1987))。例如，用于获得含有已经接受异源DNA插入的叶绿体的细胞的方法和组合物已经由Daniell等(美国专利No.5,693,507)及Maliga等(美国专利No.5,451，513)描述。
策略组合
依照本发明，在生成异源宿主以生成和积累一种或多种靶PUFA中，可以使用用于改善宿主中PUFA的生成和/或积累的本文中描述的任一种或多种(任何组合)策略。实际上，涵盖的是，各种策略组合会是叠加或协同的，并且与在缺乏一种或多种此类策略的情况中相比提供改善的PUFA生成和/或积累。实际上，实施例提供了在宿主生物体中生成PUFA的例示性策略。
本发明涵盖使用这些修饰组合，或本文中描述的任何其它修饰或修饰组合得到的任何植物或植物细胞。在一些实施方案中，此类植物已经进一步遗传修饰为表达用于改善宿主生成和/或积累PUFA(或PUFA合酶的其它生物活性产物)的如本文中描述的辅助蛋白质(例如ACoAS，GPAT，LPAAT，DAGAT或乙酰CoA羧化酶(ACC酶))。此外，本发明涵盖使用本文中描述的任何修饰或修饰组合得到的任何宿主细胞或生物体，包含靶PUFA的源自此类细胞或生物体的任何产物，包括种子或油亦然。
在一些实施方案中，依照本发明遗传修饰的植物(例如植物宿主细胞)包括但不限于任何高等植物，包括双子叶和单子叶植物两者，且特别是可食用植物，包括作物植物且特别是为了得到其油的植物。此类植物可以包括但不限于例如：大豆、油菜籽、亚麻籽、玉米、红花、向曰葵和烟草。如此，可以选择任何植物物种或植物细胞。在一些实施方案中，植物属于壳斗科(豆科，豆科作物科，豌豆科，扁豆科或豆科)。在一些实施方案中，植物属于属大豆属。在一些实施方案中，植物是Glycine albicans，Glycine aphyonota，Glycine arenari，Glycine argyrea，Glycine canescens，澎湖大豆(Glycine clandestine)，Glycinecurvata，Glycine cyrtoloba，Glycine falcate，Glycine gracei，Glycine hirticaulis，Glycine hirticaulis subsp.leptosa，Glycine lactovirens，Glycine latifolia，Glycine latrobeana，Glycine microphylla，Glycine montis-douglas，Glycineperatosa，Glycine pescadrensis，Glycine pindanica，Gycine pullenii，Glycinerubiginosa，Glycine stenophita，Glycine syndetika，烟豆(Glycine tabacina)，短绒野大豆(Glycine tomentella)，劳豆(Glycine soja)，或大豆(Glycine max)(大豆)。在一些实施方案中，植物是花生，扁豆(菜豆)，蚕豆(broad bean)(蚕豆(Vicia faba))或豌豆(豌豆(Pisum sativum))。
如本文中使用的，“植物部分”包括任何植物部分，包括但不限于种子(包括成熟种子和未成熟种子)，花粉，胚，花，果实，枝条，叶，根，茎，外植体，等等。在一些实施方案中，经遗传修饰的植物具有基因组，该基因组从其正常(例如野生型或天然存在)形式修饰(例如突变或改变)，使得实现期望的结果(例如增加或经修饰的PUFA合酶和/或使用PUFA合酶得到的期望产物的生成和/或积累)。在一些实施方案中，可以使用经典的品系开发和/或分子遗传技术实现植物的遗传修饰。本领域中已知用于生成转基因植物的方法，其中将编码期望氨基酸序列的重组核酸分子掺入植物基因组中。在一些实施方案中，依照本发明遗传修饰的植物是适合于动物(包括人)食用的植物。
可以生成，选择或鉴定来自这些植物的植物系，其经过优化以得到特别期望的性状，例如疾病抗性，易于植物转化，油含量或概况(profile)，等等。在一些实施方案中，可以经由植物育种，或者经由诸如标志物辅助育种和耕作等方法选择植物系。在一些实施方案中，可以使用植物细胞培养物，并且例如没有将其培养成分化的植物并且使用常规的农业实践栽培，而且取而代之将其在液体培养基中培养并维持。
在一些实施方案中，植物可以是含油种子植物，其中含油种子和/或含油种子中的油含有由PUFA合酶生成的PUFA。在一些实施方案中，此类油可以含有可检出量的至少一种靶或初生PUFA，其是PUFA合酶的产物。在一些实施方案中，此类油可以基本上没有中间体或副产物，该中间体或副产物不是靶或初生PUFA产物，且不是由野生型植物中的内源FAS系统天然生成的(例如野生型植物经由FAS系统生成一些较短或中间链的PUFA，诸如18个碳的PUFA，但是由于用PUFA合酶的遗传修饰而会有植物中生成的新的，或者额外的脂肪酸)。
关于经遗传修饰的植物的生成，用于植物的遗传工程化的方法是本领域中公知的。例如，许多用于植物转化的方法已经得到开发，包括用于双子叶植物和单子叶植物的生物学和物理转化方案(例如Goto-Fumiyuki等，Nature Biotech17：282-286(1999)；Miki等，Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，Glick，B.R.和Thompson，J.E.编，CRC Press，Inc.，Boca Raton，pp.67-88(1993)。另外，用于植物细胞或组织转化及植物再生的体外培养方法和载体例如在Gruber等，Methods in Plant Molecular Biologyand Biotechnology，Glick，B.R.和Thompson，J.E.编，CRC Press，Inc.，Boca Raton，pp.89-119(1993)中可得到。
本发明涉及包含选自SEQ ID NO：6-10的核酸序列的分离的核酸分子及包含如本文中描述的此类序列的修饰或突变的分离的核酸分子。本发明涉及包含选自SEQ ID NO：1-5的氨基酸序列的分离的多肽及包含如本文中描述的此类序列的修饰或突变的分离的多肽。
本发明包括重组表达载体pDAB7361。本发明包括重组表达载体pDAB7362。本发明包括重组表达载体pDAB7363。本发明包括重组表达载体pDAB7365。本发明包括重组表达载体pDAB7368。本发明包括重组表达载体pDAB7369。本发明包括重组表达载体pDAB7370。本发明包括重组表达载体pDAB100518。本发明包括重组表达载体pDAB101476。本发明包括重组表达载体pDAB9166。本发明包括重组表达载体pDAB9167。本发明包括重组表达载体pDAB7379。本发明包括重组表达载体pDAB7380。本发明包括重组表达载体pDAB9323。本发明包括重组表达载体pDAB9330。本发明包括重组表达载体pDAB9337。本发明包括重组表达载体pDAB9338。本发明包括重组表达载体pDAB9344。本发明包括重组表达载体pDAB9396。本发明包括重组表达载体pDAB101412。本发明包括重组表达载体pDAB7733。本发明包括重组表达载体pDAB7734。本发明包括重组表达载体pDAB101493。本发明包括重组表达载体pDAB109507。本发明包括重组表达载体pDAB109508。本发明包括重组表达载体pDAB109509。本发明包括重组表达载体pDAB9151。本发明包括重组表达载体pDAB108207。本发明包括重组表达载体pDAB108208。本发明包括重组表达载体pDAB108209。本发明包括重组表达载体pDAB9159。本发明包括重组表达载体pDAB9147。本发明包括重组表达载体pDAB108224。本发明包括重组表达载体pDAB108225。
本发明包括包含重组表达载体pDAB7361的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB7362的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB7363的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB7365的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB7368的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB7369的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB7370的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB100518的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB101476的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB9166的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB9167的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。
本发明包括包含重组表达载体pDAB7379的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB7380的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB9323的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB9330的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB9337的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB9338的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB9344的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB9396的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB101412的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB7733的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB7734的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。
本发明包括包含重组表达载体pDAB101493的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB109507的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB109508的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB109509的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB9151的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB108207的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB108208的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB108209的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB9159的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB9147的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB108224的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。本发明包括包含重组表达载体pDAB108225的大豆植物、其后代、细胞、组织、种子或部分。
如本文中使用的，术语“转染”用于指可以将外源核酸分子(例如重组核酸分子)插入细胞中的任何方法。术语“转化”在此类术语用于指将核酸分子导入微生物细胞，诸如藻，细菌和酵母中或导入植物细胞中时可以与术语“转染”可互换使用。在微生物和植物系统中，术语“转化”用于描述由于微生物或植物获得外源核酸所致的遗传性变化，并且与术语“转染”基本上同义。在一些实施方案中，转染技术包括但不限于转化，颗粒轰击，扩散，主动运输，浴超声处理，电穿孔，微注射，脂转染，吸附，感染和原生质体融合。
用于将表达载体导入植物中的广泛利用的方法基于土壤杆菌的天然转化系统。Horsch等，Science227：1229(1985)。根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)和发根土壤杆菌(A.rhizogenes)是已知可用于遗传转化植物细胞的植物病原性土壤细胞。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌的Ti和Ri质粒分别携带负责植物遗传转化的基因。Kado，C.I.，Crit.Rev.Plant.Sci.10：1(1991)。土壤杆菌载体系统和用于土壤杆菌介导的基因转移的方法的描述也是可用的，例如Gruber等，见上文，Miki等，见上文，Moloney等，Plant CellReports8：238(1989)，及美国专利No.4,940,838和5,464,763。
另一种已知的植物转化方法是微粒介导的转化，其中微粒表面上携带DNA。在此方法中，用生物射弹装置将表达载体导致植物组织中，所述生物射弹装置将微粒加速至足以穿透植物细胞壁和膜的速度。Sanford等，Part.Sci.Technol.5：27(1987)，Sanford，J.C，Trends Biotech.6：299(1988)，Sanford，J.C，Physiol.Plant79：206(1990)，Klein等，Biotechnology10：268(1992)。
又一种用于将DNA物理递送至植物的方法是超声处理靶细胞。Zhang等，Bio/Technology9：996(1991)。还有，脂质体或球形体融合已经用于将表达载体导入植物中。Deshayes等，EMBO J.，4：2731(1985)，Christou等，Proc Natl.Acad.Sci.USA84：3962(1987)。还已经报告了使用CaCl2沉淀，聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸将DNA直接摄入原生质体中。Hain等，Mol.Gen.Genet.199：161(1985)及Draper等，Plant Cell Physiol.23：451(1982)。还已经描述了原生质体和全细胞和组织的电穿孔。Donn等，Abstracts of VIIthInternational Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC，A2-38，p.53(1990)；D'Halluin等，Plant Cell4：1495-1505(1992)及Spencer等，Plant Mol.Biol.24：51-61(1994)。另外，也可以使用碳化硅晶须(whisker)(Kaepler等，1990，Plant CellReports)及使用例如浸花方法的植物中转化(Clough和Bent，Plant J.16：735-743(1998))。精确的植物转化方法可以随选择的植物物种和经选择用于转化的植物细胞类型(例如幼苗衍生的细胞类型诸如下胚轴和子叶或胚组织)而有些变化。
在将遗传构建体导入植物细胞中后，可以将植物细胞培养，并且在出现分化组织诸如枝条和根后，可以生成成熟的植物。在一些实施方案中，可以生成多个植物。用于再生植物的方法是本领域普通技术人员已知的，并且可以见于例如：Plant Cell and TissueCulture，1994，Vasil和Thorpe编Kluwer Academic Publishers及Plant Cell CultureProtocols(Methods in Molecular Biology111，1999Hall Eds Humana Press)。
在一些实施方案中，可以将本文中描述的经遗传修饰的植物在发酵培养基中培养或者在合适的介质诸如土壤中培养。在一些实施方案中，适合于高等植物的生长介质可以包括植物用的任何生长介质，包括但不限于土壤，砂，支持根生长的任何其它颗粒介质(例如蛭石，珍珠岩，等等)或溶液培养培养物，及合适的光照，水和营养补充物，其优化高等植物的生长。
本领域技术人员应当领会，使用重组DNA技术可以改善转染核酸分子的表达控制，其通过操作例如宿主细胞内核酸分子的拷贝数目，那些核酸分子转录的效率，所得转录物翻译的效率，和翻译后修饰的效率进行。另外，与天然启动子相比，启动子序列可以遗传工程化改造为改善表达水平。可用于控制核酸分子表达的重组技术包括但不限于将核酸分子整合入一种或多种宿主细胞染色体中，将载体稳定性序列添加至质粒，转录控制信号(例如启动子，操纵基因，增强子)的取代或修饰，翻译控制信号(例如核糖体结合位点，Shine-Dalgarno序列)的取代或修饰，修饰核酸分子以对应于宿主细胞的密码子选择，和缺失使转录物脱稳定化的序列。
在一些实施方案中，植物可以包括那些已知生成化合物的植物或遗传工程化改造为生成这些化合物/药剂的植物，所述化合物用作药剂，芳香剂，营养制品剂，功能性食物成分或化妆活性剂。
本发明的所有这些实施方案适用于任何经遗传修饰的生物体和用于生成并使用此类生物体的方法的讨论，如本文中描述的。
来自经遗传修饰的生物体的产物
在一些实施方案中，本发明的经遗传修饰的生物体生成一种或多种多不饱和脂肪酸，包括但不限于EPA(C20：5，n-3)，DHA(C22：6，n-3)，DPA(C22：5，n-6或n-3)，ARA(C20：4，n-6)，GLA(CI8：3，n-6)，ALA(C18：3，n-3)，和/或SDA(C18：4，n-3))，以及在一些实施方案中，一种或多种较长链的PUFA，包括但不限于EPA(C20：5，n-3)，DHA(C22：6，n-3)，DPA(C22：5，n-6或n-3)，或DTA(C22：4，n-6)，或其任何组合。在一些实施方案中，本发明的经遗传修饰的植物生成一种或多种多不饱和脂肪酸，包括但不限于EPA(C20：5，n-3)，DHA(C22：6，n-3)，和/或DPA(C22：5，n-6或n-3)，或其任何组合。在一些实施方案中，本发明的经遗传修饰的植物没有高油酸背景。
在一些实施方案中，经遗传修饰的生物体是已经经过遗传修饰以重组表达PUFA合酶和PPT酶的植物，如本文中描述的。在一些实施方案中，此类植物已经进一步遗传修饰为表达本文中描述的辅助蛋白(例如ACoAS，GPAT，LPAAT，DAGAT或ACC酶)，用于改善宿主生成和/或积累PUFA(或PUFA合酶的其它生物活性产物)。
本发明的一些实施方案包括生成期望链长度且具有期望双键数目的多不饱和脂肪酸及(通过延伸)包含这些PUFA的自本文中描述的经遗传修饰的植物获得的含油种子和油(例如自此类植物的油或种子获得)。可以通过本发明生成的PUFA的例子包括但不限于DHA(二十二碳六烯酸(C22：6，n-3))，ARA(二十碳四烯酸或花生四烯酸(C20：4，n-6))，DPA(二十二碳五烯酸(C22：5，n-6或n-3))，和EPA(二十碳五烯酸(C20：5，n-3))，及其任何组合。经由使用生成PUFA的PUFA合酶，通过开发经遗传修饰的植物，本发明容许生成一种或多种期望的(靶或初生)PUFA中富含的商业上有价值的脂质。
在一些实施方案中，源自特定生物体的给定PUFA合酶会生成特定的PUFA，使得从特定生物体选择PUFA合酶会导致规定靶或初生PUFA的生成。在一些实施方案中，PUFA的比率可以随特定PUFA合酶的选择及所述系统如何响应其表达的特定条件而不同。例如，使用来自破囊壶菌23B(ATCC No.20892)的PUFA合酶也可以导致生成DHA和DPA(n-6)作为靶或初生PUFA；然而，在破囊壶菌23B的情况中，DHA与DPA(n-6)的比率是10∶1(且范围可以是8∶1至40∶1)，而在裂殖壶菌中，比率通常为2.5∶1。在一些实施方案中，给定的PUFA合酶可以通过混合来自不同PUFA合酶的蛋白质和域来修饰，或者可以修饰给定PUFA合酶的域或蛋白质以改变靶PUFA产物和/或比率。
在一些实施方案中，提及生成PUFA的酶系统的“中间体产物”或“副产物”指由于系统生成靶或初生PUFA而由酶系统生成，但是不是初生或靶PUFA的任何产物，且特别是脂肪酸产物。在一些实施方案中，中间体和副产物可以包括非靶脂肪酸，其由野生型植物，或由用作指定遗传修饰的接受体的亲本植物天然生成，但是现在分类为中间体或副产物，这是因为与由野生型植物，或由用作指定遗传修饰的接受体的亲本植物产生的水平相比，它们由于遗传修饰而以更大的水平生成。在一些实施方案中，一种酶系统的初生或靶PUFA可以是初生或靶产物为不同PUFA的不同酶系统的中间体。例如，在使用标准途径来生成EPA时，脂肪酸诸如GLA，DGLA和SDA以相当大的量作为中间体产物生成(例如美国申请公开文本No.2004/0172682)。类似地，且也由美国申请公开文本No.2004/0172682例示的，在使用标准途径来生成DHA时，除上文提及的脂肪酸外，ETA和EPA(值得注意的是上述第一个例子中的靶PUFA)可以以相当大的量生成并且可以相对于总脂肪酸产物比靶PUFA自身以显著更大的量存在。
在一些实施方案中，植物可以遗传修饰为将PUFA合酶系统引入植物中。不知道植物内源含有PUFA合酶，因此，本发明代表生成具有独特的脂肪酸生成能力的植物的机会。本发明提供了遗传工程化植物以在同一植物中生成一种或多种PUFA，包括但不限于EPA，DHA，DPA(n3或n6)，ARA，GLA，SDA及其它，包括其任何组合。本发明提供了创建各种比率和形式的多种“设计者油”之任一的能力。在一些实施方案中，来自本文中描述的特定海洋生物体的PUFA合酶的使用可以延伸PUFA生成的范围，并且在用于培养大多数作物植物的温度范围内成功生成此类PUFA。
在一些实施方案中，“基本上没有”用于合成PUFA的系统的中间体或副产物或者没有以实质量存在的中间体或副产物意指由于引入或存在用于生成PUFA(例如其不是由野生型植物或用作指定遗传修饰的接受体的亲本植物生成的)的酶系统而在经遗传修饰的植物(和/或植物部分和/或种子油级分)中生成的任何中间体或副产物脂肪酸(非靶PUFA)可以以一定量存在，该量是按总脂肪酸重量计小于10％，按总脂肪酸重量计小于9％，按总脂肪酸重量计小于8％，按总脂肪酸重量计小于7％，按总脂肪酸重量计小于6％，按总脂肪酸重量计小于5％，按总脂肪酸重量计小于4％，按总脂肪酸重量计小于3％，按总脂肪酸重量计小于2％，按总脂肪酸重量计小于1％，或按总脂肪酸重量计小于0.5％。
在一些实施方案中，本发明的经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织或部分或自本发明的经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织或部分获得的油或种子包含可检测量的DHA(二十二碳六烯酸(C22：6，n-3))，DPA(n-6)(二十二碳五烯酸(C22：5n-6))或EPA(二十碳五烯酸(C20：5，n-3))。在一些实施方案中，本发明的经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织或部分或自本发明的经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织或部分获得的油或种子包含按总脂肪酸重量计至少0.01％，至少0.02％，至少0.03％，至少0.04％，至少0.05％，至少0.06％，至少0.07％，至少0.08％，至少0.09％，至少0.1％，至少0.2％，至少0.3％，至少0.4％，至少0.5％，至少0.6％，至少0.7％，至少0.8％，至少0.9％，至少1％，至少1.5％，至少2％，至少2.5％，至少3％，至少3.5％，至少4％，至少4.5％，至少5％，至少5.5％，至少6％，至少6.5％，至少7％，至少7.5％，至少8％，至少8.5％，至少9％，至少9.5％，至少10％，至少10.5％，至少11％，至少11.5％，至少12％，至少12.5％，至少13％，至少13.5％，至少14％，至少14.5％或至少15％DHA。有用的范围可以在任何这些值之间选择，例如按总脂肪酸重量计0.01％至15％，0.05％至10％和1％至5％DHA。
在一些实施方案中，本发明的经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织或部分或自本发明的经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织或部分获得的油或种子包含按总脂肪酸重量计至少0.01％，至少0.02％，至少0.03％，至少0.04％，至少0.05％，至少0.06％，至少0.07％，至少0.08％，至少0.09％，至少0.1％，至少0.2％，至少0.3％，至少0.4％，至少0.5％，至少0.6％，至少0.7％，至少0.8％，至少0.9％，至少1％，至少1.5％，至少2％，至少2.5％，至少3％，至少3.5％，至少4％，至少4.5％，至少5％，至少5.5％，至少6％，至少6.5％，至少7％，至少7.5％，至少8％，至少8.5％，至少9％，至少9.5％，或至少10％EPA。有用的范围可以在任何这些值之间选择，例如按总脂肪酸重量计0.01％至10％，0.05％至5％和0.1％至5％EPA。
在一些实施方案中，本发明的经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织或部分或自本发明的经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织或部分获得的油或种子包含按总脂肪酸重量计至少0.01％，至少0.02％，至少0.03％，至少0.04％，至少0.05％，至少0.06％，至少0.07％，至少0.08％，至少0.09％，至少0.1％，至少0.2％，至少0.3％，至少0.4％，至少0.5％，至少0.6％，至少0.7％，至少0.8％，至少0.9％，至少1％，至少1.5％，至少2％，至少2.5％，至少3％，至少3.5％，至少4％，至少4.5％，至少5％，至少5.5％，至少6％，至少6.5％，至少7％，至少7.5％，至少8％，至少8.5％，至少9％，至少9.5％，或至少10％DPA(n-6)。有用的范围可以在任何这些值之间选择，例如按总脂肪酸重量计0.01％至10％，0.01％至5％，0.01％至1％，0.01％至0.05％，0.05％至5％和0.1％至5％DPA(n-6)。
在一些实施方案中，本发明的经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织或部分或自本发明的经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织或部分获得的油或种子包含按总脂肪酸重量计至少1∶1，至少1∶1.5，至少1∶2，至少1∶2.5，至少1∶3，至少1∶3.5，至少1∶4，至少1∶4.5，至少1∶5，至少1∶5.5，至少1∶6，至少1∶6.5，至少1∶7，至少1∶7.5，至少1∶8，至少1∶8.5，至少1∶9，至少1∶10，至少1∶11，至少1∶12，至少1∶13，至少1∶14，至少1∶15，至少1∶16，至少1∶17，至少1∶18，至少1∶19，至少1∶20，至少1∶21，至少1∶22，至少1∶23，至少1∶24，至少1∶25，至少1∶26，至少1∶27，至少1∶28，至少1∶29，或至少1∶30的EPA∶DHA比率。有用的范围可以在任何这些值之间选择，例如按总脂肪酸重量计1∶1至1∶30，1∶1至1∶25，1∶1至1∶20，1∶1至1∶15，1∶1至1∶10，1∶1至1∶5，1∶1至1∶3，和1∶1至1∶2的EPA∶DHA比率。
在一些实施方案中，本发明的经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织或部分或自本发明的经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织或部分获得的油或种子包含按总脂肪酸重量计至少1∶1，至少1∶1.5，至少1∶2，至少1∶2.5，至少1∶3，至少1∶3.5，至少1∶4，至少1∶4.5，至少1∶5，至少1∶5.5，至少1∶6，至少1∶6.5，至少1∶7，至少1∶7.5，至少1∶8，至少1∶8.5，至少1∶9，或至少1∶10的DPA(n-6)∶DHA比率。有用的范围可以在任何这些值之间选择，例如按总脂肪酸重量计1∶1至1∶10，1∶1至1∶5，1∶1至1∶3和1∶1至1∶2的DPA(n-6)∶DHA比率。
在一些实施方案中，自本发明的经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织或部分或种子获得的油包含按油重量计至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，或至少99％甘油三酯。在一些实施方案中，自本发明的经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织或部分或种子获得的油包含按油重量计70％至99％甘油三酯，按油重量计75％至99％甘油三酯，按油重量计80％至99％甘油三酯，按油重量计85％至99％甘油三酯，或按油重量计90％至99％甘油三酯。已经描述了用于纯化和分析甘油三酯的方法(例如Ruiz-Gutierrez V和Barron LJ，J.Chromatogr.B.Biomed. Appl.，671：133-168，1995)。
在一些实施方案中，在PUFA合酶系统的靶产物是长链PUFA，诸如DHA，DPA(n-6或n-3)或EPA时，在用此类PUFA合酶系统遗传修饰的植物的总脂质中不以实质量存在的中间体产品和副产物可以包括但不限于：γ-亚麻酸(GLA；18：3，n-6)；十八碳四烯酸(STA或SDA；18：4，n-3)；二高-γ-亚麻酸(DGLA或HGLA；20：3，n-6)，花生四烯酸(ARA，C20：4，n-6)；二十碳三烯酸(ETA；20：3，n-9)和各种其它中间体或副产物，诸如20：0；20：1(△5)；20：1(△11)；20：2(△8，11)；20：2(△11，14)；20：3(△5，11，14)；20：3(△11，14，17)；二十碳三烯酸(20：3；Δ5，8，11)；或20：4(△5，1，14，17)。
依照本发明的植物的遗传修饰可以导致植物生成一种或多种PUFA。在一些实施方案中，由植物产生的PUFA概况和PUFA比率与由衍生PUFA合酶的生物体产生的PUFA概况或PUFA比率不必相同。
在一些实施方案中，本发明的经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织或部分可以工程化改造为经由PUFA合酶活性生成PUFA。在一些实施方案中，可以经由纯化方法回收PUFA，所述纯化方法从植物、其后代、细胞、组织或部分提取化合物。在一些实施方案中，可以通过收获植物、其后代、细胞、组织或部分回收PUFA。在一些实施方案中，可以通过从植物、其后代、细胞、组织或部分(例如从含油种子)或来自植物、其后代、细胞、组织或部分的种子收获油而回收PUFA。在一些实施方案中，植物、其后代、细胞、组织或部分也可以以其天然状态食用或进一步加工成可食用产品。
在一些实施方案中，本发明的经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织或部分可以生成一种或多种多不饱和脂肪酸。在一些实施方案中，植物、其后代、细胞、组织或部分可以生成(例如在其成熟种子中，在含油种子植物中，或者在含油种子植物的种子的油中)至少一种PUFA(靶PUFA)，且其中植物，或积累PUFA的植物部分(例如若植物是含油种子植物为成熟种子，或含油种子植物的种子油)中的总脂肪酸概况包含可检测量的一种或多种此PUFA。在一些实施方案中，靶PUFA至少是20碳PUFA，且包含至少3个双键，至少4个双键，或至少5个双键。在一些实施方案中，靶PUFA可为并非植物天然生成的PUFA。在一些实施方案中，植物中或积累PUFA的植物部分(包括植物的种子油)中的总脂肪酸概况包含按总脂肪酸重量计至少0.1％靶PUFA，按总脂肪酸重量计至少0.2％，至少0.3％，至少0.4％，至少0.5％，至少1％，至少1.5％，至少2％，至少2.5％，至少3％，至少3.5％，至少4％，至少4.5％，至少5％，至少5.5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，超过75％的至少一种多不饱和脂肪酸(一种或多种靶PUFA)，或0.1％至75％，或大于75％(多至100％或100％)(增量为0.1％)的任何百分比的靶PUFA。
如本文中使用的，提及PUFA的百分比量是以提取的总脂肪酸重量计的百分比，除非另有叙述。在一些实施方案中，通过气相层析(GC)分析脂肪酸甲酯(FAME)制备物测定总脂肪酸，尽管总脂肪酸的测定不限于此方法。
在一些实施方案中，本发明的植物(和/或其后代、细胞、组织或部分或种子油级分)中的总脂肪酸可以含有按由植物生成的总脂肪酸的重量计小于10％，按由植物生成的总脂肪酸的重量计小于9％，按由植物、其后代、细胞、组织或部分生成的总脂肪酸的重量计小于8％，按由植物、其后代、细胞、组织或部分生成的总脂肪酸的重量计小于7％，按由植物、其后代、细胞、组织或部分生成的总脂肪酸的重量计小于6％，按由植物、其后代、细胞、组织或部分生成的总脂肪酸的重量计小于5％，按由植物、其后代、细胞、组织或部分生成的总脂肪酸的重量计小于4％，按由植物、其后代、细胞、组织或部分生成的总脂肪酸的重量计小于3％，按由植物、其后代、细胞、组织或部分生成的总脂肪酸的重量计小于2％，按由植物、其后代、细胞、组织或部分生成的总脂肪酸的重量计小于1％的选自下组的脂肪酸：γ-亚麻酸(GLA；18：3，n-6)；十八碳四烯酸(STA或SDA；18：4，n-3)；二高-γ-亚麻酸(DGLA或HGLA；20：3，n-6)，花生四烯酸(ARA，C20：4，n-6)；二十碳三烯酸(ETA；20：3，n-9)和各种其它脂肪酸，诸如20：0；20：1(△5)；20：1(△11)；20：2(△8，11)；20：2(△11，14)；20：3(A5，11，14)；20：3(△11，14，17)；二十碳三烯酸(meadacid)(20：3；△5，8，11)；或20：4(△5，1，14，17)。
本发明包括由本文中描述的植物、其后代、细胞、组织或部分生成的任何种子，及由本发明的植物、其后代、细胞、组织或部分或种子生成的任何油。本发明还包括使用植物、其后代、细胞、组织或部分，或如本文中描述的种子或油生成的任何产品。
与本发明的经遗传修饰的生物体相关的用途和产品
本发明包括生成PUFA的方法，其通过种植或培养上文详细描述的本发明的经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织或部分(例如大豆)进行。在一些实施方案中，此类方法包括例如在合适的环境，诸如土壤中种植植物，该植物具有如本文中先前描述且依照本发明的遗传修饰。
本发明包括生成包含至少一种PUFA的油的方法，其包括从本发明的经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织或部分或从本发明的经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织或部分的种子回收油。
本发明包括生成包含至少一种PUFA的油的方法，其包括种植本发明的经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织或部分。本发明包括生成种子油中的至少一种PUFA的方法，其包括自本发明的经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织或部分的种子回收油。本发明包括生成种子油中的至少一种PUFA的方法，其包括种植本发明的经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织或部分。
本发明包括对有此需要的个体提供含有至少一种PUFA的补充物或治疗性产品的方法，其包括对有此需要的个体提供本发明的经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织或部分，本发明的油，本发明的种子，本发明的食物产品，本发明的功能性食物，或本发明的药用产品。本发明还包括生成本发明的经遗传修饰的植物、其后代、细胞、组织或部分的方法，其包括用(i)编码生成至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)的藻PUFA合酶系统的核酸序列；和(ii)编码将磷酸泛酰巯基乙胺基辅因子转移至藻PUFA合酶系统ACP域的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)的核酸序列转化植物或植物细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括用(iii)编码将长链PUFA游离脂肪酸(FFA)转化成酰基-CoA的酰基-CoA合成酶(ACoAS)的核酸序列转化植物或植物细胞。
在一些实施方案中，本发明的此类方法的PUFA是DHA，DPA(n-6)和/或EPA。在一些实施方案中，由本发明的此类方法生成的油是大豆油。在一些实施方案中，由本发明的此类方法生成的油包含按总脂肪酸重量计0.05％至15％DHA，或本文中进一步描述的其任何量或范围。在一些实施方案中，由本发明的此类方法生成的油进一步包含按总脂肪酸重量计0.01％至5％EPA，或本文中进一步描述的其任何量或范围。在一些实施方案中，由本发明的此类方法生成的油进一步包含按总脂肪酸重量计0.01％至5％DPA(n-6)，或本文中进一步描述的其任何量或范围。在一些实施方案中，由本发明的此类方法生成的油包含按总脂肪酸重量计1∶1至1∶30的EPA∶DHA比率，按总脂肪酸重量计1∶1至1∶3的EPA∶DHA比率，或本文中进一步描述的其任何量或范围。在一些实施方案中，由本发明的此类方法生成的油进一步包含按总脂肪酸重量计1∶1或/至1∶10的DPA(n-6)∶DHA比率，按总脂肪酸重量计1∶1至1∶3的DPA(n-6)∶DHA比率，或本文中进一步描述的其任何量或范围。
本发明进一步包括本文中描述的任何生物体或其部分(例如植物、其后代、细胞、组织、种子、或部分(例如含油种子)，或其制备物或级分)，及由本文中描述的生物体生成的任何油。本发明还包括使用生物体，其部分，或本文中描述的油生成的任何产品。
本发明涉及修饰含有至少一种脂肪酸的产品的方法，其包括对产品添加生物体，其部分，或油，它们由依照本发明且如本文中描述的经遗传修饰的生物体(例如已经如本文中描述的那样遗传修饰的植物、其后代、细胞、种子、组织或部分)生成。本发明还涵盖由此方法生成的或一般含有任何生物体，其部分，或来自本文中描述的生物体的油的任何产品。
在一些实施方案中，产品选自：食物饮食补充物，药用配制剂，人源化动物乳，婴儿配方(infant formula)，营养制品和功能性食物。合适的药用配制剂包括但不限于消炎配制剂，化疗剂，活性赋形剂，骨质疏松药，抗抑郁药，抗惊厥药，抗幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)药，用于治疗神经变性疾病的药物，用于治疗变性性肝病的药物，抗生素，和胆固醇降低配制剂。在一些实施方案中，产品用于治疗选自下组的状况：慢性炎症，急性炎症，胃肠病症，癌症，恶病质(cachexia)，心脏再狭窄(cardiac restenosis)，神经变性病症，变性性肝病，血脂病症，骨质疏松，骨关节炎，自身免疫疾病，先兆子痫(preeclampsia)，早产(preterm birth)，年龄相关黄斑病变(age related maculopathy)，肺病症，和过氧化物酶体病症(peroxisomal disorder)。
在一些实施方案中，产品是食物产品或功能性食物产品。合适的食物产品包括但不限于精制面包房商品(fine bakery ware)，面包和卷，早餐谷物(breakfast cereal)，加工和未加工奶酪，调味品(番茄酱(ketchup)，蛋黄酱(mayonnaise)，等等)，乳制品(乳，酸乳(yogurt))，布丁(pudding)和明胶甜点(gelatin dessert)，碳酸性饮料，茶，粉末状饮料混合物，加工的鱼产品，基于水果的饮料，口香糖，硬糖果(hard confectionery)，冷冻乳制品，加工的肉类产品，坚果和基于坚果的涂抹料(nut-based spread)，面食(pasta)，加工的禽制品，肉汁(gravies)和沙司(sauces)，炸土豆片(potato chip)和其它片(chip)或油炸片(crisp)，巧克力和其它糖果，汤和汤混合物，基于大豆的产品(例如乳，饮料，奶油，增白剂(whitener))，基于植物油的涂抹料，和基于植物的饮料。
在本发明的一些实施方案中，产品是供动物用的饲料或粗粉组合物，或者饲料或粗粉组合物的添加剂。术语“动物”包括人和非人。动物的非限制性例子是非反刍类(例如猪、禽、或鱼)，和反刍类(例如牛、羊和马)。术语饲料或饲料组合物意指适合于动物，或者意图被动物摄取的任何化合物，制备物，混合物，或组合物。
在一些实施方案中，本发明涉及油混合物，其包含自本文中描述的经遗传修饰的植物、其后代、组织或部分获得的油，和另一种油。在一些实施方案中，另一种油是种子油，植物油，鱼油，微生物油，或其混合物。
在一些实施方案中，自本文中描述的经遗传修饰的植物、其后代、组织或部分获得的油可以进一步加工以修饰油中的LC-PUFA，例如以形成酯和/或纯化LC-PUFA用于医学目的。
本发明的一些实施方案涉及大豆油，其包含按总脂肪酸重量计0.05％至15％DHA，或本文中进一步描述的其任何范围。在一些实施方案中，大豆油进一步包含按总脂肪酸重量计0.05％至5％EPA。在一些实施方案中，大豆油进一步包含按总脂肪酸重量计0.01％至5％DPA(n-6)。在一些实施方案中，大豆油具有按总脂肪酸重量计大于3.5％α-亚麻酸或本文中进一步描述的其任何范围的脂肪酸概况。本发明的一些实施方案涉及组合物，其包含本文中描述的大豆油。在一些实施方案中，包含大豆油的组合物包含一种或多种油。在一些实施方案中，组合物不含来自非大豆来源的PUFA(例如DHA)。
在考察其以下实施例(其并不意图为限制性的)后，本发明的其它目的、优点和新颖特征对于本领域技术人员会变得显而易见。
实施例
实施例1
PUFA合酶OrfA，PUFA合酶OrfB，PUFA合酶OrfC，酰基-CoA合成酶和4’磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶HetI的密码子优化
对编码来自裂殖壶菌ATCC_20888的PUFA合酶OrfA(GenBank ID：AF378327，GI：158518688)，来自裂殖壶菌ATCC20888的PUFA合酶OrfB(GenBank ID：AF378328，GI：158518690)，来自裂殖壶菌ATCC20888和破囊壶菌的PUFA合酶嵌合OrfC(美国申请公开文本No.2008/0022422)(又称为“杂合OrfC”)，来自裂殖壶菌ATCC20888的酰基-CoA合成酶(美国申请公开文本No.2007/0245431)，和来自念珠藻PCC7120的4’磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶HetI(GenBank ID：P37695，GI：20141367)的DNA序列的分析揭示了几种含有对于最佳的植物表达可能不利的非最佳密码子组成的序列基序的存在。将编码PUFA合酶OrfA，PUFA合酶OrfB，PUFA合酶嵌合OrfC，酰基-CoA合成酶和4’磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶HetI蛋白的基因的设计优化以生成如下的DNA序列，其在性质上更为“植物样”，并且其中序列修饰不会经由非最佳密码子组成阻碍翻译或产生mRNA不稳定性。
由于遗传密码的冗余/简并性(例如一些氨基酸由超过一种密码子规定)提供的可塑性，不同生物体或生物体类别中的基因组进化已经导致同义密码子的差别使用。此“密码子偏爱”在蛋白质编码区的平均碱基组成中得到反映。例如，具有含有相对较低G+C含量的基因组的生物体利用较多在同义密码子的第三位中具有A或T的密码子，而那些具有较高G+C含量的密码子利用较多在第三位中具有G或C的密码子。此外，认为mRNA内“次要”密码子的存在可以降低所述mRNA的绝对翻译速率，尤其在与次要密码子对应的带电荷tRNA的相对丰度较低时。此推理的延伸是个别次要密码子的翻译速率的减少对于多个次要密码子而言至少会是叠加的。因此，具有较高的次要密码子相对含量的mRNA会具有相应低的翻译速率。此速率会以编码蛋白质的相应低水平反映。
在用于双子叶植物(诸如烟草、大豆、棉花或芸苔)中表达的编码PUFA合酶OrfA，PUFA合酶OrfB，PUFA合酶嵌合OrfC，酰基-CoA合成酶和4’磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶HetI蛋白的工程化基因中，从公众可用的数据库取得芸苔的密码子选择(表1)。
表1：来自欧洲油菜(芸苔)基因的双子叶植物编码区中的同义密码子呈现(栏C和G)。对植物优化的合成基因设计设置的平衡-偏爱密码子呈现的数值在栏D和H中。
*DNU-不使用
为了平衡氨基酸的剩余密码子选择的分布，使用以下等式计算每个密码子的加权平均值呈现(表1)：C1的加权平均值％＝1/(％C1+％C2+％C3+等等)x％C1x100，其中C1是所讨论的密码子，且％C2，％C3，等等代表对于芸苔而言表1中剩余同义密码子的％数值的平均值(从栏C和G取得相关密码子的平均％值)。表1的栏D和H中给出了每个密码子的加权平均值％数值。
在设计植物表达的编码区中，确定植物优选的主要(“第一选择”)密码子，及在存在多种选择时优选密码子的第二，第三，第四选择，等等。然后，设计新的DNA序列，其编码PUFA合酶OrfA，PUFA合酶OrfB，PUFA合酶OrfC，酰基-CoA合成酶和4’磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶HetI的基本上相同的氨基酸序列，但是与初始DNA序列(其编码PUFA合酶OrfA，PUFA合酶OrfB，PUFA合酶嵌合OrfC，酰基-CoA合成酶和4’磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶HetI)不同之处在于取代植物(第一优选，第二优选，第三优选，或第四优选，等等)密码子以规定氨基酸序列内每个位置处的氨基酸。
然后，对新序列分析通过序列中的修饰创建的限制酶位点。然后，通过用第一，第二，第三，或第四选择优选密码子替换密码子来修饰鉴定的位点。然后，将序列进一步分析和修饰以降低TA或GC双联体的频率。
对这些序列的分析揭示了新的DNA序列基本上编码PUFA合酶OrfA，PUFA合酶OrfB，PUFA合酶嵌合OrfC，酰基-CoA合成酶和4’磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶HetI蛋白的氨基酸序列，但是分别使用存在于芸苔基因中的频繁使用的密码子的平衡密码子分布进行设计以在双子叶植物中实现最佳表达。特别地，新的DNA序列与编码PUFA合酶OrfA，PUFA合酶OrfB，PUFA合酶嵌合OrfC，酰基-CoA合成酶和4’磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶HetI的初始DNA序列不同之处在于取代植物(第一优选，第二优选，第三优选，或第四优选)密码子以规定蛋白质氨基酸序列内每个位置处的合适氨基酸。
使用从表1，栏D和H构建的芸苔密码子偏爱表，通过逆翻译PUFA合酶OrfA(SEQ IDNO：1)，PUFA合酶OrfB(SEQ ID NO：2)，PUFA合酶嵌合OrfC(SEQ ID NO：3)，酰基-CoA合成酶(SEQ ID NO：4)和4’磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶HetI(SEQ IDNO：5)的蛋白质序列启动植物优化的DNA序列的设计。从初始序列改变酰基-CoA合成酶(SEQ ID NO：4)的蛋白质序列；其中从蛋白质除去第二个氨基酸丙氨酸。然后，通过补偿密码子变化(同时保留总体加权平均值密码子呈现)来修饰初始序列以除去或添加限制酶识别位点，除去高度稳定性链内二级结构，并且除去对于植物中的工程化基因的克隆操作或表达可能不利的其它序列。然后，对DNA序列再次分析限制酶识别位点，其可以已经通过修饰创建。通过用第一，第二，第三，或第四选择优选密码子替换相关密码子进一步修饰鉴定的位点。序列中能影响感兴趣基因的转录或表达的其它位点包括外显子：内含子连接(5’或3’)，多聚A添加信号，或RNA聚合酶终止信号。将经修饰的序列进一步分析并进一步修饰以降低TA或CG双联体的频率，以及提高TG或CT双联体的频率。在这些双联体外，具有[G+C]或[A+T]的超过约6个连续残基的序列区组可以影响序列的转录或翻译。因此，也通过用其它选择的优选密码子替换第一或第二选择密码子等修饰这些序列区组。在基因设计中以实质性程度不包括很少使用的密码子，仅在有必要纳入与密码子组成本身不同的设计标准(例如添加或删除限制酶识别位点)时使用。
由PUFA合酶OrfA编码的蛋白质包含10个重复的“脯氨酸-丙氨酸”域，其大小范围为17至29个氨基酸。脯氨酸-丙氨酸重复之间散布9个较长的重复序列域，其包含87个氨基酸。这些重复的氨基酸序列仅在4个位置处有所变化，并且在每个变体位置处仅有两个密码子选择。使用Clustal W计算机程序分析9个重复的氨基酸序列产生同源性数值100％，和同一性数值95.4％。在DNA水平，编码9个重复的序列是100％同源的，89.7％相同的，仅在编码每个重复的261个碱基中的27个位置处存在变化(27处变化中的23处是“沉默”差异，其中相同氨基酸的同义密码子是交换的)。
标准基因设计方法不能容易地为多个此大小的重复纳入开发的新的密码子偏爱DNA序列，因为必须不断平衡各个重复中的所有密码子选择与其它8个重复中的相同位置处进行的密码子选择，以避免产生高度相关DNA序列。对于87个残基重复中的每个，存在有超过4.5x1043种可能的编码相同氨基酸序列的DNA序列(以序列中每个氨基酸的同义密码子的数目的乘积(product)计算)。如此，存在有可用于产生相同编码DNA序列的非常大量的计算空间。以下方案描述了用于对每个单独的重复产生(在计算机中(in silico))多序列设计，接着大批比较所有序列型式以鉴定代表编码重复的高度趋异序列的组的方法。
步骤1：提取编码每个重复氨基酸域的天然DNA序列作为不同序列。
步骤2：将个别重复DNA序列以不同序列输入基因设计程序(例如OPTGENETM，OcimumBiosolutions，Hyderabad，India)中。分开对每个序列实施步骤3-5。
步骤3：使用标准遗传密码翻译DNA序列。
步骤4：使用标准遗传密码和合适的密码子偏爱表达逆翻译翻译的蛋白质序列。在此例子中，使用从530个欧洲油菜蛋白质编码区汇编的偏爱密码子表，并且每个产生的序列代号为“nap”(代表“napus”)加上型式编号。如此，重复1的第一逆翻译的，密码子偏爱的序列称为“rptl napl”。在此例示中，将此方法实施10次，以产生10个编码重复1的蛋白质序列的DNA序列型式。
步骤5：将10个序列型式输出到相应数目的文本文件中。
步骤6：对每个其它重复序列域重复步骤3-5。在此例示中，产生总共90个“nap”序列型式(每个重复元件为10个)。
步骤7：将90个序列文件输入Clustal W程序Mega3.1(Megasoftware取得)，并使用所有90个序列作为输入实施多重序列比对。由于这些序列是蛋白质编码区的区段，在不容许缺口的情况中实施比对。在Clustal W比对后，将近邻连接树(Neighbor-Joining tree)装配并显现，并且在视觉上挑出蛋白质中的9个重复域中每个的10个经密码子优化的序列之一。从最深分支的树的部分选择每个选择的序列型式。
步骤8：将每个重复域的选择序列以对于每个特定重复适当的位置掺入经密码子优化的编码整个蛋白质的DNA序列中。
步骤9：实施对整个密码子优化序列(包括分开设计的趋异重复元件)的最终分析以确保缺乏不想要的基序，限制酶识别位点，等等。
采用此方法与PUFA合酶OrfA编码序列的密码子优化导致选择重复脯氨酸-丙氨酸序列，其足够趋异以避免重复序列不稳定性。从近邻连接树的最深分支选择这些序列(即，是此序列组中彼此最远相关的)。对所有成对组合完成Smith-Wasserman全局比对，并且同源性范围是74-81％，可能的中值为76-77％(表2)。
表2：PUFA OrfA重复的选择的密码子优化序列的Smith-Wasserman同源性。
图1中显示了9个重复域的选择的9个新设计的编码区的Clustal W比对(VectorNTI，Invitrogen，Carlsbad，CA)。总体上，与100％同源且89.7％相同的初始序列相比，序列是93.1％同源的，61.7％相同的。可以通过使用超过10个序列重叠，并且采用计算机程序或数学算法从这些序列选择(代替视觉选择序列)来实现较大的序列趋异。不过，例示的序列是高度趋异的，并且产生稳定的多核苷酸片段。
新设计的、芸苔优化的PUFA合酶OrfA，PUFA合酶OrfB，PUFA合酶嵌合OrfC，酰基-CoA合成酶和4’磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶HetI DNA序列分别在SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10中列出。这些密码子优化序列贯穿说明书标示为型式3(v3)，而非密码子优化的序列贯穿说明书称为型式2(v2)。
所得的DNA序列具有较高程度的密码子趋异，期望的碱基组成，含有策略性放置的限制酶识别位点，并且缺乏可能干扰基因的转录，或产物mRNA翻译的序列。表3，表4，表5，表6和表7呈现了存在于初始基因，植物优化型式和如从表1，栏D和H计算的植物优化序列的密码子组成推荐的PUFA合酶OrfA，PUFA合酶OrfB，PUFA合酶嵌合OrfC，酰基-CoA合成酶和4’磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶HetI蛋白编码区的密码子组成的比较。
在完成编码区序列的密码子优化后，将额外的核苷酸序列添加至优化密码区序列。将用于便于克隆的限制性位点，Kozak序列和额外的终止密码子添加至植物优化编码序列。另外，设计第二批PUFA合酶OrfA，PUFA合酶OrfB，PUFA合酶嵌合OrfC，酰基-CoA合成酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶HetI编码序列，其含有来自拟南芥二磷酸核酮糖羧化酶小链1A的叶绿体靶向序列(GenBank ID：NM_202369.2)。将此序列SEQ ID NO：28添加至先前描述的PUFA合酶OrfA，PUFA合酶OrfB，PUFA合酶嵌合OrfC和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶HetI编码序列。将来自SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的初始甲硫氨酸除去，并用叶绿体靶向序列替换。含有叶绿体靶向序列的序列贯穿说明书标示为型式4(v4)。
将第二种叶绿体运输肽添加至PUFA合酶OrfA，PUFA合酶OrfB，PUFA合酶嵌合OrfC，酰基-CoA合成酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶HetI编码序列。这些编码序列设计为含有来自酰基-ACP-硫酯酶的叶绿体靶向序列(GenBank ID：X73849.1)。将此序列SEQ ID NO：29添加至先前描述的PUFA合酶OrfA，PUFA合酶OrfB，PUFA合酶嵌合OrfC和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶HetI编码序列。将来自SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的初始甲硫氨酸除去，并用叶绿体靶向序列替换。含有叶绿体靶向序列的序列贯穿说明书标示为型式5(v5)。
通过修饰天然基因序列以除去多余的开读框创建来自裂殖壶菌的酰基-CoA合成酶基因的备选型式。此型式标记为“SzACS-2v4”，并且以SEQ ID NO：30列出。所得的基因用于替换酰基-CoA合成酶表达基因序列，上文称为“SzACS-2v3”。
在纸上或计算机中设计出植物优化DNA序列后，可以在实验室中合成实际的DNA分子以在序列上精确对应设计的序列。可以将此类合成的DNA分子克隆，并且以其它方式精确操作，就像它们源自自然或天然来源一样。包含SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：10且含有上文描述的额外序列的DNA片段的合成由商业供应商(Geneart Ag，Regensburg，Germany)实施。然后，将合成的DNA克隆到表达载体中，并且转化入土壤杆菌和大豆中，如实施例2和3中描述的。
实施例2
pDAB7362的质粒构建
使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB7362二元质粒(图2；SEQ ID NO：11)。pDAB7362含有3个PUFA合酶PTU(其表达上文描述的PUFA合酶OrfA，PUFA合酶OrfB，PUFA合酶嵌合OrfC基因)，1个酰基-CoA合成酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶HetI PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有截短的菜豆植物凝集素-L基因启动子(PvDlec2启动子v2；GenBank登录号X06336)，拟南芥AT2S3基因5’非翻译区(2S5’UTR；GenBank登录号NM_118850)，裂殖壶菌多不饱和脂肪酸合酶开读框A(SzPUFA OrfA v3)和拟南芥2S清蛋白基因3’非翻译区终止子(At2S SSP终止子v1；GenBank登录号M22035)。第二个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，裂殖壶菌多不饱和脂肪酸合酶开读框B(SzPUFA OrfB v3)和At2S SSP终止子v1。第三个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，裂殖壶菌和破囊壶菌多不饱和脂肪酸合酶开读框C(hSzThPUFA OrfC v3)和At2S SSP终止子v1。酰基-CoA合成酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，裂殖壶菌酰基-CoA合成酶(SzACS-2v3)和At2S SSP终止子v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，念珠藻4’磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶HetI(NoHetI v3)和At2S SSP终止子v1。
将质粒pDAB7334，pDAB7335，pDAB7336，pDAB7339和pDAB7333重组以形成pDAB7362。具体地，将上文描述的5个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFA OrfA v3，SzPUFA OrfB v3，hSzThPUFA OrfC v3，SzACS-2v3，NoHetI v3。除其它调节元件诸如过驱动(Overdrive)(Toro等，PNAS85(22)：8558-8562；1988)和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B；Gardner等，Science231：725-727；1986及国际公开文本No.WO200I/025459A1)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：木薯叶脉花叶病毒启动子(CsVMV启动子v2；Verdaguer等，Plant MolecularBiology31：1129-1139；1996)，膦丝菌素乙酰基转移酶(PAT v5；Wohlleben等，Gene70：25-37；1988)和根癌土壤杆菌ORF13’非翻译区(AmORF13’UTR v4；Huang等，J.Bacteriol.172：1814-1822；1990)。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离并在用限制酶消化掺入5个PTU和DNA测序方面测试。
实施例2.1：使用PvDlec2启动子驱动表达的其它质粒的构建
设计并建立其它构建体，其使用PvDlec2启动子驱动PUFA合酶OrfA，PUFA合酶OrfB，PUFA合酶嵌合OrfC，酰基-CoA合成酶，和4’磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶HetI转基因表达。已经对这些构建体进行各种改变以提高表达水平。这些变化包括使用非密码子优化基因序列，掺入叶绿体运输肽，及除去酰基-CoA合成酶PTU。
使用新构建的质粒来稳定转化大豆植物。将转基因大豆植物分离并分子表征。使用这些备选构建体生成含有较大量的DHA和LC-PUFA的大豆植物。测定所得的LC-PUFA积累，并且鉴定生成0.01％至15％DHA或0.01％至15％LC-PUFA的大豆植物。
实施例2.2：pDAB7361的构建
pDAB7361是一种构建为含有SzPUFA OrfA v2的天然的、非密码子优化型式的二元载体，剩余的基因序列是密码子优化的(SzPUFA OrfB v3，hSzThPUFA OrfC v3，SzACS-2v3，和NoHetI v3)。使用多位点Gatewav L-R重组反应构建pDAB7361质粒(图3；SEQ ID NO：31)。pDAB7361含有3个PUFA合酶PTU，1个酰基-CoA合成酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfA v2和At2S SSP终止子v1。第二个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfB v3和At2S SSP终止子v1。第三个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，hSzThPUFA OrfC v3和At2S SSP终止子v1。酰基-CoA合成酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzACS-2v3基因和At2S SSP终止子v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，NoHetI v3和At2S SSP终止子v1。
将质粒pDAB7355，pDAB7335，pDAB7336，pDAB7339和pDAB7333重组以形成pDAB7361。具体地，将上文描述的5个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFAOrfA v2，SzPUFA OrfB v3，hSzThPUFA OrfC v3，SzACS-2v3NoHetI v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有6个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入6个PTU和DNA测序方面测试。
实施例2.3：DAB7363的构建
pDAB7363是一种二元载体，其构建为含有重新建立的、密码子优化的SzPUFA OrfAv4，SzPUFA OrfB v4，hSzThPUFA OrfC v4，和NoHetI v4型式，它们都含有二磷酸核酮糖羧化酶小链1A(标记为SSU-TP v1)，其与编码序列的氨基端融合。另外，此质粒含有重新建立的、密码子优化的SzACS-2v3型式。使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB7363质粒(图4；SEQ ID NO：32)。pDAB7363含有3个PUFA合酶PTU，1个酰基-CoA合成酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfAv4和At2S SSP终止子v1。第二个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfB v4和At2S SSP终止子v1。第三个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，hSzThPUFA OrfC v4和At2S SSP终止子v1。酰基-CoA合成酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzACS-2v3基因和At2S SSP终止子v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，NoHetI v4和At2S SSP终止子v1。
将质粒pDAB7340，pDAB7341，pDAB7342，pDAB7344和pDAB7333重组以形成pDAB7363。具体地，将上文描述的5个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFAOrfA v4，SzPUFA OrfB v4，hSzThPUFA OrfC v4，SzACS-2v3，NoHetI v4。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有6个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入6个PTU和DNA测序方面测试。
实施例2.4：pDAB7365的构建
pDAB7365是一种二元载体，其构建为含有天然的、非密码子优化的SzPUFA OrfAv2，SzPUFA OrfB v2，hSzThPUFA OrfC v2，SzACS-2v2，和NoHetI v2型式。使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB7365质粒(图5；SEQ ID NO：33)。pDAB7365含有3个PUFA合酶PTU，1个酰基-CoA合成酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfA v2和At2SSSP终止子v1。第二个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfB v2和At2SSSP终止子v1。第三个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfC v2和At2SSSP终止子v1。酰基-CoA合成酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzACS-2v2基因和At2SSSP终止子v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，NoHetI v2和At2S SSP终止子v1。
将质粒pDAB7355，pDAB7356，pDAB7357，pDAB7360和pDAB7333重组以形成pDAB7365。具体地，将上文描述的5个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFAOrfA v2，SzPUFA OrfB v2，SzPUFA OrfC v2，SzACS-2v2，NoHetI v2。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PATv5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入6个PTU和DNA测序方面测试。
实施例2.5：pDAB7368的构建
pDAB7368是一种二元载体，其构建为含有天然的、非密码子优化的SzPUFA OrfAv2，SzPUFA OrfB v2，hSzThPUFA OrfC v2，和NoHetI v2型式。此构建体不含SzACS-2编码序列。使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB7368质粒(图6；SEQ ID NO：34)。pDAB7368含有3个PUFA合酶PTU，1个酰基-CoA合成酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFAOrfA v2和At2S SSP终止子v1。第二个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFAOrfB v2和At2S SSP终止子v1。第三个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFAOrfC v2和At2S SSP终止子v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，NoHetI v2和At2S SSP终止子v1。
将质粒pDAB7355，pDAB7356，pDAB7357，pDAB7359和pDAB7333重组以形成pDAB7368。具体地，将上文描述的4个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFAOrfA v2，SzPUFA OrfB v2，SzPUFA OrfC v2，NoHetIv2。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入5个PTU和DNA测序方面测试。
实施例2.6：pDAB7369的构建
pDAB7369是一种二元载体，其构建为含有重新建立的、密码子优化的SzPUFA OrfAv3，SzPUFA OrfB v3，hSzThPUFA OrfC v3，和NoHetI v3型式。此构建体不含SzACS-2编码序列PTU。使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB7369质粒(图7；SEQ ID NO：35)。pDAB7369含有3个PUFA合酶PTU，1个酰基-CoA合成酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfA v3和At2S SSP终止子v1。第二个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfB v3和At2S SSP终止子v1。第三个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，hSzThPUFA OrfC v3和At2S SSP终止子v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，NoHetI v3和At2S SSP终止子v1。
将质粒pDAB7334，pDAB7335，pDAB7336，pDAB7338和pDAB7333重组以形成pDAB7369。具体地，将上文描述的4个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFAOrfA v3，SzPUFA OrfB v3，hSzThPUFA OrfC v3，NoHetI v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入5个PTU和DNA测序方面测试。
实施例2.7：pDAB7370的构建
pDAB7370是一种二元载体，其构建为含有重新建立的、密码子优化的SzPUFA OrfAv4，SzPUFA OrfB v4，hSzThPUFA OrfC v4，和NoHetI v4型式，其含有与编码序列氨基端融合的二磷酸核酮糖羧化酶小链1A(标记为SSU-TPv1)。此构建体不含SzACS-2编码序列PTU。使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB7370质粒(图8；SEQ ID NO：36)。pDAB7370含有3个PUFA合酶PTU，1个酰基-CoA合成酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFAOrfAv4和At2S SSP终止子v1。第二个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFAOrfB v4和At2S SSP终止子v1。第三个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，hSzThPUFA OrfC v4和At2S SSP终止子v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，NoHetI v4和At2S SSP终止子v1。
将质粒pDAB7340，pDAB7341，pDAB7342，pDAB7343和pDAB7333重组以形成pDAB7370。具体地，将上文描述的4个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFAOrfA v4，SzPUFA OrfB v4，hSzThPUFA OrfC v4，NoHetI v4。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入5个PTU和DNA测序方面测试。
实施例2.8：pDAB100518的构建
pDAB100518是一种二元载体，其构建为含有重新建立的、密码子优化的SzPUFAOrfA v5，SzPUFA OrfB v5，hSzThPUFA OrfC v5，和NoHetI v5型式，其含有来自酰基-ACP-硫酯酶的叶绿体运输肽(标记为硫酯酶运输肽)，其与编码序列的氨基端融合。另外，质粒含有SzACS-2v3编码序列PTU，其不拥有叶绿体运输肽。使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB100518质粒(图9；SEQ ID NO：37)。pDAB100518含有3个PUFA合酶PTU，1个酰基-CoA合成酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfA v5和At2S SSP终止子v1。第二个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfB v5和At2S SSP终止子v1。第三个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，hSzThPUFA OrfC v5和At2S SSP终止子v1。酰基-CoA合成酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzACS-2v3基因和At2S SSP终止子v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，NoHetI v5和At2S SSP终止子v1。
将质粒pDAB100517，pDAB100514，pDAB100511，pDAB100515和pDAB7333重组以形成pDAB100518。具体地，将上文描述的5个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFA OrfA v5，SzPUFA OrfB v5，hSzThPUFA OrfC v5，SzACS-2v3，NoHetI v5。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AmORF13’UTR v4。然后，将含有6个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入6个PTU和DNA测序方面测试。
实施例2.9：pDAB101476的构建
pDAB101476是一种二元载体，其构建为含有重新建立的、密码子优化的SzPUFAOrfA v3，SzPUFA OrfB v3，hSzThPUFA OrfC v3，和NoHetI v3型式。SzACS-2v2基因序列是天然的、非密码子优化的型式。使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB101476质粒(图10；SEQ ID NO：38)。pDAB101476含有3个PUFA合酶PTU，1个酰基-CoA合成酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfA v3和At2S SSP终止子v1。第二个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfB v3和At2S SSP终止子v1。第三个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，hSzThPUFA OrfC v3和At2S SSP终止子v1。酰基-CoA合成酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzACS-2v2基因和At2S SSP终止子v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，NoHetI v3和At2S SSP终止子v1。
将质粒pDAB7334，pDAB7335，pDAB7336，pDAB101471和pDAB7333重组以形成pDAB101476。具体地，将上文描述的5个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFAOrfA v3，SzPUFA OrfB v3，hSzThPUFA OrfC v3，SzACS-2v2，NoHetI v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2。PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有6个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入6个PTU和DNA测序方面测试。
实施例2.10：DDAB101477的构建
pDAB101477是一种二元载体，其构建为含有重新建立的、密码子优化的SzPUFAOrfA v3，SzPUFA OrfB v3，hSzThPUFA OrfC v3，和NoHetI v3型式。使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB101477质粒(图11；SEQ ID NO：39)。pDAB101477含有3个PUFA合酶PTU，1个酰基-CoA合成酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFAOrfA v3和At2S SSP终止子v1。第二个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfB v3和At2S SSP终止子v1。第三个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，hSzThPUFA OrfC v3和At2SSSP终止子v1。酰基-CoA合成酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzACS-2v4基因和At2S SSP终止子v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，NoHetI v3和At2S SSP终止子v1。
将质粒pDAB7334，pDAB7335，pDAB7336，pDAB101472和pDAB7333重组以形成pDAB101477。具体地，将上文描述的5个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFAOrfA v3，SzPUFA OrfB v3，hSzThPUFA OrfC v3，SzACS-2v4，NoHetI v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有6个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入6个PTU和DNA测序方面测试。
实施例3
大豆转化
经由土壤杆菌介导的大豆子叶节外植体转化生成转基因大豆(Glycine max)。使用携带上文称为pDAB7362的二元载体的解除的(disarmed)土壤杆菌菌株DA2552(美国申请No.61/368，965，2010年7月29曰提交)启动转化。
使用Zeng等(Zeng P.，Vadnais D.A.，Zhang Z.，Polacco J.C.，(2004)，PlantCell Rep.，22(7)：478-482)的改良的1/2子叶节方法实施土壤杆菌介导的转化。简言之，将大豆种子(栽培种Maverick)在基础培养基上萌发，并且将子叶节分离，并用土壤杆菌感染。枝条启动，枝条延长，和生根培养基补充有头孢噻肟(cefotaxime)，特美汀(timentin)和万古霉素以除去土壤杆菌。采用草铵膦(glufosinate)选择来抑制非转化枝条的生长。将选择的枝条转移至生根培养基以形成根，然后转移至土壤混合物以驯化小植物。
用草铵膦表面(涂叶技术(leaf paint technique))处理选择小植物的顶生小叶以筛选推定的转化体。将筛选的小植物转移至温室，容许驯化，然后用草铵膦涂叶以再次确认耐受性。对这些推定的转化T0植物取样，并使用分子分析来确认PAT，和PUFA合酶OrfA，PUFA合酶OrfB，PUFA合酶嵌合OrfC，酰基-CoA合成酶和4’磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶HetI转基因的存在。容许植物在温室中自花传粉以生成T1种子。
使用第二种大豆转化方法来生成其它转基因大豆植物。使用携带上文称为pDAB7362的二元载体的解除的土壤杆菌菌株DA2552(美国临时专利申请No.61/368,965)启动转化。
使用Paz等(Paz M.，Martinez J.，Kalvig A.，Fonger T.，和Wang K.，(2005)Plant Cell Rep.，25：206-213)的改良的半种子(half-seed)方法实施土壤杆菌介导的转化。简言之，将成熟的大豆种子用氯气灭菌过夜，并用无菌H2O吸收，20小时后进行土壤杆菌介导的植物转化。通过沿着种脐纵向切割以分开种子并除去种皮来将种子切成两半。将胚轴切除，并从子叶节除去任何主枝/芽。将所得的半种子外植体用土壤杆菌感染。枝条启动，枝条延长，和生根培养基补充有头孢噻肟，特美汀和万古霉素以除去土壤杆菌。采用草铵膦选择来抑制非转化枝条的生长。将选择的枝条转移至生根培养基以形成根，然后转移至土壤混合物以驯化小植物。
用草铵膦表面(涂叶技术)处理选择小植物的顶生小叶以筛选推定的转化体。将筛选的小植物转移至温室，容许驯化，然后用草铵膦涂叶以再次确认耐受性。对这些推定的转化T0植物取样，并使用分子分析来确认PAT，和PUFA合酶OrfA，PUFA合酶OrfB，PUFA合酶嵌合OrfC，酰基-CoA合成酶和4’磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶HetI转基因的存在。7个事件鉴定为含有来自pDAB7362的转基因。将这些T0植物推进进行进一步分析，并且容许在温室中自花传粉以产生T1种子。
实施例4
大豆事件的分子分析
使用比较定量实时PCR(qPCR)法量化选择的pDAB7362大豆事件的转基因拷贝数。从成熟大豆植物的顶部和底部叶采集叶组织样品，将这些样品组合，并且将基因组DNA分离。使用BioSprint96DNA植物试剂盒和BioSprint96磁珠自动化平台(Qiagen，Valencia，CA)按照制造商的说明书分离基因组DNA。将提取的基因组DNA用ddH2O以1∶5稀释，在定量实时PCR反应(qPCR)中用作模板。
qPCR测定法设计为通过使用Roche测定设计中心(www.universalprobelibrary.com)检测pDAB7362大豆植物中的SzPUFA OrfA v3，SzPUFA OrfB v3，hThSzPUFA OrfC v3，SzACS-2v3，NoHetI v3，和PAT v5转基因。表8中描述了测定法中使用的引物和探针。用经荧光素亚酰胺(fluorescein-amidite，FAM)标记的UPL探针(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)检测靶基因的存在。在具有用花青-5(Cy-5)荧光染料标记的大豆内部参照GMFL01-25-J19，GenBank：AK286292.1(在表8中以GMS116提及)的双重反应中执行这些测定法。
表8：qPCR测定法引物和探针
使用标准方案在LC480II实时PCR热循环仪(Roche，Indianapolis，IN)上运行实时PCR反应。使用533nm发射滤器和483nm激发信号收集关于SzPUFA OrfA v3，SzPUFA OrfBv3，hThSzPUFA OrfC v3，SzACS-2v3，NoHetI v3，和PAT v5，经FAM标记的测定法的数据。使用660nm滤器和618nm激发信号收集关于经GMS1.16Cy5标记的参照测定法的数据。使用LC480II软件的“高级相对量化(Advanced Relative Quantification)”分析工作流自动计算交叉点数值(Cp值)和靶物与参照比率。使用标准“delta-delta-Ct”法计算每个样品的靶物比参照比率。通过用大豆内部参照GMFL01-25-J19的靶物-参照比率标准化样品靶物-参照比率来测定评估的拷贝数。
在来自7个pDAB7362事件的T1植物中测定PAT v5选择标志物和二十二碳六烯酸(DHA)转基因(SzPUFA OrfA v3，SzPUFA OrfB v3，hThSzPUFA OrfC v3，SzACS-2v3，和NoHetI v3)的评估的拷贝数。来自两个事件7362[710]-71006和7362[710]-71010的植物不含PAT v5选择标志物或DHA基因靶序列。来自剩余事件7362[710]-70903，7362[710]-71005，7362[710]-71008，和7362[710]-71009的植物含有PAT v5选择标志物和具有范围为1-10的拷贝数的5种DHA转基因。事件7362[708]-70801产生具有0，1或2个拷贝的PATv5基因的T1植物，指示单一分离基因座，而事件7362[710]-71005产生具有0-4的PAT v5拷贝数的T1植物，提示两个未连锁基因座的分离。
实施例5
转基因大豆植物的T1子叶的脂质分析
为了避免对有限量的T1种子的破坏性分析，对T1植物的萌发后绿色子叶实施脂肪酸甲酯(FAME)分析。已经描述了用于纯化和分析FAME的方法(例如Nightingale，ZD等，(1999)Purification of fatty acid methyl esters by high-performance liquidchromatography.J Chromatogr.B.Biomed. Sci.Appl.732(2)：495-500；及W.W Christie的“Gas chromatography and lipids：a practical guide”，1989，The Oily Press)。T1子叶中油概况的表征指示干T1种子中的油概况(Wilson，RF和Kwanyuen，P.，(1986)Triacylglycerol synthesis and metabolism in germinating soybean cotyledons，Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism，877(2)：231-237)。
实施例5.1：经由分析转基因芸苔确认T 1 子叶中的DHA的萌发后检测
用DHA生成性芸苔种子实施萌发后绿色子叶中长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)的确认和检测以评估T1子叶中油概况的表征是否指示成熟T1种子内油概况的存在。将含有二元载体pDAB7362的转基因芸苔种子于室温在水饱和的纸巾上萌发，并在3天后收获，在该点时将组织冻干。将组织直接转甲基化，并且不用己烷预提取。将LC-PUFA含量(按重量计％FAME)计算，并与成熟种子比较。来自30个芸苔出土子叶的平均DHA含量是0.71％(总LC-PUFA＝0.97％)，油含量为53.0％。萌发前48个成熟芸苔种子的平均DHA含量是0.49％(总LC-PUFA＝0.73％)，油含量为44.3％。此研究证明了LC-PUFA可以在出土绿色子叶中在萌发后检出，且出土绿色子叶中LC-PUFA的检测指示种子中存在LC-PUFA。
实施例5.2：T 1 大豆子叶中DHA的萌发后检测
对种植后3至5天取样的每个大豆幼苗的一个切出的绿色子叶实施FAME分析。将植物材料冻干，使用钢球和球磨机均质化，并用己烷脱脂3次。将合并的己烷级分蒸发，将干残留称重，并将在庚烷中重建。在存在替代物甘油三十七烷酸酯(triheptadecanoin)(Nu-Chek Prep，Elysian，MN)的情况中将已知量的油残留物用甲醇中0.25M新鲜制备的甲醇钠(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)转甲基化。在温和加热(40℃)和不断摇动下进行反应，并且将所得的FAME用庚烷提取。通过回收起反应的十七烷酸甲酯(heptadecanoate methyl-ester)替代物确认反应的完成。使用Agilent6890气相层析(Agilent Technologies，SantaClara，CA)和来自SGE(Austin，TX)的15m x0.25mm x0.25μm BPX70毛细管柱通过GC-FID分析FAME提取物。每个FAME峰通过其保留时间鉴定，并且通过注射来自Matreya LLC(Pleasant Gap，PA)的油菜籽油参照混合物量化。校正标准品含有个别添加的来自Nu-Chek的DHA、EPA和DPA(n-6)甲酯标准品。使用ChemStation4软件(Agilent)实施数据分析。来自两个事件的T1子叶含有DHA；pDAB7362[708]-70801.001和pDAB7362[710]-71005.001(表9)。
将来自事件pDAB7362[708]-70801.001的40个种子萌发，并筛选切出的绿色子叶中LC-PUFA的存在。来自40个种子中的6个的子叶含有范围为0.78％至1.58％(均值为1.12％)的LC-PUFA。DHA含量范围为0.48％至0.93％(均值为0.68％)，且DPA(n-6)含量范围为0.3％至0.65％(均值为0.44％)。
将来自事件pDAB7362[710]-71005.001的39个种子萌发，并筛选切出的绿色子叶中LC-PUFA的存在。来自39个种子中的37个的子叶含有范围为0.70％至11.98％(均值为3.91％)的LC-PUFA。在总LC-PUFA中，DHA含量范围为0.36％至8.00％(均值为2.24％)，且DPA(n-6)含量范围为0.34％至3.98％(均值为1.68％)。
与阴性对照相比，使用Pegasus III GC-TOF-MS(Leco，St.Joseph，MI)通过评估标准PUFA甲酯(Nu-Chek Prep，Elysian，MN)的特定片段化确认LC-PUFA的身份。
表9：以来自萌发的T1大豆种子子叶的总脂肪酸的重量百分比计的LC-PUFA含量
实施例6
来自转基因大豆植物的成熟T2种子的脂质分析
将来自两个事件7362[708]-70801.001和7362[710]-71005.001的T1植物在温室中培养至成熟。选择植物，其含有T1子叶中的高水平LC-PUFA和一个或两个拷贝的PAT v5及伴随的用于DHA生成的5种基因。将这些植物自花传粉，并且在成熟时收获所得的T2种子。经由FAMEs GC-FID分析的单一种子以测定T2大豆种子中的LC-PUFA和DHA含量。如下个别分析每个植物12个全成熟种子，即通过压榨压碎种子，并使用钢球和球磨机均质化。将组织用己烷脱脂三次，将合并的己烷级分蒸发至干燥，并对残留物称重，并在庚烷中重建以实施FAME分析，如先前实施例中描述的。
拥有单一拷贝PAT v5的事件7362[708]-70801.001的T1植物(在图12中称为7362[708]-70801.Sx.021)的单一T2种子含有0％至0.73％DHA(0％至1.19％总LC-PUFA)。拥有单一拷贝PAT v5的事件7362[710]-71005.001的两个T1植物(在图12中称为7362[710]-71005.Sx.006和7362[710]-71005.Sx.0.35)的单一T2种子含有0％至2.08％DHA(0％至3.56％总LC-PUFA)。含有两个拷贝的PAT v5的事件7362[710]-71005.001的7个T1植物(在图12中称为7362[710]-71005.Sx.010，7362[710]-71005.Sx.012，7362[710]-71005.Sx.013，7362[710]-71005.Sx.016，7362[710]-71005.Sx.018，7362[710]-71005.Sx.025，和7362[710]-71005Sx.031)的单一T2种子含有0％至2.84％DHA(0％至4.77％总LC-PUFA)。来自最高DHA生成系(7362[710]-71005.Sx.025)的T2种子的均值DHA含量是1.83％(3.11％总LC-PUFA)。图12中显示了来自个别T1植物的每个T2种子的DHA含量。
DHA占含有LC-PUFA的那些T2种子中的总LC-PUFA含量的60％。在T2大豆种子中仅检出两种新颖的LC-PUFA，即DHA和DPA(n-6)。预期在大豆种子中发现的脂肪酸以正常水平检出，只是由于LC-PUFA的存在，总C18脂肪酸成比例较低。除了DHA和DPA(n-6)外，在这些转基因大豆种子中没有检出其它不同脂肪酸。转基因种子的油含量(各种FAME的质量总和除以种子质量)和由转基因T1系生成的种子数目与同时在相同条件下在温室中种植的非转基因Williams82对照栽培种没有显著不同。
表10中显示了大豆事件7362[708]-70801.001和7362[710]-71005.001的各个T2种子的完整FAME概况。
实施例6.1：来自两个转基因大豆事件的成熟T 3 种子的脂质分析
将两个T2大豆植物事件7362[708]-70801.001和7362[710]-71005.001在温室中培养至成熟。将每个事件的多个植物在温室中种植，并且筛选以鉴定在T2子叶中生成高水平的LC-PUFA，且含有单一纯合转基因插入的个体植物。将鉴定的植物自花传粉，并且在种子达到成熟时收获所得的T3种子。经由FAMEs GC-FID分析的单一成熟T3种子以测定T3大豆种子中的DHA和LC-PUFA含量(图12a)。如下个别分析每个植物12个全成熟种子，即通过压榨压碎种子，并使用钢球和球磨机将压碎的种子材料均质化。将组织用己烷脱脂三次，将合并的己烷级分蒸发至干燥，并对残留物称重，并在庚烷中重建以实施FAME分析，如先前实施例中描述的。从T3种子测定DHA水平，并与先前已经测定的T2DHA水平比较(表11)。
表11：在来自两个事件7362[708]70801.001和7362[710]-71005.001的T2和T3世代来自随机选择的成熟大豆种子的平均DHA含量(％)
如表11中指示的，大豆种子中DHA的相对百分比在大豆的后续世代(来自T2和T3)中保持恒定或升高。经由FAME分析测定自事件7362[708]-70801.001(对此品系分子表征，并且发现拥有单一半合子拷贝的PAT)的T2植物的自花传粉生成的单一T3种子，并且种子测定为含有0％至0.93％DHA(0％至1.37％总LC-PUFA)。比较而言，经由FAME分析测定从事件7362[708]-70801.001生成的T2种子，并且种子测定为含有0％至0.73％DHA。经由FAME分析测定来自T2植物事件7362[710]-71005.001-1-35(对此品系分子表征，并且发现拥有单一半合子拷贝的PAT)的自花传粉的单一T3种子，并且种子测定为含有0％至3.10％DHA(0％至5.45％总LC-PUFA)。比较而言，经由FAME分析测定从事件7362[710]-71005.001-1-35生成的T2种子，并且种子测定为含有0％至2.84％DHA。另外，从事件7362[710]-71005.001-1-13，7362[710]-71005.001-1-18，和7362[710]-71005.001-1-25(每个事件测定为含有单一纯合拷贝的PAT)生成的单一T3种子含有0.79％至4.24％DHA(1.26％至6.5％总LC-PUFA)。比较而言，经由FAME分析测定从事件7362[710]-71005.001-1-13，7362[710]-71005.001-1-18，和7362[710]-71005.001-1-25生成的T2种子，并且种子测定为含有0.79％至2.84％DHA。将转基因事件与对照植物比较，发现每个植物的产量(种子数目)和总油含量(％)在与转基因系相似的条件中与Williams82对照相似。
对于测试的所有品系，在T2和T3世代的大豆种子中生成并测量的DHA和LC-PUFA百分比从T2世代至T3世代是水平一致或升高的。这些结果指示性状是可遗传的，且性状对较高世代的传送不导致降低的DHA生成。
实施例7
转基因大豆种子中PUFA合酶蛋白的Western印迹检测
通过Western印迹分析在成熟转基因种子样品中检测PUFA合酶OrfA(由SzPUFAOrfA v3基因编码)，PUFA合酶OrfB(由SzPUFA OrfB v3基因编码)，PUFA合酶嵌合OrfC(由hThSzPUFA OrfC v3基因编码)和HetI(来自念珠藻PCC7120，GenBank ID：P37695，GL20141367)。在己烷提取后保留残留的大豆T2种子饼样品，用于FAME分析。将粉末状种子饼在具有单一4.5mm不锈钢球的管中放置，并且添加提取缓冲液(50mM Tris，10mMEDTA，2％SDS)。将样品管温和摇动30分钟，以3,000rcf离心15分钟，并且使用上清液进行分析。通过660nm蛋白质测定法(Thermo Fisher，Rockford，IL)测定种子提取物中总可溶性蛋白质的量。将样品相对于1.25mg/ml总可溶性蛋白质标准化，并且在具有50mM DTT的LDS样品缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)中制备，用于每道标准化加载16.25μg总可溶性蛋白质。将样品在3％-8％Tris-乙酸(盐)凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)中电泳，并且转移至硝酸纤维素膜，用于检测PUFA合酶OrfA，PUFA合酶OrfB，和PUFA合酶嵌合OrfC。将样品在4％-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)中电泳，并且转移至硝酸纤维素膜，用于检测HetI。
将印迹在封闭缓冲液中温育，然后用针对不同PUFA合酶OrfA，PUFA合酶OrfB，PUFA合酶嵌合OrfC，和HetI多肽的抗体探查。使用针对裂殖壶菌PUFA合酶OrfAA2区(SzPUFS-A)的兔抗-A2-A，针对裂殖壶菌PUFA合酶OrfB的B3区(SzPUFS-B)的兔抗-B3-A，和针对全长HetI多肽的兔抗-HetI。区B3包含OrfB的烯酰基还原酶(ER)域。由于PUFA合酶嵌合OrfC中也有同源ER域，此抗血清识别western印迹上的PUFA合酶OrfB和PUFA合酶嵌合OrfC两者。使用经荧光标记的抗兔二抗(山羊抗兔AF633(Invitrogen，Carlsbad，CA))进行检测。在TyphoonTrio Plus荧光成像仪(GEHealthcare，New Brunswick NJ)上显现印迹。
来自事件7362[708]-70801和7362[710]-71005的成熟T2种子的蛋白质提取物的SDS-PAGE western印迹在用PUFA合酶OrfA，PUFA合酶OrfB，PUFA合酶嵌合OrfC，和HetI特异性抗血清探查时显示了合适大小的条带(图13)。通过用考马斯蓝的直接染色也可以看到PUFA合酶OrfA，PUFA合酶OrfB，和PUFA合酶嵌合OrfC的条带。
实施例8
使用备选启动子表达藻PUFA合酶基因套件
使用别的转录调节元件来表达编码PUFA合酶OrfA，PUFA合酶OrfB，PUFA合酶嵌合OrfC，酰基-CoA合成酶和4’磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶HetI蛋白的基因可以进一步提高大豆种子内的LC-PUFA和DHA含量。在三酰甘油生物合成和沉积期间在发育早期，且持续延长的时间段表达的转录调节元件的鉴定和使用可以通过在种子发育的早期阶段(例如在15至25DAP)促进LC-PUFA和DHA生物合成基因的转录来提高大豆种子内LC-PUFA和DHA的水平，并且因此延长LC-PUFA和DHA生成时间。此类转录调节区的例子包括但不限于Lesquerellafendleri KCS(LfKCS3)启动子(美国专利No.7,253,337)和FAE1启动子(美国专利No.6,784,342)及甘蓝(Brassica oleracea)酰基载体蛋白(BoACP)启动子(国际公开文本No.WO1992/18634)。另外，可以使用其它种子特异性启动子，诸如来自菜豆的菜豆蛋白启动子(美国专利No.5,504,200)在种子发育过程中将异源基因的表达强力驱动延长的时间段以提高大豆种子内LC-PUFA和DHA的水平。最终，可以使用强组成型启动子诸如木薯叶脉花叶病毒启动子(CsVMV启动子v2)贯穿所有发育阶段驱动异源基因的表达，由此提高大豆种子和其它植物组织内的LC-PUFA和DHA水平。
这些启动子单独或组合使用以驱动表达PUFA合酶OrfA，PUFA合酶OrfB，PUFA合酶嵌合OrfC，酰基-CoA合成酶和4’磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶HetI表达盒，其先前在质粒pDAB7362中描述。替换质粒内的转录调节区的方法是本领域中公知的。因而，将包含PvDlec2启动子v2的多核苷酸片段从pDAB7362(或用于建立pDAB7362的前述质粒)除去，并用新的启动子区替换。使用新构建的质粒稳定转化大豆植物。将转基因大豆植物分离，并分子表征。使用本文中描述的方法通过分析脂质概况(FAME)测定所得的LC-PUFA积累，并且鉴定生成按总脂肪酸重量计0.01％至15％DHA，按总脂肪酸重量计0.01％至10％DPA(n-6)，或按总脂肪酸重量计0.01％至10％EPA的大豆植物。
使用在种子发育早期表达的启动子
实施例8.1：pDAB9166的构建
使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB9166质粒(图14；SEQ ID NO：40)。pDAB9166含有3个PUFA合酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有LfKCS3启动子v1，SzPUFA OrfA v3和AtuORF233’UTR v1。第二个PUFA合酶PTU含有LfKCS3启动子v1，SzPUFA OrfB v3和AtuORF233’UTR v1。第三个PUFA合酶PTU含有Lf CS3启动子v1，hSzThPUFA OrfC v3和AtuORF233’UTR v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有LfKCS3启动子v1，NoHetI v3和AtuORF233’UTR v1。
将质粒pDAB9161，pDAB9162，pDAB9163，pDAB101484和pDAB7333重组以形成pDAB9166。具体地，将上文描述的4个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFAOrfA v3，SzPUFA OrfB v3，hSzThPUFA OrfC v3，NoHetI v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入5个PTU和DNA测序方面测试。
实施例8.2：pDAB9167的构建
使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB9167质粒(图15；SEQ ID NO：41)。pDAB9167含有3个PUFA合酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有LfKCS3启动子v1，SzPUFA OrfAv3和AtuORF233’UTRv1。第二个PUFA合酶PTU含有BoACP启动子v1，BoACP5’UTR v1，SzPUFA OrfB v3和AtuORF233’UTR v1。第三个PUFA合酶PTU含有LfKCS3启动子v1。hSzThPUFA OrfC v3和AtuORF233’UTR v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有BoACP启动子v1，BoACP5’UTR v1，NoHetI v3和AtuORF233’UTR v1。
将质粒pDAB9161，pDAB9165，pDAB9163，pDAB101485和pDAB7333重组以形成pDAB9167。具体地，将上文描述的4个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFAOrfA v3，SzPUFA OrfB v3，hSzThPUFA OrfC v3，NoHetI v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入5个PTU和DNA测序方面测试。
含有菜豆蛋白启动子的质粒
实施例8.3：pDAB7379的构建
pDAB7379是一种二元载体，其构建为含有重新建立的、密码子优化的SzPUFAOrfA，SzPUFA OrfB，hSzThPUFA OrfC，和NoHetI型式。此构建体中不包含SzACS-2基因序列。使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB7379质粒(图16；SEQ ID NO：42)。
pDAB7379含有3个PUFA合酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，SzPUFAOrfA v3和AtuORF233’UTR v1。第二个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，SzPUFA OrfBv3和AtuORF233’UTR v1。第三个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，hSzThPUFA OrfC v3和AtuORF233’UTR v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，NoHetI v3和AtuORF233’UTR v1。
将质粒pDAB7371，pDAB7372，pDAB7373，pDAB7374和pDAB7333重组以形成pDAB7379。具体地，将上文描述的4个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFAOrfA v3，SzPUFA OrfB v3，hSzThPUFA OrfC v3，NoHetI v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORFl3’UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入5个PTU和DNA测序方面测试。
实施例8.4：DAB7380的构建
pDAB7380是一种二元载体，其构建为含有重新建立的、密码子优化的SzPUFAOrfA、SzPUFA OrfB、hSzThPUFA OrfC、和NoHetI型式。此构建体中不包含SzACS-2基因序列。修饰此构建体中使用的菜豆蛋白启动子型式，基本上如Bustos等，1989(The Plant Cell，Vol.1；839-853)描述的，其中启动子的5’部分是截短的，且菜豆蛋白5’非翻译区保持完整。使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB7380质粒(图17；SEQ ID NO：43)。
pDAB7380含有3个PUFA合酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v4，PvPhas5’UTR，SzPUFAOrfA v3和AtuORF233’UTR v1。第二个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v4，PvPhas5’UTR，SzPUFA OrfBv3和AtuORF233’UTR v1。第三个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v4，PvPhas5’UTR，hSzThPUFA OrfC v3和AtuORF233’UTR v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvPhas启动子v5，PvPhas5’UTR，NoHetI v3和AtuORF233’UTR v1。
将质粒pDAB7375，pDAB7376，pDAB7377，pDAB7378和pDAB7333重组以形成pDAB7380。具体地，将上文描述的4个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFAOrfA v3，SzPUFA OrfB v3，hSzThPUFA OrfC v3，NoHetI v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入5个PTU和DNA测序方面测试。
实施例8.5：DAB9323的构建
pDAB9323是一种二元载体，其构建为含有天然的、非密码子优化的SzPUFA OrfA，SzPUFA OrfB，hSzThPUFA OrfC，SzACS-2，和NoHetI型式。使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB9323质粒(图18；SEQ ID NO：44)。
pDAB9323含有3个PUFA合酶PTU，1个酰基-CoA合成酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，SzPUFA OrfA v2，PvPhas3’UTR v1和PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)。第二个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，SzPUFA OrfB v2，PvPhas3’UTR v1和PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)。第三个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，SzPUFA OrfC v2，PvPhas3’UTR v1和PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)。酰基-CoA合成酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，SzACS-2v2基因，PvPhas3’UTR v1和PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，NoHetI v2，PvPhas3’UTR v1和PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)。
将质粒pDAB9307，pDAB9311，pDAB9315，pDAB9322和pDAB7333重组以形成pDAB9323。具体地，将上文描述的5个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFAOrfA v2，SzPUFA OrfB v2，SzPUFA OrfC v2，NoHetIv2。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有6个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入6个PTU和DNA测序方面测试。
实施例8.6：pDAB9330的构建
pDAB9330是一种二元载体，其构建为含有重新建立的、密码子优化的SzPUFAOrfA，SzPUFA OrfB，hSzThPUFA OrfC，SzACS-2，和NoHetI型式。使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB9330质粒(图19；SEQ ID NO：45)。pDAB9330含有3个PUFA合酶PTU，1个酰基-CoA合成酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，SzPUFA OrfA v3，PvPhas3’UTR v1和PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)。第二个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，SzPUFA OrfB v3，PvPhas3’UTR和PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)。第三个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，hSzThPUFA OrfC v3，PvPhas3’UTR v1和PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)。酰基-CoA合成酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，SzACS-2v3基因，PvPhas3’UTR v1和PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，NoHetI v3，PvPhas3’UTRv1和PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)。
将质粒pDAB9324，pDAB9325，pDAB9326，pDAB9329和pDAB7333重组以形成pDAB9330。具体地，将上文描述的5个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFAOrfA v3，SzPUFA OrfB v3，hSzThPUFA OrfC v3，SzACS-2v3，NoHetI v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有6个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入6个PTU和DNA测序方面测试。
实施例8.7：pDAB9337的构建
pDAB9337是一种二元载体，其构建为含有重新建立的、密码子优化的SzPUFAOrfA，SzPUFA OrfB，hSzThPUFA OrfC，和NoHetI型式，其表达由菜豆蛋白启动子驱动。使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB9337质粒(图20；SEQ ID NO：46)。
pDAB9337含有3个PUFA合酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，SzPUFAOrfA v3，PvPhas3’UTR v1和PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)。第二个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，SzPUFA OrfB v3，PvPhas3’UTR v1和PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)。第三个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，hSzThPUFAOrfC v3，PvPhas3’UTR v1和PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，NoHetI v3，PvPhas3’UTR v1和PvPhas3’MARv2(在质粒图上未注释)。
将质粒pDAB9324，pDAB9325，pDAB9326，pDAB9328和pDAB7333重组以形成pDAB9337。具体地，将上文描述的4个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFAOrfA v3，SzPUFA OrfB v3，hSzThPUFA OrfC v3，NoHetI v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入5个PTU和DNA测序方面测试。
实施例8.8：pDAB9338的构建
pDAB9338是一种二元载体，其构建为含有重新建立的、密码子优化的SzPUFAOrfA，SzPUFA OrfB，hSzThPUFA OrfC，和NoHetI型式。使用菜豆蛋白启动子来驱动SzPUFAOrfA的表达，并且使用PvDlec2启动子来驱动其它转基因。使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB9338质粒(图21；SEQ ID NO：47)。
pDAB9338含有3个PUFA合酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，SzPUFAOrfA v3，PvPhas3’UTR v1和PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)。第二个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfB v3和At2S SSP终止子v1。第三个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，hSzThPUFA OrfC v3和At2SSSP终止子v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，NoHetI v3和At2S SSP终止子v1。
将质粒pDAB9324，pDAB7335，pDAB7336，pDAB7338和pDAB7333重组以形成pDAB9338。具体地，将上文描述的4个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFAOrfA v3，SzPUFA OrfB v3，hSzThPUFA OrfC v3，NoHetI v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入5个PTU和DNA测序方面测试。
实施例8.9：pDAB9344的构建
pDAB9344是一种二元载体，其构建为含有重新建立的、密码子优化的SzPUFAOrfA，SzPUFA OrfB，hSzThPUFA OrfC，和NoHetI型式，它们都含有与编码序列的氨基端融合的二磷酸核酮糖羧化酶小链1A(标记为SSU-TP v1)。使用菜豆蛋白启动子来驱动SzPUFAOrfA的表达，并且使用PvDlec2启动子来驱动其它转基因。
使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB9344质粒(图22；SEQ ID NO：48)。pDAB9344含有3个PUFA合酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，SzPUFA OrfA v4，PvPhas3’UTR v1和PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)。第二个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，SzPUFA OrfB v4，PvPhas3’UTR v1和PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)。第三个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，hSzThPUFA OrfC v4，PvPhas3’UTR v1和PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，NoHetI v4，PvPhas3’UTR v1和PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)。
将质粒pDAB9343，pDAB9342，pDAB9340，pDAB9331和pDAB7333重组以形成pDAB9344。具体地，将上文描述的4个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFAOrfA v4，SzPUFA OrfB v4，hSzThPUFA OrfC v4，NoHetI v4。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有6个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入5个PTU和DNA测序方面测试。
实施例8.10：DAB9396的构建
pDAB9396是一种二元载体，其构建为含有重新建立的、密码子优化的SzPUFAOrfA，SzPUFA OrfB，hSzThPUFA OrfC，SzACS-2，和NoHetI型式。使用菜豆蛋白启动子来驱动SzPUFA OrfA和SzPUFA OrfB的表达。使用PvDlec2启动子来驱动其它转基因；hSzThPUFAOrfC，SzACS-2，和NoHetI。
使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB9396质粒(图23；SEQ ID NO：49)。pDAB9396含有3个PUFA合酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，SzPUFA OrfA v3，PvPhas3’UTR v1和PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)。第二个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfB v3和At2S SSP终止子v1。第三个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，hSzThPUFA OrfCv3和At2S SSP终止子v1。酰基-CoA合成酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，SzACS-2v3基因，PvPhas3’UTR v1和PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，NoHetI v3和At2S SSP终止子v1。
将质粒pDAB9324，pDAB7335，pDAB7336，pDAB7339和pDAB7333重组以形成pDAB9338。具体地，将上文描述的5个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFAOrfA v3，SzPUFA OrfB v3，hSzThPUFA OrfC v3，SzACS-2v3，NoHetI v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入6个PTU和DNA测序方面测试。
实施例8.11：pDAB101412的构建
pDAB101412是一种二元载体，其构建为含有重新建立的、密码子优化的SzPUFAOrfA，SzPUFA OrfB，hSzThPUFA OrfC，SzACS-2，和NoHetI型式。修饰此构建体中使用的菜豆蛋白启动子型式，基本上如Bustos等，1989(The Plant Cell，Vol.1；839-853)中描述的，其中启动子的5’部分是截短的，且菜豆蛋白5’非翻译区保持完整。截短的菜豆蛋白启动子序列贯穿本申请标示为型式4(v4)，型式5(v5)，和型式6(v6)。使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB101412质粒(图24；SEQ ID NO：50)。
pDAB101412含有3个PUFA合酶PTU，1个酰基-CoA合成酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v4，PvPhas5’UTR，SzPUFA OrfA v3和AtuORF233’UTR v1。第二个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v4，PvPhas5’UTR，SzPUFA OrfB v3和AtuORF233’UTR v1。第三个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v4，PvPhas5’UTR，hSzThPUFA OrfC v3和AtuORF233’UTR v1。酰基-CoA合成酶PTU含有PvPhas启动子v4，PvPhas5’UTR，2S5’UTR，SzACS-2v3基因和AtuORF235’UTR v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvPhas启动子v5，PvPhas5’UTR，NoHetI v3和AtuORF233’UTR v1。
将质粒pDAB7375，pDAB7376，pDAB7377，pDAB7398和pDAB7333重组以形成pDAB101412。具体地，将上文描述的5个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFAOrfA v3，SzPUFA OrfB v3，hSzThPUFA OrfC v3，SzACS-2v3，NoHetI v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13'UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入6个PTU和DNA测序方面测试。
用在种子发育早期表达的启动子的大豆转化
使用上文描述的方案，使用质粒稳定转化大豆植物。将转基因大豆植物分离并分子表征。使用备选构建体产生含有较大量DHA和LC-PUFA的大豆植物。测定所得的LC-PUFA积累，并且鉴定生成0.01％至15％DHA或0.01％至15％LC-PUFA的大豆植物。
实施例9
使用备选构建体设计得到的藻PUFA合酶基因套件的表达
引入启动子多样性以降低调节元件的复制
基因沉默是一种已经在转基因大豆事件的后代世代中观察到的现象。几篇综述文章讨论了转录基因沉默(TGS)和转录后基因沉默(PTGS)，诸如Waterhouse I.，2001(Nature411：834-842)，Vaucheret和Fagard，2001(Trends in Genetics17(1)：29-35，及Okamoto和Hirochika，2001(Trends in Plant Sci.6(11)：527-534)的那些。在植物中，基因沉默可以通过转基因多核苷酸序列(串联重复转基因序列，反向重复转基因序列，或对染色体的多处插入)或者在感染性植物病毒或根癌土壤杆菌的T-DNA携带与靶基因序列同源的序列时触发。
另外，转基因多核苷酸序列的复制可以起构建体不稳定性的触发物的作用。共享高水平序列相似性的多个转基因序列可以彼此折起来。可以经由同源重组发生重排，其中切除DNA的居间序列。因此，切除位于重复转基因多核苷酸序列之间的DNA片段。
设计质粒载体中的一种策略是将启动子多样性引入构建体中，其通过掺入维持每种转基因的高水平表达的多个独特的种子特异性启动子进行。将启动子序列多样性引入质粒载体中可以降低基因沉默，并且改善质粒稳定性。多种种子特异性启动子包括PvDlec2，菜豆蛋白，和Napin(美国专利No.5，608，152)。这些启动子在启动子活性诸如组织特异性，表达水平，表达持续时间等方面是相对相当的。
实施例9.1：pDAB7733的构建
使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB7733二元载体(图25；SEQID NO：51)。pDAB7733含有3个PUFA合酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v4，PvPhas5’UTR，SzPUFA OrfA v3和AtuORF233’UTR v1。第二个PUFA合酶PTU含有BnaNapinC启动子v1，BnaNapinC5’UTR，SzPUFAOrfB v3和BnaNapinC3’UTR v1。第三个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，hSzThPUFA OrfC v3和At2S SSP终止子v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvPhas启动子v5，PvPhas5’UTR，NoHetI v3和AtuORF233’UTR v1。
将质粒pDAB7375，pDAB7731，pDAB7336，pDAB7378和pDAB7333重组以形成pDAB7733。具体地，将上文描述的4个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFAOrfA v3，SzPUFA OrfB v3，hSzThPUFA OrfC v3，NoHetI v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入5个PTU和DNA测序方面测试。
实施例9.2：pDAB7734的构建
使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB7734二元载体(图26；SEQ ID NO：52)。pDAB7734含有3个PUFA合酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfA v3和At2S SSP终止子v1。第二个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v4，PvPhas5’UTR，SzPUFA OrfBv3和AtuORF233’UTR v1。第三个PUFA合酶PTU含有BnaNapinC启动子v1，BnaNapinC5’UTR，hSzThPUFA OrfC v3和BnaNapinC3’UTR v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，NoHetI v3和At2S SSP终止子v1。
将质粒pDAB7334，pDAB7376，pDAB7732，pDAB7338和pDAB7333重组以形成pDAB7734。具体地，将上文描述的4个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFAOrfA v3，SzPUFA OrfB v3，hSzThPUFA OrfC v3，NoHetI v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入5个PTU和DNA测序方面测试。
实施例9.3：pDAB101493的构建
使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB101493二元载体(图27；SEQ ID NO：53)。pDAB101493含有3个PUFA合酶PTUs，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfAv3和At2S SSP终止子v1。第二个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v4，PvPhas5*UTR，SzPUFAOrfB v3和AtuORF233’UTR v1。第三个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，hSzThPUFA OrfC v3和At2S SSP终止子v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvPhas启动子v5，PvPhas5’UTR，NoHetI v3和AtuORF233’UTR v1。
将质粒pDAB7334，pDAB7376，pDAB7336，pDAB7378和pDAB7333重组以形成pDAB101493。具体地，将上文描述的4个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFAOrfA v3，SzPUFA OrfB v3，hSzThPUFA OrfC v3，NoHetI v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入5个PTU和DNA测序方面测试。
实施例9.4：pDAB109507的构建
使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB109507质粒(图28；SEQ ID NO：54)。pDAB109507含有3个PUFA合酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，SzPUFA OrfA v3和PvPhas3’UTRv1和PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)。第二个PUFA合酶PTU含有BnaNapinC启动子v1，BnaNapinC5’UTR，SzPUFA OrfB v3和BnaNapinC3’UTR v1。第三个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，hSzThPUFA OrfC v3和At2S SSP终止子v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有BoACP启动子/5’UTR v1，NoHetI v3和AtuORF233’UTR v1。
将质粒pDAB9324，pDAB7731，pDAB7336，pDAB101485和pDAB7333重组以形成pDAB109507。具体地，将上文描述的4个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFAOrfA v3，SzPUFA OrfB v3，hSzThPUFA OrfC v3，NoHetI v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入5个PTU和DNA测序方面测试。
实施例9.5：pDAB109508的构建
使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB109508质粒(图29；SEQ IDNO：55)。pDAB109508含有3个PUFA合酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，SzPUFA OrfA v3和PvPhas3’UTRv1和PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)。第二个PUFA合酶PTU含有BnaNapinC启动子v1，BnaNapinC5’UTR，SzPUFA OrfB v3和BnaNapinC3’UTR v1。第三个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，hSzThPUFA OrfC v3和At2S SSP终止子v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，NoHetI v3和At2S SSP终止子v1。
将质粒pDAB9324，pDAB7731，pDAB7336，pDAB7338和pDAB7333重组以形成pDAB109508。具体地，将上文描述的4个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFAOrfA v3，SzPUFA OrfB v3，hSzThPUFA OrfC v3，NoHetI v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入5个PTU和DNA测序方面测试。
实施例9.6：pDAB109509的构建
使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB109509质粒(图30；SEQ ID NO：56)。pDAB109509含有3个PUFA合酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfA v3和At2S SSP终止子v1。第二个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfB v3和At2S SSP终止子v1。第三个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，hSzThPUFAOrfC v3和At2S SSP终止子v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有BoACP启动子/5’UTRv1，NoHetI v3和AtuORF233’UTR v1。
将质粒pDAB7334，pDAB7335，pDAB7336，pDAB101485和pDAB7333重组以形成pDAB109509。具体地，将上文描述的4个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFAOrfA v3，SzPUFA OrfB v3，hSzThPUFA OrfC v3，NoHetI v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入5个PTU和DNA测序方面测试。
重排二元构建体PTU的次序以降低长基因序列的片段化
将SzPUFA OrfA PTU置于二元构建体的3’端以测试PTU盒的次序是否可以降低分离转基因事件中的片段化和重排。SzPUFA OrfA是一个较大的开读框(约8,700b.p.)，其含有9个串联酰基载体蛋白重复。在第一批完成的构建体中，SzPUFA OrfA PTU定位为首先整合入植物染色体中。随后，SzPUFAOrfA PTU继之以剩余的PUFA合成相关基因PTU，因为它们在分子大小上降低。对SzPUFA OrfA编码区的分子分析指示一些转基因芸苔和拟南芥事件含有片段化的插入。描述了备选的构建体设计，其中已经将PUFA合酶PTU的次序改变为以下构造：hSzThPUFA OrfC PTU，SzPUFA OrfB PTU，NoHetI PTU，SzPUFA OrfA PTU，和PAT PTU。完成改变二元构建体上SzPUFA OrfA PTU的位置以降低分离的转基因事件中的片段化和重排。
实施例9.7：pDAB9151的构建
使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB9151质粒(图31；SEQ ID NO：57)。pDAB9151含有3个PUFA合酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfB v3和At2S SSP终止子v1。第二个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，hSzThPUFAOrfCv3和At2S SSP终止子v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，NoHetI v3和At2S SSP终止子v1。最终的PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfA v3和At2S SSP终止子v1。
将质粒pDAB9148，pDAB7335，pDAB9149，pDAB9150和pDAB7333重组以形成pDAB9151。具体地，将上文描述的4个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：hSzThPUFA OrfC v3，SzPUFA OrfB v3，NoHetI v3，SzPUFAOrfA v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PATv5，AtuORF13'UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入5个PTU和DNA测序方面测试。
改变二元构建体PTU的转录方向以引入构建体多样性
一种备选的构建体设计包括改变PUFA合酶PTU的次序和基因表达盒的转录方向。在第一批完成的构建体中，每个基因表达盒以相同方向(“头至尾”，其中一个基因表达盒的启动子位于第二个基因表达盒的3’UTR附近)定位。以下构建体描述了一种策略，其中基因表达盒以不同方向定位，并且利用备选启动子。在这些例子中，基因表达盒与第二基因表达盒反式定位，使得这两个基因表达盒的启动子工程化改造为彼此相邻。此构造称为“头至头”构造。实施例中描述了其它构造，其中一种基因表达盒与第二基因表达盒反式定位，使得这两个基因表达盒的3’UTR工程化改造为彼此相邻。此构造称为“尾至尾”构造。为了减轻此类设计的潜在通读，已经将双向Orf23/24终止子置于这两个PTU之间。提出这些构造提高转基因的表达，由此导致较高的LC-PUFA和DHA脂肪酸浓度和含量。
实施例9.8：pDAB108207的构建
使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB108207质粒(图32；SEQ ID NO：58)。pDAB108207含有3个PUFA合酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfA v3和At2S SSP终止子v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvPhas启动子v6，PvPhas5’UTR，NoHetI v3，PvPhas3’UTR v1和PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)。第二个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，hSzThPUFA OrfC v3，At2S SSP终止子v1和AtuORF233’UTRv1。第三个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v6，PvPhas5’UTR，SzPUFA OrfB v3，PvPhas3’UTR和PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)和AtuORF233’UTR v1。
将质粒pDAB7334，pDAB101489，pDAB108205，pDAB108206和pDAB7333重组以形成pDAB108207。具体地，在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内，将SzPUFA OrfA v3和NoHetI v3以尾至尾取向放置；将NoHetI v3和hSzThPUFA OrfC v3以头至头取向放置；将hSzThPUFA OrfC v3和SzPUFA OrfB以尾至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFA OrfA v3，NoHetI v3，hSzThPUFA OrfC v3，SzPUFA OrfB v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入5个PTU和DNA测序方面测试。
实施例9.9：pDAB108208的构建
使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB108208质粒(图33；SEQ ID NO：59)。pDAB108208含有3个PUFA合酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfA v3和At2S SSP终止子v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvPhas启动子v4，PvPhas5’UTR，NoHetI v3和AtuORF233’UTR v1。第二个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，hSzThPUFA OrfC v3和At2S SSP终止子v1。第三个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v5，PvPhas5’UTR，SzPUFA OrfB v3，PvPhas3’UTR，PvPhas3″MAR v2(在质粒图上未注释)，和AtuORF233’UTR v1。
将质粒pDAB108200，pDAB101490，pDAB108201，pDAB108202和pDAB7333重组以形成pDAB108208。具体地，在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内，将SzPUFA OrfA v3和NoHetI v3以头至头取向放置；将NoHetI v3和hSzThPUFA OrfC v3以尾至尾取向放置；将hSzThPUFA OrfCv3和SzPUFA OrfB以头至头取向放置。基因的次序是：SzPUFA OrfA v3，NoHetI v3，hSzThPUFA OrfC v3，SzPUFA OrfB v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入5个PTU和DNA测序方面测试。
实施例9.10：pDAB108209的构建
使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB108209质粒(图34；SEQ ID NO：60)。pDAB108209含有3个PUFA合酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5*UTR，SzPUFA OrfA v3和At2S SSP终止子v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvPhas启动子v4，PvPhas5’UTR，NoHetI v3和AtuORF233’UTR v1。第二个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，hSzThPUFA OrfC v3和At2S SSP终止子v1。第三个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v5，PvPhas5’UTR，SzPUFA OrfB v3，PvPhas3’UTR和PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)，和随机DNA间隔物。
将质粒pDAB108200，pDAB108204，pDAB108201，pDAB108202和pDAB7333重组以形成pDAB108209。具体地，在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内，将SzPUFA OrfA v3和NoHetI v3以头至头取向放置；将NoHetI v3和hSzThPUFA OrfC v3以尾至尾取向放置；将hSzThPUFA OrfC v3和SzPUFA OrfB以头至头取向放置。基因的次序是：SzPUFA OrfA v3，NoHetI v3，hSzThPUFA OrfC v3，SzPUFA OrfB v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入5个PTU和DNA测序方面测试。
倍增3’UTR并且纳入间隔物DNA以使转录干扰最小化。
在连续叠加多个基因时可以发生转录干扰，由此导致降低的下游基因表达。此现象源自进入接着的启动子-转录单元中的3’UTR和终止子的转录通读。描述了备选的构建体设计，其由两种使转录干扰和转录干扰最小化的策略组成。第一种策略部署两个终止子/3’UTR的使用，其在各个DHA基因表达盒间叠加以限制通读到接着的基因表达盒中。第二种策略在表达盒间插入约1000个碱基对的间隔物DNA，由此使转录干扰最小化。
实施例9.11：pDAB108207的构建
使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB108207质粒(图32；SEQ ID NO：58)。pDAB108207含有3个PUFA合酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfA v3和At2S SSP终止子v1。第二个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，SzPUFAOrfBv3，PvPhas3’UTR，PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)，和AtuORF233’UTR v1。第三个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，hSzThPUFA OrfC v3，At2S SSP终止子v1和AtuORF233’UTR v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvPhas启动子v6，PvPhas5’UTR，NoHetI v3，PvPhas3’UTR v1和PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)。
将质粒pDAB7334，pDAB101489，pDAB108205，pDAB108206和pDAB7333重组以形成pDAB108207。具体地，在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内，将SzPUFA OrfA v3和NoHetI v3以尾至尾取向放置，并将AtuORF233’UTR在两个PTU间放置；将NoHetI v3和hSzThPUFA OrfC v3以头至头取向放置；将hSzThPUFA OrfC v3和SzPUFA OrfB以头至尾取向放置，并且将AtuORF233’UTR在两个PTU间放置。基因的次序是：SzPUFA OrfA v3，NoHetIv3，hSzThPUFA OrfC v3，SzPUFA OrfB v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PATv5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入5个PTU和DNA测序方面测试。
实施例9.12：pDAB108208的构建
使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB108208质粒(图33；SEQ ID NO：59)。pDAB108208含有3个PUFA合酶PTU，1个酰基-CoA合成酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfA v3和At2S SSP终止子v1。第二个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v5，PvPhas5’UTR，SzPUFA OrfB v3，PvPhas3’UTR，PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)和AtuORF233’UTR v1。第三个PUPA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，hSzThPUFA OrfCv3和At2S SSP终止子v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvPhas启动子v4，PvPhas5’UTR，NoHetIv3和AtuORF233’UTR v1。
将质粒pDAB108200，pDAB101490，pDAB108201，pDAB108202和pDAB7333重组以形成pDAB108208。具体地，在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内，将SzPUFA OrfA v3和NoHetI v3以头至头取向放置；将NoHetI v3和hSzThPUFA OrfC v3以尾至尾取向放置，并且将AtuORF233’UTR在两个PTU间放置；将hSzThPUFA OrfC v3和SzPUFA OrfB以头至头取向放置。基因的次序是：SzPUFA OrfA v3，NoHetI v3，hSzThPUFA OrfC v3，SzPUFA OrfB v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入5个PTU和DNA测序方面测试。
实施例9.13：pDAB108209的构建
使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB108209质粒(图34；SEQ ID NO：60)。pDAB108209含有3个PUFA合酶PTU，1个酰基-CoA合成酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfA v3和At2S SSP终止子v1。第二个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v5，PvPhas5’UTR，SzPUFA OrfB v3，PvPhas3’UTR，PvPhas3’MAR v2(在质粒图上未注释)，和随机DNA间隔物。第三个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，hSzThPUFA OrfC v3和At2S SSP终止子v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvPhas启动子v4，PvPhas5’UTR，NoHetIv3和AtuORF233’UTR v1。
将质粒pDAB108200，pDAB108204，pDAB108201，pDAB108202和pDAB7333重组以形成pDAB108209。具体地，在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内，将SzPUFA OrfA v3和NoHetI v3以头至头取向放置；将NoHetI v3和hSzThPUFA OrfC v3以尾至尾取向放置，并且将1000个碱基对间隔物在两个PTU间放置；将hSzThPUFA OrfC v3和SzPUFA OrfB以头至头取向放置。基因的次序是：SzPUFA OrfAv3，NoHetI v3，hSzThPUFA OrfCv3，SzPUFA OrfBv3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AmORF13’UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入5个PTU和DNA测序方面测试。
使用备选3’UTR-终止子来限制转录通读。
土壤杆菌ORF233’UTR-终止子主要用于终止多种上述构建体中的转录。最近显示了ZmLipase3’UTR-终止子在终止拟南芥中的转录通读中更有效。因而，一种构建体型式与PvDlec2启动子组合利用ZmLipase3’UTR-终止子以测试此3’UTR是否可以降低上游基因的转录通读，由此降低转录干扰。
实施例9.14：pDAB9159的构建
使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB9159质粒(图35；SEQ ID NO：61)。pDAB9159含有3个PUFA合酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfA v3和ZmLip3’UTR v1。第二个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，SzPUFA OrfB v3和ZmLip3’UTR v1。第三个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，hSzThPUFA OrfCv3和ZmLip3’UTR v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvPhas启动子v3，PvPhas5’UTR，NoHetI v3和ZmLip3’UTR v1。
将质粒pDAB9152，pDAB9153，pDAB9154，pDAB9155和pDAB7333重组以形成pDAB9159。具体地，将上文描述的4个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFAOrfA v3，SzPUFA OrfB v3，hSzThPUFA OrfC v3，NoHetI v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入5个PTU和DNA测序方面测试。
实施例9.15：pDAB9147的构建
使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB9147质粒(图36；SEQ ID NO：62)。pDAB9147含有3个PUFA合酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfA v3，At2SSSP终止子v1和ZmLip3’UTR v1。第二个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfB v3和At2S SSP终止子v1。第三个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，hSzThPUFA OrfC v3和At2S SSP终止子v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，NoHetI v3和At2S SSP终止子v1。
将质粒pDAB9146，pDAB7335，pDAB7336，pDAB7338和pDAB7333重组以形成pDAB9147。具体地，将上文描述的4个PTU在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内以头至尾取向放置。基因的次序是：SzPUFAOrfA v3，SzPUFA OrfB v3，hSzThPUFA OrfC v3，NoHetI v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入5个PTU和DNA测序方面测试。
投递两个不同T-DNA上的DHA基因
一种备选构建体设计由构建两个分开的二元载体组成，第一个载体含有一个T-DNA上的PUFA合酶基因子集，且第二个二元载体含有第二个T-DNA上的剩余PUFA合酶基因。这些二元载体单独用于转化植物，将该植物有性杂交，由此生成含有所有PUFA合酶基因表达构建体的后代。一种生成转基因植物的备选方法会是将这两个二元载体共转化到大豆组织中，并且选择或筛选含有这两个T链的单一植物。
实施例9.16：pDAB108224的构建
使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB108224质粒(图37；SEQ ID NO：63)。pDAB108224含有1个PUFA合酶PTU，1个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfA v3和At2S SSP终止子v1。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶PTU含有PvPhas启动子v4，PvPhas5’UTR，NoHetI v3和AtuORF233’UTR v1。
将质粒pDAB108216，pDAB108221和pDAB7333重组以形成pDAB108224。具体地，在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内，将SzPUFA OrfA v3和NoHetI v3以头至头取向放置。基因的次序是：SzPUFAOrfA v3，NoHetI v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入3个PTU和DNA测序方面测试。
实施例9.17：pDAB108225的构建
使用多位点Gateway L-R重组反应构建pDAB108225质粒(图38；SEQ ID NO：64)。pDAB108225含有2个PUFA合酶PTU和膦丝菌素乙酰基转移酶PTU。具体地，第一个PUFA合酶PTU含有PvDlec2启动子v2，2S5’UTR，SzPUFA OrfB v3和At2S SSP终止子v1。第二个PUFA合酶PTU含有PvPhas启动子v4，SzPUFA OrfB v3和Atu ORF233’UTR v1。
将质粒pDAB108217，pDAB108222和pDAB7333重组以形成pDAB108225。具体地，在植物转化二元pDAB7333的T链DNA边界区内，将SzPUFA(MB v3和hSzThPUFA OrfC v3以头至头取向放置。基因的次序是：SzPUFA OrfB v3，hSzThPUFA OrfC v3。除其它调节元件诸如过驱动和T-链边界序列(T-DNA边界A和T-DNA边界B)外，pDAB7333还含有膦丝菌素乙酰基转移酶PTU：CsVMV启动子v2，PAT v5，AtuORF13’UTR v4。然后，将含有5个PTU的重组质粒分离，并在用限制酶消化掺入3个PTU和DNA测序方面测试。
用含有备选设计的构建体的大豆转化
这些质粒用于使用上文描述的方案稳定转化大豆植物。将转基因大豆植物分离并分子表征。备选构建体的使用生成含有较大量的DHA和LC-PUFA的大豆植物。测定所得的LC-PUFA积累，并且鉴定生成0.01％至15％DHA或0.01％至15％LC-PUFA的大豆植物。
实施例10
用于转化拟南芥的备选构建体设计及随后生成LC-PUFA和DHA
用含有pDAB101493，pDAB7362，pDAB7369，pDAB101412，或pDAB7380二元载体的根癌土壤杆菌菌株转化拟南芥植物。由Clough和Bent(1998)描述的浸花转化方案用于转化。Clough和Bent，“Floral dip：a simplified method for agrobacterium-mediatedtransformation of Arabidopsis thalia，”Plant J.，16：735-743，1998。获得转化的拟南芥植物，并且完成转基因存在的分子确认。将来自转基因拟南芥事件的T1植物在温室中种植至成熟。将这些植物自花传粉，并且在成熟时收获所得的T2种子，经由FAMEs GC-FID分析T2种子(10mg)以测定T2拟南芥种子中的LC-PUFA和DHA含量。经由FAME GC-FID法分析组织，如先前实施例中描述的。来自拟南芥植物的T1植物的T2种子含有0％至0.95％DHA和0％至1.50％总LC-PUFA。图39中显示了来自个别T1植物的T2种子的LC-PUFA和DHA含量。
实施例11
在大豆内共表达DGAT2或ACC酶与藻PUFA合酶基因套件
通过转化嵌合DNA分子进一步修饰大豆植物内的油含量，所述嵌合DNA分子编码并表达乙酰CoA羧化酶(ACC酶)或2型二酰基甘油酰基转移酶(DGAT2)。将这些基因与上文描述的藻PUFA合酶基因共表达，其经由育种含有ACC酶或DGAT2表达盒的大豆植物与含有PUFA合酶基因的大豆植物；或者通过用含有ACC酶或DGAT2和PUFA合酶基因的基因叠加转化大豆植物进行。表达ACC酶或DGAT2编码序列必需的调节元件可以包括上文描述的那些调节元件。也可以使用本领域中已知的其它调节元件表达序列。使用上文描述的转化方案将ACC酶和DGAT2表达盒转化到大豆中。转化可以作为与PUFA合酶OrfA，PUFA合酶OrfB，PUFA合酶OrfC，酰基-CoA合成酶和4’磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶HetI表达盒组合的ACC酶或DGAT2表达盒的分子叠加；或者作为与选择标志物连锁，然后随后与含有PUFA合酶OrfA，PUFA合酶OrfB，PUFA合酶OrfC，酰基-CoA合成酶和4’磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶HetI表达盒的大豆植物杂交的独立ACC酶或DGAT2表达盒发生。将阳性转化体分离并分子表征。鉴定与未转化对照大豆植物相比在植物，植物种子，或植物油浓缩物中含有增加的LC-PUFA积累的大豆植物。此类增加的范围可以是1.2至20倍增加。
细胞质中ACC酶的过表达可以产生较高的丙二酰-CoA水平。在存在并表达藻PUFA合酶基因时，含有升高的胞质丙二酰-CoA水平的大豆植物或种子可以生成随后较高水平的长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)。在大豆植物内表达的DGAT2基因可以能够潜在将相当大量的二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)掺入三酰甘油中。对LC-PUFA具有底物偏爱的DGAT2基因(参见例如PCT国际公开文本WO2009/085169A2)可以提高这些脂肪酸对三酰甘油(TAG)的掺入。此类DGAT基因可用于引导将LC-PUFA，特别是DHA掺入TAG中，及用于提高植物和其它生物体中的TAG生成。
实施例12
用表达PUFA合酶基因的备选构建体设计转化的拟南芥种子中的DHA生成
基本上如Clough中Bent(Plant J.，199816(6)：735-43)中描述的，使用浸花法生成用含有质粒的根癌土壤杆菌转化的拟南芥T1事件，该质粒编码多种植物表达元件控制下的PUFA合酶基因和HetI(且在一些情况中为SzACS-2)。将所得的T1种子收获并播种。选择经转化的T1植物，其通过用膦丝菌素喷雾以选择那些含有功能性PAT基因作为选择标志物的植物。对来自存活T1植物的叶组织取样，并且通过对PAT基因特异性的定量PCR反应分析，以鉴定那些含有单一拷贝的选择标志物(及关联转基因)的植物。将这些植物培养至成熟，收获T2种子，并分析LC-PUFA含量(作为总可提取FAME的％)。表12中显示了来自用编码PUFA合酶基因的各种构建体生成的事件的数据汇总。
表12：含有单一拷贝的PAT转基因的拟南芥事件，其生成T2种子中的LC-PUFA和每个事件的DHA和EPA水平，示为总油的百分比。
1.具有大于1％总种子FAME的LC-PUFA含量的事件数目，括号中为占总事件的％。
2.所有T2种子样品的均值总LC-PUFA含量(DHA(n-3)+EPA(n-3)+DPA(n-6))作为总种子FAME的％
3.分析的所有T2种子样品的最大DHA含量作为总FAME的％
4.分析的所有T2种子样品的最大EPA含量作为总FAME的％
5.所有LC-PUFA生成性事件间平均n-3LC-PUFA(DHA+EPA)/总LC-PUFA含量(作为％)
这些数据显示了某些构建体构造和启动子组合产生较高比例的在T2种子中含有LC-PUFA的事件(对于pDAB109507而言所有单拷贝事件的77％生成DHA，且对于pDAB108207而言所有单拷贝事件的86％生成DHA)。某些构建体还生成较高比例的生成＞1％LC-PUFA含量的事件(对于pDAB109507而言所有单拷贝事件的33％，和对于pDAB108207而言所有单拷贝事件的34％)。对于不同构建体，来自多个事件的T2种子的最大LC-PUFA含量范围为0.24％-2.03％。同样地，某些构建体生成较高水平的ω-3LC-PUFA。在生成的所有构建体和事件间，最大DHA含量范围为0.17％-1.45％，且最大EPA含量范围为0％-0.26％。这些数据指示构建体设计的变化，其中改变启动子构造，生成与用pDAB7362转化的转基因植物相比展现出增加的LC-PUFA的转基因植物。因而，构建体设计变化的这些构建体是作物转化期望的。
将来自高LC-PUFA生成性事件的T2种子种植，并使用定量PCR对来自生长植物的叶组织取样，以测定PAT基因和其它转基因。鉴定含有两个拷贝的转基因的植物(即纯合子)，并种植至成熟。将所得的T3种子收获，并且分析LC-PUFA含量。含有重复启动子/3’UTR表达元件的一些构建体诸如pDAB7362和pDAB109509在随后的T3种子世代中显示较差的LC-PUFA性状稳定性。然而，用不同构建体构造和/或多样化的表达元件(例如pDAB108207，109508和7734)转化的一些事件产生LC-PUFA性状进入T3种子世代中的显著改善的稳定性，如表13中显示的。这些数据指示某些构建体可以维持随后世代中DHA性状的稳定性，并且此类构建体是作物转化优选的。
表13：来自选择的转基因拟南芥DHA生成性T2系的T3种子后代的LC-PUFA分析
总LC-PUFA含量和DHA含量是总FAME的％。
1.分析来自5-20个单独纯合植物的T3散装种子(bulk seed)
为了例示和描述，已经呈现了本发明的上述描述。此外，描述不意图将本发明限制于本文中公开的形式。
可以以任何和所有变型组合本文中描述的所有各种方面，实施方案和选项。
本说明书中提及的所有出版物，专利和专利申请通过提述并入本文，其程度就像每篇单独的出版物，专利或专利申请具体且单独指明以通过提述并入一样。

Claims (12)

1.一种生成包含可检测量的DHA(二十二碳六烯酸(C22:6,n-3))，DPA(二十二碳五烯酸(C22:5,n-6或n-3))或EPA(二十碳五烯酸(C20:5,n-3))的经遗传修饰的大豆植物细胞的方法，该方法包括用
包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸具有与SEQ ID NO:6至少80％相同的核苷酸序列，该多核苷酸编码生成至少一种多不饱和脂肪酸(PUFA)系统的多不饱和脂肪酸(PUFA)合酶的第一部分，其中所述PUFA合酶系统的第一部分由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成；
包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸具有与SEQ ID NO:7至少80％相同的核苷酸序列，该多核苷酸编码所述PUFA合酶系统的第二部分，其中所述PUFA合酶系统的第二部分由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成；
包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸具有与SEQ ID NO:8至少80％相同的核苷酸序列，该多核苷酸编码所述PUFA合酶系统的第三部分，其中所述PUFA合酶系统的第三部分由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成；
包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸具有与SEQ ID NO:10至少80％相同的核苷酸序列，所述多核苷酸编码将磷酸泛酰巯基乙胺基辅因子转移至PUFA合酶系统ACP域的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT酶)，其中所述PPT酶由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成；和
包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸具有与SEQ ID NO:9至少80％相同的核苷酸序列，该多核苷酸编码乙酰-CoA合成酶(AcoAS)，其中所述AcoAS由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成；
转化大豆植物或植物细胞，
使得经转化的植物细胞包含可检测量的DHA(二十二碳六烯酸(C22:6,n-3))，DPA(二十二碳五烯酸(C22:5,n-6或n-3))或EPA(二十碳五烯酸(C20:5,n-3))。
2.权利要求1的方法，其中编码PUFA合酶系统的第一部分的多核苷酸是SEQ ID NO:6。
3.权利要求1的方法，其中编码PUFA合酶系统的第二部分的多核苷酸是SEQ ID NO:7。
4.权利要求1的方法，其中编码PUFA合酶系统的第三部分的多核苷酸是SEQ ID NO:8。
5.权利要求1的方法，其中编码PUFA合酶系统的第一部分的多核苷酸是SEQ ID NO:6，编码PUFA合酶系统的第二部分的多核苷酸是SEQ ID NO:7，编码PUFA合酶系统的第三部分的多核苷酸是SEQ ID NO:8。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中编码PPT酶的多核苷酸是SEQ ID NO:10。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中编码PUFA合酶系统的各部分的多核苷酸和编码PPT酶的多核苷酸包含在单一重组表达载体中。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中编码PUFA合酶系统的各部分的多核苷酸、编码PPT酶的多核苷酸、和编码ACoAS的多核苷酸各自与种子特异性启动子或叶特异性启动子可操作连接。
9.权利要求8的方法，其中所述启动子选自下组：PvDlec2、LfKCS3、FAE 1、BoACP、BnaNapinC、泛素和CsVMV启动子。
10.权利要求1的方法，其中编码ACoAS的多核苷酸是SEQ ID NO:9。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中编码PUFA合酶系统的各部分的多核苷酸、编码PPT酶的多核苷酸、所述编码ACoAS的多核苷酸包含在单一重组表达载体中。
12.前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括用编码乙酰CoA羧化酶(ACC酶)的多核苷酸或编码2型二酰基甘油酰基转移酶(DGAT2)的多核苷酸转化所述大豆植物或植物细胞。
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Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11236351B2 (en) * 2010-05-17 2022-02-01 Dow Agrosciences Llc Production of DHA and other LC PUFAs in plants
TW201307553A (zh) 2011-07-26 2013-02-16 Dow Agrosciences Llc 在植物中生產二十二碳六烯酸（ｄｈａ）及其他長鏈多元不飽和脂肪酸（ｌｃ－ｐｕｆａ）之技術
CN109468241A (zh) 2011-10-19 2019-03-15 麻省理工学院 工程改造的微生物及用于微生物油生产的方法
JP6242882B2 (ja) * 2012-06-15 2017-12-06 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーション 植物細胞における長鎖多価不飽和脂肪酸の産生
KR20160065952A (ko) 2013-10-04 2016-06-09 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 제아 메이스 메탈로티오네인-유사 조절 요소 및 그의 용도
BR102014025574A2 (pt) 2013-10-15 2015-09-29 Dow Agrosciences Llc elementos regulatórios de zea mays e usos dos mesmos
BR102014025499A2 (pt) 2013-10-15 2015-09-29 Dow Agrosciences Llc elementos regulatórios de zea mays e uso dos mesmos
TW201525136A (zh) * 2013-11-26 2015-07-01 Dow Agrosciences Llc 利用破囊壺菌ＰＵＦＡ合成酶於油籽作物中生成ω－３長鏈多不飽和脂肪酸
WO2015196250A1 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Lipid comprising docosapentaenoic acid
KR102535223B1 (ko) 2013-12-18 2023-05-30 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 장쇄 다중불포화 지방산을 포함하는 지질
TW201527316A (zh) 2013-12-31 2015-07-16 Dow Agrosciences Llc 新穎玉米泛素啓動子（五）
TW201527312A (zh) 2013-12-31 2015-07-16 Dow Agrosciences Llc 新穎玉米泛素啓動子（一）
TW201527313A (zh) 2013-12-31 2015-07-16 Dow Agrosciences Llc 新穎玉米泛素啓動子（二）
TW201527314A (zh) 2013-12-31 2015-07-16 Dow Agrosciences Llc 新穎玉米泛素啓動子（三）
BR102015000943A2 (pt) 2014-01-17 2016-06-07 Dow Agrosciences Llc expressão aumentada de proteína em planta
TW201538518A (zh) 2014-02-28 2015-10-16 Dow Agrosciences Llc 藉由嵌合基因調控元件所賦予之根部特異性表現
JP2018511331A (ja) 2015-04-15 2018-04-26 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 導入遺伝子発現のための植物プロモーター
MX2017012936A (es) 2015-04-15 2018-02-01 Dow Agrosciences Llc Promotor de plantas para la expresion transgenica.
TW201718861A (zh) 2015-09-22 2017-06-01 道禮責任有限公司 用於轉殖基因表現之植物啟動子及３’ｕｔｒ
TW201718862A (zh) 2015-09-22 2017-06-01 Dow Agrosciences Llc 用於轉殖基因表現之植物啟動子及３’ｕｔｒ
CA3002151A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Dow Agrosciences Llc Plant promoter for transgene expression
US20170121726A1 (en) 2015-11-04 2017-05-04 Dow Agrosciences Llc Plant promoter for transgene expression
EP3455351B1 (en) 2016-05-12 2022-08-24 DSM IP Assets B.V. Method of increasing omega-3 polyunsaturated fatty acids production in microalgae
EP4338586A2 (en) * 2016-06-16 2024-03-20 Nuseed Nutritional Australia Pty Ltd Elite event canola ns-b50027-4
CN106148286B (zh) * 2016-06-29 2019-10-29 牛刚 一种用于检测热原的细胞模型的构建方法和细胞模型及热原检测试剂盒
CN110291199B (zh) 2016-10-03 2023-12-22 美国陶氏益农公司 用于转基因表达的植物启动子
EP3518657B1 (en) 2016-10-03 2022-07-13 Corteva Agriscience LLC Plant promoter for transgene expression
CA3073050A1 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Dow Agrosciences Llc Compositions and methods for expressing transgenes using regulatory elements from chlorophyll binding ab genes
CN110106174A (zh) * 2019-04-21 2019-08-09 吉林省农业科学院 一种大豆叶特异启动子GmGLP3（Glyma16g00980）及其分离方法和应用
CN110144349A (zh) * 2019-04-21 2019-08-20 吉林省农业科学院 一种大豆叶特异启动子GmNR1(Glyma14g33480)及其分离方法和应用
WO2023084416A1 (en) 2021-11-09 2023-05-19 Benson Hill, Inc. Promoter elements for improved polynucleotide expression in plants
WO2023111961A1 (en) 2021-12-15 2023-06-22 Benson Hill, Inc. Spatio-temporal promoters for polynucleotide expression in plants

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101573451A (zh) * 2006-03-15 2009-11-04 马泰克生物科学公司 利用pufa聚酮化合物合成酶系统在异源的生物体中产生多不饱和脂肪酸的方法

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
US5504200A (en) 1983-04-15 1996-04-02 Mycogen Plant Science, Inc. Plant gene expression
US5420034A (en) 1986-07-31 1995-05-30 Calgene, Inc. Seed-specific transcriptional regulation
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5693507A (en) 1988-09-26 1997-12-02 Auburn University Genetic engineering of plant chloroplasts
JPH02292397A (ja) * 1989-05-02 1990-12-03 Lion Corp 食用油脂組成物及び加工食品
US5451513A (en) 1990-05-01 1995-09-19 The State University of New Jersey Rutgers Method for stably transforming plastids of multicellular plants
CA2106960C (en) 1991-04-09 2005-03-08 Jacqueline De Silva Plant promoter involved in controlling lipid biosynthesis in seeds
US6210700B1 (en) 1997-01-14 2001-04-03 Novartis Nutrition Ag Enhancement of transplant graft survival through nutritional immunomodulation with omega-9 fatty acid dietary supplement therapy
AU720677B2 (en) 1997-04-11 2000-06-08 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain polyunsaturated fatty acids in plants
US6566583B1 (en) 1997-06-04 2003-05-20 Daniel Facciotti Schizochytrium PKS genes
WO1998055625A1 (en) 1997-06-04 1998-12-10 Calgene, Llc Production of polyunsaturated fatty acids by expression of polyketide-like synthesis genes in plants
US6489542B1 (en) * 1998-11-04 2002-12-03 Monsanto Technology Llc Methods for transforming plants to express Cry2Ab δ-endotoxins targeted to the plastids
US7247461B2 (en) 1999-01-14 2007-07-24 Martek Biosciences Corporation Nucleic acid molecule encoding ORFA of a PUFA polyketide synthase system and uses thereof
US7217856B2 (en) 1999-01-14 2007-05-15 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US7211418B2 (en) 1999-01-14 2007-05-01 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US20070244192A1 (en) * 1999-01-14 2007-10-18 Martek Biosciences Corporation Plant seed oils containing polyunsaturated fatty acids
US8003772B2 (en) * 1999-01-14 2011-08-23 Martek Biosciences Corporation Chimeric PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
JP3285843B2 (ja) * 1999-06-30 2002-05-27 兼松食品株式会社 風味を向上させた魚肉食品、並びにその製造方法
US6784342B1 (en) 1999-08-04 2004-08-31 The University Of British Columbia Regulation of embryonic transcription in plants
EP1136560B1 (en) 1999-09-30 2008-11-19 Japan Tobacco Inc. Vectors for transforming plants
RU2311457C2 (ru) * 2000-02-09 2007-11-27 Басф Акциенгезельшафт Новый ген элонгазы и способ получения полиненасыщенных кислот жирного ряда
DK1254238T3 (da) 2000-02-09 2009-11-30 Basf Se Nyt elongasegen og fremgangsmåde til fremstilling af flerumættede fedtsyrer
AU2001274402A1 (en) 2000-05-24 2001-12-03 The University Of British Columbia Gene regulatory region that promotes early seed-specific transcription
AU2001274408A1 (en) * 2000-05-24 2001-12-03 The University Of British Columbia Nucleic acid encoding a plant very long chain fatty acid biosynthetic enzyme
GB0012597D0 (en) * 2000-05-25 2000-07-12 Astrazeneca Ab Formulation
DE10208812A1 (de) 2002-03-01 2003-09-11 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren
US7405344B2 (en) * 2002-12-19 2008-07-29 Monsanto Technology Llc Elevation of oil levels in Brassica plants
US20040172682A1 (en) 2003-02-12 2004-09-02 Kinney Anthony J. Production of very long chain polyunsaturated fatty acids in oilseed plants
BRPI0412931A (pt) 2003-07-25 2006-09-26 Euro Celtique Sa tratamento da supressão de dependência
CA2559360A1 (en) 2004-02-27 2005-09-09 Basf Plant Science Gmbh Method for producing c18, c20 and c22 polyunsaturated fatty acids in transgenic plants
CN1930277B (zh) 2004-02-27 2011-02-02 巴斯福植物科学有限公司 在转基因植物中产生多不饱和脂肪酸的方法
WO2006135866A2 (en) 2005-06-10 2006-12-21 Martek Biosciences Corporation Pufa polyketide synthase systems and uses thereof
JP2009500612A (ja) 2005-07-01 2009-01-08 ハネウェル・インターナショナル・インコーポレーテッド 流量測定分析器
US7868228B2 (en) 2006-01-31 2011-01-11 Monsanto Technology Llc Phosphopantetheinyl transferases from bacteria
AU2007226511A1 (en) * 2006-03-15 2007-09-20 Dsm Ip Assets B.V. Plant seed oils containing polyunsaturated fatty acids
CN101466270A (zh) * 2006-04-11 2009-06-24 马泰克生物科学公司 包含长链多不饱和脂肪酸的食品及其制备方法
CN101528067A (zh) * 2006-08-29 2009-09-09 马泰克生物科学公司 二十二碳五烯酸（n-6）油在婴儿配方中的用途
NZ578166A (en) * 2007-01-03 2012-04-27 Monsanto Technology Llc Food compositions incorporating stearidonic acid
CN101889090B (zh) * 2007-10-05 2018-01-23 陶氏益农公司 用于将分子物质转移入植物细胞中的方法
EP2234474B1 (en) 2007-12-21 2016-10-26 National Research Council of Canada Diacylglycerol acyltransferase 2 genes and proteins encoded thereby from algae
JP2011519552A (ja) 2008-04-25 2011-07-14 ビーエーエスエフ プラント サイエンス ゲーエムベーハー 植物種子油
WO2010103402A1 (en) * 2009-03-09 2010-09-16 Pronova Biopharma Norge As Compositions comprising a fatty acid oil mixture comprising epa and dha in free acid form and a surfactant, and methods and uses thereof
TW201144442A (en) * 2010-05-17 2011-12-16 Dow Agrosciences Llc Production of DHA and other LC-PUFAs in plants
TW201307553A (zh) 2011-07-26 2013-02-16 Dow Agrosciences Llc 在植物中生產二十二碳六烯酸（ｄｈａ）及其他長鏈多元不飽和脂肪酸（ｌｃ－ｐｕｆａ）之技術
WO2016002642A1 (ja) 2014-07-04 2016-01-07 日立造船株式会社 静電スクリーン印刷装置
JP6931789B2 (ja) 2018-08-02 2021-09-08 株式会社三洋物産 遊技機

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101573451A (zh) * 2006-03-15 2009-11-04 马泰克生物科学公司 利用pufa聚酮化合物合成酶系统在异源的生物体中产生多不饱和脂肪酸的方法

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JP2019068806A (ja) 2019-05-09
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