CN101809160B - 河豚毒素的生物合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及河豚毒素的生物合成方法，包括获取具有一种或多种弧菌的培养，如通过种菌培养；将弧菌培养和产生TTX有机体的组织提取物加入发酵器中的培养基中；和从所述发酵器分离纯化TTX。本发明的方法在约3-5天的时间得到大约0.5mg/L的TTX产出，TTX的纯度至少为90％。

Description

河豚毒素的生物合成方法

技术领域

本发明涉及河豚毒素的生物合成方法。

背景技术

河豚毒素(Tetrodotoxin，简称TTX)最早从河豚的卵巢中分离得到。从那时起，对它的商业化提取和纯化已有多年的历史。然而，TTX的提取率非常地低，大约100Kg的卵巢得到1g的TTX，从而使TTX成为价格最昂贵的天然神经毒素之一。而且，由于过量生产导致河豚的种类不断减少，整个产业遭遇了减退。

鉴于上述问题，众多研究者转而提出新的合成方法。TTX的合成对有机化学家来说却是一种挑战(Huang，“Synthetic Approaches to Tetrodotoxin”)。例如，一些方法包括用于在C8a位置引进胍态氮的立体定向法。其它的方法关注的是新颖的分子的重排。但是由于持续的复杂性，直接从河豚的卵巢中提取河豚毒素更为合算。

寻找更经济的TTX生产途径的驱动力在于，TTX具有作为新的可能对帮助癌症患者有用的药物的潜力和作为用于吸食海洛因成瘾者的戒瘾剂的潜力。据估计，2百万的癌症患者一个月的疗程就需要1200g的TTX，而2百万吸毒者每十天就需要400g的TTX。

本发明的目的即在于克服现有技术中的不足和问题。

发明内容

本发明提出了TTX的生物合成方法，以得到高产出、高纯度的TTX。

本发明还提出了TTX的分离和纯化方法。

通过下面的说明、权利要求和附图，本发明中的装置和方法的各个特征、方面及优点将更容易理解。

附图说明

以下将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，其中：

图1是根据本发明的TTX的生物合成方法流程图。

图2是根据本发明的分离和纯化TTX的方法流程图。

图3是本发明的生物合成TTX的方法的结果与现有技术生物合成TTX的方法的结果图。

具体实施方式

以下的某些例示性的实施例仅作举例之用，并意欲限制本发明、其申请或者应用。在整份说明书中，“产生TTX有机体”是指这样的有机体，其器官中通过自产等内源途径或是食物链、共生关系等外生代谢作用或其结合产生的结构式为C₁₁H₁₇O₈N₃的河豚毒素化合物及其类似物，包括但不限于去氢河豚毒素(anhydrotetrodotoxin)、河豚毒素(tetrodotoxin)、甲氧基河豚毒素(methoxytetrodotoxin)、乙氧基河豚毒素(ethoxytetrodotoxin)、脱氧河豚毒素(deoxytetrodotoxin)和河豚毒酸(tetrodonic acid)。“生长因子”是指存在于有机体的组织中的类似蛋白质的物质，它能够稳定有机体组织中河豚毒素的结构，以至于其结构不会分解或是发生类似的改变。

转到图1-3：

图1是根据本发明的实施例的TTX的生物合成方法，该方法包括以下的步骤：获取一种或多种弧菌(Vibrio)培养-101、向发酵器中移入弧菌培养和组织提取物-103、从培养基上分离合成的TTX-105以及纯化得到的TTX-107。

获取一种或多种弧菌培养的101步骤包括收集生长有弧菌的培养基。收集可包括获取正确保存的培养或从种菌得到的培养。培养中的一种或多种弧菌可选自以下的组：黑美人弧菌(Vibrio nigripulchritudo)、地中海弧菌(Vibriomediterranei)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、杀鲑弧菌(Vibrio salmonicida)、塔氏弧菌(Vibrio tubiashii)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、坎氏弧菌(Vibrio campbellii)、需钠弧菌(Vibrio natriegens)、沙蚕弧菌(Vibrio nereis)、鲨鱼弧菌(Vibrio carchariae)、河流弧菌(Vibriofluvialis)、费氏弧菌(Vibrio fischeri)、创伤弧菌(Vib行o vulnificus)、美丽弧菌(Vibrio splendidus)、东方弧菌(Vibrio orientalis)、适应弧菌(Vibrioaestuarianus)、海弧菌(Vibrio pelagius)、钛云母弧菌(Vibrio wodanis)、弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)、解蛋白弧菌(Vibrio proteolyticus)、鱼肠道弧菌(Vibrioichthyoenteri)、杀扇贝弧菌(Vibrio pectenicida)、火神弧菌(Vibrio logei)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)、米氏弧菌(Vibrio mytili)、留氏弧菌(Vibriorumoiensis)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、产气弧菌(Vibrio gazogenes)、鲍弧菌(Vibrio halioticoli)、霍氏弧菌(Vibrio hollisae)、奥氏弧菌(Vibrio ordalii)、梅氏弧菌(Vibrio metschnkiovii)和胆弧菌(Vibrio choleme)。

在一个优选实施例中，弧菌为溶藻弧菌、鳗弧菌、胆弧菌、副溶血弧菌和河流弧菌中的一种或多种。

弧菌用于培养的样品可从产生TTX有机体的器官中获取，所述产生TTX有机体包括扁形动物类(flatworms)、纽形动物类(ribbon worms)、腹生动物类(gastropods)、蓝圈八爪鱼类(blue-ringed octopuses)、海星类(starfish)、海胆类(sea urchins)、扇蟹类(xanthid crabs)、马蹄蟹类(horsehoe crab)、虾虎鱼类(gobies)、蛙类(frogs)、蝾螈类(newts)和河豚类。在一个实施例中，弧菌选自以下的河豚类：四齿鲀科(Tetraodontidae)、二齿鲀科(Diodontidae)和三齿鲀科(Triodontidae)，如腹纹叉鼻鲀(Arothron hispidis)、星斑叉鼻鲀(Arothron stellatus)、凹鼻鲀(Chelonodon patocoa)、铅点东方鲀(Takifugualboplumbeus)、星点东方鲀(Takifugu niphobles)、横纹东方鲀(Takifuguoblongus)、弓斑东方鲀(Takifugu ocellatus)、黄鳍东方鲀(Takifugu xanthopterus)和六斑刺鲀(Diodon holocanthus)。在一个实施例中，弧菌，尤其是溶藻弧菌以下的河豚类：凹鼻鲀、铅点东方鲀和星点东方鲀。用于提供弧菌的器官，如组织可以是肠、肝、卵巢、胃和皮肤中的一种或几种的组合。在一个实施例中，弧菌从星点东方鲀的卵巢和/或凹鼻鲀的皮肤和/或铅点东方鲀的肠中获取。

在从有机体组织获取弧菌的过程中，所述的组织首先从有机体上切下，优选的是无菌切割。切下的组织加入到包括培养基的生物反应器中，例如摇瓶、通气搅拌(aeration-agitation)生物反应器、渗透推进生物反应器(percolatedimpellor bioreactor)、通风管气升式生物反应器(draught tube air-lift bioreactor)、通风管涡轮生物反应器(draft tube with lasplan turbine bioreactor)、气升式循环生物反应器(air-lift loop bioreactor)、转筒式生物反应器(rotating drumbioreactor)和旋转过滤反应器(spin filter bioreactor)。在一个实施例中，生物反应器采用摇瓶。生物反应器的大小可介于大约250ml到1L之间。生物反应器中应包含有介质，如无菌海水、海水、基于无菌海水或海水的介质和不含血清的介质。在一个实施例中，在加入所述组织(批处理)前，生物反应器中包含有无菌海水。介质中的所述组织可以大约75rpm到250rpm的速度振荡5-25分钟。

振荡后，50ml到500ml左右的生物反应器中的混合物提取到包含一定体积介质的第二生物反应器中，所述体积从25ml到100ml不等，所述介质可与第一反应器中相同，也可不同。在一个实施例中，第二生物反应器中的介质与第一反应器中所用相同。第二生物反应器中组织的最终含量应该在大约0.40g/ml到0.10g/ml之间。

取出第二反应器混合物体积的大约10％作为提取物并加到合适的基质上。所述提取物的体积可从2.5ml到60ml不等。所述基质可由玻璃、塑料、陶瓷或合成树脂制成，并包含有培养基，如琼脂。所述基质可包括附着的反应器，如滚瓶、塑料袋、多盘、多碟、多板、螺旋膜、玻璃珠、增殖物和类似物。微载体培养法，如串珠法或玻璃珠法也可以利用。微载体可由葡聚糖、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯纤维素、明胶和玻璃制成。所述微载体可视情况在外面包覆有胶原或带负电的二甲基氨基乙基、二乙基氨基丙基和三甲基-z-羟氨丙基。

在所述基质上菌落形成后，所述菌落可视情况纯化，纯化方法包括聚集悬浮的菌体、提取、吸附离子交换和类似操作。

得到的弧菌纯培养然后加到种菌培养基上，作为后续步骤中的种菌培养。所述弧菌纯培养的转移可通过安装在生物反应器上的软管实现。在一个实施例中，所述弧菌纯培养可先由安装在种菌发酵器上的无菌金属容器来转移。种菌培养中的种菌培养基可包括大量的糖、碳、氮、水、无机物、盐、多元醇和其它为生长所必需的元素。天然成分，如大豆蛋白胨、燕麦片和类似物也可以利用。在一个实施例中，培养基包括大约0.25-1g的大豆蛋白胨、0.25-1g的酵母提取物、0.25-1g的葡萄糖、蒸馏水和pH调节剂，其pH位于7.0到7.7之间。

种菌培养可在20-30℃之间生长24-48小时，所述种菌培养基的体积可从150mL到1000mL不等。

包括种菌培养在种菌培养基上的生长在内的后续步骤的数量取决于最终阶段得到的TTX的纯度。在各级步骤中，细菌培养液的体积可以有十倍的增长。然而，在一些实施例中，细菌培养液的体积可以大于发酵器体积的十分之一。

然后，种菌培养可转移至发酵器中。在一个实施例中，所述转移通过气压实现。所述发酵器中的培养基可包括大豆蛋白、酵母提取物、糖、蒸馏水等。在一个实施例中，所述培养基中大豆蛋白大约0.25-0.10g、酵母提取物大约0.25-0.10g和蔗糖大约2.5-10g，余下用蒸馏水补足，并用缓冲液调，如2M氨水或2M盐酸调节pH到大约7.1-7.7。发酵器内部的温度控制在28-35℃之间，所述培养基的提供伴随无菌空气和搅拌。

生长组织提取物与种菌培养同时加到所述发酵器中的培养基上。同时不是指两者在同一个精确的时刻加入，而是说两者同时存在于所述发酵器中，特别是在所述发酵器中的培养基上。生长组织提取物和种菌培养的加入顺序没有要求，可以在同一时间段中加入到所述发酵器中的培养基上，也可以是一个比另一个加入稍晚。生长组织提取物和种菌培养在所述发酵器中的培养基上存留的时间长短的改变也属于本发明的范围，不是由此的派生。按照下面将要提到的，生长组织提取物之所以这样称谓是因为它包含有生长因子的成分。

生长组织提取物可从获取培养101中使用的有机体得到。在一个实施例中，生长组织提取物可从不同的有机体或物种中取得，前提是这些有机体提供生长因子，而且其组织中有TTX的合成，生长组织提取物可以从有机体的皮肤、肠、肝或卵巢得到。在一个实施例中，生长组织提取物是得自肝或卵巢，生长组织提取物切下后，用盐溶液均质化，过滤除菌。生长组织提取物在使用前可储存于-80℃到-60℃，生长组织提取物在发酵器培养基中的浓度在大约0.5-1.5g/L之间。

通过生长组织提取物与种菌培养加入到发酵器中的培养基上，与不加生长组织提取物相比，认为TTX的增长是协同性的。这种协同性增长很可能是生长组织提取物中的生长因子导致的。

发酵可至少持续60小时，或者直到有溶菌情形发生。从发酵器培养基分离TTX 105，如后面将要提到的，多种步骤可组使用，如离心、过滤、溶剂萃取、离子交换、吸附、洗脱、pH调节、加热、蒸发、干燥和其它认为是对获得高纯度、高产出TTX所必需的步骤。在一个实施例中，在最多3-5天的时间中获得了至少0.5mg/L、纯度至少为90％的TTX。在另外一个实施例中，在最多5-7天的时间中获得了1mg/L、纯度超过95％的TTX。

图2是从依据本发明的培养分离和纯化TTX方法的一个实施例。

在所述分离和纯化TTX的方法中，发酵器中培养基首先调节pH201至3.0到大约4.0。在一个实施例中，这是通过酸如盐酸实现的，并且所述培养基加热到90-100℃大约8-10分钟，然后离心203，如试管离心、碟式离心、过滤离心、立式锥篮离心等。所述培养基在1-10℃下以2000-9000rpm的速度离心10-20分钟。保留205上层清液，并调节pH到大约6。

接下来，蒸发207所述上层清液，蒸发可通过依次安装的一个或多个蒸发器组成的蒸发系统实现，蒸发器可从下列选择：强制循环(forced circulation)、浸没管式强制循环(submerged-tube forced circulation)、奥斯陆循环(oslo-typecirculation)、短型立管(short-type vertical)、推进器加热管(propeller calandria)、立式长管(long-tube vertical)、再循环立式长管(recirculating long-tube vertical)、降膜(falling film)、水平管(horizontal tube)等。所述上层清液可在大约40-55℃间蒸发，优选在减压下；所述上层清液蒸发至其原始体积的2-8％，得到TTX产物。

吸附介质如活性炭，与所述TTX产物混合209。所述吸附介质的体积优选与TTX产物的体积相同。

接着，对所述吸附介质进行洗脱211。在一个优选实施例中，吸附介质洗脱至少2次，更优选的是3次。洗脱可利用1∶20的醋酸/乙醇溶液。

对得到的洗脱液进行蒸发213。在一个实施例中，蒸发在减压、40-50℃下进行，蒸发直至洗脱液达到其原始体积的0.5-2％。在一个替代实施例中，在蒸发213前，洗脱液先调pH至大约6。

蒸发后，得到的TTX提取物上离子交换柱215.在一个优选实施例中，柱子中充满了弱阳离子交换树脂珠。所述TTX提取物接着用弱酸如0.5％的醋酸洗脱217，然后调pH到大约6，在40-50℃下减压蒸发219至其原始体积的0.5-2％。

所述提取物可进行干燥221，如利用冷冻干燥、喷雾干燥、真空干燥、流化干燥等，然后溶于水如蒸馏水、DDW等。得到的溶液上另外的柱子223，柱子优选含有弱阳离子交换树脂珠。对所述柱子洗脱225，得到洗脱液，调pH到大约6，接着在40-50℃下蒸发227至其原始体积的0.5-2％。蒸发后得到的TTX提取物可进行干燥，如冷冻干燥、喷雾干燥、真空干燥、流化干燥等。

如前所述，得到的TTX纯度至少为90％。在一个优选实施例中，纯度大于95％。

为满足实际放大操作需要，在不脱离本申请的范围和原理的前提下可对上述方法作适当调整。放大技术对本领域及本领域中的技术人员是熟知的。

实施例

几株弧菌从铅点东方鲀的肠中观察分离得到。弧菌菌株保存于4℃的ORI琼脂板上，在接种到种菌培养基前，先在新鲜的平板上进行亚培养。

所有培养基均通过高压蒸汽灭菌法在121℃下灭菌20分钟。种菌培养基(每1000mL)的制备方法如下：

植物蛋白胨         1.0g

酵母提取物         1.0g

葡萄糖             1.0g

蒸馏水             至1000ml

用1M的NaOH调pH到   7.5

每种弧菌在琼脂板上的单菌落均用接种环无菌条件下转移到500ml培养瓶的250ml种菌培养基中。接种的菌培养25℃下在摇床上以1000rpm的速度培养24-48小时。

铅点东方鲀组织提取物按如下制备并用0.2μm膜过滤除菌：

卵巢(铅点东方鲀)    100g

磷酸盐缓冲液        100ml

用2M的盐酸调pH到    7.5

发酵培养基(每1L)按如下制备：

植物蛋白胨              1.0g

酵母提取物              1.0g

蔗糖                    10g

蒸馏水                  至1000ml

用2M氨水或2M盐酸调pH    7.5

200ml的种菌培养和10g的铅点东方鲀组织提取物无菌条件下加入到12L发酵器的10L发酵培养基中，发酵器中充满无菌空气并不断搅拌，30℃、pH7.5维持3天的时间。

整个发酵过程经过至少60小时，当有溶菌情形发生时完成。从发酵器中收集发酵培养基前，利用2.5M盐酸将发酵培养基的pH调至3.5，并加热至95℃持续10分钟。发酵培养基4℃下8000rpm离心15分钟除去细胞，保留上层清液用2M氨水调pH至6，在45℃下减压蒸发至原始体积的5％，并与等量(v/w)活性炭混合。将吸附在活性炭上的TTX用1∶20的醋酸/乙醇溶液洗脱3次，洗脱液用2M氨水调pH至6，然后45℃下减压蒸发至原始体积的1％。将TTX提取物上弱阳离子交换树脂(

70)柱(3×50cm)，并用0.5％醋酸洗脱，同时利用HPLC分析或鼠活体检定法监控。洗脱得到的TTX提取物用2M氨水调pH至6，在45℃下减压蒸发至原始体积的1％，然后冷冻干燥并溶于蒸馏水。所得液体上弱阳离子交换树脂(

70)柱(1×80cm)，利用0-0.2％醋酸(线性梯度)洗脱TTX，通过HPLC分析或鼠活检定法监控。将得到的TTX收集到一起用2M氨水调pH到6，然后45℃下减压蒸发至原始体积的1％，冷冻干燥得到纯度95％以上的TTX。

图3比较了依据本发明的TTX的生产301与现有技术的TTX的生产303及在培养瓶中简单培养弧菌的TTX的生产305。如图3所示，通过本发明的TTX的生产301非常快，在3天内产出了0.5mg/L的TTX，而现有技术303在6天产出了0.4mg/L的TTX，培养瓶培养305在超过10天的时间里产出了不到0.1mg/L的TTX。

本发明的上述系统和装置可通过设备及控制系统来控制和监控。所述设备及控制系统要包括在线传感器，如带温度计的探针、温度计、pH指示电极、Ag和Pb探针、导电探针、电容探针，在线仪器，包括转速计、功率表、质量流量计、转子式测速仪、变形测量器、测压元件、弹簧膜、充油膜、电磁流量计、涡漩仪及带顺磁分析仪、质谱仪和红外线分析仪的气体分析仪。所述设备和控制系统还可包括用于测量压缩细胞体积、干重、光密度、显微观察、库尔特计数、平板计数的离线仪器和一个或多个具有处理器、临时和永久存储、用于管理生产和发酵器的算法和包括显示器、键盘、鼠标在内的用户界面装置等的控制器，所述控制器的例子包括台式电脑、PDA、笔记本电脑和控制面板。

参照结合附图对本发明的系统和实施例所作的说明，应当理解，本发明的系统并不限于具体的实施例。本领域的普通技术人员在不脱离未决权利要求中限定的范围及精神下可以作出各种调节和变动。

为了更好地理解未决的权利要求，应当理解：

a)术语“包括”并不排除未列在给出的权利要求中其它要素或操作的存在；

b)位于要素前的“一”并不排除此要素的复数性存在；

c)权利要求中的任何附图标记并不限制它们的范围；

d)除特别声明外，任何公开的装置或其部分可组合在一起或进一步地分成几部分；

e)除了特别的指示外，特定操作或步骤不需要特定的顺序。

Claims (8)

1.一种河豚毒素（TTX）的生物合成方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

从含有一种或多种弧菌的种菌培养基获取培养，所述一种或多种弧菌为分离自铅点东方鲀的肠中的弧菌；

同时把所述培养和从产生TTX有机体切下的生长组织提取物加入到含有培养基的发酵器中；所述从产生TTX有机体切下的生长组织提取物来自于铅点东方鲀的卵巢；以及

从所述发酵器培养基分离纯化TTX；

从所述发酵器培养基分离纯化TTX包括以下步骤：

调节pH并加热所述发酵器培养基；

离心所述培养基；

蒸发从所述离心后培养基得到的上层清液；

混合吸附介质与得到的TTX提取物；

洗脱所述吸附介质；

蒸发从所述洗脱吸附介质中得到的洗脱液；

将得到的TTX提到物上离子交换柱；

干燥所述得到的TTX提取物；

将得到的TTX提取物溶液上第二离子交换柱；

洗脱所述第二离子交换柱；

蒸发上一步所得的洗脱液；以及

干燥所述的洗脱液。

2.根据权利要求1所述的河豚毒素的生物合成方法，其特征在于，在获取所述培养前还包括：

从产生TTX有机体切下组织提取物；

加入所述组织提取物到生物反应器；

提取生物反应器混合物到第二生物反应器；

提取第二生物反应器混合物到基质；以及

放置从所述基质得到的培养于培养基中形成种菌培养。

3.根据权利要求2所述的河豚毒素的生物合成方法，其特征在于，所述生物反应器为摇瓶。

4.根据权利要求2所述的河豚毒素的生物合成方法，其特征在于，所述种菌培养中的所述培养基包括大豆蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖和蒸馏水。

5.根据权利要求1所述的河豚毒素的生物合成方法，其特征在于，所述发酵器培养基包括大豆蛋白胨、酵母提取物、糖、蒸馏水和缓冲液。

6.根据权利要求5所述的河豚毒素的生物合成方法，其特征在于，所述发酵器培养基暴露于无菌空气中并不断搅拌。

7.根据权利要求1所述的河豚毒素的生物合成方法，其特征在于，所述生长组织提取物包含一种或多种生长因子。

8.根据权利要求1所述的河豚毒素的生物合成方法，其特征在于，所述方法最多3-5天得到至少0.5mg/L、纯度90%以上的TTX。

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