CN111235030A - 一种两级混合培养生产病毒的系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种两级混合培养生产病毒的系统，其中生产细胞和生产病毒分为两级，第一级设备生产细胞后注入第二级设备用于生产病毒。本系统可以根据细胞和病毒的特点灵活的选择设备类型、生产体积、培养方式、培养时间、营养成分和生产工艺，可以降低生产成本，连续大量生产病毒，提高病毒产率，保证生产病毒疫苗的质量。本方法应用广泛，可用于生产人用疫苗病毒、兽用疫苗病毒、溶瘤病毒、细胞治疗相关病毒、基因治疗相关病毒等。

Description

一种两级混合培养生产病毒的系统
技术领域
本发明属于病毒生产技术领域，更具体的涉及一种连续培养生产病毒的系统。
背景技术
在过去的半个世纪中，生物制药行业一直是以批量生产方式生产。然而近年来，美国FDA(food and drug administration)力推连续生产，尤其是在2019年2月26日发布《连续制造的质量考虑指南》草案。连续生产(continuous manufacturing,CM)是指几天甚至长达几个月连续运行不间断生产，相对于批量生产是一种新方式，可以降低制药成本，提高制药效率，缩短制药时间，提高药品产量，减少占地面积。同时可以根据药品的需要量灵活的调整产量，降低库存。因而连续生产是未来制药业趋势。
对于病毒疫苗而言，现有的技术还不能满足完全连续生产，因为一些病毒(如口蹄疫病毒)感染细胞后发生病变甚至死亡；一些病毒(如脊髓灰质炎病毒)长时间培养繁殖会发生基因突变。CN1807599A中公开一种连续生产病毒的方法，其是采用细胞培养液不断流入一个反应器以及病毒上清液不断流出而实现病毒的连续增殖，其中的培养方式中，在接毒反应器中实现细胞的增殖和病毒的繁殖。然而细胞一旦发生病变死亡则无法连续生产从而导致生产中断，而且长时间培养发生病毒基因突变也会导致疫苗的不合格。另外，该发明所述的细胞培养和病毒生产实际上是一级生产，病毒的滴度和质量实时受到注入细胞的密度、细胞死亡速率、病毒感染效率和传播速度等的影响。因而在实际生产时如果用该方法生产病毒则质量会不可控，而且批间差异大。CN102228686A中公开了一种大规模生产狂犬疫苗的方法，其中利用大规模悬浮培养细胞并接种狂犬病毒，通过流加、灌流技术使狂犬病毒大量繁殖，但是该专利中涉及的细胞培养方式为批培养，反应器阶数多，细胞培养时间长，细胞密度低，生产效率很低。
可以看出，现有技术中病毒疫苗连续大规模生产存在上述的结果不可靠的技术障碍，同时还需要采用大型的接毒反应器，存在生产成本高，效率低、不能连续生产以及生产的病毒疫苗质量不能保证等问题。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明提出一种连续生产病毒疫苗的系统，该系统是一种两级混合培养生产病毒的系统。
本发明的两级混合培养生产病毒的系统包括两级设备，第一级设备用于生产细胞，第二级设备用于生产病毒。两级设备有效衔接实现了既能采用连续生产方式高效生产细胞、降低成本，又能连续生产病毒，保证连续生产的病毒的质量稳定，从而实现疫苗生产成本降低，生产效率提高，疫苗产量和质量提高，占地面积减少等优势。
进一步，本发明提供一种两级混合培养生产病毒的系统，其包括第一级设备用于生产细胞，第二级设备用于生产病毒；第一级设备包括细胞培养反应器，第二级设备包括接毒反应器。第一级设备的细胞培养器可以为一个或多个，第二级设备中的接毒反应器也可以分为一个或多个的接毒反应器。当细胞培养反应器中的细胞密度或者数量达到需求后，将其中的细胞按需求分注入第二级设备中的接毒反应器，进行病毒接种，然后进行继续培养。细胞培养器生产的细胞分别单独注入或汇合或部分汇合注入到第二级设备的相应接毒反应器中。
更进一步：
第一级设备的细胞培养器选择是机械搅拌式反应器，膜生物反应器，鼓泡塔生物反应器，气升式生物反应器，动物生物反应器，植物生物反应器，纸片式反应器，潮汐式反应器，搅拌瓶，细胞工厂，转瓶，摇瓶等培养器的一种或多种，设备培养体积为0.1升-20000升。
第二级设备选择为机械搅拌式反应器，膜生物反应器，鼓泡塔生物反应器，气升式生物反应器，动物生物反应器，植物生物反应器，纸片式反应器，潮汐式反应器，搅拌瓶，细胞工厂，转瓶，摇瓶等培养器的一种或多种，设备培养体积为0.1升-20000升。
更进一步：
第一级设备的细胞培养器生产细胞的方式为贴壁培养，悬浮培养，载体培养，灌流培养，半灌流培养，连续培养，半连续培养,或几种方式结合培养。
第二级设备的接毒反应器生产病毒的方式为批培养，流加培养，灌流培养，半灌流培养，连续培养，半连续培养,或几种方式结合培养。
更进一步：
第一级设备的细胞培养器生产细胞的种类为哺乳动物细胞、体细胞、生殖细胞、原代细胞、二倍体细胞、传代细胞、干细胞、成纤维细胞、昆虫细胞或癌细胞等。
第二级设备的接毒反应器生产病毒的种类为感染细胞生产病毒、类病毒、假病毒、病毒样颗粒或包装病毒或拯救病毒，转染细胞生产病毒、类病毒、假病毒或包装病毒或拯救病毒等。进一步优选为流感病毒、狂犬病病毒、口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸道病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、肠道病毒、轮状病毒、新城疫病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘病毒、杆状病毒、冠状病毒、病毒载体或基因编辑的病毒等。
更进一步：
第二级设备的接毒反应器不同，其可以分别接种不同种类的病毒。
另一方面，本发明提供一种两级混合培养生产病毒的方法，该方法通过两级混合培养生产病毒的设备实现，所述两级混合培养生产病毒的设备包括两级设备，第一级设备用于生产细胞，第二级设备用于生产病毒。进一步，第一级设备包括细胞培养反应器，第二级设备包括接毒反应器。第一级设备的细胞培养器可以为一个或多个，第二级设备中的接毒反应器也可以分为一个或多个的接毒反应器。当细胞培养反应器中的细胞密度或者数量达到需求后，将其中的细胞按需求注入第二级设备中的接毒反应器，进行病毒接种，然后进行继续培养。进一步，细胞培养器生产的细胞分别单独注入或汇合或部分汇合注入到第二级设备的相应接毒反应器中。
更进一步：
第一级设备的细胞培养器选择通过机械搅拌式，膜生物反应式，鼓泡塔生物反应式，气升式，搅拌瓶式，转瓶式，摇瓶式等培养方式的一种或多种，细胞培养器培养体积为0.1升-20000升。
第二级设备的接毒反应器选择通过机械搅拌式，膜生物反应式，鼓泡塔生物反应式，气升式，搅拌瓶式，转瓶式，摇瓶式等培养方式的一种或多种，接毒反应器的培养体积为0.1升-20000升。
更进一步：
第一级设备的细胞培养器生产细胞的方式为贴壁培养，悬浮培养，载体培养，灌流培养，半灌流培养，连续培养，半连续培养,或几种方式结合培养。
第二级设备的接毒反应器生产病毒的方式为批培养，流加培养，灌流培养，半灌流培养，连续培养，半连续培养,或几种方式结合培养。
更进一步：
第一级设备的细胞培养器生产细胞的种类为哺乳动物细胞、体细胞、生殖细胞、原代细胞、二倍体细胞、传代细胞、干细胞、成纤维细胞、昆虫细胞或癌细胞等。
第二级设备的接毒反应器生产病毒的种类为感染细胞生产病毒、类病毒、假病毒、病毒样颗粒或包装病毒或拯救病毒，转染细胞生产病毒、类病毒、假病毒或包装病毒或拯救病毒等。进一步优选为流感病毒、狂犬病病毒、口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸道病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、肠道病毒、轮状病毒、新城疫病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘病毒、杆状病毒、冠状病毒、病毒载体或基因编辑的病毒等。
更进一步：
第二级设备的接毒反应器不同，其可以分别接种不同种类的病毒。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明的两级混合培养生产病毒的系统可以基于原有车间、设备进行升级改进，成本较低。设备灵活，减少占地面积，方便根据销量和库存灵活调整产量。
本发明的两级混合培养生产病毒的系统可以减少细胞扩增次数，增加细胞密度，降低细胞培养生产成本，缩短生产时间。同时可以及时收获和储存生产的病毒从而提高病毒滴度，克服很多病毒不能连续生产的问题，从而实现降低疫苗生产成本，提高生产效率。
在本发明的两级混合培养生产病毒的系统中，细胞的增殖过程和接毒培养过程是独立的，保证了细胞和病毒的接触时间较短，可以避免病毒的变异，从而在连续生产病毒疫苗的基础上，提高了病毒疫苗的生产效率，也保证了病毒疫苗的质量稳定性。
附图说明
图1是本发明的结构示意图。其中：1为第一级设备的细胞培养器，2为培养基补料罐，3、4、5、6为第二级设备的接毒反应器。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，并结合附图对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
附图1是本发明的一种两级混合培养生产病毒的系统，其包括第一级设备的细胞培养器1用于生产细胞，第二级设备的接毒反应器3、4、5、6用于生产病毒。
实施例1分级培养细胞质量评价
用于细胞培养器1的B1培养基：为Gibco培养基目录产品(CD BHK-21ProductionMedium)。
用于接毒反应器3、4、5、6的B2培养基：为Gibco培养基目录产品(CD BHK-21Production Medium)添加0.1％牛血清。
细胞培养器1中采用半灌流培养进行细胞培养：在一个培养体积为30ml的摇瓶中注入B1培养基，接种悬浮BHK-21细胞进行培养。在培养过程中每24h通过离心弃掉15mL培养基的上清液，再加入新鲜的15mL B1培养基继续培养。
当细胞密度达到33-40×106细胞/ml时，将细胞培养器的细胞注入3、4、5、6接毒反应器。
在注入了细胞的接毒反应器3、4、5、6中再次注入B2培养基，继续进行细胞培养，48小时后检测细胞活力和浓度。结果如下表：
表1
Figure BDA0002405632930000051
由上表可以看出，利用B1和B2细胞培养基在批培养的情况下，按照常规方法接种0.5×106细胞/ml，在培养48h后细胞密度为4.63-4.74×106细胞/ml,细胞活力为91.7-92.9％，符合现行生产的接毒所需的细胞密度和活力。
也就是说，第一级设备生产出来的高密度细胞以常规接种方法注入第二级设备进行细胞培养，能够达到接毒所需的密度和活力。从而可以达到缩短生产时间、提高疫苗生产效率、保证了病毒疫苗的质量的技术效果。
上述的两级混合培养生产病毒的系统中，第一级设备的细胞培养器可以为一个或多个，第一级设备生产的细胞可以汇合或部分汇合注入到第二级设备，也可以分散注入到第二级设备。如此细胞源源不断的供给到第二级设备的接毒反应器，可以保证连续的病毒生产。同时细胞的增殖过程和接毒过程是独立的，保证了细胞和病毒的接触时间较短，可以避免病毒的变异，从而在连续生产病毒疫苗的基础上，提高了病毒疫苗的生产效率，也保证了病毒疫苗的质量。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范畴。

Claims (10)

1.一种两级混合培养生产病毒的系统，其包括第一级设备用于生产细胞，第二级设备用于生产病毒；第一级设备包括细胞培养反应器，第二级设备为接毒反应器，当细胞培养反应器中的细胞密度或者数量达到设定条件后，将其中的细胞分配给第二级设备中的一个或多个接毒反应器中，接种病毒，进行培养。
2.根据权利要求1所述的两级混合培养生产病毒的系统，其特征在于，第一级设备的细胞培养器可以为一个或多个，第一级设备生产的细胞能够汇合或部分汇合注入到第二级设备，或能够分散注入到第二级设备。
3.根据权利要求1-2之一所述的两级混合培养生产病毒的系统，其特征在于，第一级设备分为一级或多级的细胞培养反应器；第二级设备分为一级或多级的接毒反应器。
4.根据权利要求1-3之一所述的两级混合培养生产病毒的系统，其特征在于，第二级设备生产的病毒种类是一种或多种。
5.根据权利要求1-4之一所述的两级混合培养生产病毒的系统，其特征在于，第一级设备的细胞培养器是机械搅拌式反应器，膜生物反应器，鼓泡塔生物反应器，气升式生物反应器，动物生物反应器，植物生物反应器，纸片式反应器，潮汐式反应器，搅拌瓶，细胞工厂，转瓶或摇瓶；种类可以为一种或多种；设备培养体积为0.1升-20000升。
6.根据权利要求1-5之一所述的两级混合培养生产病毒的系统，其特征在于，第二级设备为机械搅拌式反应器，膜生物反应器，鼓泡塔生物反应器，气升式生物反应器，动物生物反应器，植物生物反应器，纸片式反应器，潮汐式反应器，搅拌瓶，细胞工厂，转瓶或摇瓶；种类可以为一种或多种；设备培养体积为0.1升-20000升。
7.根据权利要求1-6之一所述的两级混合培养生产病毒的系统，其特征在于，第一级设备的生产细胞的方式为贴壁培养，悬浮培养，载体培养，灌流培养，半灌流培养，连续培养，半连续培养,或几种方式结合培养。
8.根据权利要求1-7之一所述的两级混合培养生产病毒的系统，其特征在于，第二级设备生产病毒的种类为感染细胞生产病毒、类病毒、假病毒、病毒样颗粒或包装病毒或拯救病毒，转染细胞生产病毒、类病毒、假病毒或包装病毒或拯救病毒。
9.一种两级混合培养生产病毒的方法，该方法通过两级混合培养生产病毒的设备实现，所述两级混合培养生产病毒的设备包括两级设备，第一级设备用于生产细胞，第二级设备用于生产病毒,第一级设备包括细胞培养反应器，第二级设备包括接毒反应器,当细胞培养反应器中的细胞密度或者数量达到需求后，将其中的细胞按需求注入第二级设备中的接毒反应器，进行病毒接种，然后进行继续培养。
10.如权利要求9所述的两级混合培养生产病毒的方法，其中第一级设备的细胞培养器可以为一个或多个，第二级设备中的接毒反应器也可以分为一个或多个的接毒反应器，细胞培养器生产的细胞分别单独注入或汇合或部分汇合注入到第二级设备的相应接毒反应器中。
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