KR20160140537A - 고농도 메갈로사이티바이러스 백신의 제조방법 - Google Patents

고농도 메갈로사이티바이러스 백신의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고농도 메갈로사이티바이러스 백신의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 (a) 메갈로사이티바이러스에 감염되는 어류의 초대 자어 배양세포를 수득하는 단계; (b) 상기 자어 배양세포에 메갈로사이티바이러스를 접종한 후, 배양하는 단계; (c) 상기 자어 배양세포에서 메갈로사이티바이러스를 분리하는단계를 포함하는 초대 자어 배양세포를 이용한 메갈로사이티바이러스의 배양방법 및 상기 배양된 메갈로사이티바이러스 및 감염된 어류의 비장 조직에서 수득된 고농도 바이러스 조직마쇄액을 이용한 메갈로사이티바이러스를 이용한 백신의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, in vitro배양이 어려운 메갈로사이티바이러스의 고농도로 배양할 수 있고 또한 감염된 어류 조직의 고농도 바이러스를 백신으로 활용할 수 있어, 현재까지 적용이 불가능했던 돌돔을 포함한 주요 양식어종 모두에서의 메갈로사이티바이러스 감염증의 예방백신을 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 백신제조 방법은 향후 우리나라에 유입가능성이 있는 다른 type의 메갈로사이티바이러스 모두에 대한 예방 백신 대책으로 활용할 수 있다.

Description

고농도 메갈로사이티바이러스 백신의 제조방법{Method for Preparing Megalocytivirus Vaccin at High Concentration}
본 발명은 고농도 메갈로사이티바이러스 백신의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 (a) 메갈로사이티바이러스에 감염되는 어류의 초대 자어 배양세포를 수득하는 단계; (b) 상기 수득된 자어 배양세포에 메갈로사이티바이러스를 접종한 후, 배양하는 단계; 및 (c) 상기 자어 배양세포에서 메갈로사이티바이러스를 분리하는 단계를 포함하는 초대 자어 배양세포를 이용한 메갈로사이티바이러스의 배양방법 및 상기 배양된 메갈로사이티바이러스 및 감염된 어류의 비장 조직에서 수득된 고농도 바이러스 조직마쇄액을 이용한 메갈로사이티바이러스를 이용한 백신의 제조방법에 관한 것이다.
참돔이리도바이러스 감염증 (Red sea bream iridovirus disease, RSIVD)은 1990년 일본 시코쿠 에히메현의 참돔양식장에서 최초로 발병하였으며, 원인체는 이리도바이러스과의 메갈로사이티바이러스 속으로 확인되었다. 이리도바이러스과는 이리도바이러스, 클로르이리도바이러스, 라나바이러스, 림포시스티바이러스 그리고 메갈로사이티바이러스 속으로로 분류된다. 그 중 메갈로사이티바이러스는 200~240 nm의 크기의 정이십면체의 dsDNA 바이러스로 어류에 높은 병원성을 보이며, 감염된 어류는 유영력의 상실, 심한 빈혈, 아가미 점상출혈, 비장 및 신장 비대증상을 나타낸다. 조직병리학적으로는 비장, 심장, 신장, 간, 아가미 조직 등에 비정형비대세포를 형성한다.
현재 메갈로사이티바이러스는 아시아 각국의 30여종이 넘는 어류에서 발병 보고가 있을 만큼 숙주의 범위가 넓으며, 병원성 또한 높아 양식산업에 경제적으로 큰 손실을 입히고 있다. 특히 메갈로사이티바이러스는 돌돔 양식장에서 가장 빈번히 발병하여 누적폐사율이 거의 100%에 육박하여 매년 세계 돌돔의 생산량을 감소시키는 주원인이 되고 있어 소위 바다의 구제역이라 불릴 정도로 그 피해가 막심하다.
메갈로사이티바이러스는 유전적으로 RSIV Ehime-1 strain으로 대표되는 subgroup 1, 우리나라 돌돔 (rock bream, Opleganthus fasciatus)에서 주로 감염되며 rock bream iridovirus (RBIV)로 대표되는 subgroup 2, infectious spleen and kidney necrosis virus (ISKNV)로 대표되는 subgroup 3 그리고 우리나라 넙치 (Olive flounder, Paralichthys olivaceus)양식장 및 중국의 터봇 (turbot, Scophthalmus maximus)에서 분리되며 turbot reddish body iridovirus (TRBIV)로 대표되는 subgroup 4로 4개의 subgroup으로 나눌 수 있다. 현재까지 subgroup 1, 2 4 에 대한 백신 효과는 여러 논문에서 보고된 바 있다. 그러나 위의 백신에 대한 보고는 대부분 감염 시 폐사율이 상대적으로 낮은 어종을 대상으로 이루어 졌고, 정작 현재 메갈로사이티바이러스에 가장 감수성이 높고 대량 폐사를 나타내는 어종인 돌돔에 대한 효과적인 메갈로사이티바이러스 백신 개발에 대한 정보는 없다.
최근 메갈로사이티바이러스 subgroup 1에 속하는 Ehime 1 strain을 이용한 백신이 돌돔에 비하여 비교적 감수성이 약한 참돔을 대상으로 field test를 마쳤으며, 일본에서 상업화되어 출시되었다. 하지만 개발된 백신의 적용 범위는 red sea bream, striped jack (Pseudocaranx dentex), Malabar grouper (Epinephelus malabaricus), orange spotted grouper (Epinephelus coioides) 그리고 genus Seriola에 속하는 어종에는 적용이 가능하지만, 돌돔이 속하는 genus Oplegnathus에 대해서는 백신의 효과가 거의 없는 것으로 판명 되었다. 실제로 위의 백신은 국내에 수입되어 사용 허가를 취득하였지만 국내 주요 어종인 돌돔에 대한 백신의 효과 부족에 의한 시장 경제적 문제에 의하여 판매가 중단된 바 있다.
한편, 메갈로사이티바이러스 감염 어류의 특징은 비장의 비대화 (정상크기의 약 10-20배로서 성어 감염어 한 개체의 비장조직은 약 500마리 정도의 성어에 백신으로 투여 할 수 있는 바이러스를 함유하고 있을 것으로 추정)이며 이에는 고농도의 메갈로사이티바이러스가 존재하고 있다. 그러나 이러한 폐사어는 활용되지 않고 그대로 폐기되어 환경오염을 야기 시킬뿐만 아니라 심지어 메갈로사이티바이러스 에 대한 매개체 역할을 하고 있다. 그러나 이를 백신 자원으로 활용하기 위해 감염어류의 조직을 이용한 새로운 개념의 백신을 개발해 나간다면 환경오염 방지와 바이러스의 예방을 동시에 이루어 나갈 수 있는 제안이 될 것이다.
본 발명에서는 특이적인 조직 비대를 나타내는 메갈로사이티바이러스 감염 폐사어의 장기에 함유된 바이러스를 불활화 시킨 후 고농도로 투여함으로서 돌돔에까지 활용 가능한 새로운 개념의 메갈로사이티바이러스 백신개발을 실시하였다. 본 방법은 다른 어류바이러스성 질병 (Koi herpesvirus, 그리고 우리나라 1종 전염병인 SVC 등) 에 대하여서도 유사한 방법으로 쉽게 접근 할 수 있는 방법이다.
이에, 본 발명자들은 돌돔에 대하여 효과가 뛰어난 메갈로사이티바이러스 백신을 개발하고자 예의 노력한 결과, 어류의 초대 자어 배양세포를 이용하여 메갈로사이티바이러스를 in vitro 배양하는 경우, 성공적으로 고농도로 메갈로사이티바이러스를 배양할 수 있고 또한 감염된 돌돔의 비장 조직을 이용하여 고농도의 메갈로사이티바이러스 마쇄액을 제작할 수 있으며, 상기 배양 또는 감염조직에서 수득한 바이러스를 불활화 시킨 백신이 돌돔을 비롯한 여러 어류에서 우수한 면역효과를 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 메갈로사이티바이러스의 고농도 배양방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 돌돔에 대하여 효과가 뛰어난 메갈로사이티바이러스 백신의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 메갈로사이티바이러스에 감염되는 어류의 초대 자어 배양세포를 수득하는 단계; (b) 상기 자어 배양세포에 메갈로사이티바이러스를 접종한 후, 배양하는 단계; (c) 상기 자어 배양세포에서 메갈로사이티바이러스를 분리하는 단계; 및 (d) 감염된 어류의 비장 조직을 이용하여 고농도 바이러스 조직마쇄액을 수득하는 단계를 포함하는 초대 자어 배양세포를 이용한 메갈로사이티바이러스의 배양방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 배양된 메갈로사이티바이러스를 불활화시키켜 백신을 수득하는 것을 특징으로 하는 초대 자어 배양세포와 감염조직을 이용한 메갈로사이티바이러스백신의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 배양이 어려운 메갈로사이티바이러스를 고농도로 in vitro 배양할 수 있고 또한 감염 폐사어를 이용하여 고농도 바이러스 조직마쇄액을 수득할 수 있으며, 이를 통해 현재까지 적용이 불가능했던 돌돔을 포함한 주요 양식어종 모두에서의 메갈로사이티바이러스 감염증의 예방백신을 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 백신제조 방법은 향후 우리나라에 유입가능성이 있는 다른 type의 메갈로사이티바이러스 모두에 대한 예방 백신 대책으로 활용할 수 있다.
도 1은 메갈로사이티바이러스 MCP 유전자에 대한 계통학적 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 돌돔, 참돔, 강담돔, 감성돔 및 넙치의 초대 자어세포와 돌돔 및 참돔의 초대 지느러미세포의 형태를 나타낸 것이다.
도 3은 KGNS 11 감염 7일 후 초대배양된 자어세포와 지느러미세포의 바이러스에 의한 세포변성형태를 나타낸 것이다.
도 4는 초대배양된 자어세포와 지느러미세포에서 KGNS 11 바이러스의 증가배수를 나타낸 그래프이다.
도 5는 백신제조 방법에 따른 메갈로사이티바이러스에 대한 돌돔의 생존률을 비교한 그래프이다.
현재 돌돔이 속한 Oplegnathus속에서의 백신의 적용이 어려운 이유는 1) 돌돔이 다른 어종에 비해 메갈로사이티바이러스에 대한 감수성이 상당히 높기 때문이거나 2) 현재 상품화된 백신은 돌돔이 항원을 인식하기에 너무 낮은 농도의 백신이거나 3) 돌돔의 경우 주로 메갈로사이티바이러스 subgroup 2가 발병하지만 정보 제공이 이루어지고 있는 백신의 경우 subgroup 1 (Ehime-1 strain)로 제작되었기 때문에 상대적으로 subgroup 2에 대한 특이 항체 유도가 약하기 때문으로 추측된다.
본 발명에서는 최근 한국의 양식돌돔에서 분리된 고병원성의 메갈로사이티바이러스 subgroup 2 (KGNS 11 strain)를 이용하여 한국형 메갈로사이티바이러스에 대한 백신을 제조하여 돌돔 및 감수성이 있다고 알려진 참돔, 강담돔, 점농어, 넙치, 강도다리, 감성돔, 조피볼락에 직접 적용하였다. 이를 위해 메갈로사이티바이러스의 효과적인 배양을 위하여 기존에 사용된 GF 세포가 아닌 메갈로사이티바이러스에 감수성이 가장 높고 세포성장이 빠를 것으로 생각되는 돌돔자어세포를 초대배양하여 고농도의 메갈로사이티바이러스를 배양하였다. 초대세포를 이용하여 배양된 바이러스는 기존의 주화세포에서 배양된 바이러스에 비하여 고농도를 나타내어 상등액자체로서 고농도의 백신제조 원료로 사용 할 수 있게 됨으로서 추가적인 바이러스의 농축과정을 실시할 필요가 없다. 또한 제조된 자어세포의 경우 매우 제한적인 수요에 대응한 후 잔여 자어의 경우 사료 등으로 폐기되고 있어, 어가소득 증대 및 자원의 효율적사용등 여러 가지 긍정적 효과를 보여줄 것으로 기대된다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 메갈로사이티바이러스에 감염되는 어류의 초대 자어 배양세포를 수득하는 단계; (b) 상기 자어 배양세포에 메갈로사이티바이러스를 접종한 후, 배양하는 단계; 및 (c) 상기 자어 배양세포에서 메갈로사이티바이러스를 분리하는단계를 포함하는 초대 자어 배양세포를 이용한 메갈로사이티바이러스의 배양방법에 관한 것이다.
본 발명에서 "자어 배양 세포"는 어류의 난을 멸균해수로 세척한 뒤 부화시킨 자어를 mesh에 통과시켜 단일세포 형태로 만든 세포를 말한다.
본 발명에 있어서, 상기 어류는 돌돔, 강담동, 점농어, 넙치, 감성동, 강도다리 및 조피볼락으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 메갈로사이티바이러스는 돌돔, 강담동, 점농어, 넙치, 감성동, 강도다리 및 조피볼락으로 구성된 군에서 선택되는 어류의 감염조직에서 분리된 것임을 특징으로할 수 있다.
본 발명에 있어서, 메갈로사이티바이러스는 모든 종류의 메갈로사이티바이러스를 포함하며, 서브그룹 1, 서브그룹 2, 서브그룹 3 및 서브그룹 4로 구성된 군에서 선택되는 메갈로사이티바이러스인 것을 특징으로 할 수 있다.
메갈로사이티바이러스의 경우, 바이러스를 in vitro 계대배양하였을 때 바이러스의 감염성이 점점 감소한다고 알려져 있다. 현재 상업화된 메갈로사이티바이러스 백신의 경우 GF cell을 이용한 in vitro배양방법에 대하여 매우 간단히 그리고 특이적인 결과 없이 기술하고 있으나, 많은 연구결과 메갈로사이티바이러스의 경우 in vitro에서 배양이 어렵고 계대배양에 따른 문제점이 거론되고 있다. 실제로 본 연구실에서 GF cell을 이용하여 배양해본 결과 2번째 바이러스 passage이후의 바이러스는 재감염성을 보여주지 않았다. 따라서 기존에 상업화된 백신의 경우 바이러스 배양 과정 중 바이러스의 농도가 점점 감소했을 가능성 또한 배재할 수 없었다.
그러나, 본 발명의 일양태의 메갈로사이티바이러스 배양방법에 따르면, 자어세포에서 KGNS 11의 증가배수를 나타내었다. RBE 세포와 RSBE 세포에 감염된 돌돔의 비장에서 분리된 KGNS 11 strain 접종 7일 후 바이러스는 처음 접종한 바이러스에 비해 각각 31,000와 21,500배로 크게 증가 하여 5.01x1010 와 4.24x1010 copies/ml의 농도로 나타났다. 또한 SPFE 세포, BSBE 세포, OFE 세포에서 KGNS 11 strain을 처음 접종한 바이러스에 비해 평균 17,100배 증가하여 1010 copies/ml 이상의 농도를 보여주어, 고농도로의 메갈로사이티바이러스 배양이 가능한 것을 확인하였다.
또한, 감염된 돌돔의 비장조직을 이용하여 제작한 조직 마쇄액의 바이러스는초대 자어세포에서 배양한 농도와 거의 동일한 5.10x1010 copies/ml로 나타나 직접적인 감염 조직 마쇄액에서도 고농도의 메갈로사이티바이러스를 수득할 수 있다는 것을 확인하였다.
다른 관점에서, 본 발명은 상기 방법으로 수득된 메갈로사이트바이러스를 불활화시키켜 백신을 수득하는 것을 특징으로 하는 초대 자어 배양세포와 감염조직을 이용한 메갈로사이티바이러스백신의 제조방법에 관한 것이다.
메갈로사이티바이러스는 돌돔 양식장에서 매년 발병하여 누적폐사율이 거의 100%에 육박하여, 매년 세계 돌돔의 생산량을 감소시키는 주원인이 되고 있다. 하지만 돌돔이 속한 Oplegnathus속에 적용이 가능한 메갈로사이티바이러스 백신은 아직 보고된바 없다.
따라서, 본 발명의 돌돔에서 효과적인 메갈로사이티바이러스 백신은 곧 메갈로사이티바이러스에 감염이 된다고 알려진 다른 모든 어종에 적용이 가능함을 의미 할 것이다.
본 발명의 일 양태에서는 본 발명의 방법으로 제조된 메갈로사이티바이러스 백신을 돌돔, 참돔, 강담돔, 점농어, 넙치, 감성돔, 강도다리 및 조피볼락에 대하여, 감염예방효과를 확인하였다.
본 발명의 다른 양태에서는, 바이러스의 불활화 종류에 따른 돌돔의 폐사율을 확인한 결과, 포르말린처리, 자외선처리, 열처리를 수행하여 불활화시킨 백신의 경우, 포르말린과 자외선 처리한 백신에서 동일한 감염예방효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 메갈로사이티바이러스에 대한 감수성있는 어류의 감염조직을 마쇄하여 메갈로사이티바이러스를 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득된 메갈로사이티바이러스를 불활화시켜 백신을 수득하는 단계를 포함하는 메갈로사이티바이러스 백신의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 메갈로사이티바이러스의 불활화는 포르말린 처리 또는 자외선 처리에 의해 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 메갈로사이티바이러스의 확보
1-1: 메갈로사이티바이러스의 확보
이하의 실시예에서 사용되는 메갈로사이티바이러스는 KGNS 11, PGIV-SP 그리고 FLIV-G strain이며 각각 2007년 경상남도 남해안의 돌돔 (rock bream, Oplegnathus fasciatus)가두리 양식장, 2005년 싱가포르에서 수입된 담수관상어 펄구라미 (pearl gourami, Trichogaster leeri)수족관 및 2006년 거제의 넙치 (Olive flounder, Paralichthys olivaceus)양식장에서 전형적인 메갈로사이티바이러스의 감염증상을 보이는 개체로부터 분리하였다. 채집된 개체는 마취한 뒤 비장과 신장을 적출하였으며, 적출한 비장과 신장 조직은 PBS에서 마쇄한 후 4℃, 10,000g 에서 10분간 원심분리하였으며, 그 상등액을 건강한 돌돔에 접종 후 돌돔이 폐사하거나 빈사상태가 되면 비장을 적출하여 바이러스를 증폭 및 재분리하였다. 증폭된 바이러스는 -70℃에서 사용 전까지 보관하였다.
1-2:메갈로사이티바이러스의 염기서열분석
1-1의 각 감염어의 비장 조직으로부터 total DNA를 분리 후 PCR을 실시하여 메갈로사이티바이러스감염을 확인하였다.
PCR에 사용된 프라이머는 메갈로사이티바이러스의 MCP gene 부위로부터 고안된 M2F (5'-ATA ACG ACC AGT TCA AAC-3':서열번호 1)와 M2R (5'-GGC GGC GAC AAT GCC GTG-3':서열번호 2)을 사용하였다.
PCR 산물은 Prep-A-Gene DNA purification kit (Bio-Rad Laboratories, USA)를 사용하여 정제하였고, 정제된 DNA는 TOPO-TA Cloning Kit (Invitrogen)를 사용하여 클로닝한 후, 염기서열을 확인하였다. 밝혔다. 염기서열은 Clustal W program과 MEGA4 program (Version 4.0.)으로 계통적 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 본 실시예에서 분리된 메갈로사이티바이러스와 이전에 분리된 바이러스와의 유전적 거리를 나타내는 계통수로 KGNS 11 strain은 2000년도에 우리나라 사천에서 분리된 메갈로사이티바아러스 IVS-1 strain과 MCP gene의 상동성을 확인한 결과, 99.8% 일치하여 같은 subgroup 2에 속하는 것을 확인할 수 있었다.
1-3: 분리된 KGNS 11 strain의 병원성 확인
KGNS 11과 IVS-1의 병원성을 확인하기 위해, 순치된 돌돔, 참돔, 강담돔, 점농어, 넙치, 강도다리, 감성돔 및 조피볼락에 KGNS 11과 IVS-1을 1x106~1x101 copies/fish의 농도로 복강주사하였다. 음성 대조구는 PBS를 0.1 ml 주사하였으며, 각 그룹은 20마리씩 접종하였다. 실험어는 25℃에서 사육하였으며, 매일 폐사를 관찰하였다. 폐사한 어류는 비장에서 viral DNA를 분리한 뒤, M2F/R primer set을 이용한 PCR을 이용하여 감염여부를 확인하였다.
본 발병의 표 1은 다양한 어종에서 KGNS 11와 IVS-1의 병원성을 확인해 보았다. KGNS 11과 IVS-1을 접종한 결과 생존율의 차이는 나타나지 않았고, 돌돔과 강담돔의 경우 모든 그룹에서 접종 9~21일 이내에 100% 폐사하였고 참돔의 경우 1x106 copies/fish 접종한 그룹에서는 100%에 이르는 폐사율을 나타냈고 1x104 copies/fish에서는 70%의 폐사율을 보여 돌돔에 비하여서는 낮았으나 다른 어종에 비해 높은 민감성을 보였다. 점농어, 감성돔, 조피볼락 등은 비교적 낮은 폐사율을 나타냈고, 넙치와 강도다리의 경우는 폐사가 일어나지 않았다.
KGNS 11 starin의 다양한 양식어종에서의 병원성 확인
어종 바이러스 바이러스
농도* 		실험어 수 누적 폐사어 수 폐사율 (%)
돌돔 KGNS 11 6 20 20 100
5 20 20 100
4 20 20 100
3 20 20 100
2 20 20 100
1 20 20 100
IVS-1 4 20 20 100
대조구** - 20 0 0
참돔 KGNS 11 6 20 20 100
5 20 18 90
4 20 14 70
3 20 10 50
2 20 2 10
1 20 0 0
IVS-1 4 20 20 80
대조구** - 20 0 0
강담돔 KGNS 11 4 20 20 100
IVS-1 4 20 20 100
대조구 - 20 0 0
점농어 KGNS 11 4 20 10 50
IVS-1 4 20 8 40
대조구** - 20 0 0
넙치 KGNS 11 4 20 0 0
IVS-1 4 20 0 0
대조구** - 20 0 0
강도다리 KGNS 11 4 20 0 0
IVS-1 4 20 0 0
대조구** - 20 0 0
감성돔 KGNS 11 4 20 4 20
IVS-1 4 20 3 15
대조구** - 20 0 0
조피볼락 KGNS 11 4 20 5 25
IVS-1 4 20 6 30
대조구** - 20 0 0
* Log10 copies/fish
** MEM 배지를 바이러스와 동일한 방법으로 접종 한 그룹
실시예 2 : 초대배양세포의 제조
2-1: 초대 자어세포의 배양
돔돔, 참돔 (red sea bream, Pagrus major), 강담돔 (spotted parrot fish, Oplegnathus punctatus), 감성돔 (black sea bream, Acanthopagrus schlegelii) 및 넙치의 난을 통영과 여수의 양식장에서 분양받았다. 어류의 난은 멸균된 해수로 충분히 세척한 뒤 22℃의 멸균해수에서 부화시켰다. 부화한 자어는 antibiotics and antimycotics (Gibco, USA)가 포함된 MEM으로 3회 세척하였다. 그 후 자어는 mesh를 통과시켜 단일세포로 만들었다. 단일세포는 4℃ 500g에서 10분간 원심분리하는 방법으로 3회 세척하였으며, 최종적으로 10% FBS가 포함된 MEM에 현탁하였다.
Trypan blue 염색을 통해 살아있는 세포를 계수한 뒤 25cm2 tissue culture flask (Corning, USA)에 106 cells/flask로 접종하였으며, 이를 통해 제작된 초대배양세포를 25℃에서 배양하였다. 배양 3일 후 자어세포는 단층을 형성하였으며, 이후 감염 실험을 실시하였다. 초대배양된 자어세포를 돌돔 자어세포 (RBE cell), 참돔 자어세포 (RSBE cell), 강담돔 자어세포 (SPFE cell), 감성돔 자어세포 (BSBE cell) 및 넙치 자어세포 (OFE cell)라고 명명하였으며, 도 2의 A~E에는 초대배양된 자어세포의 형태를 나타낸 현미경 사진이다. 모든 자어세포는 epithelial-like, fibroblast-like 및 neuron-like cell로 구성되어 있었으며, 형태적으로 유사하여 현미경상으로는 유래어종의 구별은 불가능하였다.
2-1: 초대지느러미세포의 배양
건강한 참돔 치어 (체중 4.0±0.5 g) 및 돌돔치어 (체중 3.0±0.5 g) 를 부산 및 거제의 양식장에서 구입하였다. 구입한 어류는 70% 에탄올로 체표면을 소독한 뒤 지느러미를 적출하였다. 지느러미는 1 mm2이하의 크기로 잘게 자른 뒤 antibiotics and antimycotics가 첨가된 Hank's balanced salt solution (HBSS, Sigma-Aldrich)로 3번 washing 하였다. 세척된 지느러미는 0.25% trysin-EDTA solution (Gibco)로 4℃에서 60분간 세포를 떼어내었다. Trypsin-EDTA를 처리한 지느러미 조직 및 세포는 20% FBS(Gibco, USA)와 항생제 (penicillin, 200 IU/ml; streptomycin, 200 ug/ml)가 첨가된 L-15 (Sigma-Aldrich)배지 10 ml을 첨가하고 4℃ 500 g에서 10분간 원심 분리를 3회 실시하여 trypsin을 제거하였다.
세포는 다시 20% FBS (Gibco, USA)와 antibiotics and antimycotics가 첨가된 L-15 배지 5 ml에 현탁한 뒤 25 cm2 tissue culture flask (Corning, USA)에 접종하였다. 참돔 지느러미 세포는 25℃에서 배양하였으며, 배지는 2일에 한번 씩 교환하였다. 배양된 돌돔과 참돔 지느러미 세포는 각각 RSBF 세포와 RBF 세포라고 명명하였다. 도 2의 F, G에는 초대배양된 어류지느러미세포의 형태를 나타낸 현미경 사진이다. 어류지느러미세포는 epithelial-like, fibroblast-like로 구성되어 있었으며, 형태적으로 유사하였다.
실시예 3: 바이러스의 정량적 분석
바이러스의 정량적 분석을 위해서 viral DNA와 quantitative PCR (qPCR)을 이용하였으며, Viral DNA의 분리는 AccuPrep Genomic DNA Extraction kit (Bioneer, 한국)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 분리하였다. 분리된 viral DNA는 LightCycler 480 II (Roche,USA)를 이용한 absolute qPCR법으로 정량하였다. Absolute qPCR은 2xLightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche,USA) 10μl, MCP gene을 타겟으로 한 qM1F (5'-GGC GAC TAC CTC ATT AAT GT-3':서열번호 3)와 qM1R (5'-CCA CCA GGT CGT TAA ATG A-3':서열번호 4) 프라이머 각각 0.5 pM 및 template DNA 1μl를 첨가한 후, 최종 volume이 20μl가 되도록 하였다. qPCR의 조건은 95℃에서 10분간 반응한 후, 95℃ 10초, 60℃ 15초, 72℃ 20초의 반응을 1 cycle로 하여 40 cycles를 반응시켰으며, 마지막 cycle 후에는 모든 반응물에 대하여 72℃부터 95℃까지의 영역에서 melting curve분석을 실시하였다. qPCR의 Standard를 위해 KGNS 11의 MCP gene을 TOPO-TA vector (Invitirogen)에 삽입하여 Escherichia coli DH5α에 형질전환시킨 뒤 재조합된 플라스미드를 재분리하여 사용하였다. 재조합된 플라스미드는 1.0x108~1.0x101 copies/μl 의 농도 범위로 하여 10-fold씩 단계희석하여 standard curve를 작성하는데 사용하였다.
실시예 4: 감염된 어류의 조직에서의 바이러스 분리
4-1: KGNS 11에 감염돌돔의 조직 내 바이러스 분포
KGNS 11에 감염된 돌돔의 조직별 바이러스의 분포를 확인하기 위해, 돌돔 (체중 150±10.0 g)에 KGNS 11이 감염된 조직마쇄액 (10 mg/fish)을 복강주사하였으며, 폐사 직전의 돌돔은 해부하여 간, 신장 그리고 비장을 적출하고 조직별 바이러스 농도를 분석하기 위해 qPCR법으로 정량하였다.
표 2는 KGNS 11에 감염된 돌돔의 조직별 바이러스 분포를 나타내었다. 그 결과 다른 조직에서 보다 비장과 두신에서 높은 바이러스 축적을 확인할 수 있었다.
KGNS 11에 감염된 돌돔의 조직별 바이러스 농도 분포
조 직 개체번호 바이러스 축적농도
(Log10 copies/mg)
비 장 1 9.07
2 9.54
3 9.32
4 9.35
평균값 9.35
두 신 1 7.98
2 9.18
3 9.18
4 8.90
평균값 8.99
간 1 8.79
2 8.71
3 7.53
4 7.48
평균값 8.48
아가미 1 7.18
2 7.99
3 7.79
4 6.93
평균값 7.66
4- 2 :KGNS 11에 감염된 어류의 바이러스 농도 분석
상기 실시예 4-1에서 KGNS 11에 감염된 돌돔의 조직별 바이러스 분포에서 비장에서 가장 높은 축적을 확인하였다. 따라서 이후 다른 어종에서의 바이러스 축적 분석은 비장을 이용하여 분석하였다.
시험에 사용된 어종은 돌돔, 강담돔, 참돔, 점농어, 감성돔, 조피볼락, 넙치, 강도다리를 사용하였으며, 이들 어종은 각각 10 마리씩 KGNS 11 (10 mg/fish)을 복강주사하였으며, 폐사 직전의 어류는 비장을 적출하여 정량적으로 분석하였다.
표 3은 KGNS 11에 감염된 어종별 비장 내 바이러스 축적량을 나타내었다. 돌돔, 참돔 그리고 강담돔에서 가장 높은 바이러스 축적량을 확인할 수 있었으며, 폐사가 나타나지 않는 넙치에서도 바이러스가 축적되어있음을 확인할 수 있었다.
KGNS 11에 감염된 어류의 비장내 바이러스 축적량
어류 종류 어체무게
(g)		 평균값 (10마리)
바이러스 축적농도 (Log10 copies/mg)
돌돔 300 ± 28 9.15 ± 0.33
참돔 500 ± 42 8.75 ± 0.52
강담돔 300 ± 41 9.01 ± 0.31
점농어 400 ± 37 7.65 ± 0.18
감성돔 250 ± 28 6.27 ± 0.21
조피볼락 30 ± 4 7.28 ± 0.35
넙치 200 ± 29 6.21 ± 0.60
강도다리 250 ± 26 5.98 ± 0.42
4-3 감염조직에서 바이러스 추출
조직 내에서 KGNS 11을 분리하기 위해 인위적으로 KGNS 11을 돌돔에 복강주사 하였다. 그리고 폐사 직전의 돌돔은 해부하여 비장을 적출하였다. 적출된 비장은 MEM (Sigma-Aldrich)을 이용하여 10% (w/v) 비율로 마쇄하였으며, 4℃, 10,000 g에서 10분간 원심 분리한 후 상등액을 획득하였다. 상등액은 0.45 μm syringe filter를 통과시켜 획득하였으며, 일부는 viral copy number를 측정하는데 사용되었고 나머지는 -70℃ 에서 백신제조 전까지 보관하였다. 감염조직에서 추출한 바이러스는 5.10x1010 copies/ml의 농도를 나타내었다.
실시예 5: 초대배양세포를 이용한 KGNS 11 strain의 배양
실시예 2에서 배양한 자어세포 (RBE, RSBE, SPFE, BSBE 및 OFE)의 메갈로사이티바이러스에 대한 감수성을 확인하기 위하여, KGNS 11 strain에 감염된 돌돔 비장에서 분리된 KGNS 11을 접종하였다.
도 3에는 KGNS 11에 감염되어 세포변성효과가 나타난 세포의 모습을 나타내었다. 접종 3일 후 모든 자어세포와 지느러미세포에서 현미경으로 관찰시 반짝이며 비대해진 세포 즉 세포변성효과가 관찰되었으며, 접종 7일 후에는 다수의 세포변성효과가 관찰되었다.
도 4에는 자어세포와 지느러미세포에서의 KGNS 11 바이러스 증가배수를 나타내었다. RBE 세포와 RSBE 세포에 감염된 돌돔의 비장에서 분리된 KGNS 11 strain 접종 7일 후 바이러스는 처음 접종한 바이러스에 비해 각각 31,000와 21,500배로 크게 증가 하여 5.01x1010 와 4.24x1010 copies/ml의 농도로 나타났다. 또한 SPFE 세포, BSBE 세포, OFE 세포에서 KGNS 11 strain을 처음 접종한 바이러스에 비해 평균 17,100배 증가하여 1010 copies/ml 이상의 농도를 보여주었다. 한편 본 발명에서 제작한 초대 배양된 돌돔과 참돔 지느러미 세포(RBF, RSBF)에서는 바이러스 최종 농도가 자어세포에 비하여 평균적으로 큰 차이는 아니나 다소 낮은 바이러스 농도의 경향을 보였다. 한편 GF cell은 KGNS 11 접종 시에는 처음 접종한 바이러스에 비해 약 250배 증가에 그쳤다. 그리고 BF-2 cell에서는 바이러스의 증가는 거의 미미하였다.
실시예 6 : 초대 자어세포를 이용한 메갈로사이티바이러스 백신의 제조 및 효과확인
6-1: 초대 자어세포에서 배양된 메갈로사이티바이러스의 불활화
KGNS 11을 RBE 세포에서 배양한 상등액을 2,000 g 에서 10분간 원심분리 한 후 포르말린 불활화 백신조제의 원료로 사용하였다. 불활화백신 제조는 포르말린 (37% formaldehyde, Sigma-Aldrich)을 바이러스 원료에 최종농도 0.2% (v/v)가 되도록 첨가 한 후 100 rpm의 혼합 (shaking)과 함께 4℃에서 5일간 불활화 하였다.
6- 2:백신의 투여농도에 따른 효과 비교
RBE 세포에서 배양된 KGNS 11을 포르말린으로 불활화한 백신을 High concentration megalocytivirus vaccine (HCMV)이라 명명하였으며, HCMV를 10배로 희석한 백신은 Low concentration megalocytivirus vaccine (LCMV)이라 명명하였다. 또한 백신의 투여 농도에 따른 효과를 비교하기 위해, 바이러스 농축은 초원심분리기를 이용해 RBE cell에서 배양된 KGNS 11 strain 10 ml을 4℃ 50,000 g에서 90분간 ultracentrifuge (Beckman Optima L-80 XP, SW 41 Ti rotor)를 하였다. 농축된 바이러스는 0.8 ml의 MEM으로 현탁하여 백신으로 사용하였으며, 이를 10xHCMV (바이러스 농도가 HCMV보다 10배 높음, 5.0x1011 copies/ml)이라고 명명하였다.
백신의 투여 농도가 바이러스 감염 시 어류의 생존률에 미치는 영향을 비교하기 위해, 농도가 각기 다른 10xHCMV (5.0x1011 copies/ml), HCMV (5.0x1010 copies/ml), LCMV (5.0x109 copies/ml)를 돌돔에 접종하였다. 또한 참돔에는 HCMV와 LCMV를 각각 접종하였다. 그리고 2주 후 돌돔의 경우 IVS-1과 KGNS 11을 1.0x104 copies/fish의 농도로 복강주사하였으며, 참돔의 경우 KGNS 11과 IVS-1을 1.0x106 copies/fish의 농도로 복강주사하였다.
표 4에는 백신 투여 농도 및 공격실험 시 megalocytivirus strain에 따른 돌돔과 참돔의 생존률을 비교하였다. KGNS 11과 IVS-1에 따른 생존률의 차이는 관찰되지 않았지만 백신 투여농도에 따른 생존율의 차이를 확인할 수 있었다.
백신 투여농도에 따른 megalocytivirus에 대한 돌돔과 참돔의 생존률 비교
어종 백신의
종류		 백신 투여농도* 바이러스 실험어 수 누적폐사어 수 폐사율 (%)
돌돔 10×HCMV 10.7 KGNS 11 20 6 30
HCMV 9.7 KGNS 11 20 8 40
LCMV 8.7 KGNS 11 20 20 100
대조구** - KGNS 11 20 20 100
10×HCMV 10.7 IVS-1 20 7 25
HCMV 9.7 IVS-1 20 8 40
LCMV 8.7 IVS-1 20 20 100
대조구** - IVS-1 20 20 100
참돔 10×HCMV 10.7 KGNS 11 20 4 20
HCMV 9.7 KGNS 11 20 6 30
LCMV 8.7 KGNS 11 20 8 40
대조구** - KGNS 11 20 17 85
10×HCMV 10.7 IVS-1 20 5 25
HCMV 9.7 IVS-1 20 7 35
LCMV 8.7 IVS-1 20 8 40
대조구** - IVS-1 20 18 90
* Log10 copies/fish
** MEM 배지를 백신과 동일한 방법으로 투여 한 돌돔
6-3: 백신 제조 방법에 따른 효과비교
6-2에서 포르말린으로 불활화 시킨 HCMV가 돌돔에 높은 생존율을 보여주었다. 따라서 이후의 실험에서는 돌돔자어세포에서 배양된 바이러스를 이용하여 백신을 제조하였으며, 보다 효과적인 불활화 법을 찾기 위해 다양한 불활화 방법을 이용하여 백신을 제조하였다.
포르말린 불활화백신을 제조하기 위해, 포르말린 (37% formaldehyde, Sigma-Aldrich)을 바이러스 배양액에 최종농도 0.1% (v/v)가 되도록 첨가해주었다. 그리고 나서 4℃에서 7일간 불활화하였다. RBE 세포에서 배양된 바이러스를 포르말린으로 불활화한 백신을 제조하였다. 열처리불활화 백신은 자어세포에서 배양된 KGNS 11을 56℃에서 30분간 불활화하였으며, 자외선 불활화 백신은 배양된 KGNS 11을 페트리디쉬에 분주한 뒤 자외선등과 30 cm 거리에서 1시간 30분간 불활화하였다. 불활화된 바이러스는 사용 전까지 4℃에서 보관하였다.
제작된 백신이 불활화되었는지 확인하기 위해서 각각의 다른 방법으로 불활화된 백신 0.1 ml을 돌돔 (체중 5 ± 2g) 20마리에 복강내 주사하였으며, 대조구로서 바이러스 배양액 0.1 ml을 주사하였다.
그 결과, 표 5에 나타낸 바와 같이, 불활화 시키지 않은 바이러스액으로 주사한 대조구는 2주일 이내에 100% 폐사하였지만, 불활성화 백신을 주사한 모든 실험구에서는 6주 동안 관찰 결과 폐사가 전혀 발생하지 않았으므로 본 발명의 불활화 백신이 100% 불활화 되었음을 의미하며, 그 안전성을 증명하였다.
불활화 백신 주사에 의한 돌돔의 폐사율
백신의 종류 실험어 수 누적폐사어 수 폐사율
포르말린 불활화 20 0 0
자외선 불활화 20 0 0
열처리 불활화 20 0 0
대조구 (활성바이러스) 20 20 100
백신의 효과검증을 위해 포르말린, 자외선 그리고 열처리 방법으로 불활화한 백신을 각각 돌돔에 복강주사 하였으며 대조구는 세포배양배지를 접종하였다. 돌돔에 백신 접종 2주 후 KGNS 11을 1.0x104 copies/fish의 농도로 복강주사하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 포르말린과 자외선으로 불활화한 백신을 접종한 돌돔은 40.0% 그리고 30.0%의 누적폐사율을 보였다. 반면 열처리 불활화백신을 접종한 돌돔의 경우 95.0%의 높은 폐사율을 나타내었다. 세포배양배지를 접종한 대조구는 100% 폐사하여 포르말린과 자외선 불활화 백신은 높은 생존율을 보여주었으며 거의 생존율 차이가 없었으므로 이후의 실험에서는 대표적인 바이러스 불활화법인 포르말린 불활화법을 이용하여 백신을 제조하였다.
6-4: 감염조직을 이용한 백신의 제작과 효과
실시예 4-3에서 KGNS 11에 감염된 돌돔의 비장에서 분리된 바이러스가 5.10x1010 copies/ml의 농도를 보여 HCMV와 비슷한 농도를 나타내었다. 따라서 감염조직을 이용한 고농도 바이러스 백신을 제작하기 위하여 폐사직전의 돌돔을 해부하여 비장을 적출한 뒤 FBS가 첨가되지 않은 Minimum Essential Medium (MEM, Sigma-Aldrich)과 10% (w/v) 비율로 마쇄하고 2,000 g 에서 10분간 원심분리 한 후 포르말린 불활화 백신조제의 원료로 사용하였으며, 불활화백신 제조는 포르말린 (37% formaldehyde, Sigma-Aldrich)을 바이러스 원료에 최종농도 0.2% (v/v)가 되도록 첨가 한 후 100 rpm의 혼합 (shaking)과 함께 4℃에서 5일간 불활화 하였으며, 이렇게 제작한 백신을 Tissue-derived vaccine (TDV)라고 명명하였다.
제조된 TDV는 돌돔에 복강주사 하였으며 대조구는 세포배양배지를 접종하였다. 백신 접종 2주 후 배양된 KGNS 11을 1.0x104 copies/fish의 농도로 복강주사하여 공격 실험을 하였다.
TDV의 돌돔에 대한 백신효과는 HCMV의 효과와 유사한 60%의 생존율을 보였으며 상업화된 Biken 백신의 돌돔에 대한 백신효과는 거의 없음을 다시 한번 재확인하였다. 그러므로 고용량의 조직마쇄액도 백신으로써 충분한 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. (도 6)
6-5: 백신투여 기간에 따른 효과 비교
상기 실시예 1-3과 6-2에서 KGNS 11과 IVS-1 strain의 병원성에는 차이가 없음을 확인하였다. 따라서 이후의 실험에서는 공격실험에 KGNS 11 strain을 이용하여 공격실험을 실시하였다.
백신 기간에 따른 효과를 비교하기 위해, 돌돔과 참돔에 HCMV과 LCMV를 접종한 후 2, 4주 그리고 6주 후 KGNS 11을 1.0x104 copies/fish의 농도로 복강주사하였다. 표 6은 백신 접종 이후의 면역 기간에 따른 메갈로사이티바이러스에 대한 돌돔과 참돔의 생존률을 비교한 것이다. 돌돔과 참돔 모두 백신 기간에 따른 생존률의 뚜렷한 차이를 확인할 수 없었다. 이는 백신이 2주후부터 면역이 형성되어 최소 6주 동안 유지됨을 의미한다.
백신 접종기간에 따른 megalocytivirus에 대한 돌돔과 참돔의 생존률 비교
어종 백신의
종류		 면역 기간 바이러스 접종량* 실험어 수 누적폐사어 수 폐사율 (%)
돌돔 HCMV 2주 4 20 7 35
HCMV 4주 4 20 8 40
HCMV 6주 4 20 8 40
LCMV 2주 4 20 20 100
LCMV 4주 4 20 20 100
LCMV 6주 4 20 20 100
대조구** - 4 20 20 100
참돔 HCMV 2주 6 20 6 30
HCMV 4주 6 20 6 30
HCMV 6주 6 20 7 35
LCMV 2주 6 20 8 40
LCMV 4주 6 20 9 45
LCMV 6주 6 20 8 40
대조구** - 6 20 18 90
* Log10 copies/fish
** MEM 배지를 백신과 동일한 방법으로 투여 한 돌돔
6-6: 바이러스 투여법 및 접종량에 따른 백신의 효과 비교
상기 실시예 6-3에서 HCMV의 백신 접종기간에 따른 비교에서 2~6주 모두 큰 차이를 보이지 않아 이후의 실험에서는 백신 접종 2주 후 공격실험을 실시하였다.
실제 양식 현장에서 바이러스가 수계를 통해 감염되는 방식과 유사한 환경을 만들어 백신의 효과를 비교하기 위해 혼합사육(cohabitation)실험을 실시하였다. 300 L 수조에 그물망을 이용하여 5개의 그룹으로 구분하였다. 한 그룹은 돌돔 20마리에 KGNS 11을 1.0x104 copies/fish의 농도로 복강주사하였으며 (공급그룹), 다른 세 그룹은 HCMV, LCMV 그리고 TDV (Tissue derived vaccine, 를 접종한 후 2주 지난 돌돔을 각각 20마리씩 수용하였으며, 다른 한 그룹은 대조구로 MEM을 접종한 돌돔 (수용그룹)을 수용한 후 폐사율을 관찰하였다. 수조는 45일 동안 25℃를 유지하면서 해수를 매일 50%를 환수하였다.
표 7은 혼합사육을 이용한 돌돔과 참돔의 생존률을 비교하였다. KGNS 11을 접종한 공급그룹의 경우 돌돔의 경우 접종 9일째부터 폐사가 시작되어 12일째는 100% 폐사하였다. 또한 수용그룹의 대조군 역시 혼합사육 36일 후 100% 폐사되었다. 하지만 수용그룹 돌돔에서 HCMV, LCMV 그리고 TDV 백신의 경우 혼합사육 실시 후 45일 동안 각각 동안 20, 60 그리고 15%의 누적폐사율을 보였다. 참돔의 공급그룹은 90% 폐사하였으며, 수용그룹은 80% 폐사하였다. HCMV, LCMV 그리고 TDV를 접종한 참돔의 경우 혼합사육 실시 후 45일 동안 각각 0, 40 그리고 0%의 누적폐사율을 보였다.
혼합사육(cohabitation)을 통한 감염에 따른 백신 접종한 돌돔과 참돔의 생존률 비교
어종 감염방법 백신의
종류		 바이러스 실험어 수 누적폐사어 수 폐사율 (%)
돌돔 공급그룹 - KGNS 11 20 20 100
수용그룹 HCMV - 20 4 20
LCMV - 20 12 60
TDV - 20 3 15
대조구* - 20 20 100
참돔 공급그룹 - KGNS 11 20 18 90
수용그룹 HCMV - 20 0 0
LCMV - 20 8 40
TDV - 20 0 0
대조구* - 20 16 80
표 8은 KGNS 11의 접종량에 따른 백신의 효과를 나타내었다. HCMV와 LCMV를 돌돔과 참돔에 접종하였다. 2주 후 KGNS 11을 돌돔에 1.0x105~1.0x101 copies/fish의 농도로 참돔에는 1.0x107~1.0x103 copies/fish의 농도 10배씩 단계 희석하여 모든 시험구에 복강 주사하였다. 그 결과, 돌돔과 참돔에 공격한 바이러스의 양이 감소할수록 생존율이 증가하는 경향을 보여주었다.
바이러스 접종량에 따른 백신을 접종한 돌돔과 참돔의 생존률 비교
어종 백신의
종류		 백신 투여농도* 바이러스 접종량* 실험어 수 누적폐사어 수 폐사율 (%)







돌돔

HCMV		 10.7 5 20 9 45
10.7 4 20 8 40
10.7 3 20 6 30
10.7 2 20 4 20
10.7 1 20 0 0


LCMV		 9.7 5 20 20 100
9.7 4 20 18 90
9.7 3 20 14 70
9.7 2 20 11 55
9.7 1 20 5 25


Commercial vaccine		 5 20 20 100
4 20 20 100
3 20 17 85
2 20 15 75
1 20 12 60


대 조 구**		 5 20 20 100
4 20 20 100
3 20 20 100
2 20 20 100
1 20 20 100









참돔

HCMV		 10.7 7 20 8 40
10.7 6 20 6 30
10.7 5 20 4 20
10.7 4 20 0 0
10.7 3 20 0 0


LCMV		 9.7 7 20 9 45
9.7 6 20 8 40
9.7 5 20 7 35
9.7 4 20 0 0
9.7 3 20 0 0


Commercial vaccine		 7 20 14 70
6 20 12 60
5 20 12 60
4 20 8 40
3 20 0 0


대 조 구**		 7 20 20 100
6 20 18 90
5 20 16 80
4 20 8 40
3 20 0 0
* Log10 copies/fish
** MEM 배지를 백신과 동일한 방법으로 투여 한 돌돔
6-7 바이러스 type 및 어종에 따른 백신의 효과 비교
다른 type의 메갈로사이티바이러스에 대한 교차반응을 확인하기 위해, PGIV-SP strain (메갈로사이티바이러스 subgroup 3)과 FLIV-G (메갈로사이티바이러스 subgroup 4)를 함께 이용하였다. 백신효과 검증에 사용된 어종은 돌돔, 참돔, 강담돔, 점농어, 감성돔, 조피볼락, 넙치, 강도다리이며 각각 20마리의 어류에 HCMV 또는 TDV를 접종한 후 2주후 KGNS 11, PGIV-SP 그리고 FLIV-G를 접종하였다.
표 9 및 표 10에서는 바이러스 type 및 어종에 따른 백신의 효과를 비교하였다. Megalocytivirus subgroup 2 인 KGNS 11로 조제한 백신 HCMV와 TDV는 subgroup 2 뿐만 아니라 subgroup 3인 PGIV-SP에 의한 공격에 대하여서도 교차방어 할 수 있음을 확인할 수 있었으며, subgroup 4 인 FLIV-G의 공격 실험의 경우 전 어종에서 뚜렷한 병원성을 나타내지 않았으나 교차방어의 가능성은 충분히 인식할 수 있었다. 그러므로 한국형 megalocytivirus subgroup 2 strain을 이용한 백신은 모든 megalocytivirus subgroup 에 대하여 효과적인 것을 확인하였다.
바이러스 type 및 어종에 따른 백신의 효과 비교(1)
어종 백신의
종류		 공격 한 바이러스 바이러스 접종량* 실험어 수 누적폐사어 수 폐사율 (%)
돌돔 HCMV KGNS 11 4 20 8 40
HCMV PGIV-SP 4 20 8 40
HCMV FLIV-G 4 20 0 0
TDV KGNS 11 4 20 6 30
TDV PGIV-SP 4 20 7 35
TDV FLIV-G 4 20 0 0
대조구** KGNS 11 4 20 20 100
대조구** PGIV-SP 4 20 20 100
대조구** FLIV-G 4 20 1 5
참돔 HCMV KGNS 11 6 20 6 30
HCMV PGIV-SP 6 20 7 35
HCMV FLIV-G 6 20 0 0
TDV KGNS 11 6 20 6 30
TDV PGIV-SP 6 20 5 25
TDV FLIV-G 6 20 0 0
대조구** KGNS 11 6 20 18 90
대조구** PGIV-SP 6 20 17 85
대조구** FLIV-G 6 20 0 0
강담돔 HCMV KGNS 11 4 20 6 30
HCMV PGIV-SP 4 20 5 25
HCMV FLIV-G 4 20 0 0
TDV KGNS 11 4 20 7 35
TDV PGIV-SP 4 20 6 30
TDV FLIV-G 4 20 0 0
대조구** KGNS 11 4 20 20 100
대조구** PGIV-SP 4 20 20 100
대조구** FLIV-G 4 20 1 5
점농어 HCMV KGNS 11 6 20 2 10
HCMV PGIV-SP 6 20 4 20
HCMV FLIV-G 6 20 0 0
TDV KGNS 11 6 20 1 5
TDV PGIV-SP 6 20 2 10
TDV FLIV-G 6 20 0 0
대조구** KGNS 11 6 20 14 70
대조구** PGIV-SP 6 20 16 80
대조구** FLIV-G 6 20 1 5
* Log10 copies/fish
** MEM 배지를 백신과 동일한 방법으로 투여 한 돌돔
바이러스 type 및 어종에 따른 백신의 효과 비교(2)
어종 백신의
종류		 바이러스 type 바이러스 접종량* 실험어 수 누적폐사어 수 폐사율 (%)
조피볼락 HCMV KGNS 11 6 20 0 0
HCMV PGIV-SP 6 20 0 0
HCMV FLIV-G 6 20 0 0
TDV KGNS 11 6 20 0 0
TDV PGIV-SP 6 20 0 0
TDV FLIV-G 6 20 0 0
대조구** KGNS 11 6 20 10 50
대조구** PGIV-SP 6 20 11 55
대조구** FLIV-G 6 20 0 0
감성돔 HCMV KGNS 11 6 20 0 0
HCMV PGIV-SP 6 20 0 0
HCMV FLIV-G 6 20 0 0
TDV KGNS 11 6 20 0 0
TDV PGIV-SP 6 20 0 0
TDV FLIV-G 6 20 0 0
대조구** KGNS 11 6 20 8 40
대조구** PGIV-SP 6 20 9 45
대조구** FLIV-G 6 20 6 0
넙치 HCMV KGNS 11 6 20 0 0
HCMV PGIV-SP 6 20 0 0
HCMV FLIV-G 6 20 0 0
TDV KGNS 11 6 20 0 0
TDV PGIV-SP 6 20 0 0
TDV FLIV-G 6 20 0 0
대조구** KGNS 11 6 20 0 0
대조구** PGIV-SP 6 20 0 0
대조구** FLIV-G 6 20 0 0
강도다리 HCMV KGNS 11 6 20 0 0
HCMV PGIV-SP 6 20 0 0
HCMV FLIV-G 6 20 0 0
TDV KGNS 11 6 20 0 0
TDV PGIV-SP 6 20 0 0
TDV FLIV-G 6 20 0 0
대조구** KGNS 11 6 20 0 0
대조구** PGIV-SP 6 20 0 0
대조구** FLIV-G 6 20 0 0
* Log10 copies/fish
** MEM 배지를 백신과 동일한 방법으로 투여 한 돌돔
6-8: 백신 투여 어류의 중화 항체가 분석
HCMV, LCMV 그리고 TDV를 접종하고 2주후 돌돔의 미부정맥에서 채혈을 실시하였다. 분리된 혈액으로부터 혈청을 분리하였으며, 분리한 혈청을 이용하여 중화 항체가 분석을 실시하였다. 채혈한 혈청은 56℃에서 30분간 보체를 불활화 하였으며 L-15 배지로 10배 희석한 뒤 다시 2배씩 단계 희석하였다. 단계 희석된 혈청은 같은 titer의 KGN 11 (102 TCID50/25μl)을 혼합한 뒤 25℃에서 1시간 동안 바이러스를 중화시켰다. 중화 반응된 바이러스는 GF cell이 배양된 96 well tissue culture plate에 접종하였다. 각 plate의 바이러스는 25℃에서 7일간 배양 후 CPE를 관찰하였다.
표 11은 백신을 투여한 어류 혈청의 중화항체가를 나타내었다. HCMV 와 TDV 투여 2 주의 중화 항체가는 LCMV 투여 그룹에서 나타난 중화항체가에 비하여 약 27% 정도 높은 수치를 나타내었다. 그러나 HCMV 투여 2 주후의 돌돔에 KGNS 11 (104 viral particles/fish)를 복강주사하여 공격 실험 후 21 일째 까지 생존한 돌돔에서는 중화항체가의 증가가 확인 되지 않았다. 추정적으로 백신의 boosting 효과는 뚜렷하지 않을 것으로 생각 된다.
백신 투여 2 주 후 채취된 돌돔 혈청의 바이러스에 대한 중화항체가
백신 실험구 생존어* 대조구**
HCMV 127.0
127.0
4.6
LCMV 100.8
TDV 127.0
* 백신 투여 2 주후의 돌돔 그룹에 배양된 KGNS 11 ( 104 viral particles / fish ) 로 복강주사하여 공격 실험 후 21 일째 까지 생존한 돌돔
** MEM 배지를 백신과 동일한 방법으로 투여 한 돌돔
6-9: 백신의 최적 보관온도 및 기간 검증
백신의 보관 온도 및 기간 설정을 위해, 상온, 4℃, -20℃ 그리고 -70℃에서 HCMV를 3, 6, 12 개월 동안 보관하였다. 양성 대조구로는 바로 제작된 HCMV를 사용하였으며, 음성 대조구로는 MEM을 사용하였다. 돌돔에 각각의 백신을 접종하였으며, 2주 후 KGNS 11을 104 copies / fish의 농도로 접종하여 공격 실험을 실시하였다.
표 12는 백신의 온도별 보관기간별 백신의 효과 비교결과를 나타내었다. HCMV는 4℃ 이하에서 약 12개월 정도 보관이 가능하였으며, 조직 백신은 12개월 이상 상온 보관 시 그 효과가 감소하는 것을 알 수 있었다.
돌돔에 대하여 실시한 백신의 보관기간에 따른 예방효과 검증 실험
백신종류 백신보관 기간 백신보관 온도 실험어 수 누적폐사어 수 폐사율 (%)
HCMV 3개월 상온 20 9 45
4℃ 20 8 40
-20℃ 20 9 45
-70℃ 20 8 40
6개월 상온 20 9 45
4℃ 20 8 40
-20℃ 20 10 50
-70℃ 20 9 45
12개월 상온 20 10 50
4℃ 20 9 45
-20℃ 20 10 50
-70℃ 20 8 40
즉시사용 20 7 35
TDV 3개월 상온 20 9 45
4℃ 20 10 50
-20℃ 20 10 50
-70℃ 20 8 40
6개월 상온 20 10 50
4℃ 20 10 50
-20℃ 20 9 45
-70℃ 20 9 45
12개월 상온 20 13 65
4℃ 20 10 50
-20℃ 20 11 55
-70℃ 20 8 40
즉시사용 20 7 35
대조구 - 20 20 100
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Jeju National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Method for Preparing Megalocytivirus Vaccin at High Concentration <130> P14-B226 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M2F Primer <400> 1 ataacgacca gttcaaac 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M2R Primer <400> 2 ggcggcgaca atgccgtg 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> qM1F Primer <400> 3 ggcgactacc tcattaatgt 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> qM1R Primer <400> 4 ccaccaggtc gttaaatga 19

Claims (4)

  1. 다음 단계를 포함하는 메갈로사이티바이러스 감염가능한 지느러미배양세포를 이용한 메갈로사이티바이러스의 배양방법:
    (a) 메갈로사이티바이러스에 감염 가능한 돌돔, 강담돔, 참돔, 점농어, 넙치, 감성돔, 강도다리 및 조피볼락으로 구성된 군에서 선택되는 어류의 초대 지느러미 배양세포를 수득하는 단계;
    (b) 상기 수득된 지느러미 배양세포에 메갈로사이티바이러스를 접종한 후, 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 지느러미 배양세포에서 메갈로사이티바이러스를 분리 수득하는단계.
  2. 제1항 있어서, 메갈로사이티바이러스는 서브그룹 1, 서브그룹 2, 서브그룹 3 및 서브그룹 4로 구성된 군에서 선택되는 메갈로사이티바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항의 방법으로 배양된 메갈로사이티바이러스를 불활화시켜 백신을 수득하는 것을 특징으로 하는 초대 자어 배양세포를 이용한 메갈로사이티바이러스 백신의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서, 메갈로사이티바이러스의 불활화는 포르말린 처리 또는 자외선 처리에 의해 수행하는 것을 특징으로 하는 백신 제조 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111235030A (zh) * 2020-03-10 2020-06-05 北京好思康科技有限公司 一种两级混合培养生产病毒的系统
CN116536275A (zh) * 2023-06-30 2023-08-04 广东永顺生物制药股份有限公司 一株斑石鲷腹水病毒毒株及其制备方法、应用和疫苗

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