KR20090065908A - 이리도 바이러스 감염증에 대한 백신 조성물 및 이의제조방법 - Google Patents
이리도 바이러스 감염증에 대한 백신 조성물 및 이의제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 이리도 바이러스 감염증에 대한 백신조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 이리도 바이러스에 감염된 어류의 내부 장기 조직을 수득한 후, 이를 β-프로피오락톤으로 불활성화시켜 제조한 백신조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 이리도 바이러스 감염증에 대한 백신조성물은 면역효과가 우수하면서도 해산어 뿐만 아니라 담수어종에 대해서도 적용가능한 장점이 있으며, 이리도바이러스 감염어의 조직 내에 고농도로 축적되어 있는 이리도바이러스 비리온(virion) 자체를 불활성화시켜 제조됨을 특징으로 하기 때문에 세포배양에 따른 높은 제작비용을 생략하게 하여 매우 경제적이다.
이리도 바이러스, 백신, 메갈로사이티바이러스 속, 베타-프로피오락톤
Description
본 발명은 이리도 바이러스 감염증에 대한 백신조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 이리도 바이러스에 감염된 어류의 내부 장기 조직을 수득한 후, 이를 β-프로피오락톤으로 불활성화시켜 제조한 백신조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
이리도바이러스는 돔류를 비롯한 30 가지 이상의 해산어종을 감염시키는 것으로 알려져 있는데, 치어부터 성어까지 전 시기에 걸쳐서 발병할 수 있다. 이리도 바이러스에 의한 어류의 질병 발생은 국내 수산양식 현장에서 매년 심각한 경제적 손실을 입히고 있으며, 발병 시 치료가 매우 어려운 것으로 알려져 그 피해는 더욱 증폭되고 있다. 한편, 최근에는 담수 관상어에서도 이리도 바이러스에 의한 감염문제가 보고되고 있다.
이러한 이리도 바이러스에는 크게 이리도바이러스 속 (Iridovirus genus), 클로르이리도바이러스 속 (Chloriridovirus genus), 라나바이러스 속 (Ranavirus genus), 림포시스티바이러스 속 (Lymphocystivirus genus) 및 메갈로사이티바이러스 속 (Megalocytivirus genus) 등 5가지 속이 존재하는데, 이 중 척추동물을 감염시키는 이리도 바이러스로는 라나바이러스 속, 림포시스티바이러스 속 및 메갈로사이티바이러스 속이 있다. 이 중 메갈로사이티바이러스 속은 주요 양식 어류 및 관상어 모두에서 대량 폐사를 유발시키는 것으로 알려져 있어, 메갈로사이티바이러스 속의 이리도바이러스에 대한 어류용 백신 개발이 시급히 요구되고 있다.
이에 어류의 이리도 바이러스 백신에 대한 연구가 진행된 결과, GF (grunt fin) 세포에 이리도바이러스를 접종한 후, 감염된 세포 배양액을 포르말린으로 불활성화시켜 사용한 예가 있었다 (Nakajima, K. et al., Fish Pathol ., 32:205, 1997). 그러나 상기 포르말린 불활성화 백신은 FBS (fetal bovine serum)와 같은 고가의 시약, 고가의 장비 및 장치, 매우 숙련된 인력, 및 대형 무균시설의 설치를 사용하여야 하는 대량 세포 배양 방법이 필요하였다.
한편, 기존의 이리도바이러스 불활성화 백신 제조방법의 경우, 필수적으로 이리도 바이러스의 세포배양과정을 포함하고 있는데, 이러한 세포 배양법 사용에 대해 구체적인 분석을 실시한 보고에 의하면, 세포 배양의 계대 과정이 되풀이될수록 이리도 바이러스의 농도가 감소한다고 하였다 (Nakajima, K. et al., Fish Pathol., 29:29, 1994; Chou, H.Y. et al., Fish Pathol ., 33:201, 1998). 이러한 연구결과는 세포 배양에 의한 바이러스를 항원으로 사용하는 이리도바이러스 백신제조에서 일정하게 높은 수준의 이리도바이러스의 농도를 유지하는데 상당한 어려 움이 있음을 제시하는 것이며, 이러한 특성은 다양한 세포주를 사용한 세포배양에서 공통적으로 발생하는 것이라는 것이 학계의 통설로 받아들여지고 있다. 한국공개특허 2001-98698호는 혼합 불활성화 백신에 대한 것으로, 종래의 방법과 같이 이리도 바이러스를 GF 세포에 접종한 후 배양하여 그 배양액을 사용하는 것으로 역시 상기와 동일한 문제점이 있다. 또한, 연속배양에 의한 백신의 생산은 이루어지지 않고, 단순히 대형 용기(vessel)를 사용하는 배치식(batch type)의 배양이 이루어지고 있어 그 효율성은 낮은 편이다. 이로 인하여 적기에 필요한 대량의 백신공급이 쉽게 이루어지지 않고, 제작된 백신의 가격도 높은 단점이 있었다.
이에, 본 발명자들은 기존의 GF 세포를 사용한 이리도바이러스 불활성화 백신의 단점인 높은 제작비용과 세포배양의 계대 과정에 따른 바이러스의 농도 감소 문제를 해결하고, 백신효과가 우수하며 경제적으로 효율적인 이리도 바이러스 백신의 제조방법을 제공하고자 예의노력한 결과, 이리도 바이러스에 감염된 폐사어의 내부 장기 조직을 불활성화시켜 백신을 제조하여, 이의 면역효과가 우수하며 양식 해산어뿐만 아니라 관상용 담수어 등 넓은 범위의 어종에 대하여 면역효과를 가지는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 주된 목적은 면역효과가 우수하면서도 해산어 뿐만 아니라 담수어종에 대하여도 적용가능한 이리도 바이러스 감염증의 백신 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 경제적인 상기 이리도 바이러스 백신 조성물의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 이리도 바이러스 감염증에 대한 백신 조성물의 제조방법을 제공한다:
(a) 이리도 바이러스에 감염된 어류의 내부 장기 조직을 수득하는 단계; 및
(b) 상기 수득된 이리도 바이러스 함유 조직을 β-프로피오락톤으로 처리하여 상기 이리도 바이러스를 불활성화시켜 백신 조성물을 제조하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 바이러스는 메갈로사이티바이러스 속일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 내부 장기 조직은 폐사어의 비장 또는 신장조직인 것임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 상기 수득된 이리도 바이러스 함유 조직을 마쇄한 후 원심분리하여 얻은 상등액을 β-프로피오락톤으로 처리하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 경우, 바람직하게는 상기 β-프로피오락톤은 0.1~1.0%(v/v) 의 농도로 처리할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 어류는 참돔, 붉돔, 돌돔, 강담돔, 점농어, 조피볼락, 방어, 잿방어, 넙치 및 가자미로 구성된 군에서 선택된 해산어임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 또한 상기 어류는 펄구라미, 드워프구라미, 블루구라미, 실버구라미, 엔젤피쉬, 구피 및 몰리로 구성된 군에서 선택된 담수 관상어임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 메갈로사이티바이러스 속에 감염된 어류의 내부 장기 조직을 원료로 하는 것을 특징으로 하는 이리도바이러스 감염증에 대한 백신 조성물을 제공한다.
본 발명은 이리도바이러스 감염어의 조직 내에 고농도로 축적되어 있는 이리도바이러스 비리온(virion) 자체를 불활성화시키기 때문에 세포배양에 따른 높은 제작비용을 생략함으로서 경제적인 이리도 바이러스 감염증에 대한 백신의 제조방법을 제공하는 효과가 있다.
본 발명은 또한, 이리도바이러스 감염증에 대한 면역효과가 우수하면서도 해산어 뿐만 아니라 담수어종에 대해서도 적용가능한 어류의 이리도 바이러스 감염증에 대한 백신 조성물을 제공하는 효과가 있다.
본 발명은 일 관점에서, 다음의 단계를 포함하는 이리도 바이러스 감염증에 대한 백신 조성물의 제조방법에 관한 것이다:
(a) 이리도 바이러스에 감염된 어류의 내부 장기 조직을 수집하는 단계; 및
(b) 상기 수득된 이리도 바이러스 함유 조직을 β-프로피오락톤으로 처리하여 상기 이리도 바이러스를 불활성화시켜 백신 조성물을 제조하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 바이러스는 메갈로사이티바이러스 속일 수 있다.
이리도 바이러스 중 메갈로사이티바이러스 속은 MCP 유전자의 염기서열 특성에 따라 3개의 소그룹(subgroups)으로 분류되고, 주요 양식어류 및 관상어를 감염시켜 대량 폐사를 유발하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 내부 장기 조직은 폐사어의 비장 또는 신장조직인 것임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 백신 제조 원료로 사용하는 내부 장기 조직은 폐기처분하는 이리도바이러스에 감염된 어류로부터 비장, 신장 등과 같은 내부 장기 자체를 분리 채취하여 사용할 수 있는데, 이러한 감염조직에 이리도바이러스가 고밀도로 존재하고 있음을 리얼타임 PCR(Real-time PCR) 기법을 사용하여 확인하였다.
이리도바이러스에 감염된 어류는 비장과 신장 조직의 비대가 특징적인 증상으로 나타내고 있어, 경제적인 관점에서도 본 발명의 방법에 의하여 백신을 제조하 는 경우 감염 어류 한 마리로부터 수천 마리분 이상의 어류에 사용할 수 있는 백신 제조가 가능하다. 현재 양식 현장에서는 이리도바이러스에 감염된 어류 혹은 폐사한 어류를 전량 폐기하고 있으므로, 이러한 폐사어의 백신 제조 원료로서의 재활용은 폐자원의 재활용으로서 의미가 있다. 본 발명에 따른 백신 조성물은 어류에 대한 효능뿐 아니라 저렴한 제작 경비로 인해 더욱 높은 경쟁력을 가질 수 있다.
본 발명에 있어서, 또한 상기 (b)단계는 상기 바이러스의 불활성화 처리 전, 상기 수집된 조직을 마쇄한 후 원심분리하여 상등액을 얻는 단계를 더 거친 후, 상등액에 불활성화 처리하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 불활성화는 다양한 처리방법에 의하여 이루어질 수 있으나, 바람직하게는 β-프로피오락톤을 처리하여 불활성화시키며, 바람직하게는 0.1~1.0%(v/v)의 농도로 처리한다. 이때, β-프로피오락톤 처리 후, 이를 불활성화시키기 위해서 37℃에서 1~3시간 반응시킨다.
발암성이 강한 포르말린과 같은 위해물질 첨가 백신이 투여된 양식어류가 그대로 사람의 식탁에 오르는 것은 잠재적인 식품 안전성 문제가 될 수도 있음에 반하여, β-프로피오락톤은 그 자체를 불활성화시킬 수 있는 매우 안전한 방법이다.
본 발명에 있어서, 상기 어류는 참돔, 붉돔, 돌돔, 강담돔, 점농어, 조피볼락, 방어, 잿방어, 넙치 및 가자미로 구성된 군에서 선택된 해산어임을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 즉 이리도바이러스 감염증을 나타내는 해산어류로부터 내부 장기 조직을 분리하여 이용할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 자명할 것이다. 다만, 바람직하게는 상기 어류로는 돌돔을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 또한 상기 어류는 펄구라미, 드워프구라미, 블루구라미, 실버구라미, 엔젤피쉬, 구피 및 몰리로 구성된 군에서 선택된 담수 관상어임을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 즉, 이리도바이러스 감염증을 나타내는 관상어류로부터 내부 장기 조직을 분리하여 이용할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 메갈로사이티바이러스 속에 감염된 어류의 내부 장기 조직을 원료로 하는 것을 특징으로 하는 이리도바이러스 감염증에 대한 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 백신 조성물의 효과를 증가시키기 위한 보조제로서, 면역조성제(adjuvant)를 첨가혼합할 수 있다. 예를 들면, 광물유, 식물유, 알루미늄하이드록사이드, 인산알루미늄, 실리카, 무라밀디펩티드 유도체 등을 첨가, 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물을 이용한 어류의 면역은 백신 조성물을 복강 또는 근육 내 접종, 피하 접종, 침투법 및 경구투여하는 등의 방법을 이용할 수 있다. 면역화할 경우에는 바람직하게는 백신 조성물은 어류 마리당 감염조직의 양이 0.1~1mg으로 포함되도록 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 해산어와 담수관상어 양자 모두에 대한 이리도 바이러스 감염증의 예방에 매우 효과적이며, 해산어 유래 이리도 바이러스와 담수관상어 유래 이리도 바이러스 양자 모두에 대해 높은 면역 효과를 유도할 수 있다.
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실시예
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이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
1. 백신 제조를 위한 시료의 선정
1-1. 이리도 바이러스의
감염여부
확인
전형적인 이리도 바이러스 감염증상은 행동이 둔해지고, 심한 빈혈, 아가미의 점상출혈, 그리고 비장과 신장의 비대화가 특히 두드러지게 나타난다. Giemsa 용액으로 염색 시, 조직병리학적으로 비장, 신장, 간, 그리고 아가미 등의 조직에서 대형화된 비즈 세포(bead cells)들을 관찰할 수가 있다.
이러한 전형적인 이리도 바이러스의 감염증상을 보이는 경상남도 남해안의 가두리 양식장의 돌돔, 거제도 양식장의 넙치, 부산의 관상어 도매상에서 담수관상 어인 펄구라미의 비장과 신장 조직을 적출하여 -70℃에서 사용 전까지 보관하였다.
그 후, 각 감염어의 비장 조직으로부터 전체 DNA를 분리한 후, PCR을 실시하여 이리도 바이러스의 감염 여부를 확인하였다. PCR에 사용된 프라이머는 이리도 바이러스의 MCP 유전자의 염기서열 전체가 포함되도록 고안한 것으로 다음의 서열과 같다.
센스 프라이머 5'-GAGAGACCCCAACACGAC-3' (서열번호 1)
안티센스 프라이머 5'-ACCTGGTGGCTCCAGTGC-3' (서열번호 2)
상기 프라이머로 증폭시킨 각 PCR 산물은 프랩-A-유전자 DNA 분리 키트 (Prep-A-Gene DNA purification kit, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 정제하였고, 정제된 DNA는 TOPO-TA Cloning Kit (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 클로닝 한 후, Big Dye Terminator Cycle DNA Sequencing Kit (ABI PRISM PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 염기서열을 밝혔다. 그리고, 각 감염어의 비장조직에서 분리한 DNA의 염기서열은 Clustal W 프로그램과 MEGA2 프로그램 (Version 2.1. Department of Biology, Arizona State University, Tempe, AZ, USA)을 사용하여 계통적 분석을 실시하였다.
계통적 분석은 상기와 같이 각 감염어의 비장조직에서 분리한 MCP 유전자 부위 DNA 염기서열을 NCBI의 BLAST에 입력하여 기 보고된 염기서열 중 가장 유사한 것을 찾아서 서로 비교함으로써 이루어졌으며, 그 결과 상기 어류의 감염조직으로 부터 분리한 바이러스는 이리도바이러스 중 어류에서 질병을 일으키는 메갈로사이티바이러스 속 (genus Megalocytivirus)으로 확인되었다. 분석결과는 다음과 같다.
먼저, 상기 전형적인 이리도 바이러스의 감염증상을 보이는 경상남도 남해안의 가두리 양식장 돌돔의 이리도 바이러스는 RB-1, 거제도 양식장 넙치의 이리도 바이러스는 OF-1, 부산의 관상어 도매상에서 구입한 담수관상어인 펄구라미의 이리도 바이러스는 PG-1라 명명하였다.
<표 1>은 상기 바이러스 RB-1, PG-1 및 OF-1을 GenBank에 등록된 여러 메갈로사이티바이러스의 MCP 유전자 부위 DNA 염기서열과 비교하여 상동성(%)을 표시한 것이다.
<표 1> 이리도 바이러스의 MCP (major capsid protein) 유전자 비교 분석
1, RB-1; 2, RFIV-KOR-TY (AY532614); 3, RSIV-KOR-TY (AY532612); 4, RBIV-KOR-YS (AY532610); 5, RBIV-KOR-GJ (AY532609); 6, RBIV-KOR-TY3 (AY532607); 7, RBIV-KOR-TY1 (AY532606); 8, RBIV CNU-1 (AY849393); 9, OFIV (DQ198145); 10, RSIV (AY310918); 11, RBIV CNU-2 (AY849394); 12, RBIV-KOR-TY4 (AY532608); 13, OSGIV (AY894343); 14, RBIV-KOR-TY2 (AY533035); 15, SBIV-KOR-TY (AY532613); 16, SBIV (AY310917); 17, GSDIV (AY285746); 18, LYCIV (AY779031); 19, RSIV Ehime-1 (AB080362); 20, ISKNV (AF371960); 21, DGIV (AY989901); 22, MCIV (AY936203); 23, PG-1; 24, DGIV (AY285744); 25, ALIV (AB109368); 26, RBIV-KOR-CS (AY532611); 27, TRBV (AY590687); 28, FLIV-EJ (AY633987); 29, OFIV (AY661546); 30, FLIV-JJ (AY633988); 31, TBIV (AB166788); 32, OF-1.
메갈로사이티바이러스 속은 MCP 유전자의 염기서열 특성에 따라 3개의 소그룹(subgroups)으로 분류되는데, 상기 바이러스 RB-1, PG-1 및 OF-1은 각각 메갈로사이티바이러스의 소그룹 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ에 속하는 것으로 밝혀졌다.
도 1은 메갈로사이티바이러스 속의 분류학적 계통 관계를 표시하고 있으며, 상기 <표 1>의 결과와 일치한다.
상기의 분석 결과는, 상기 이리도바이러스 감염증상을 보이는 어류의 내장조직의 바이러스는 공지된 메갈로사이티바이러스 속 바이러스와 유전적으로 99% 이상의 유사성을 가지고 있으며, 이것은 공지된 메갈로사이티바이러스 속 바이러스를 사용하는 경우에도 동일한 결과를 얻을 수 있다는 것을 의미한다.
1-2: 분리된
이리도바이러스에
의한 어종별 폐사율 분석
상기 실시예 1-1에서 확보한 메갈로사이티바이러스의 어류에 대한 병원성을 확인하기 위해 인위감염 실험을 실시하였으며, 그 방법은 다음과 같다.
해산어인 돌돔 (치어, 성어), 참돔 (치어, 성어), 점농어, 조피볼락, 넙치, 감성돔을 남해안 양식장에서 구입하였고, 담수관상어인 펄구라미, 드워프구라미, 엔젤피쉬를 부산의 관상어 도매상에서 구입하였다. 해산어는 250ℓ 수조에 담수어는 40ℓ 수조에 각각 어종별로 넣은 후 수온이 25±1℃가 되도록 하여 2주일간 순치시켰다. 각 어종은 PCR 방법을 이용하여 이리도 바이러스 미감염을 확인한 후, 각각 15마리씩 복강주사를 통해 아래와 같은 방법으로 공격 실험하였다.
상기 실시예 1-1의 각 감염어의 비장 조직에 PBS 완충액을 첨가하여 마쇄한 후, 그 조직 마쇄액을 공격 실험에서 접종액으로 사용하였다. 바이러스 접종액은 0.45 ㎛ 필터에 통과시킨 후, 어체중 1㎏당 감염조직 10㎍에 해당하는 조직 분쇄물을 복강 내에 0.1㎖씩 주사하였고, 대조군으로서 PBS를 각 어종에 대해 0.1㎖씩 복강 내 주사하였다.
그 후, 수온 25±1℃의 격리된 수조에서 사육하면서 25일간 폐사를 관찰하였고, 폐사어의 이리도 바이러스 감염 유무는 다음과 같은 두 가지 방법을 사용하여 판별하였다. 첫 번째는 폐사어의 비장 조직에서 전체 DNA를 분리 후 PCR 방법을 사용하였고, 두 번째는 광학현미경을 사용하여 비장 조직 내에서의 대형화된 비즈 세포(bead cells)의 출현을 관찰하는 방법을 사용하였다.
<표 2> 이리도바이러스에 의한 어종별 폐사율
그 결과, <표 2>에 나타난 바와 같이, 메갈로사이티바이러스 RB-1, PG-1 및 OF-1은 돌돔 치어와 성어에서 모두 100%의 누적폐사율을 나타내었다. 또한, 참돔, 점농어, 조피볼락, 넙치, 펄구라미, 드워프구라미의 6 어종에 대해서는 40~87%의 폐사율을 보였고, 그 중 참돔에서 가장 높은 폐사율이 나타났다.
엔젤피쉬는 0~13%로 매우 낮은 폐사율을 나타내었고, 감성돔의 경우에는 세 가지 바이러스에 대해 단 한 마리의 폐사도 없었다. 모든 대조군(PBS)에서는 폐사가 없었으며, PCR과 현미경적 관찰을 통한 이리도 바이러스 질병 검사에서 대조군을 제외한 전 폐사 어에서 양성 반응을 나타내었으며, 모든 폐 사어가 이리도 바이러스 감염에 의해 폐사했다는 것을 확인하였다.
상기의 결과는 해산어에서 분리한 메갈로사이티바이러스 RB-1 및 OF-1과 담수어에서 분리한 메갈로사이티바이러스 PG-1은 실험에 사용한 대부분의 해산어와 담수어종에 대해 높은 병원성을 가졌으며, 모두 광범위한 숙주 감염성을 가진다는 것을 의미한다.
1-3: 감염 조직 내 이리도 바이러스
particle
의 농도 분석
본 발명의 백신 제작에 사용할 원료를 효과적으로 선택하기 위하여, 감염 조직(비장, 신장)에서 가장 많은 이리도 바이러스를 포함하는 어종을 판별하였다. 양식장에서 이리도바이러스에 의한 피해가 특히 많은 돌돔, 참돔, 점농어, 조피볼락, 넙치와 담수관상어인 펄구라미, 드워프구라미 등을 대상으로 조사하였으며 그 방법은 아래와 같다. 돌돔 (체중 200 ± 28g), 참돔 (체중 500 ± 42g), 점농어 (체중 400 ± 37g), 조피볼락 (체중 30 ± 4g), 넙치 (체중 200 ± 29g), 펄구라미 (체중 4 ± 1g), 드워프구라미 (체중 4 ± 1g) 등 7 어종에 대해 복강 내 주사를 통해 메갈로사이티바이러스 RB-1, PG-1 및 OF-1로 각각 감염시켰고, 죽기 직전 상태의 감염어 10마리씩으로부터 비장과 신장을 분리하여 무게를 측정하였다.
감염어의 비장과 신장 1㎎으로부터 전체 DNA를 분리하여 리얼-타임 PCR(real-time PCR) 분석에 사용하였다. 각 10마리씩의 어종에 대해 분석하였으며, 바이러스 카피 수(viral copy numbers) / ㎎ (비장 또는 신장 조직) 값은 10마리에 대한 평균값으로 구하였다.
Real-time PCR 분석은 Rotor-Gene 6000 (Corbett Research)을 사용하여 아래와 같은 방법으로 실시하였다. Real-time PCR 반응을 위해서 1×EvaGreen dye, 1×PCR buffer (10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50mM KCl), 2.5 mM MgCl2, 0.3 mM dNTPs, 각각의 0.5 pM primer, 2.5 U Taq DNA polymerase 그리고 1㎕ 전체 DNA를 PCR tube에 첨가하여 최종 20㎕의 반응액이 되도록 하였고, 유전자 증폭 반응 조건은 다음과 같이 하였다: 94℃에서 10분간 1 사이클; 94℃에서 10초, 52℃에서 15초, 72℃에서 20초간 40사이클. 표준곡선(Standard curve)을 위한 플라스미드 DNA(plasmid DNA)의 양을 측정한 결과 5.0×109 copies / ㎕로 나타났다.
감염 어종 별 비장 내에서의 바이러스 카피 수(viral copy numbers) 결과는 <표 3>, <표 4> 및 <표 5>와 같다.
<표 3> 메갈로사이티바이러스 RB-1에 감염된 어류의 비장 또는 신장 조직 내 바이러스 카피 수(viral copy numbers) 비교
| 어류명 | 어체무게(g) | 평균값(10마리) Viral copy numbers ×107 /mg(비장 또는 신장) |
| 돌돔 | 200 ± 28 | 27 ± 6 |
| 참돔 | 500 ± 42 | 9.7 ± 3.2 |
| 점농어 | 400 ± 37 | 9.2 ± 2.1 |
| 조피볼락 | 30 ± 4 | 4.9 ± 1.5 |
| 넙치 | 200 ± 29 | 5.2 ± 1.7 |
| 펄구라미 | 4 ± 1 | 8.2 ± 2.3 |
| 드워프구라미 | 4 ± 1 | 3.3 ± 1.2 |
<표 4> 메갈로사이티바이러스 OF-1에 감염된 어류의 비장과 신장 조직 내 바이러스 카피 수(viral copy numbers) 비교
| 어류명 | 어체무게(g) | 평균값(10마리) Viral copy numbers ×107 /mg(비장 또는 신장) |
| 돌돔 | 200 ± 28 | 19 ± 5 |
| 참돔 | 500 ± 42 | 9.5 ± 2.5 |
| 점농어 | 400 ± 37 | 8.7 ± 1.8 |
| 조피볼락 | 30 ± 4 | 6.2 ± 1.5 |
| 넙치 | 200 ± 29 | 7.7 ± 2.0 |
| 펄구라미 | 4 ± 1 | 9.0 ± 2.8 |
| 드워프구라미 | 4 ± 1 | 2.5 ± 1.4 |
<표 5> 메갈로사이티바이러스 PG-1에 감염된 어류의 비장과 신장 조직 내 바이러스 카피 수(viral copy numbers) 비교
| 어류명 | 어체무게(g) | 평균값(10마리) Viral copy numbers ×107 /mg(비장 또는 신장) |
| 돌돔 | 200 ± 28 | 31 ± 6 |
| 참돔 | 500 ± 42 | 8.9 ± 1.6 |
| 점농어 | 400 ± 37 | 9.6 ± 2.7 |
| 조피볼락 | 30 ± 4 | 3.7 ± 1.5 |
| 넙치 | 200 ± 29 | 5.8 ± 1.9 |
| 펄구라미 | 4 ± 1 | 8.7 ± 2.2 |
| 드워프구라미 | 4 ± 1 | 3.8 ± 1.7 |
그 결과, 메갈로사이티바이러스 RB-1, PG-1 및 OF-1에 따른 바이러스 카피 수는 큰 변화를 보이지 않았다. 그러나 어종에 따라서는 바이러스 카피 수의 유의적인 차이가 나타났으며, 동일한 감염 조직량 (1㎎)에서 가장 많은 이리도 바이러스를 포함하고 있었던 어종은 돌돔으로 나타났다. 그러므로 소량의 감염조직에서 충분한 양의 이리도 바이러스를 포함하고 있는 돌돔을 본 발명의 백신 제작을 위한 원료로 선정하였다.
실시예
2. 이리도 바이러스 감염증에 대한 불활성화 백신의 제조
2-1: 백신 제조를 위한 시료
상기 실시예 1-1의 메갈로사이티바이러스 RB-1에 감염된 돌돔의 비장과 신장 조직을 백신 제조를 위한 시료로 사용하였으며, 불활성화 과정 전까지의 처리 방법은 다음과 같다.
상기 실시예 1-1의 메갈로사이티바이러스 RB-1에 감염된 돌돔으로부터 비장과 신장 조직을 적출하여 10 ㎎/㎖ 농도가 되도록 PBS (phosphate-buffered saline) 완충액을 첨가하여 마쇄하였다. 마쇄액은 300×g, 5분간 원심분리하여 상등액을 취하였고, 그 상등액을 다시 2600×g, 10분간 원심분리하여 상등액을 취한 후, 그 상등액을 백신 제조를 위한 시료로 사용하였다.
다만, 본 발명에서는 이미 메갈로사이티바이러스에 감염된 돌돔을 구입하여 이의 비장과 신장 조직을 백신 제조를 위한 시료로 사용하였으나, 상기 실시예 1-1의 계통분석결과와 같이 본 실시예에서 사용한 바이러스는 이미 공지된 메갈로사이티바이러스 속의 바이러스이다. 이에 실시예 1-1에 제시된 타 메갈로사이티바이러 스 및 다른 속의 이리도바이러스를 어류에 인위적으로 감염시킨 후, 감염된 어류의 감염조직을 사용하는 경우에도 동일한 결과를 얻을 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
2-2: 불활성화 방법
본 발명의 불활성화 백신을 제조하기 위하여 세 가지의 다른 처리 방법을 각각 사용하였고, 그 방법은 다음과 같다.
(a) β-프로피오락톤 처리
상기 실시예 2-1에서 얻은 시료에 β-프로피오락톤을 최종농도 0.01%, 0.1%, 1%(V/V)가 되도록 각각 혼합하여 4℃에서 5시간 반응시켜서 바이러스를 불활성화시킨 후, 다시 37℃에서 2시간 정치하여 β-프로피오락톤을 불활성화시켰다.
(b) 포르말린 처리
상기 실시예 2-1에서 얻은 시료에 포르말린을 최종농도 0.1%, 1%(V/V)가 되도록 각각 혼합하여 4℃에서 10일간 반응시켜서 바이러스를 불활성화시켰다.
(c) 열처리
고열처리 (180℃) 방법으로 불활성화시키기 위해서 용기를 제작하였고, 지름 0.3mm의 스테인레스 관을 코일(coil) 형태로 약 5㎖ 용량이 되도록 하여 양끝으로 스크류 마개를 끼울 수 있도록 하였다. 스테인레스 관에 상기 실시예 2-1에서 얻은 시료를 넣고 온도 조절이 가능한 기름 속에 스테인레스 관을 넣음으로써 고열처리 (180℃)시켰다. 시료는 60℃ 1분, 100℃ 1분, 180℃ 10초간 각각 열처리하여 불활성화시켰고, 60℃와 100℃ 반응시에는 동일 용기에 시료를 넣어 가열시킨 물에 중탕시킴으로써 불활성화시켰다. 열처리시킨 시료는 얼음 위로 옮겨서 빠르게 식혔다.
2-3: 바이러스의 불활성화 확인
상기 과정을 거친 시료가 완전히 불활성화되었는지 확인하기 위해서 상기와 같이 불활성화 처리된 각 시료의 0.1㎖를 돌돔 (체중 5 ± 2g) 20마리에 복강 내 주사하였으며, 대조군으로서 불활성화시키지 않은 시료 0.1㎖를 주사하여 6주간 폐사를 관찰하였다.
<표 6> 불활성화 백신 주사에 의한 돌돔의 폐사율
| 불활화 방법 | 처리 방법 | 실험어 수 | 누적 폐사어 수 | 폐사율 (%) |
| β-프로피오락톤 불활성화 처리 | 0.01%, 5시간 | 20 | 16 | 80 |
| 0.1 %, 5시간 | 20 | 0 | 0 | |
| 1.0 %, 5시간 | 20 | 0 | 0 | |
| 포르말린 불활성화 백신 | 0.1 %, 10일 | 20 | 0 | 0 |
| 1.0 %, 10일 | 20 | 20 | 100 | |
| 포르말린 | 1.0% | 20 | 20 | 100 |
| 열처리 불활성화 백신 | 60℃ 1분 | 20 | 18 | 90 |
| 100℃ 1분 | 20 | 0 | 0 | |
| 180℃ 10초 | 20 | 0 | 0 | |
| 대조군 (처리 전 시료) | 20 | 20 | 100 | |
그 결과, <표 6>에 나타난 바와 같이, 불활성화시키지 않은 시료를 주사한 대조군은 2주일 이내에 100% 폐사하였다. 또한, β-프로피오락톤을 0.01% 처리한 실험군에서는 80% 폐사하였으나, 0.1%와 1% 처리시에는 폐사가 전혀 발생하지 않아 완전히 불활성화된 것을 확인하였다. 포르말린을 0.1% 처리시에는 폐사가 발생하지 않았지만, 1% 처리시에는 주사 후 1일 이내에 100% 폐사하였다. 그러나, 별도로 1%의 포르말린만을 주사한 대조군의 경우에도 100% 폐사하는 것으로 나타났으며, 이에 1%의 포르말린으로 불활성화시킨 백신은 이물질로서 첨가된 포르말린 자체의 어류 맹독성으로 인한 폐사였음을 확인하였다.
한편, 열처리 시, 60℃ 1분 처리한 실험군에서는 90% 폐사하였지만, 100℃ 1분, 180℃ 10초간 처리한 실험군에서는 폐사가 나타나지 않았다. 즉, β-프로피오락톤 0.1% 이상, 포르말린 0.1% 이상 그리고 열처리 100℃ 1분 이상, 180℃ 10초 이상 등의 조건하에서 시료가 완전히 불활성화된 것을 확인하였다.
실시예
3. 백신의 제조방법과 농도에 따른 어종별 효과
상기 실시예 2에서 제조된 불활성화 백신의 처리방법과 농도에 따른 백신의 효능을 돌돔과 참돔을 대상으로 다음과 같이 실험하였다.
PCR 방법을 사용하여 이리도바이러스에 감염되지 않은 것을 확인한 돌돔 (5±2g)과 참돔 (7±3g)을 실험군 당 20마리씩 40ℓ 수조에 수용하였고, 상기 실시예 2에서 제조된 불활성화 백신을 어류의 복강 내에 0.1㎖씩 주사했을 때 투여되는 감염 조직의 양이 1㎎이 되도록 PBS 완충액에 희석하여 각각 주사한 후 25℃에서 사육하였다. 또한, 백신의 농도에 따른 효능을 분석하기 위하여, 어류 1 마리당 투여되는 감염 조직의 양을 0.1㎎이 되도록 PBS 완충액에 희석하여 0.1㎖씩 복강 내에 각각 주사한 후 25℃에서 사육하였다. 대조군으로서는 PBS 완충액을 0.1㎖씩 주사하였고, 백신 처리한 실험군과 동일한 방법으로 사육하였다.
그로부터 2주일 후, 상기 실시예 1에서 분리한 메갈로사이티바이러스 RB-1을 각 실험군과 대조군에 상기 실시예 1의 1-2와 동일한 방법으로 복강주사를 통해 직접 감염시켰고, 감염시킨 어류는 30일간 사육하면서 폐사율을 조사하였다.
<표 7>은 그 실험 결과를 표시하며, <표 7> 상의 RPS(relative percent survival)는 다음과 같은 식을 기초로 산출하였다.
RPS = [(대조군 폐사율 - 실험군 폐사율)] / 대조고 폐사율 × 100
<표 7> 본 발명의 불활성화 백신을 면역시킨 후 이리도 바이러스로 감염시킨 어류의 폐사율
*: 백신에 포함된 감염 조직의 양 (㎎) / 마리
조사결과, <표 7>에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 백신조성물을 돌돔에 복강 내 투여한 경우, 높은 효과를 나타내지는 않았다. 즉, 포르말린 처리와 열처리 방법으로 제작한 백신은 대조군과 마찬가지로 모두 100%의 누적폐사율을 보였다. 그러나, β-프로피오락톤 불활성화 백신의 경우, 0.1㎎의 감염조직을 사용한 실험군에서는 모두 폐사하였지만 1㎎의 감염조직을 사용한 실험군에서는 20~25%의 RPS를 나타내어 다른 불활성화 백신과는 차이를 보였으며, β-프로피오락톤의 농도를 0.1%와 1%로 다르게 처리한 실험군 사이에서 유의적인 차이점은 나타나지 않았다.
참돔의 경우 돌돔에서 보다 매우 높은 면역 효과를 나타내었다. 그 중 β-프로피오락톤 불활성화 백신을 사용한 실험군에서 특히 높은 효과를 나타내었는데, 감염조직의 양 1㎎이 포함된 β-프로피오락톤 불활성화 백신 실험군에서는 87~93%의 높은 RPS 수치를 보였으며, 감염조직의 양 0.1㎎이 포함된 백신 실험군에서도 87%로 높게 나타났다. 감염조직 1㎎이 포함된 포르말린 및 열처리 불활성화 백신 실험군은 53~67%의 RPS 수치를 나타내었고, 1/10의 감염조직의 양 (0.1㎎)이 포함된 경우 RPS 수치가 27~33%로 감소하였다.
한편, 참돔의 대조군에서는 75%의 누적폐사율을 나타내었지만, 돌돔 대조군의 경우 100%의 누적폐사율을 보여 이리도 바이러스의 병원성이 어종에 따라 다른 것을 확인하였다.
상기의 실험결과는 포르말린이나 열처리 방법에 의한 불활성화 방법과 달리 본 발명에 따른 조건으로 β-프로피오락톤을 사용하여 항원을 불활성화시킨 경우 타 불활성화 방법에 의해 면역효과를 보이지 않은 어종에 대해서도 면역효과를 나타냄을 보이는 것으로서, 이리도 바이러스 감염증에 대한 백신조성물에 대하여 불활성화 방법으로서 β-프로피오락톤을 이용하는 것이 가장 우수한 면역효과를 가져옴을 의미한다.
한편, 모든 실험군에서 감염조직의 양 1㎎이 포함된 백신이 0.1㎎이 포함된 백신에 비해 높은 면역 효과를 보인바, 감염조직의 양은 1mg 이상 10mg 이하의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다.
이에 이후의 실험에서는 모두 감염조직 1㎎이 포함된 백신을 사용하였으며, 바이러스의 완전한 불활성화를 확인한 최소한의 시간과 최소량의 첨가물 처리 방법인 0.1% β-프로피오락톤 처리, 0.1% 포르말린 처리, 그리고 180℃ 10초 열처리 등의 방법을 이후의 실험에 사용하였다.
실시예
4. 백신의 종류, 대상 어종, 면역기간, 면역경로 및 바이러스 타입에 따른 백신의 효과
상기 실시예 3에서 백신의 제조방법과 농도에 따른 백신의 효과를 분석하였으며, 세 가지 제조방법 중 β-프로피오락톤을 처리하였을 때, 그리고 감염조직 1㎎이 포함된 백신을 투여했을 때 가장 높은 면역 효과가 나타나는 것을 확인하였다.
동일 농도 (1㎎)의 백신을 사용하여 백신의 종류, 대상어종, 면역기간, 면역경로 그리고 이리도 바이러스 타입을 달리하였을 때의 백신의 효능을 항목별로 각 각 실험하였고, 그 방법은 다음과 같다.
실험 어종은 이리도바이러스에 감염되지 않은 것으로 확인된 해산어 (돌돔; 5±2g, 참돔; 7±3g)와 담수어 (펄구라미; 3±1g)를 사용하였고, 실험군 당 20마리씩 40ℓ 수조에 수용하였다.
상기 실시예 3에서 제조된 불활성화 백신을 0.1㎖씩 복강 또는 근육 내에 각각 주사한 후 25℃에서 사육하였고, 대조군으로서 PBS 완충액을 0.1㎖씩 동일한 방법으로 주사하였다.
이러한 면역처리 후 2주와 4주 경과 시점에 메갈로사이티바이러스 속의 세 가지 소그룹을 대표하는 실시예 1에서 분리한 메갈로사이티바이러스 RB-1, PG-1 및 OF-1을 복강 내에 주사하여 감염시켰다. 감염시킨 어류는 20일간 사육하면서 폐사율을 조사하였고, RPS를 산출하였다.
실험에 따른 결과는 다음의 <표 8>, <표 9> 및 <표 10>과 같다.
<표 8> 불활성화 백신으로 면역시킨 후 이리도 바이러스로 감염시킨 참돔의 폐사율
*: 백신에 포함된 감염 조직의 양 (㎎) / 마리
<표 9> 불활성화 백신으로 면역시킨 후 이리도 바이러스로 감염시킨 펄구라 미의 폐사율
*: 백신에 포함된 감염 조직의 양 (㎎) / 마리
<표 10> 불활성화 백신으로 면역시킨 후 이리도 바이러스로 감염시킨 돌돔의 폐사율
*: 백신에 포함된 감염 조직의 양 (㎎) / 마리
실험결과, 상기 <표 8> 및 <표 9>에 나타난 바와 같이, 실시예 3에서 제조된 세 Ⅰ가지 이리도 바이러스 불활성화 백신은 해산어인 참돔과 담수어인 펄구라미 모두에서 면역시킨 후 2주째와 4주째의 공격 실험에서 대조군에 비해 높은 생존률을 보여 이리도 바이러스 감염에 대하여서 예방 효과가 탁월하다는 것을 증명하였다. 또한, 복강 내와 근육 내의 각각 다른 백신 투여 경로에 따른 유의미한 차이는 나타나지 않았고, 세 가지 백신 중, β-프로피오락톤 불활성화 백신은 다른 두 백신에 비해 3 어종 모두에서 높은 예방 효과를 보였다.
상기 백신은 메갈로사이티바이러스 속 바이러스 소그룹 Ⅰ인 RB-1을 사용하여 제작한 백신으로서, 상기 표 8 내지 10의 결과는 메갈로사이티바이러스 RB-1을 사용하여 제작한 백신이 메갈로사이티바이러스 RB-1뿐만 아니라, 어류 이리도 바이러스의 다른 소그룹인 메갈로사이티바이러스 OF-1와 PG-1에 대해서도 교차 면역반응을 나타냄을 의미한다.
한편, 표 10에 나타난 바와 같이, 돌돔의 경우 실시예 3과 마찬가지로 β-프로피오락톤 불활성화 백신에서 20~30% RPS를 보였지만, 나머지 두 백신에서는 효과를 나타내지 않았다.
실시예
5. 백신의
부스팅
(
boosting
) 효과
상기 실시예 3에서 제조된 세 가지 불활성화 백신의 효과를 더욱 증대시키는 방법을 찾기 위해서, 부스팅(boosting) 효과를 실험하였고, 그 방법은 다음과 같다.
상기 실시예 4와 동일하게 돌돔 (5±2g), 참돔 (7±3g), 펄구라미 (3±1g)를 실험군 당 20마리씩 40ℓ 수조에 수용한 후, 상기 실시예 3에서 제조한 세 가지 불활성화 백신을 0.1㎖씩 복강 내에 각각 주사한 후 25℃에서 사육하였고, 대조군은 PBS 완충액을 0.1㎖씩 동일한 방법으로 주사하였다.
이러한 면역처리 후 4주 경과 시점에 각각의 실험군과 대조군에 대해 한 번 더 동일한 방법으로 면역시켰으며, 다시 2주 경과 시점에 상기 실시예 1-1의 메갈로사이티바이러스 RB-1을 복강 내에 주사하여 감염시켰다. 감염시킨 어류는 20일간 사육하면서 폐사율을 조사하였고, RPS를 산출하였다.
<표 11> 불활성화 백신으로 2회 연속 복강 내 면역시킨 후 이리도 바이러스고 감염시킨 어류의 폐사율
a: 백신에 포함된 감염 조직의 양 (㎎) / 마리
b: 0.1% β-프로피오락톤
c: 0.1% 포르말린
d: 열처리 180℃ 10초
그 결과, <표 11>에 나타난 바와 같이, 포르말린과 열처리 불활성화 백신에서는 상기 실시예 4의 표 8 내지 10과 대비하였을 때, 유의적인 변화가 나타나지 않았다. 그러나 β-프로피오락톤 불활성화 백신을 돌돔에 면역시킨 경우, 1회 면역 시에는 25%의 RPS를 나타내었지만 2회 면역시에는 40%의 RPS를 나타내어 백신의 효과가 증대되었음을 확인하였다.
실시예
6: 경제성 분석
상기 표 3은 이리도바이러스에 감염된 돌돔의 비장과 신장 조직 1㎎에는 약 2.7×108의 바이러스 카피 수(viral copy numbers)가 있음을 나타냈으며, 상기 실시예 5의 결과는 본 발명의 열처리 불활성화 백신은 감염된 비장과 신장 조직 1㎎에 해당하는 양을 접종시에 백신의 높은 효과를 보임을 나타내었다.
<표 12> 이리도 바이러스에 감염된 돌돔 한 마리로부터 제조 가능한 백신의 양
| 어종 | 감염 유무 | 어체중 (g) | 마릿수 | 비장 (㎎) | 신장 (㎎) | 비장+신장 (㎎) | 백신 처리 가 능한 어류 수 (마리) |
| 돌돔 | 감염 | 22±4 | 5 | 94±12 | 107±15 | 201±27 | 201 |
| 200±28 | 5 | 560±78 | 813±153 | 1,373±231 | 1,373 | ||
| 비감염 | 22±4 | 5 | 17±5 | 35±6 | 52±11 | - | |
| 200±28 | 5 | 180±41 | 315±47 | 495±88 | - |
<표 12>는 이리도 바이러스에 감염된 돌돔 한 마리로부터 제조 가능한 백신의 양을 표시하는 것으로, 백신의 원료로서 감염어의 비장과 신장을 모두 사용하며, 신장 (㎎)은 두신 전부를 취한 값이다.
이리도 바이러스에 감염된 돌돔은 감염되지 않은 돌돔에 비해 비장과 신장의 비대 증상이 매우 높게 나타났으며, 약 200g 무게의 돌돔 한 마리는 이리도 바이러 스 감염시에 비장과 신장 무게를 합한 값이 1,373±408㎎으로 나타났다. 이것은 이리도 바이러스에 감염된 돌돔 (200g) 한 마리로부터 약 1,373마리의 어류에 접종할 수 있는 백신을 제작할 수 있다는 것을 보여준다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 이리도 바이러스인 메갈로사이티바이러스 속의 분류학적 계통 관계도이다.
<110> Pukyong National University Industry-University Cooperation Foundation
<120> Vaccine Composition for Irido Virus Infectious Diseases and the
Method Thereof
<130> P07-B228
<160> 2
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR sense primer that amplifies MCP gene
<400> 1
gagagacccc aacacgac 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR antisense primer that amplifies MCP gene
<400> 2
acctggtggc tccagtgc 18
Claims (8)
- 다음의 단계를 포함하는 이리도 바이러스 감염증에 대한 백신 조성물의 제조방법:(a) 이리도 바이러스에 감염된 어류의 내부 장기 조직을 수득하는 단계; 및(b) 상기 수득된 이리도 바이러스 함유 조직을 β-프로피오락톤으로 처리하여 상기 이리도 바이러스를 불활성화시켜 백신 조성물을 제조하는 단계.
- 제1항에 있어서,상기 바이러스는 메갈로사이티바이러스 속인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항에 있어서,상기 내부 장기 조직은 폐사어의 비장 또는 신장조직인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,상기 (b) 단계는 상기 수득된 이리도 바이러스 함유 조직을 마쇄한 후 원심 분리하여 얻은 상등액을 β-프로피오락톤으로 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서,상기 β-프로피오락톤은 0.1~1.0%(v/v)의 농도로 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,상기 어류는 참돔, 붉돔, 돌돔, 강담돔, 점농어, 조피볼락, 방어, 잿방어, 넙치 및 가자미로 구성된 군에서 선택된 해산어임을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,상기 어류는 펄구라미, 드워프구라미, 블루구라미, 실버구라미, 엔젤피쉬, 구피 및 몰리로 구성된 군에서 선택된 담수 관상어임을 특징으로 하는 방법.
- 메갈로사이티바이러스 속에 감염된 어류의 내부 장기 조직을 원료로 하는 이리도 바이러스 감염증에 대한 백신 조성물.
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