KR102162572B1

KR102162572B1 - 키토산 나노입자를 이용한 바이러스성 출혈성 패혈증에 대한 백신 조성물

Info

Publication number: KR102162572B1
Application number: KR1020200034822A
Authority: KR
Inventors: 정성주; 사잘 콜; 김위식
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2020-03-23
Filing date: 2020-03-23
Publication date: 2020-10-07
Also published as: KR20200101308A

Abstract

본 발명에 따른 백신 조성물은 넙치에서 발생하는 바이러스성 출혈성 패혈증을 효과적으로 예방할 수 있으므로, 넙치의 양식 산업 등에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 침지 및 경구 투여를 통해서도 효과를 나타내기 때문에 성어기뿐만이 아니라 주사 스트레스로 폐사가 발생하여 주사백신을 사용할 수 없는 치어기에도 간편한 방법으로 바이러스성 출혈성 패혈증을 예방 및 치료할 수 있다.

Description

키토산 나노입자를 이용한 바이러스성 출혈성 패혈증에 대한 백신 조성물{Vaccine Composition for Viral Hemorrhagic Septicemia Using Chitosan Nanoparticles}

본 발명은 키토산 나노입자를 이용한 바이러스성 출혈성 패혈증에 대한 백신 조성물, 이의 제조방법 및 이를 이용한 바이러스성 출혈성 패혈증의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)는 바이러스성 출혈성 패혈증(VHS) 질병의 원인 병원체이다. VHS는 유럽, 미국 및 동남 아시아 전역의 담수 및 해양 어류 70 종 이상에 질병을 일으킨다. 우리나라는 2001년 처음 발생한 이후 빈번한 발생으로 엄청난 경제적 손실을 입었다.

바이러스성 출혈성 패혈증은 주로 늦은 겨울과 봄철 수온이 8-15℃에서 넙치의 모든 연령층에서 50-70%의 사망률을 초래한다. 특히 종묘배양장에서 18-20℃에서 사육하던 넙치를 수온이 14-15℃인 중간육성 양어장으로 운반해 오는 7 cm 전후의 넙치는 운송 스트레스와 수온 변화에 의한 스트레스로 바이러스 공격에 취약하다. 더구나 VHSV는 수온이 8-15℃에서 높은 폐사를 유발하게 되므로 이 시기의 넙치에 가장 높은 폐사를 유발하게 된다. 일단 넙치가 바이러스에 감염되어 질병 증상을 보이기 시작하면 생존 가능성이 매우 낮아 1-2주 이내에 사망한다.

백신접종은 경제적, 환경적 관점에서 바이러스성 출혈성 패혈증에 대한 가장 효과적인 예방법이다. 불활화백신, 약독화 생백신, 원핵 및 진핵 발현 시스템의 재조합 백신 및 DNA 기반 백신을 포함하여 30년 이상 다양한 면역 전략이 시도되었다. 이 모든 면역 전략 중에서 DNA 백신은 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증에 대한 가장 유망한 백신 접종 전략임이 입증되었다. 그러나 한국을 비롯한 대부분의 국가에서 식용 어류에 DNA 백신을 사용하는 것에 대한 법적 제한이 있기 때문에 DNA 백신을 사용할 수는 없다. 그러므로 강력하고 오래 지속되는 면역 반응을 이끌어 낼 수 있을 뿐만 아니라 양식에 적합한 것으로 입증된 경험적 배합에 기반한 백신의 개발이 필수적이다.

주사면역은 크기가 작은 어류에 스트레스를 유발하여 주사 스트레스만으로도 어체를 사망에 이르게 할 수 있으므로 15 cm 이하의 넙치에는 적용하기 어렵다. 또한 개체별로 주사해야하므로 노동력이 많이 들며 백신 접종을 위한 추가 비용이 필요하다. 따라서, 주사면역법의 한계를 극복하기 위해 어체에 스트레스를 주지 않는 점막(침지/구강) 경로로 백신 전달 경로를 대체 할 필요성이 제기되었다. 어류에서 점막(침지/구강) 경로로 백신을 전달하는 방법이 전세계적으로 시도되고 있으나 주사백신에 의하여 효능면에서 아주 낮다.

포르말린 불활화 항원은 경구 경로를 통해 전달될 때 생체 내 환경에서 분해되거나, 침지 경로를 통해 투여될 때 면역 세포에 도달하지 못하여 숙주 어류에서 면역 유발에 실패하게 된다. 따라서 불활화 VHSV 항원을 환경(생체 내 및 외부 환경 모두)의 분해로부터 보호할 수 있을 뿐만 아니라 면역계를 유도하기 위해 효율적으로 숙주 면역 기관으로 전달할 수 있는 전달 시스템이 필요하다.

나노 결합/나노 캡슐화에 사용되는 여러 가지 고분자 중에서 키틴(갑각류 껍질의 주성분)을 탈 아세틸화시킨 천연 생체 고분자인 키토산((1,4)-2-아미노-2-데옥시-β-D-글루칸)은 뛰어난 생체 적합성, 낮은 면역원성, 그리고 다른 폴리머들에 비해 낮은 세포 독성 때문에 많은 주목을 받고 있다.

본 발명자들은 어류에서의 VHSV 감염 방어에 효과적인 백신을 개발하기 위해 노력하였다. 그 결과, 키토산 나노입자를 사용하여 불활화된 VHSV를 캡슐화하여 제조한 백신이 넙치에서 VHSV에 대한 높은 방어 효과를 보임을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 바이러스성 출혈성 패혈증 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 바이러스성 출혈성 패혈증 백신 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신 조성물을 이용한 바이러스성 출혈성 패혈증에 대한 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)의 불활화 균체를 키토산(chitosan)으로 캡슐화한 나노구(nanosphere)를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.

본 발명자들은 어류에서의 VHSV 감염 방어에 효과적인 백신을 개발하기 위해 노력하였다. 그 결과, 키토산을 사용하여 불활화된 VHSV를 캡슐화하여 제조한 백신이 넙치에서 VHSV에 대한 높은 방어 효과를 보임을 규명하였다.

본 명세서에서 용어 '바이러스성 출혈성 패혈증(Viral hemorrhagic septicemia, VHS)'은 유럽, 미국 및 동남 아시아 전역의 담수 및 해양 어류 70종 이상에 큰 피해를 주고 있는 바이러스 질병이다. 우리나라에서는 2001년 처음 발생한 이후 빈번한 발생으로 엄청난 경제적 손실을 입히고 있다. 늦은 겨울부터 봄철에 주로 발생하며, 수온이 8-15℃에서 넙치의 모든 연령군(치어부터 성어)에서 50-70%의 높은 사망률을 보인다.

바이러스성 출혈성 패혈증의 원인 바이러스(VHSV)는 음성 단일가닥 RNA 바이러스로 랍도바이러스(rhabdovirus)과에 속한다. VHSV는 어린 치어기뿐 아니라 출하 시기의 큰 성어에서도 폐사를 일으키며 감염어는 체색흑화, 복막과 복강 내의 투명 복수액 저류, 간 울혈, 비장 비대, 신장종대, 간, 신장, 비장 및 골격근에 괴사와 아가미 새엽의 비후, 간농축, 골격근 혈구 축적 등의 내부증상이 나타나며, 피부 상피층 또는 아가미 내피 세포를 통해 바이러스가 어체로 침입하여 혈류를 타고 신장, 비장의 조혈 형성조직 등 내부장기로 빠르게 이동하는 것으로 보고되어있다.

본 발명에서 용어, "예방"이란 조성물의 투여로 바이러스성 출혈성 패혈증의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 용어, "치료"란 조성물의 투여로 바이러스성 출혈성 패혈증에 의해 이미 유발된 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 용어, "백신"이란 감염 질환을 예방하기 위한 면역을 위하여 쓰이는 항원을 의미한다. 백신에 의해 자극을 받으면 개체 내의 면역 시스템이 작동하여 항체를 생성하게 되고, 그 감수성을 유지하다가 재감염이 일어나는 경우, 빠른 시간 내에 항체를 효과적으로 생성함으로써 질환을 극복할 수 있게 된다.

본 발명의 백신 조성물이 적용되는 어류는 바람직하게는 넙치과 어류일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 넙치일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서 본 발명의 백신을 넙치에 침지, 경구 투여 또는 이의 조합으로 투여한 경우, 주사 백신과 유사한 수준의 상대 생존율(RPS)을 나타내고, IgM, IgT, pIgR, MHC-I, MHC-II 및 IFN-γ 등 면역 관련 유전자의 발현을 유도하며, 전신 면역 반응 및 점막 면역 반응 모두를 자극하여 바이러스 공격으로부터 우수한 방어력을 보임을 확인하였다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 백신 조성물은 침지 또는 경구 투여용 백신 조성물이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 백신 조성물은 어류에 투여되어, 아래 수학식 I로 산출되는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스에 대한 상대생존율(RPS)이 50 내지 80%, 50 내지 75%, 50 내지 70%, 55 내지 80%, 55 내지 75%, 55 내지 70%, 60 내지 80% 또는 60 내지 75%, 예를 들어, 60 내지 70%를 나타낸다.

[수학식 I]

상대 생존율(RPS, %) = {1-(백신 접종 군 사망률%/ 대조구 사망률 %)} × 100.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 불활화 균체를 키토산으로 캡슐화한 나노구(nanosphere)의 직경은 100 내지 600 nm, 100 내지 550 nm, 100 내지 500 nm, 150 내지 600 nm, 150 내지 550 nm, 150 내지 500 nm, 200 내지 600 nm, 200 내지 550 nm, 200 내지 500 nm, 250 내지 600 nm, 250 내지 550 nm, 250 내지 500 nm, 300 내지 600 nm, 300 내지 550 nm, 300 내지 500 nm, 350 내지 600 nm, 350 내지 550 nm, 350 내지 500 nm, 400 내지 600 nm, 400 내지 550 nm, 400 내지 500 nm, 450 내지 600 nm 또는 450 내지 550 nm이고, 예를 들어, 450 내지 500 nm일 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 추가로 약리학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 백신에 적합한 담체는 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 설탕 등을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 및 에멀전일 수 있다. 비-수용액 담체는 파라핀오일, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일, 및 주사 가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올레이트를 포함한다. 수용액 담체는 식염수 및 완충배지를 포함하는, 물, 알콜/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함한다.

비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 방부제 및 기타 첨가제 예컨대 예를 들면 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 것이 추가로 존재할 수 있다. 바람직한 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B를 포함한다.

본 발명의 백신 조성물은 어주번트(adjuvant)를 포함할 수 있다. 어주번트는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함한다. 허용 가능한 어주번트는 사포닌, 미네랄 젤 예컨대 수산화 알루미늄, 계면활성제 예컨대 리소레시틴, 플루론 폴리올, 다중음이온, 펩타이드, 오일 또는 탄화수소 에멀전, 키홀림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 백신 조성물의 투여량은 바람직하게는 0.01 mL/미 내지 1 mL/미의 범위이나, 개체의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)를 불활화시키는 단계; 및 불활화된 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스를 키토산(chitosan)으로 캡슐화시키는 단계를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증에 대한 백신 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 불활화는 바이러스에 포르말린을 처리하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 캡슐화 단계는 상기 불활화된 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스를 산성용매에 녹인 키토산과 혼합하여 1차 균질화하는 단계; 비이온성 계면활성제를 포함하는 파라핀 오일을 첨가하여 2차 균질화하는 단계; 및 겔화 용액을 적하(dropping)하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 산성용매는 아세트산(acetic acid), 말론산(malonic acid), CMEBAC(N carboxymethyl N,N diethylbenzene ammonium chloride), 젖산(lactic acid), 시트르산(citric acid) 또는 아세트산 나트륨(sodium acetate)일 수 있고, 예를 들어, 아세트산 나트륨일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제, 소르비탄 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르계 비이온성 계면활성제, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제 및 폴리에틸렌 폴리프로필렌 글리콜계 비이온성 계면활성제로 구성된 군으로부터 선택된 1 이상일 수 있다. 예를 들어 상기 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제는 트윈 20, 트윈 40, 트윈 60, 트윈 80 및 트윈 85로 이루어진 군에서 선택된 1 이상, 바람직하게는 트윈 80일 수 있다. 또한, 상기 소르비탄 지방산 에스테르계 비이온성 계면활성제로서 스판 20, 스판 40, 스판 60, 스판 80 및 스판 85로 이루어진 군에서 선택된 1 이상, 바람직하게는 스판 80일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 겔화 용액은 TPP(Tripolyphosphate)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 백신 조성물을 어류에 투여하는 단계를 포함하는 바이러스성 출혈성 패혈증에 대한 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

상기 투여는 침지 및 경구 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방식으로 투여될 수 있으며, 예를 들어, 침지 및 경구 투여의 조합으로 투여될 수 있다.

상기 어류는 바람직하게는 넙치과 어류일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 넙치일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

도 1은 불활화 VHSV 항원을 캡슐화한 키토산 NPs(CNPs-IV)의 제작 방법을 나타내는 모식도이다.
도 2는 백신의 효능을 검증하기 위한 [실험 I]에 대한 모식도이다.
도 3은 백신의 효능을 검증하기 위한 [실험 II]에 대한 모식도이다.
도 4는 Zetasizer S-90 Malvern 기기를 이용하여 동적 광산란(DLS)에 의한 키토산 나노 입자(PNP)의 빈 입자 크기 분포를 분석한 결과이다.
도 5는 IV-를 포함한 키토산 나노구(CNPs-IV)의 투과 전자 현미경 사진으로 450-500 nm의 평균 입도 범위를 갖는 부드럽고 구형인 나노구를 보여준다.
도 6은 백신투여 2주 후 CNPs-IV(침지), CNPs-IV(경구), CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(경구/경구), NVC 대조군에 VHSV를 10⁶ TCID₅₀/마리의 농도로 공격감염한 후 측정한 누적 생존율 및 상대생존율(RPS)을 나타낸다.
도 7은 백신투여 30일 후 CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(침지/경구), NVC 대조구에 VHSV를 10⁶ TCID₅₀/마리의 농도로 공격감염힌 측정한 누적 생존율 및 상대생존율(RPS)을 나타낸다.
도 8은 신장 조직 총 RNA 50 ng에 포함된 VHSV의 절대 카피 수를 나타낸다.
백신 투여 후 독성이 있는 VHSV(10⁶ TCID⁵⁰/마리)로 공격감염하였다. 백신 투여 후 공격감염 전(pre challenge), 바이러스 공격감염 24시간 후(24 hpc), 48시간 후(48 hpc), 96시간 후(96 hpc)의 VHSV의 절대 카피 수를 점으로 표시하였다.
도 9a는 VHSV에 대한 특이 항체의 백분율 저해(PI)를 혈청 샘플에 대하여 항-VHSV-G MAb를 사용하여 경쟁적 ELISA로 분석한 결과이다.
CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(침지/경구), NVC 대조구 혈청에서 VHSV 항원에 결합하는 항-VHSV 항체의 백분율 저해로 표시하였다. 2차 백신투여(booster vaccine) 48시간 후(48 hpv), 백신 투여 후 공격감염 전(pre challenge), 바이러스 공격감염 48시간 후(48 hpc), 96시간 후(96 hpc).
양방향 분산 분석(two-way ANOVA)을 수행하여 같은 그룹 내에서 날짜의 경과에 따른 차이, 다른 백신 그룹간의 차이 및 상호 작용 효과를 p-값으로 통계적 유의성을 평가하였고(p <0.05)일 경우 유의한 차이가 있는 것으로 평가하였다. Duncan 다중 범위 테스트의 결과는 NVC그룹은 소문자(w-z), CNPs-IV(침지/침지)그룹은 소문자(a-e), CNPs-IV(침지/구강) 그룹은 대문자(A-E)로 통계적 차이를 표시하고 각각의 시간대별 두 그룹간의 차이는 t-테스트를 실시하였고 통계적 차이는 별표 *로 표시하였다.
도 9b는 VHSV에 대한 특이 항체의 백분율 저해(PI)를 피부 점액 샘플에 대하여 항-VHSV-G MAb를 사용하여 경쟁적 ELISA로 분석한 결과이다.
도 9c는 VHSV에 대한 특이 항체의 백분율 저해(PI)를 장내 점액 샘플에 대하여 항-VHSV-G MAb를 사용하여 경쟁적 ELISA로 분석한 결과이다.
도 10a는 CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(침지/경구), NVC 대조구의 신장 조직에서 IgM 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
1차백신투여 48시간 후(48 hpv), 2차 백신투여 48시간 후(48 hpbv), 백신 투여 후 공격감염 전(pre challenge), 바이러스 공격감염 24시간 후(24 hpc), 48시간 후(48 hpc), 96시간 후(96 hpc).
양방향 분산 분석(two-way ANOVA)을 수행하여 같은 그룹 내에서 날짜의 경과에 따른 차이, 다른 백신 그룹간의 차이 및 상호 작용 효과를 p-값으로 통계적 유의성을 평가하였고(p <0.05)일 경우 유의한 차이가 있는 것으로 평가하였다.
Duncan 다중 범위 테스트의 결과는 NVC그룹은 소문자(w-z), CNPs-IV(침지/침지) 그룹은 소문자(a-e), CNPs-IV(침지/경구) 그룹은 대문자(A-E)로 통계적 차이를 표시하고, 각각의 시간대별 그룹간의 차이는 t-테스트를 실시하였고 통계적 차이는 유의적 차이가 있는 경우는 ‘*’, 유의적 차이가 없는 경우는 ‘ns’로 표시하였다.
도 10b는 CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(침지/경구), NVC 대조구의 피부 조직에서 IgM 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 10c는 CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(침지/경구), NVC 대조구의 장 조직에서 IgM 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 10d는 CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(침지/경구), NVC 대조구의 신장 조직에서 IgT 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 10e는 CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(침지/경구), NVC 대조구의 피부 조직에서 IgT 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 10f는 CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(침지/경구), NVC 대조구의 장 조직에서 IgT 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 10g는 CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(침지/경구), NVC 대조구의 신장 조직에서 plgR 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 10h는 CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(침지/경구), NVC 대조구의 피부 조직에서 plgR 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 10i는 CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(침지/경구), NVC 대조구의 장 조직에서 plgR 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 11a는 CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(침지/경구), NVC 대조구의 신장 조직에서 MHC I 유전자 발현을 분석한 결과이다.
1차 백신 투여 48시간 후(48 hpv), 2차 백신 투여 48시간 후(48 hpbv), 백신 투여 후 공격감염 전(pre challenge), 바이러스 공격감염 24시간 후(24 hpc), 48시간 후(48 hpc), 96시간 후(96 hpc).
양방향 분산 분석(two-way ANOVA)을 수행하여 같은 그룹 내에서 날짜의 경과에 따른 차이, 다른 백신 그룹간의 차이 및 상호 작용 효과를 p-값으로 통계적 유의성을 평가하였고(p <0.05)일 경우 유의한 차이가 있는 것으로 평가하였다.
Duncan 다중 범위 테스트의 결과는 NVC그룹은 소문자(w-z), CNPs-IV(침지/침지) 그룹은 소문자(a-e), CNPs-IV(침지/경구) 그룹은 대문자(A-E)로 통계적 차이를 표시하였고 각각의 시간대별 그룹간의 차이는 t-테스트를 실시하였고 통계적 차이는 유의적 차이가 있는 경우는 ‘*’, 유의적 차이가 없는 경우는 ‘ns’로 표시하였다.
도 11b는 CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(침지/경구), NVC 대조구의 피부 조직에서 MHC I 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 11c는 CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(침지/경구), NVC 대조구의 장 조직에서 MHC I 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 11d는 CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(침지/경구), NVC 대조구의 신장 조직에서 MHC II 유전자 발현을 분석한 결과이다.
도 11e는 CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(침지/경구), NVC 대조구의 피부 조직에서 MHC II 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 11f는 CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(침지/경구), NVC 대조구의 장 조직에서 MHC II 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 12a는 CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(침지/경구), NVC 대조구의 신장 조직에서 IFN-γ 유전자 발현을 분석한 결과이다.
1차 백신투여 48시간 후(48 hpv), 2차 백신투여 48시간 후(48 hpbv), 백신 투여 후 공격감염 전(pre challenge), 바이러스 공격감염 24시간 후(24 hpc), 48시간 후(48 hpc), 96시간 후(96 hpc).
양방향 분산 분석(two-way ANOVA)을 수행하여 같은 그룹 내에서 날짜의 경과에 따른 차이, 다른 백신 그룹간의 차이 및 상호 작용 효과를 p- 값으로 통계적 유의성을 평가하였고(p <0.05)일 경우 유의한 차이가 있는 것으로 평가하였다.
Duncan 다중 범위 테스트의 결과는 NVC그룹은 소문자(w-z), CNPs-IV(침지/침지) 그룹은 소문자(a-e), CNPs-IV(침지/경구) 그룹은 대문자(A-E)로 통계적 차이를 표시하였고 각각의 시간대별 그룹간의 차이는 t-테스트를 실시하였고 통계적 차이는 유의적 차이가 있는 경우는 ‘*’, 유의적 차이가 없는 경우는 ‘ns’로 표시하였다.
도 12b는 CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(침지/경구), NVC 대조구의 피부 조직에서 IFN-γ 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 12c는 CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(침지/경구), NVC 대조구의 장 조직에서 IFN-γ 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 12d는 CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(침지/경구), NVC 대조구의 신장 조직에서 caspase 3 유전자 발현을 분석한 결과이다.
도 12e는 CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(침지/경구), NVC 대조구의 피부 조직에서 caspase 3 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 12f는 CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(침지/경구), NVC 대조구의 장 조직에서 caspase 3 유전자의 발현을 분석한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 거쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%"는 별도의 언급이 없는 한 고체/고체는(중량/중량)%, 고체/액체는(중량/부피) %, 그리고 액체/액체는(부피/부피)%이다.

실시예 1. 키토산 나노 입자(CNPs)에서 불활화 항원의 캡슐화

1.1. 실험 넙치

지역 부화장에서 양식된 넙치(Paralichthys olivaceus)의 치어(10.5 ± 1.7 g)를 50 ppm 포르말린으로 약욕한 후 자외선 처리 된 호기성 해수를 제공한 옥내 사육시설에 순응시키면서 펠렛사료를 하루에 두 차례 먹였다. 백신 접종 전 3주간 매일 체중의 3%의 사료를 급이하면서 유수식으로 사육하였다. 수온과 pH는 각각 19-20℃와 8-8.5로 유지하였다. 무작위로 채집한 10마리의 아가미와 피부에서 기생충이 없음을 확인하였고, 비장과 신장에서 세균이 분리되지 않는 것을 BHI 배지로 확인하였다. 또한, VHSV가 감염되지 않은 것은 PCR(nested polymerase chain reaction)을 통해 확인하였다.

1.2. 바이러스 배양 및 바이러스 항원의 제조 - 포르말린 불활화

VHSV(F1Wa05 균주)는 10%(v/v) fetal bovine serum(FBS), 100 IU/mL 페니실린 G(Gibco, Invitrogen, USA) 및 100 μg/mL 스트렙토마이신(Gibco, Invitrogen, USA)을 첨가한 Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM)(Gibco, Invitrogen, USA)에서 15℃로 유지시킨 FHM 상피세포주에서 배양하였다. FHM 상피세포주에 바이러스 농도 0.01의 감염 다중도(m.o.i)를 접종하였다. 세포변성효과(cytopathic effect: CPE)가 뚜렷하게 나타났을 때 바이러스배양액과 세포를 수확했다. 세포 파편을 제거하기 위해 세포 배양 상등액을 4℃에서 30분간 5,000 x g으로 원심 분리하여 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.

10⁸ TCID₅₀/mL의 역가를 갖는 바이러스 230 mL에 0.3% 포르말린을 첨가하고 4℃에서 24시간 동안 교반하여 불활화시켰다. 불활화 여부는 FHM 세포에 재접종하여 확인하였다. 'IV'로 명명된 불활화 바이러스는 4℃에서 2시간 동안 30,000 rpm으로 원심분리하여 농축하였다. 농축한 IV 항원은 면역에 사용하기 위해 분주하였고, 멸균 증류수에 부유시켜 나노캡슐화할 때까지 4℃에 보관하였다.

1.3. 키토산 나노 입자(CNPs)에서 IV 항원의 캡슐화

키토산 NP는 Roy K, et al.에 기술된 방법에 따라 제조되었다. 간단히, 키토산(Sigma-Aldrich, USA) 0.5 g을 100 mL의 아세트산 나트륨 완충액(pH 5.4)에 넣고 격렬히 교반하면서 3시간 동안 자기 교반기에서 유지 하였다. 완료 후 용해 용액을 0.2 ㎛ 주사기-필터를 사용하여 여과하였다. 이후 수산화 나트륨을 사용하여 용액의 pH를 5.4로 조정하고 증류수를 사용하여 최종 부피를 100 mL로 조정하였다. 용액을 완전히 혼합하기 위해 추가로 1시간 동안 자기 교반기상에서 유지시키고, 0.2 ㎛ 주사기-필터를 사용하여 최종적으로 여과시켰다.

1.4. 나노구(Nanospheres) 특성 분석

Blank CNP는 Zetasizer S-90 Malvern 기기(Malvern, UK)를 사용하여 동적 광산란(DLS)에 의한 크기 및 크기 분포의 측정하였다. 간단히 말하면, 0.3 mg/mL의 농도에서 CNP 샘플 1.3 mL를 폴리스티렌 큐벳에 넣고 25℃에서 측정을 수행했다. 점도 및 굴절률은 물과 동일하게 설정하였다.

CNPs-IV 나노구의 형태 및 크기 분포는 투과 전자 현미경(TEM)에 의해 평가되었다. TEM 분석을 위해 얇은 구리 그리드 위에 formvar막을 입히고 여기에

CNPs-IV 수용액 5 μL를 얹어 건조시켰다. 그 후 phosphotungstic acid 염색액 5 μL를 첨가하여 10초간 염색 후 그리드를 5 μL의 증류수로 세척하고 공기 건조시켰다. 그리드는 투과 전자 현미경(Hitachi, Japan) 하에서 검사되었다.

1.5. IV 항원을 캡슐화한 키토산 NPs(CNPs-IV)의 제작

키토산 NPs에서 IV 항원의 캡슐화는 약간의 변형을 가한 water-in-oil(W/O) emulsification 공정을 사용하여 도 1과 같이 수행하였다. 간단히 설명하면, 아세트산 나트륨 완충액(pH 5.4)에서 준비한 키토산 용액(0.05%) 10 mL를 농축한 IV 항원 수용액 1 mL와 혼합하고 2,500 rpm에서 5분간 균질화시켰다. 키토산 및 IV 항원의 혼합물(W)을 1.5 mL의 Span-80(sorbitan monolaurate, 유화제)을 함유하는 200 ㎖의 유동 파라핀 오일(O)에 첨가한 다음, 2,500 rpm에서 10분간 균질화하여 water-in-oil primary emulsion(W/O)을 만들었다. 1차 에멀젼을 교반기에서 2,500 rpm으로 1시간 동안 교반하면서 50%(w/v) 폴리인산나트륨(TPP, 겔화용액) 4 mL를 한방울씩 떨어뜨렸다. Chitosan-IV 나노구(CNPs-IV)를 1,000 xg에서 30분 동안 원심 분리하여 분리하고 70% 알코올을 사용하여 2회 세척 한 다음 4℃에서 보관하였다.

본 발명에서는 water-in-oil(W/O) emulsification 유화 공정에 의해 CNP에 불활화된 VHSV(IV)를 캡슐화했다. 나노분석기와 투과전자현미경에 의한 CNPs에 바이러스를 코팅하기 전과 후의 CNP의 크기 분포와 형태를 확인하기 위한 예비 실험을 각각 수행하였다. 빈 CNP는 191.1 nm의 평균 크기로 균일한 분포를 보였다(도 4).

키토산 나노 입자에 불활화 VHSV(IV)를 캡슐화한 CNPs-IV 나노구를 투과 전자현미경으로 분석한 결과 규칙적이고 균일한 구형인 450-500 nm의 나노구를 관찰하였다(도 5). CNPs-IV의 중심의 높은 전자 밀도 영역은 IV 항원이 내부에 양성으로 포위되고 CNPs이 둘러싸여 있음을 나타내고 있었다. 크기 분포 및 크기 분포의 균일성으로부터 제작한 CNPs-IV 나노구가 경구 또는 침지 경로를 통해 어류에 백신을 전달하기에 적합한 것으로 확인되었다.

실시예 2. 백신 효능 검증

2.1. 예방 접종을 위한 백신 준비

침지 백신을 위해 준비된 CNPs-IV 나노구는 백신 접종 전에 20 ml의 증류수에 현탁시켰다. 경구 백신 접종의 경우, CNPs-IV 나노구를 사료무게의 5%의 hydroxypropyl methylcellulose(Sigma-Aldrich, USA) 현탁액에 넣어 사료에 뿌린 다음 50℃에서 1시간 건조시켰다. 2% HPMC(사료의 w/w) 및 1.6% TEC(사료의 v/w)로 백신 코팅된 펠릿 위에 분무하고 37℃에서 1시간 동안 말린 후 경구로 투여하였다.

2.2. 백신의 효능 검증(실험 I)

2.2.1. 백신투여(실험 I)

각 그룹당 30 마리씩 6개 실험군(총 180마리)(12.5 ± 1.5 g)으로 무작위로 나누어 300 L FRP(섬유 강화 플라스틱) 수조에서 사육하였다. 자외선 처리된 해수로 20℃에서 사육하였다. 6개 실험군은 다음과 같다. ① CNPs-IV(침지), ② CNPs-IV(경구), ③ CNPs-IV(1차 침지/2차 침지), ④ CNPs-IV(1차 경구/2차 경구), ⑤ NVC(백신을 투여하지 않은 대조구) 및 ⑥ 무처리 대조구. 전체 실험 설계는 도 2에 나타내었다.

1차 침지 면역을 위해 플라스틱 용기에 1 L의 해수를 넣고 20 mL의 CNPs-IV 백신을 넣고 잘 섞었다. 여기에 CNPs-IV(침지) 및 CNPs-IV(침지/침지) 그룹의 어류를 30마리씩 나누어 넣고, 산소를 공급하면서 CNPs-IV 백신액에서 2시간 침지하였다. 그 후 넙치를 원래의 탱크로 다시 옮겼다. 1차 침지 백신 투여 2 주(300 day) 후에 CNP-IV(침지/침지) 그룹에 2차(booster)로 침지 백신을 투여하였다.

CNPs-IV(경구) 및 CNPs-IV(경구/경구) 군의 경구 면역을 위하여 어류는 CNPs-IV 나노 구체를 함유하는 준비된 사료를 2일간(2회/일)(두 그룹 모두) 투여하였다.

1차 경구 백신 투여 2주(300 °day) 후에 CNP-IV(경구/경구) 그룹은 2차(booster)로 1차 백신과 동일한 방법으로 경구백신을 투여하였다. 대조구는 백신이 포함되지 않은 사료를 투여하였다.

2.2.2. 공격감염(실험 I)

1차 면역 30일 후 6개 실험구의 모든 어류를 자외선 처리된 해수 25 L가 함유된 플라스틱 수조(그룹 당 2개 수조)에 옮기고 온도가 약 15℃로 유지되는 항온실로 옮겼다. 백신을 투여한 군과 NVC 대조군의 어류는 백신 균주와 같은 VHSV(10⁶ TCID₅₀ 바이러스/어류) 균주 100 μL를 복강내 주사하여 공격감염하였고 무처리 대조구는 바이러스를 감염시키지 않았다. 감염 후 20일 동안 사망률 패턴과 VHS의 임상 증상을 매일 관찰하였다. 죽은 어류는 모두 복수증상을 나타내고 있었다. 백신을 투여한 구의 상대생존율(RPS)은 아래 공식에 의해 계산하였다.

상대 생존율(RPS, %) = {1-(백신 접종구 사망률% / 대조구 사망률%)} × 100.

2.3. 백신의 효능 검증(실험 II)

2.3.1. 백신투여(실험 II)

백신 효능 시험 I의 결과를 참조하여 두 번째 백신 효능 시험 II를 설계하였다. 실험-II에서, 넙치(n = 240, n = 어류의 수)(12.5±1.5 g)를 각 그룹 당 60마리씩 다음과 같이 4개 그룹, ① CNPs-IV(침지/침지), ② CNPs-IV(침지/경구), ③ NVC 대조구(백신을 투여하지 않고 바이러스공격), ④ 무처리 대조구로 나누고 500 L의 FRP 수조에 자외선 처리된 해수를 넣고 20℃에서 사육하였다. 실험 II의 설계는 도 3에 나타내었다.

1차 침지 백신 투여를 위하여 CNPs-IV(침지/침지) 및 CNPs-IV(침지/경구) 그룹의 어류를 2개의 플라스틱(각 그룹당 1마리)의 플라스틱 수족관(60마리의 어류/수족관)에 분배하고 2 L 20 mL의 CNPs-IV 백신 용액으로 2시간 동안 침지 면역과 유사하게 시행하였다.

1차 침지 면역을 위해 플라스틱 용기에 2 L의 해수를 넣고 20 mL의 CNPs-IV 백신을 넣고 잘 섞었다. 여기에 CNPs-IV(침지/침지) 및 CNPs-IV(침지/경구) 그룹의 어류를 60마리씩 나누어 넣고, 산소를 공급하면서 CNPs-IV 백신액에서 2시간 침지하였다. 그 후 넙치를 원래의 탱크로 다시 옮겼다. 1차 침지 백신 투여 2주(300 °day) 후에 CNP-IV(침지/침지) 그룹은 2차(booster)로 침지 백신을 투여하였고, CNPs-IV(침지/경구) 군에는 시험-I에 기술된 바와 같이 CNP-IV 나노구를 함유한 사료를 경구로 투여하였다(1일 2회 투여, 총 2일간 투여).

1차 침지 면역 48시간(hpiv), 2차 백신투여 48시간 후(hpbv) 및 바이러스 공격 직전(1차 백신 투여일로부터 접종 30일 후)에 각 실험구에서 5 마리를 무작위로 골라 혈액, 피부점액 및 장 점액을 취하였다.

백신이 유도하는 면역반응을 알기 위하여 각 시점에서 혈청, 신장 조직 샘플을 수집했다. CNPs-IV(침지/침지), NVC 대조구 및 무처리 대조구으로부터 동일한 시점에 피부(꼬리 자루 부위로부터의 부분) 및 피부 점액 샘플을 수집하였다. CNPs-IV(침지/경구), NVC 대조군 및 무처리 대조구의 장을 3등분한 후 각 부분을 동일한 분량만큼 취하여 하나의 튜브에 넣었다. 장 점액 시료는 48시간 후(hpbv) 및 바이러스 공격 직전(1차 백신 투여일로부터 접종 30일 후)에 취하였다.

2.3.2. 공격감염[실험 II]

공격감염을 위하여 4개의 실험 그룹 각각에서 남은 45 마리의 어류를 25 L의 자외선 처리된 바닷물이 들어있는 플라스틱 수조(그룹당 3개 수조, n = 15/수조)으로 항온실(15℃)로 옮겼다. 공격감염을 위해 CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(침지/경구), NVC 대조구 및 무처리 대조구의 4개 실험 그룹에서 각각 15 마리를 저온실험 시설(15℃)로 옮기고 UV 처리된 25 L의 해수를 함유한 플라스틱 수조로 옮겼다. 바이러스의 공격에 대한 저항성을 알아보기 위하여 바이러스 배양액 100 μL(10⁶ TCID₅₀/마리)를 복강으로 주사하였고, 무처리 대조구에는 바이러스를 접종하지 않았다.

감염 후 20일 동안 매일 VHS의 사망률 및 증상을 관찰하였다. 사망한 어류를 채집하여 VHSV에 특이적인 사망을 조사했다. 상대 생존율(RPS)는 아래의 공식으로 계산하였다.

상대 생존율(RPS, %) = {1-(백신 접종 군 사망률 %/대조구 사망률 %)} × 100.

24시간, 48시간 및 96시간 공격 후(hpc)에 아래의 표와 같이 그룹별로 각 샘플링 시간대에 5마리씩 무작위로 신장 조직 및 혈액 샘플을 취하였다. 혈청, 피부 점액, 장 점액은 항체검출에 사용하였고, 신장, 피부 및 장은 면역 유전자 발현 분석 분석에 사용하였다(표 1).

VHSV 공격감염 24 시간, 48 시간 및 96 시간 후(hpc) 그룹별 채취한 샘플

그룹	신장	혈액	피부	장
CNPs-IV(침지/침지)	24, 48, 96 hpc*	24, 48, 96 hpc	48 hpc	48 hpc
CNPs-IV(침지/경구)	24, 48, 96 hpc	24, 48, 96 hpc	48 hpc	48 hpc
NVC 대조구	24, 48, 96 hpc	24, 48, 96 hpc	48 hpc	48 hpc
무처리 대조구	24, 48, 96 hpc	24, 48, 96 hpc	48 hpc	48 hpc

*hpc: hour post challenge(공격 감염 후 시간)

2.4. 상대 생존율(RPS) 분석

본 발명에서는 2번의 백신 투여와 공격 실험을 실시하였다. 실험 I은 넙치에 준비된 백신(CNPs-IV)을 성공적으로 전달하고 VHSV 공격에 대하여 방어력을 유도할 수 있는 효과적인 방법을 찾기 위한 실험이었다. 실험 II는 백신이 효능을 나타내는 면역 메커니즘을 밝히고, 백신의 효능을 개선하기 위하여 1차 침지 면역 후 2차 면역(부스팅)의 효과를(침지와 경구로 2차 백신 투여) 알아보고자 하였다.

실험 I에서 각 그룹별 누적폐사율과 상대생존율은 표 2에, 공격감염 후 폐사의 경과는 도 6에 나타내었다. 상대생존율이 높은 순서대로 나타내면 CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(침지), CNPs-IV(경구/경구), CNPs-IV(경구)이다. 즉 침지백신이 경구백신보다 효능이 좋으며, 2회 백신(부스팅)에 의하여 백신의 효능이 증가함을 알 수 있었다. 투여한 백신의 효능을 log-rank test로 생존율 통계분석 결과 CNPs-IV(침지/침지)구 만이 유의한 효능이 있었다.

실험 I의 그룹별 누적 폐사율 및 상대생존율

그룹	누적폐사율(%)	상대생존율(%)	log rank test(p값)
CNPs-IV(침지)	53.3	46.7	0.06
CNPs-IV(침지/침지)	46.7	53.3	0.048*
CNPs-IV(경구)	100	0	0.44
CNPs-IV(경구/경구)	80	20	0.15
NVC 대조구	100	0	-
무처리 대조구	0	-	-

*p값이 0.05이하로 백신의 효능이 있음

실험 II에서 각 그룹별 누적폐사율과 상대생존율은 표 3에, 공격감염 후 폐사의 경과는 도 7에 나타내었다. 상대생존율은 CNPs-IV(침지/침지)구가 60%, CNPs-IV(침지/경구)구가 66.6%였다. 이러한 높은 상대생존율은 주사백신과 유사하게 높은 것으로 넙치에 주사스트레스를 주지 않고 작은 크기에도 적용할 수 있는 방법을 제시한 것이다. 또한 1차로 침지로 백신을 투여한 후 2차 면역(부스팅)은 침지와 경구가 모두 유사한 효능이 있으므로 2차 면역은 어체에 전혀 스트레스가 없는 경구 백신법이 사용하기에 편리할 것이다.

실험 I의 그룹별 누적 폐사율 및 상대생존율

그룹	누적폐사율(%)	상대생존율(%)	log rank test(p값)
CNPs-IV(침지/침지)	40	60	0.048*
CNPs-IV(침지/경구)	33.4	66.6	0.048*
NVC 대조구	100	0	-
무처리 대조구	0	-	-

*p값이 0.05이하로 백신의 효능이 있음

실시예 3. 경쟁적 ELISA에 의한 항체가 분석

3.1. 혈청, 피부 및 장 점액 수집

혈액은 꼬리 미병부에서 채혈하여 일반적인 방법으로 2,000g에서 15분간 4℃에서 원심분리하고 -20℃에 보관하였다.

피부점액은 CNPs-IV(침지/경구), NVC 대조구와 무처리 대조구에서 취하였다. 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF, Sigma-Aldrich, USA)를 포함한 멸균 PBS 200 μL를 넣은 지퍼락 비닐 봉지에 넙치를 넣고 피부 표면을 가볍게 문질러 피부 점액 샘플을 수집했다. zip-lock bag에서 모은 점액을 microcentrifuge tube로 옮겼다. 이후 1분간 볼텍스한 후 2,000g에서 15분간 4℃에서 원심분리하고 -20℃에 보관하였다.

소화관 점액의 수집을 위해, 어류를 무균적으로 해부하고 장을 절제 하였다. 소화관 점액을 수집하기 전에 모든 장내 내용물을 조심스럽게 제거하여 오염을 방지했다. 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF, Sigma-Aldrich, USA)를 포함한 멸균 PBS 200 μL가 든 에펜돌프 튜브에 장의 3조각(앞부분, 중간부분, 뒷부분) 넣고 핀셋으로 부드럽게 눌러 장내 점액을 용출시켰다. 이후 1분간 볼텍스한 후 2,000g에서 15분간 4℃에서 원심분리하고 -20℃에 보관하였다.

3.2. 경쟁적 ELISA

실험어의 혈청, 피부 점액 및 장 점액에서의 특정 항체(항-VHSV Ig) 정량은 이전에 Kole et al에 의해 보고된 방법에 따라 3가지 competitive enzyme-linked immunosorbent assays(c-ELISA)를 수행하였다. 96-well ELISA 플레이트(Nunc, 덴마크)에서 코팅 완충액(탄산염-중탄산염 완충액, pH 9.6)으로 희석한 VHSV(10⁸ TCID₅₀/mL) 100 μL를 4℃에서 하룻밤 배양했다. 플레이트를 5분 동안 3회 세척 완충액(PBS-T, 0.05% tween20, PBS pH 7.4)으로 3회 세척하고 300 μL 블로킹 완충액(PBS-T 중 3% 소 혈청 알부민(BSA) 용액)으로 차단하고 추가로 25℃에서 1 시간, 플레이트를 5분 동안 3회 세척 완충액으로 다시 세척하였다. 상이한 시점에서 모든 실험 그룹으로부터 샘플링 한 100 ㎕의 혈청(PBS-T에 녹인 1% BSA로 200배 희석), 피부 점액 및 장 점액을 1시간 동안 실온에서 ELISA 쉐이커에서 배양하였다. 이어서, VHSV-G 유전자에 대한 단클론항체(AB Frontier, Korea) 희석액(PBS-T에 녹인 1% BSA로 200배 희석)을 100μL 씩 각 웰에 첨가하고 4℃에서 밤새 반응시켰다.

MAb에 대한 흡광도를 판독하기 위해 각 플레이트의 3-well에 100 μL의 MAb 200배 희석액만을 첨가했다. 플레이트를 다음 날에 세척 완충액으로 3 회 세척하고 25℃에서 PBS-T으로 2,000배 희석한 2차 항체(Goat anti-mice HRP conjugate, Thermo Fisher Scientific, USA) 100 μL와 1시간 동안 항온 배양 하였다. 플레이트를 PBS-T으로 5회 완전히 세정하고, 기질 O-페닐렌 디아민 테트라 하이드로 클로라이드(OPD) 용액을 각 well에 첨가하였다. 플레이트를 어두운 곳에서 25℃에서 20분 동안 배양하였다. 그 후, 2N H₂SO₄ 50 ㎕로 반응을 멈추고 VERSA max 마이크로 플레이트 판독기(Perkin Elmer, USA)를 사용하여 492 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 다음의 식에 의해 유도된 억제 백분율로서 나타내었다.

PI = 100-(시험 혈청의 평균 OD492) × 100) /(MAbs의 평균 OD492)

3.3. 통계 분석

상이한 시점에서 모든 실험군으로부터 수집된 상이한 조직 샘플에서 혈청 및 점액 샘플에서의 VHSV-특이 항체가 및 유전자 발현을 위해 생성 된 데이터를 통계 패키지 SPSS 버전 22(SPSS Inc., USA)를 사용하여 통계적으로 분석하였다. 각 데이터 세트는 그룹 내(시간 단위, 그룹 단위) 사이의 통계적 유의성을 결정하고 상호 작용 효과를 평가하기 위해 양방향 분산 분석(two-way ANOVA)을 받았다. 사후 분석은 Duncan의 multiple range test와 unpaired t-test를 사용하여 서로 다른 시점에서의 항체가 및 유전자 발현의 유의한 차이를 측정하였다. 비교는 5% 확률 수준에서 이루어졌으며 0.05 미만의 p값은 통계적으로 유의하다고 간주되었다. 결과는 평균 ± 표준 오차로 나타내었다.

3.4. 경쟁적 ELISA 결과 분석

상대생존율 분석 외에도 혈청, 피부 점액 및 장 점액에서 항 -VHSV 항체를 검출하기 위해 세 가지 cELISA 세트를 사용했으며 각 cELISA에 대해 VHSV에 대한 억제율(PI) 활성을 계산했다(도 9). 특이항체 정량에는 실험 II의 항체, 피부점액, 장점액을 사용하였다.

3.4.1. 혈청 항체가

혈액내의 항체가는 1차 백신 투여 후 48 시간(48 hpiv)에 CNPs-IV(침지/침지)와 CNPs-IV(침지/경구)그룹 모두 백신을 투여하지 않은 구에 비하여 유의하게(p <0.05) 높았다(도 9a). 항체가는 2차 백신 투여 후 48 시간(48 hpbv, 부스팅)후에 더욱 증가하였으며 1차 백신 투여일로부터 30일 이후(pre challenge)까지 높게 유지되었다. 바이러스를 공격감염한지 48시간 후(48 hpc)와 96시간 후(96 hpc)에는 백신투여구(>80% 억제)가 NVC대조구(~40% 억제)에 비하여 억제율이 높았다. 즉, 백신의 투여에 의하여 효과적으로 VHSV에 대한 항체가가 증가하였으며, 바이러스로 공격감염한 후에도 백신투여구에서 유의하게 높은 항체가가 검출되고 있어, 바이러스에 대한 높은 항체가가 바이러스에 대한 방어력 제공에 기여했을 것으로 판단된다.

또한, CNPs-IV(침지/침지)와 CNPs-IV(침지/경구) 백신투여구 모두에서 비슷한 수준의 항체가 검출되어 CNPs-IV를 1차로 침지로 백신한다면 2차 백신(부스팅)은 경구와 침지 모두가 유효한 방법임을 나타내고 있다.

3.4.2. 피부점액 항체가

캡슐화된 백신은 점막 부위인 피부(도 9b) 및 장(도 9c)에서 국소적으로 면역 반응을 유도할 수 있었다. CNPs-IV(침지/침지) 그룹의 피부 점액에서 48 hpbv에서 항체 역가가 가장 높았다. 이는 CNPs-IV(침지/침지) 그룹의 혈청 항체가는 바이러스로 공격감염한 후에 최대로 증가한 것과는 차이가 있는 것으로 전신면역과는 다른 경로의 피부 관련 림프 조직(skin associated lymphoid tissue: SALT) 존재하기 때문인 것으로 생각된다. 또한 백신 접종을 하지 않은 대조구 넙치를 포함하여 모든 실험어의 피부 점액에서 약 50% 억제가 나타났는데 이는 어류가 태어나면서부터 지닌 자연면역(비특이적면역)으로 바이러스 침입에 대한 장벽을 제공하는 자연 항체에 의한 반응으로 생각되었다.

3.4.3. 장 점액 항체가

백신을 투여하지 않은 정상적인 넙치의 장내 림프구 조직(gut associated lymphoid tissue: GALT)에서 유래된 장 점액에서의 항체 반응은 ~20%로 유지되었지만 경구 백신 접종으로 CNPs-IV(침지/경구) 구에서 장 점액의 항체 역가 수준은 증가(~60%)되었다(도 9c). CNPs-IV(침지/구강) 그룹의 높은 항체 역가는 CNPs-IV 백신이 산성인 위장 환경에서 변성없이 면장의 면역세포들이 모여있는 두 번째 소화관에 도달 할 수 있었고 점막 장벽을 통과하여 국부 및 / 또는 전신 반응의 유도를 위한 항원 제시 세포(APCs)를 자극한 것을 나타낸다.

혈청, 피부 및 장 점액에서 특이적인 항체 반응 분석으로부터, 전신 면역 반응만이 숙주 어류에서 방어 면역을 생성하도록 유도되는 주사 백신과는 달리, 침지 또는 구강에 의한 캡슐화된 백신의 투여 경로는 전신 및 점막 면역 반응을 자극하여 바이러스 감염에 대해 넙치에게 보다 넓은 보호 장치를 부여하는 것을 알 수 있다.

실시예 4. 면역 관련 유전자의 발현

4.1. 신장, 피부 및 장 조직 수집

신장은 두신을 취하여 바로 -80℃에 보관하였다. 피부는 상기 3.1의 방법과 같이 피부점액을 채취한 후 킴와이프로 물기를 제거한 후 근육으로부터 피부를 벗겨 바로 -80℃에 보관하였다. 장은 상기 3.1의 방법과 같이 장을 3등분 한 후 각각으로부터 일부를 잘라내어 -80℃에 보관하였다.

4.2. RNA 분리 및 cDNA 합성

제조 회사의 프로토콜에 따라 RNAiso Plus(Takara Bio Inc, Japan)를 사용하여 신장, 장 및 피부 조직으로부터 총 RNA를 추출하고 NanoDropTM 1000 분광 광도계(Thermo Fisher Scientific, USA)로 RNA의 양을 측정하였다. 잔류 게놈 DNA는 RNase-free DNase I(Takara Bio Inc, Japan)을 사용하여 제거 하였다. ReverTra Ace qPCR RT Kit(Toyobo, Japan)를 사용하여 올리고-dT 프라이머와 ReverTra Ace 역전사 효소를 사용하여 10 μL 반응 부피로 총 RNA(1μg)를 first-strand cDNA로 역전사시켰다. 생성된 cDNA는 -20℃에서 보관하였다.

4.3. 실험 시료에서 면역 유전자의 정량적 발현 분석

면역 관련 유전자에 대한 유전자 특이적 프라이머는 NCBI 데이터베이스의 이용 가능한 서열에 기초한 Primer3Plus를 사용하여 디자인하였다(표 4). 넙치 β-액틴을 하우스 키핑 유전자로 선택하고 유전자 발현에 사용된 모든 프라이머를 표 4에 열거하였다. 유전자 발현 분석을 위해, ExicyclerTM 96 Real-Time Quantitative Thermal Block(Bioneer, 한국)에서 SYBR Green AccuPower® PCR PreMix(Bioneer)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 각 유전자의 상대적인 정량화를 위해, 실험군과 비 실험군의 신장, 피부 및 장 조직으로부터 합성된 cDNA를 주형으로 사용하였다. 반응은 94℃에서 10분간의 초기 변성, 20초 변성(94℃), 어닐링(온도는 표 4에 주어진다) 및 스캐닝을 35 사이클 수행 한 20 ㎕의 최종 반응 부피에서(2회 반복) 수행하였다. 임계주기(Ct) 값은 Bioneer ExicyclerTM 96 Real-Time PCR 시스템의 자동 설정을 사용하여 결정되었다. 면역 반응의 상대적인 정량화는 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 평가되었고, 바이러스 mRNA는 정량화하였다.

Real-time PCR에 사용한 primer

Target gene	GenBank acc. no	Product length	정방향 프라이머(5'-3')	역방향 프라이머(5'-3')	Ta
VHSV N	JF792424	138	ATCTGGAGGCAAAGTGCAAG	CCATGAGGTTGTCGTTGTTG	62
β-actin	HQ386788	131	CCTCTTCCAGCCTTCATTC	TGGTTCCTCCAGATAGCAC	56
IgM	AB052744	115	GCCTCCTTCTTCTGCTCTG	CCTCAGTGGATGTTGTGATT	56
IgT	KX174302	150	TAATTGTTCAGTAACTCATGCCG	GATTGAAGTGTTCCTATGCGTCT	56
pIgR	HM536144	478	AAGGAGGAGGACTCTGGGTG	TGGTGATGGGTCTGGATGG	58
MHC I	AB126921	148	TCTCCCTCCTCTCCAGTCAGC	GCTCATCTGGAAGGTCCCGTCAT	58
MHC II	AY848955	107	GTCGTCAGGCTTCACTCTGT	TCTCTTTGCCAGCTCACTTT	56
IFN-γ	AB435093	126	CTACAAGCGGCGATATGATG	GGAGGTTCTGGATGGTTTTG	64
Caspase3	JQ394697	115	ACATCATGACACGGGTGAAC	TCCTTCGTCAGCATTGACAC	58

CNPs-IV(침지/침지)와 CNPs-IV(침지/경구)그룹 모두에서 바이러스 공격감염 24시간, 48시간 및 96시간 이후에 NVC 대조구와 비교하여 10배에서 100배 정도 낮은 mRNA copy number가 검출되었다. 즉 백신을 투여한 구에서 바이러스의 증식이 낮아져 폐사가 적게 발생하는 것을 알 수 있었다(도 8).

3.5. 면역 관련 유전자의 발현 분석

백신 투여 후와 공격감염 후에 신장, 피부, 장에서의 면역유전자의 발현을 분석하여 백신이 유도하는 면역반응을 알아내고자 하였다. 어류에서 신장은 B 세포와 T 림프구 모두의 기원뿐만 아니라 B 세포의 성숙과 같은 면역 기능을 담당하는 주요면역 기관이다. 피부와 장의 점막표면은 항원의 침투와 이후의 점막 면역을 유도하는 부위이다. 따라서 VHSV에 대한 CNPs-IV 백신 유효성의 면역학적 기초를 이해하기 위해, 본 발명은 백신을 투여한 후와 공격감염 후에 신장(신장의 앞부분) 및 점막(피부 및 장)에서 면역 관련 유전자의 발현을 분석하였다.

면역 글로불린(Ig)은 B-림프구 수용체로 발현되거나 혈장과 점액으로 분비되어 특이적 면역반응을 수행하는 면역계의 핵심이 되는 체액성 면역의 구성요소이다. 어류의 Ig isotype중 IgM은 전신 순환계에서 가장 풍부하게 발견되는 반면에 IgT는 점막 구획에서 더 두드러진다. 이와 함께 피부 상피 세포, 장 세포 및 간세포에서 강하게 발현되는 것으로 알려진 고분자 IgR(pIgR)은 Ig 분자와 결합하여 세포외로 Ig을 운반한다.

본 발명에서 CNPs-IV mucosal vaccine 백신을 투여한 후 IgM, IgT 및 이들의 수용체인 pIgR의 유전자 전사체가 신장, 피부와 장에서 현저하게 증가되었다(도 10). 이것은 백신을 투여한 어류에서 전신 및 점막 면역이 모두 자극되어 Ig 분비 세포를 생성을 입증하는 결과이며 항체 의존성 체액 반응을 유발하는 CNP-IV 점막 백신의 효율을 뒷받침하는 결과이다. 이 결과는 cELISA 결과에서 관찰된 항체 검출의 결과와 일치하며, 나노 캡슐화된 점막 백신이 Ig 분자의 높은 발현을 일으킨다는 몇 가지 이전 연구와 일치한다. 여기서 주목할 점은 IgT의 발현은 48 hpbv과 24 hpc 및 48 hpc에 2,000배 이상으로 높은데 비해 IgM 발현은 15배 미만으로 높은 것인데 이는 대조구의 IgT의 Ct값이 37 이하로 낮았기 때문이다. 또한 이들 유전자의 발현이 피부와 장에서 차이를 보였는데 피부에서의 발현은 2차 면역(부스팅) 후에 현저하게 증가되고 공격감염 후에 낮은 반응을 보인데 비하여 장에서는 48 hpbv와 공격감염 후에 발현이 증가되는 것을 보였다. 이는 바이러스의 공격감염을 주사로 했기 때문에 주사감염은 피부를 통한 침지감염보다 피부 표면으로 면역유도가 낮았기 때문으로 생각된다.

백신을 투여한 그룹에서 신장, 피부, 장관 모두에서 MHC-1와 MHC-II의 발현이 증가되었는데(도 11) 이는 이들 조직에서 MHC-II-CD4-B-cell 증식에 의한 항체 생성, MHC-I-CD8-T-cell자극에 의한 세포성 면역의 증강으로, 전신성 및 점막성의 면역반응이 있어났음을 알 수 있다.

또한, 본 발명에서는 바이러스 백신 효능에 중요한 유전자인 IFN-γ 유전자의 발현을 조사하였다. IFN-γ 유전자의 발현은 나노 백신으로 백신을 투여한 후에 유의한 증가를 보였다(도 12). CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(침지/경구) 그룹 중 CNPs-IV(침지/침지)그룹의 피부에서의 IFN-γ 활성이 CNPs-IV(침지/경구) 그룹의 장에서의 IFN 활성보다 높았다. 두 그룹 모두 신장에서 높은 IFN-γ 활성을 나타내었다. 예상한 바와 같이, 신장에서의 발현 수준은 백신을 투여한 넙치에 VHSV로 공격감염했을 때 가장 높았고, IFN-γ와 같은 신속한 항바이러스 단백질의 생산이 궁극적으로 백신투여한 그룹들에 높은 생존을 유발한 것으로 생각된다. 송어에서 CNPs-IV로 나노 캡슐화한 VHSV의(DNA) 백신에서 유사한 IFN-γ의 발현증가가 보고되고 있다. 공격감염 후 신장과 장에서 IFN-γ의 발현은 증가하였으나 피부에서는 발현이 증가하지 않았는데 이는 숙주의 면역반응이 장기에 따라 차이가 나기 때문일 것이다.

카스파제 3 발현패턴은 MHC-1 발현과 유사하여 신속한 T-세포 반응이 숙주 세포 독성을 유발하여 궁극적으로는 바이러스 증식을 제한하여 생존율을 높이는데 기여한 것으로 생각되었다.

세포 사멸은 항바이러스 면역 방어 기전의 필수적인 부분이다. 조기에 효과적인 apoptosis 반응은 숙주 내에서 바이러스 복제와 질병의 진전을 중단시킬 수 있다. 세포 사멸 유도 물질은 카스파제들을 연쇄적으로 활성화시키고, 이어서 세포 사멸의 최종 실행자인 카스파제 3의 활성화를 유도한다. 이러한 관점에서, 본 발명에서는 카스파제 3 유전자의 발현 동역학을 분석하였다(도 12). 백신을 투여하지 않은 대조 어류와 비교하여 두 백신 접종 군의 모든 분석 조직에서 48 hpc에서 caspase 3의 높은 유도를 보였다.

요약하면, 넙치 치어기에 사용할 수 있는 VHSV에 대한 침지/경구백신을 개발하기 위하여 불활화한 VHSV로 키토산 나노파티클을 만들어 캡슐화하여 백신으로서의 효능을 확인하였다. 제작한 백신은 CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(침지/경구) 모두 VHSV에 의한 넙치의 폐사를 감소시키는 효능이 있었다. 또한 CNPs-IV(침지/침지), CNPs-IV(침지/경구) 백신의 투여는 혈청과 점액의 항체가를 증가시키고 다양한 면역유전자의 발현을 증가시켜 면역의 증강을 유도하는 것을 증명하였다. 이로써 불활화 VHSV를 키토산 나노파티클로 만든 백신은 침지/침지로 2회 면역하거나 침지/경구로 2회 면역하는 방법으로 VHSV에 의한 폐사를 획기적으로 감소시키는 효능이 있음을 증명하였다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Vaccine Composition for Viral Hemorrhagic Septicemia Using <130> PN190062D <150> KR 10-2019-0019046 <151> 2019-02-19 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHSV N Forward Primer <400> 1 atctggaggc aaagtgcaag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHSV N Reverse Primer <400> 2 ccatgaggtt gtcgttgttg 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-actin Forward Primer <400> 3 cctcttccag ccttcattc 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-actin Reverse Primer <400> 4 tggttcctcc agatagcac 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgM Forward Primer <400> 5 gcctccttct tctgctctg 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgM Reverse Primer <400> 6 cctcagtgga tgttgtgatt 20 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgT Forward Primer <400> 7 taattgttca gtaactcatg ccg 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgT Reverse Primer <400> 8 gattgaagtg ttcctatgcg tct 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pIgR Forward Primer <400> 9 aaggaggagg actctgggtg 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pIgR Reverse Primer <400> 10 tggtgatggg tctggatgg 19 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MHC I Forward Primer <400> 11 tctccctcct ctccagtcag c 21 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MHC I Reverse Primer <400> 12 gctcatctgg aaggtcccgt cat 23 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MHC II Forward Primer <400> 13 gtcgtcaggc ttcactctgt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MHC II Reverse Primer <400> 14 tctctttgcc agctcacttt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFN-gamma Forward Primer <400> 15 ctacaagcgg cgatatgatg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFN-gamma Reverse Primer <400> 16 ggaggttctg gatggttttg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Caspase 3 Forward Primer <400> 17 acatcatgac acgggtgaac 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Caspase 3 Reverse Primer <400> 18 tccttcgtca gcattgacac 20

Claims

바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)의 불활화 균체를 포함하는 구형의 유효성분; 및 상기 유효성분의 외주면을 키토산(chitosan)으로 코팅한 직경 450 내지 500 nm의 나노구(nanosphere)를 포함하는 넙치과(Paralichthyidae) 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제1항에 있어서, 백신 조성물은 침지 또는 경구 투여용인 것인, 백신 조성물.
바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)의 불활화 균체를 포함하는 구형의 유효성분의 외주면을 키토산(chitosan)으로 캡슐화시키는 캡슐화 단계를 포함하는 넙치과 (Paralichthyidae) 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증 예방 또는 치료용 백신 조성물의 제조방법.
제3항에 있어서, 캡슐화 단계는 다음의 단계를 포함하는 것인, 백신 조성물의 제조방법:
바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 불활화 균체를 산성용매에 녹인 키토산과 혼합하여 1차 균질화하는 제1차 균질화 단계; 및
비이온성 계면활성제를 포함하는 파라핀 오일을 첨가하여 2차 균질화하는 제2차 균질화 단계.
제3항에 있어서, 백신 조성물은 침지 또는 경구 투여용인 것인, 백신 조성물의 제조방법.
바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)의 불활화 균체를 포함하는 구형의 유효성분; 및 상기 유효성분의 외주면을 키토산(chitosan)으로 코팅한 직경 450 내지 500 nm의 나노구(nanosphere)를 포함하는 넙치과(Paralichthyidae) 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증 예방 또는 치료용 백신 조성물을, 넙치과 어류에 투여하는 투여 단계를 포함하는 넙치과 어류의 바이러스성 출혈성 패혈증 예방 또는 치료 방법.
제6항에 있어서, 투여 단계는 침지 또는 경구 투여를 통하여 수행되는 것인, 바이러스성 출혈성 패혈증 예방 또는 치료 방법.