KR20080064813A

KR20080064813A - 면역원성이 증강된 ｐｒｒｓｖ 항원을 사용하는 동물의백신화 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20080064813A
Application number: KR1020087007613A
Authority: KR
Inventors: 이스라룰 에이치. 앤사리; 페르난도 에이. 오소리오; 아시트 케이. 패트나이크
Original assignee: 보드 오브 리젠츠 오브 디 유니버시티 오브 네브라스카
Priority date: 2005-08-30
Filing date: 2006-08-30
Publication date: 2008-07-09
Also published as: JP2009506129A; CA2620667A1; EP1929047A2; WO2007040876A3; ES2343371T3; PL1929047T3; US20080233083A1; US7608272B2; EP1929047A4; CN101300363A; DE602006013003D1; EP1929047B1; BRPI0615610A2; WO2007040876A2; DK1929047T3; ATE461295T1

Abstract

야생형 (wt) 또는 당화된 GP5로 면역화된 돼지에 의해 생산되는 중화 항체의 수준과 비교할 때, 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 주요 표면 단백질 GP5의 저당화 변이체로 시험감염된 돼지는 생산되는 PRRSV-중화 항체의 수준을 증가시키는 것으로 나타났다. 본 발명은 PRRSV에 대한 돼지의 면역 반응을 증강시키는 방법, 면역 반응을 증강시키는데 유용한 조성물 뿐만 아니라, PRRSV 주요 표면 단백질 GP5의 저당화 변이체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스, 저당화, 면역 반응.

Description

면역원성이 증강된 ＰＲＲＳＶ 항원을 사용하는 동물의 백신화 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR VACCINATION OF ANIMALS WITH PRRSV ANTIGENS WITH IMPROVED IMMUNOGENICITY}

관련-출원의 교차 참조

본 출원은 2005년 8월 30일자로 출원된 미국 가출원 제60/712,357호를 우선권으로 주장한다.

연방 정부 지원 연구 또는 개발에 관한 진술

본 발명은 미국 농림부로부터 부여된 국립 연구 계획 경쟁 허가 번호 2004-01576(National Research Initiative Competitive Grant #2004-01576) 및 연구 자원 프로젝트 번호 P20RR15636를 위한 국립 센터의 국립 보건원 COBRE 프로그램(National Institute of Health COBRE program of National Center for Research Resources Project # P20RR15636)하에 미국 정부의 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.

첨부물

해당 사항 없음

본 발명의 배경

기술분야

본 발명은 일반적으로 면역원성이 증강된 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 항원을 포함하는 조성물 및 그의 사용 방법에 관한 것이다. 본원에 기술된 조성물 및 방법을 통해 PRRSV 항원에 대한 돼지의 면역원성 반응은 증강되고, 이로써 PRRSV 감염에 대한 돼지의 보호도 증강된다.

관련 기술

PRRSV는 경제적으로 중요한 것으로, 돼지에서 병을 일으키는 병원체이다. 경산돈(sow)과 미경산돈(gilt)을 PRRSV로 감염시킬 경우 번식 장해를 일으킬 수 있다. PRRSV는 또한 모든 연령의 돼지에서 호흡기 질환을 유발한다. PRRSV에 의한 감염으로부터 돼지를 보호하기 위하여 돼지를 백신화할 수 있다. 그러나, 현재 상업적으로 이용가능한 백신 (그 중 대부분은 약독화된 생백신이다)은 다소 효과가 없는 바, 이에 증강되어야 한다. PRRSV로부터 보호하는 것에 관한 완전한 면역학적 기전이 명확하지는 않지만; 이러한 보호에 있어 PRRSV-중화 항체가 중요하다는 것은 명백히 제시되었다. 불행하게도, PRRSV 그 자체 (그의 야생형 형태) 또는 그로부터 유래된 현 생백신에는 적시에 유효 (즉, 보호) 수준으로 바이러스-특이 중화 항체를 유도할 수 있는 능력이 부족하다.

발명의 영문명칭이 "Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof"인 미국 특허 번호 제6,500,662호 (캘버트(Calvert) 등, 2002년 12월 31일)는 감염성 북미 PRRSV cDNA 클론의 개발 및 그의 백신으로서의 용도를 기재하고 있다. 그러나, 미 국 특허 번호 제6,500,662호는 저당화(hypoglycosylated) PRRSV 항원을 포함하는 PRRSV 백신을 개시하지는 않는다.

다른 연구에서는 다양한 북미 PRRSV 종으로부터의 GP5 단백질 (또는 ORF5 단백질) 서열을 서로 비교하고, 렐리스타드(Lelystad) 종으로서 알려져 있는 대표적인 유럽 PRRSV 단리체와도 비교하여, GP5 공통(consensus) 서열중 44번 아스파라긴 (N44) 및 51번 아스파라긴 (N51)의 N-연결 당화 부위가 조사된 모든 PRRSV 단리체에서 보존되고 있음을 밝혀냈다 [Pirzadeh et al., Can. J. Vet Res., 1998, 62:170-177]. 그러나, GP5 공통 서열중 31번 아스파라긴 (N31)에 위치하는 N-당화 부위는 특정의 북미 PRRSV 단리체에 존재하지 않았고, 유럽 PRRSV 렐리스타드 종 단리체에도 존재하지 않았다. 네개 (4)의 북미 PRRSV 종과 렐리스타드 종으로부터의 재조합 GST-GP5 융합 단백질은 불용성 봉입체로서 이. 콜라이(E. coli)에서 생산되고, 복원되고, 토끼에서 면역원으로서 사용되었다. 이. 콜라이에서 생산된 상기의 재조합 단백질은 그들 본래의 N-당화 부위를 보유는 하지만, 당화시키지는 않는다.

IAF-Klop 북미 PRRSV 단리체의 GP5 유전자에 융합된 CMV 프로모터 융합체를 포함하는 DNA 백신을 돼지에 접종한 것도 PRRSV 시험감염에 대하여 면역화된 동물을 보호하는 것으로 나타났다 [Pirzadeh and Dea, 1998, J.General Virology, 79, 989-999]. 이러한 특정의 GP5 유전자 단리체는 DNA 백신으로 면역화된 돼지에서 발현될 때, 가정컨대 당화되는 N31, N44 및 N51 아스파라긴 잔기를 함유하는 GP5 단백질을 코딩한다. IAF-Klop 종의 GP5 유전자중 본래의 N-당화 부위를 보유는 하 되, 당화시키지 않는 이. 콜라이 생산 GST-GP5로 돼지를 백신화한 것은 바이러스로 시험감염된 돼지를 보호하지 못했다.

저당화 PRRSV 단백질이 발현되도록 하는 돌연변이를 함유하는 유럽 PRRSV 감염 클론 또한 기재된 바 있다 [Wissink et al., 2004, J. Gen. Virol. 85:3715-23]. 상기 특정 참고문헌에서는 PRRSV 렐리스타드 종 GP(5) 단백질의 53번 아스파라긴 잔기 (N53)가 당화되지 못하도록 하는, 상기 부위내 돌연변이를 함유하는 PRRSV는 감염성이고, 감염성 PRRSV 렐리스타드 종 바이러스 입자를 생산할 있다고 보고되었다. 대조적으로, PRRSV 렐리스타드 종 GP(5) 단백질의 N46이 N-연결 당화되지 못하도록 하는, 상기 부위내 돌연변이를 함유하는 PRRSV는 비감염성이고, 감염성 PRRSV 렐리스타드 종 바이러스 입자를 생산하지 못한다. 위싱크(Wissink) 등은 유럽 PRRSV GP_2a 단백질에서의 N-글리칸 부위와, 유추적으로 GP5 단백질의 N53 부위는 수용체 상호작용 또는 면역 차폐를 비롯하여, 천연 숙주에서 매우 다양한 수준으로 작용할 수 있다고 추측하였다.

PRRSV 이외의 바이러스에서 글리칸 잔기는 다양한 역할과 연루되어 왔다. 일반적으로 N-연결 당화는 단백질의 정확한 폴딩, 표적화, 및 생물학적 활성에 중요하다 ([Helenius, A. and M. Aebi., Annu. Rev. Biochem. 73:1019-1049, 2004.]; [Williams, D. B. and Glycoconj J., 12:iii-iv. 1995]; [Zhang, et al., Glycobiology 14:1229-46, 2004]). 다수의 외피 보유 바이러스에서, 외피 단백질은 당 부분 첨가에 의해 변형되고, 외피 단백질의 N-연결 당화는 수용체 결합, 막 융합, 세포내로의 침투, 및 바이러스 출아와 같이 바이러스 당단백질의 다양한 작용을 한다 ([Braakman, I. and E. van Anken, Traffic 1:533-9, 2000]; [Doms et al. Virology 193:545-62, 1993]). 최근 연구를 통해 단백질 폴딩 및 세포내 수송 [Shi, X. and R. M. Elliott, J. Virol. 78:5414-22, 2004] 뿐만 아니라, 생물학적 활성에서 한탄(Hantaan) 바이러스 당단백질의 N-연결 당화의 역할과, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA) 단백질의 항원성 [Abe, Y., et al., J. Virol. 78:9605-11, 2004]이 입증되었다. 추가로, 바이러스 외피 단백질의 당화는 바이러스-중화 항체 반응을 회피, 차단 또는 최소화하기 위하여 수개의 상이한 외피 보유 바이러스가 사용하는 바이러스 면역 회피 및 지속을 위한 기전이라는 것은 명백한 것이다. 이러한 효과에 대한 일례는 SIV [Reitter, J. N. et al., Nat. Med. 4:679-84, 1998] 및 HIV-1 [Wei, X. et al., Nature 422:307-12, 2003], HBV [Lee, J. et a!.. Biochem. Biophys. Res. Commun. 303:427-32, 2003], 인플루엔자 [Skehel, J. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1779-83, 1984] 및 아테리바이러스 LDV [Chen, Z. et al. Virology 266:88-98, 2000]에 대하여 보고되었다.

상기의 문제들을 이유로 하여 본 발명이 개발되었다. 야생형 (wt) 또는 당화된 GP5로 면역화된 돼지에 의해 생산되는 중화 항체의 수준과 비교할 때, PRRSV 주요 표면 단백질 GP5의 저당화 변이체는 면역화된 돼지에 의해 생산되는 PRRSV-중화 항체의 수준을 증가시킨다는 것이 입증되었다.

본 발명은 첫번째로, 서열 1의 기준(reference) GP5 단백질중 34번 아스파라긴 또는 51번 아스파라긴에 상응하는 1개 이상의 N-연결 당화 부위가 불활성화된 저당화 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) GP5 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, PRRSV 항원에 대한 돼지의 면역 반응이 증강되도록 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 서열 1중 34번 아스파라긴 또는 51번 아스파라긴에 상응하는 1개 이상의 N-연결 당화 부위가 불활성화된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 감염성 PRRSV RNA 분자를 코딩하는 감염성 PRRSV RNA 분자 또는 DNA 분자를 포함할 수 있다. 감염성 PRRSV RNA 분자는 북미 PRRSV 유도체 또는 유럽 PRRSV 유도체이다. 별법으로, 이러한 폴리뉴클레오티드는 포유동물 세포에서 활성인 프로모터가 저당화 GP5 단백질을 코딩하는 상기의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되어 있는 DNA 분자를 포함할 수 있다. 본 발명의 특정의 바람직한 실시태양에서, 이러한 프로모터는 CMV 프로모터이다. 별법으로, 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터일 수 있다. 사용될 수 있는 대표적인 바이러스 벡터로는 백시니아 바이러스 벡터, 단순 헤르페스 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 및 TGEV 벡터를 포함한다.

다양한 유형 및 공급원의 PRRSV 서열을 사용하여 서열 1의 기준 GP5 단백질중 34번 아스파라긴 또는 51번 아스파라긴에 상응하는 1개 이상의 N-연결 당화 부위가 불활성화된 저당화 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 수득할 수 있다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 저당화 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 직접 합성, 북미 PRRSV 단리체 GP5 뉴클레오티드 서열의 돌연변이 유발, 또는 공통 북미 PRRSV GP5 뉴클레오티드 서열의 돌연변이 유발에 의해 수득된다. 북미 PRRSV 단리체 GP5 뉴클레오티드 서열은 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12 및 서열 13의 GP5 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 군으로부터 선택될 수 있다. 공통 북미 PRRSV GP5 뉴클레오티드 서열은 서열 14와 85％ 이상 일치하는 공통 GP5 단백질을 코딩한다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 저당화 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 직접 합성, 유럽 PRRSV 단리체 GP5 뉴클레오티드 서열의 돌연변이 유발, 또는 공통 유럽 PRRSV GP5 뉴클레오티드 서열의 돌연변이 유발에 의해 수득된다. 유럽 PRRSV 단리체 GP5 뉴클레오티드 서열은 서열 15와 85％ 이상 일치하는 GP5 단백질을 코딩한다.

특정 N-연결 당화 부위를 불활성화시키는 다양한 방법을 사용하여 본 발명의 방법을 효과적으로 실시할 수 있다. 51번 아스파라긴에 상응하는 N-연결 당화 부위를 불활성화시키는 하나의 바람직한 방법은 아스파라긴 코돈을 아스파라긴 이외의 아미노산을 코딩하는 코돈으로 대체하는 것이다. 이러한 대체 코돈은 알라닌 또는 글루타민 잔기를 코딩할 수 있다. 더욱 바람직한 실시태양에서, 서열 1의 기준 GP5 단백질중 34번 아스파라긴 및 51번 아스파라긴에 상응하는 상기 N-연결 당화 부위 둘 다가 불활성화된다. 다른 실시태양에서, 34번 아스파라긴에 상응하는 N-연결 당화 부위가 불활성화된다. 이러한 34번 아스파라긴 N-연결 당화 부위는, 상기 34번 아스파라긴을 코딩하는 코돈을 아스파라긴 이외의 아미노산을 코딩하는 코돈으로 대체함으로써 불활성화될 수 있다. 다른 아미노산을 코딩하는 코돈은 알라닌 또는 글루타민 잔기를 코딩할 수 있다. 다른 바람직한 실시태양에서, 기준 GP5 단백질중 34번 아스파라긴 및 51번 아스파라긴에 상응하는 N-연결 당화 부위 둘 다는 34번 아스파라긴 및 51번 아스파라긴을 코딩하는 코돈을 아스파라긴 이외의 아미노산을 코딩하는 코돈으로 대체함으로써 불활성화될 수 있다. 34번 아스파라긴 및 51번 아스파라긴을 코딩하는 코돈 둘 다는 알라닌 또는 글루타민 잔기를 코딩하는 코돈으로 대체됨으로써 상기의 당화 부위를 불활성화시킬 수 있다. 별법으로, 이들 코돈 둘 다는 알라닌 잔기를 코딩하는 코돈으로 대체되어 상기 코돈 둘 다를 불활성화시킬 수 있다. 별법으로, N-연결 당화 부위중 하나는, 상기 34번 아스파라긴 또는 상기 51번 아스파라긴을 코딩하는 하나의 코돈을 아스파라긴 이외의 아미노산을 코딩하는 코돈으로 대체함으로써 불활성화되고, 나머지 하나의 N-연결 당화 부위는 다른 기법에 의해 불활성화된다.

바람직한 실시태양에서, 본 방법은 서열 1의 기준 GP5 단백질중 34번 아스파라긴 또는 51번 아스파라긴에 상응하는 1개 이상의 N-연결 당화 부위가 불활성화된 저당화 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체 단백질을 코딩하는 북미 PRRSV 유도체인 감염성 PRRSV RNA 분자를 사용한다. 더욱 바람직한 실시태양에서, 서열 1의 기준 GP5 단백질중 34번 아스파라긴 및 51번 아스파라긴에 상응하는 상기 N-연결 당화 부위 둘 다가 불활성화된다. 기준 GP5 단백질중 34번 아스파라긴 및 51번 아스파라긴에 상응하는 N-연결 당화 부위 둘 다는 34번 아스파라긴 및 51번 아스파라긴을 코딩하는 코돈을 아스파라긴 이외의 아미노산을 코딩하는 코돈으로 대체함으로써 불활성화될 수 있다. 34번 아스파라긴 및 51번 아스파라긴을 코딩하는 코돈 둘 다는 알라닌 또는 글루타민 잔기를 코딩하는 코돈으로 대체됨으로써 상기의 당화 부위를 불활성화시킬 수 있다. 별법으로, 상기 코돈 둘 다는 알라닌 잔기를 코딩하는 코돈으로 대체되어 상기의 당화 부위를 불활성화시킬 수 있다.

본 방법을 실시하기 위하여, 폴리뉴클레오티드 함유 조성물을 피하 주사, 정맥내 주사, 진피내 주사, 비경구 주사, 근육내 주사, 무침(needle free) 주사, 전기천공, 경구 전달, 비내 전달, 구비강(oronasal) 전달, 또는 그의 임의의 조합에 의해 투여한다. 투여되는 조성물은 치료학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 치료학적으로 허용가능한 담체는 단백질, 완충액, 계면활성제, 및 폴리에틸렌 글리콜 중합체, 또는 그의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.

투여되는 조성물은 추가로 보조제(adjuvant)를 포함할 수 있다. 이러한 보조제는 수산화알루미늄, 퀼(Quil) A, 알루미나겔 현탁액, 광유, 글리세리드, 지방산, 지방산 부산물, 마이코박테리아, 및 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 투여되는 조성물은 또한 제2 보조제, 예로서, 인터루킨 1 (IL-1), IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, 감마 인터페론 (g-IFN), 세포 괴사 인자, MDP (뮤라밀 디펩티드), 면역자극제 복합체 (ISCOM), 및 리포좀을 포함할 수 있다.

PRRSV 항원에 대한 돼지의 면역 반응 증강은 상기 돼지에 의한 PRRSV 중화 항체 생산 증가를 포함할 수 있다. PRRSV 중화 항체 생산 증가는 전형적으로 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 돼지를 면역화시킬 때 관찰된다. 증강된 면역 반응은 경산돈, 미경산돈, 수퇘지(boar), 또는 새끼 돼지(piglet)에서 수득할 수 있다.

본 발명은 또한 서열 1의 기준 GP5 단백질중 34번 아스파라긴 또는 51번 아스파라긴에 상응하는 1개 이상의 N-연결 당화 부위가 불활성화된 저당화 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) GP5 폴리펩티드 변이체를 포함하는 조성물을 돼지에게 투여하는 것을 포함하는, PRRSV 항원에 대한 돼지의 면역 반응이 증강되도록 유도하는 방법을 제공한다. 저당화 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체 단백질은 세균, 효모, 또는 포유동물 발현 시스템에서 앞서 기술된 방법에서 사용된 것과 동일한 폴리뉴클레오티드에 의해 생산될 수 있다.

본 발명은 또한 서열 1의 기준 GP5 단백질중 51번 아스파라긴에 상응하는 1개 이상의 N-연결 당화 부위가 불활성화된 저당화 북미 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 치료학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시태양에서, 조성물은 서열 1에서 34번 아스파라긴 및 51번 아스파라긴에 상응하는 N-연결 당화 부위 둘 다가 불활성화된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 이러한 조성물은 감염성 북미 PRRSV RNA 분자를 코딩하는 감염성 북미 PRRSV RNA 분자 또는 DNA 분자를 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드는, 포유동물 세포에서 활성인 프로모터가 상기 저당화 북미 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 상기의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되어 있는 DNA 분자를 포함할 수 있다. 특정 바람직한 실시태양에서, 이러한 프로모터는 CMV 프로모터이다. 추가의 다른 실시태양에서, 조성물중의 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터를 포함한다. 본 조성물에서 사용될 수 있는 바이러스 벡터로는 백시니아 바이러스 벡터, 단순 헤르페스 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 및 TGEV 벡터 중 어느 하나일 수 있다.

조성물의 폴리뉴클레오티드에서, N-연결 당화 부위는, 상기 51번 아스파라긴을 코딩하는 코돈을 아스파라긴 이외의 아미노산을 코딩하는 코돈으로 대체함으로써 불활성화된다. 아스파라긴 이외의 아미노산을 코딩하는 코돈은 알라닌 또는 글루타민 잔기를 코딩한다. 이러한 조성물의 다른 실시태양에서, 추가의 N-연결 당화 부위는, 34번 아스파라긴을 코딩하는 코돈을 아스파라긴 이외의 아미노산을 코딩하는 코돈으로 대체함으로써 불활성화된다. 다른 아미노산을 코딩하는 이러한 코돈은 알라닌 또는 글루타민 잔기를 코딩할 수 있다. 따라서, 서열 1의 북미 기준 GP5 단백질중 34번 아스파라긴 및 51번 아스파라긴에 상응하는 N-연결 당화 부위 둘 다가 불활성화된 저당화 북미 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바람직한 조성물은 이러한 적용을 위해 제공된다. 상기 N-연결 당화 부위 둘 다는, 상기 34번 아스파라긴 및 상기 51번 아스파라긴을 코딩하는 코돈을 아스파라긴 이외의 아미노산을 코딩하는 코돈으로 대체함으로써 불활성화될 수 있다. 이러한, 아스파라긴 이외의 아미노산을 코딩하는 코돈은 알라닌 또는 글루타민 잔기를 코딩할 수 있다.

조성물에 사용되는 치료학적으로 허용가능한 담체는 단백질, 완충액, 계면활성제, 및 폴리에틸렌 글리콜 중합체, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 조성물은 1종 이상의 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 보조제는 수산화알루미늄, 퀼 A, 알루미나겔 현탁액, 광유, 글리세리드, 지방산, 지방산 부산물, 마이코박테리아, 및 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 조성물은 추가로 인터루킨 1 (IL-1), IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, 감마 인터페론 (g-IFN), 세포 괴사 인자, MDP (뮤라밀 디펩티드), 면역자극제 복합체 (ISCOM), 및 리포좀으로 구성된 군으로부터 선택된 제2 보조제일 수 있다.

서열 1의 기준 GP5 단백질중 51번 아스파라긴에 상응하는 1개 이상의 N-연결 당화 부위가 불활성화된 저당화 북미 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체, 및 치료학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물 또한 본 발명에 의해 제공된다. 바람직한 실시태양에서, 서열 1의 기준 GP5 단백질중 34번 아스파라긴 또는 51번 아스파라긴에 상응하는 N-연결 당화 부위는 불활성화된다. 저당화 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체 단백질은 세균, 효모, 또는 포유동물 발현 시스템에서 앞서 기술된 방법에서 사용된 것과 동일한 폴리뉴클레오티드에 의해 생산될 수 있다.

본 발명은 또한 서열 1의 기준 GP5 단백질중 51번 아스파라긴에 상응하는 1개 이상의 N-연결 당화 부위가 불활성화된 저당화 북미 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 특정 실시태양에서, 서열 1에서 34번 아스파라긴 및 51번 아스파라긴에 상응하는 N-연결 당화 부위 둘 다가 불활성화된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 이러한 단리된 폴리뉴클레오티드는 감염성 북미 PRRSV RNA 분자를 코딩하는 감염성 북미 PRRSV RNA 분자 또는 DNA 분자를 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는, 포유동물 세포에서 활성인 프로모터가 상기 저당화 북미 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 상기의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되어 있는 DNA 분자를 포함한다. 특정 바람직한 실시태양에서, 이러한 프로모터는 CMV 프로모터이다. 추가의 다른 실시태양에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터를 포함한다. 본 조성물에서 사용될 수 있는 바이러스 벡터로는 백시니아 바이러스 벡터, 단순 헤르페스 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 및 TGEV 벡터 중 어느 하나일 수 있다.

단리된 폴리뉴클레오티드에서, N-연결 당화 부위는, 상기 51번 아스파라긴을 코딩하는 코돈을 아스파라긴 이외의 아미노산을 코딩하는 코돈으로 대체함으로써 불활성화된다. 아스파라긴 이외의 아미노산을 코딩하는 코돈은 알라닌 또는 글루타민 잔기를 코딩한다. 다른 바람직한 실시태양에서, 추가의 N-연결 당화 부위는, 34번 아스파라긴을 코딩하는 코돈을 아스파라긴 이외의 아미노산을 코딩하는 코돈으로 대체함으로써 불활성화된다. 다른 아미노산을 코딩하는 이러한 코돈은 알라닌 또는 글루타민 잔기를 코딩할 수 있다. 따라서, 서열 1의 북미 기준 GP5 단백질중 34번 아스파라긴 및 51번 아스파라긴에 상응하는 N-연결 당화 부위 둘 다가 불활성화된 저당화 북미 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체 단백질을 코딩하는 바람직한 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 N-연결 당화 부위 둘 다는, 상기 34번 아스파라긴 및 상기 51번 아스파라긴을 코딩하는 코돈을 아스파라긴 이외의 아미노산을 코딩하는 코돈으로 대체함으로써 불활성화될 수 있다. 이러한, 아스파라긴 이외의 아미노산을 코딩하는 코돈은 알라닌 또는 글루타민 잔기를 코딩할 수 있다.

본 발명은 또한 단리된 폴리펩티드가 서열 1의 기준 GP5 단백질중 51번 아스파라긴에 상응하는 1개 이상의 N-연결 당화 부위가 불활성화된 저당화 북미 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체인 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 단리된 저당화 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체 단백질은 세균, 효모, 또는 포유동물 발현 시스템에서 앞서 기술된 방법에서 사용된 것과 동일한 폴리뉴클레오티드에 의해 생산될 수 있고, 크로마토그래피, 또는 다른 기법에 의해 정제될 수 있다.

본 발명의 추가의 특징과 잇점 뿐만 아니라, 본 발명의 다양한 실시태양의 구성과 작용도 첨부된 도면을 참고로 하기에 상세히 기술된다.

명세서내 포함되어 있고, 그의 일부분을 형성하는 첨부 도면은 상세한 설명과 함께 본 발명의 실시태양을 설명하고, 본 발명의 원리를 설명하는 역할을 한다. 도면에서,

도 1은 PRRSV GP5 및 M 단백질의 일시적인 발현을 설명한다. A. 뇌심근염 바이러스로부터 유래된 IRES (IE) 측면에 위치하는 GP5 및 M 코딩 영역을 나타내는 이시스트론성 작제물의 개략도. 코딩 영역은, GP5 코딩 영역 상류 바로 가까이에 존재하는 T7 RNA 중합효소 프로모터 (검은색 직사각형)의 조정하에 있다. 굽은 화살표 표시는 벡터로부터 T7 RNA 중합효소에 의한 전사의 위치와 방향을 나타낸다. B. 이시스트론성 벡터로 형질감염된 세포에서 GP5 및 M 단백질의 발현. 모의-형질감염된 세포 (레인 1) 또는 플라스미드 형질감염된 세포 (레인 2-7)는 물질 및 방법에 기술된 바와 같이 방사선표지하고, 항-Gp5 항체 (레인 1-5) 또는 항-M 항체 (레인 6-7)로 면역침전시켰다. 면역침전된 단백질을 처리하지 않은 채로 남겨두거나 (-) (레인 1, 2, 6, 및 7), 엔도 H (레인 3), PNGase F (레인 4)로 처리하고 (+), 전기영동에 의해 분석하였다. 레인 5는 튜니카마이신으로 처리된 (+) 형질감 염된 세포로부터의 면역침전된 단백질을 함유한다. 상대 분자량 (Mr) (킬로달톤)에 따른 단백질의 이동을 나타낸다.

도 2는 이시스트론성 플라스미드를 사용한, WT-GP5 및 그의 돌연변이체의 당화 분석을 설명한다. A. 이시스트론성 벡터 및 제시한 34번, 44번, 및 51번 아미노산 위치에 3개의 잠정적 당화 부위를 갖는 PRRSV GP5의 개략도. B. 본 연구에서 사용된 다양한 돌연변이체들. C. wt 및 돌연변이체 GP5의 발현, 및 그들의 엔도 H에 대한 감수성. 본 실험은 도 1에 관한 설명에 기술된 바와 같이 실시하였고, 단백질은 항-GP5 항체로 면역침전시키고, 엔도 H (+)로 분해하거나, 분해하지 않고 남겨두고 (-), 전기영동에 의해 분석하였다. 돌연변이체 GP5 단백질을 화살촉으로 표시하였다. 상대 분자량 (Mr) (킬로달톤)에 따른 단백질의 이동을 우측에 나타낸다.

도 3은 돌연변이체 GP5를 코딩하는 돌연변이체 바이러스의 특징화를 설명한다. A. MARC-145 세포에서 wt (FL-12) 및 다양한 돌연변이체 PRRSV들의 일회(single step) 성장 동역학. 6-웰에 플레이팅된 세포를 3.0의 MOI로 PRRSV를 사용하여 감염시키고, 감염 후 지정된 시간에 배양 상등액을 수집하고, 바이러스 역가를 측정하였다. 3개의 독립적인 실험으로부터 평균 역가를 표준 편차 (오차 막대)와 함께 나타낸다. B. 돌연변이체 바이러스의 플라크 형태. 흰색의 화살표와 화살촉 표시는 보다 덜 투명한 플라크를 나타낸다. C. 돌연변이체 PRRSV를 회복시키는 트란스-보상. wt GP5 단백질을 발현시키는 세포로부터의 돌연변이체 바이러스 회복에 대한 양적 분석. 3개의 독립적인 실험으로부터 평균 바이러스 수율을 표준 편차 (오차 막대로 표시)와 함께 나타낸다.

도 4는 돌연변이체 비리온내로 혼입되고, 돌연변이체 바이러스-감염된 세포에서 합성된 GP5를 조사한 것을 설명한다. A. 감염된 세포의 배양 상등액으로부터 얻은 방사선표지된 비리온을 펠릿화하고, GP5 단백질을 면역침전시키고, 엔도 H (+)로 처리하거나, 처리하지 않고 (-), 전기영동에 의해 분석하였다. 레인 1 및 2의 엔도 H 분해된 GP5와 분해되지 않는 GP5는 흰색 괄호로 표시하였다. B. 다양한 돌연변이체 바이러스로 감염된 세포를 방사선표지하고, GP5를 면역침전시키고, 엔도 H (+)로 처리하거나, 처리하지 않고 (-), 전기영동에 의해 분석하였다. 레인 2 및 3의 엔도 H 분해된 GP5와 분해되지 않는 GP5는 흰색 괄호로 표시하였다. 상대 분자량 (Mr) (킬로달톤)에 따른 단백질의 이동을 각 패널의 우측에 나타낸다.

도 5는 북미 PRRSV GP5 기준 n-말단 서열 (서열 1; 종 NVSL 97-7895)과 북미 PRRSV GP5 n-말단 아미노산 서열의 정렬을 설명한다. 200개의 아미노산 단백질의 정렬중 처음 60개의 N-말단 아미노산을 나타낸다. 단백질중 N-연결 당화 부위에서 34번 아스파라긴 "NSS" 및 51번 아스파라긴 "NGT"는 굵게 표시하였다. 기준 GP5 단백질의 29번 잔기와 35번 잔기 사이에 위치하는 다른 N-연결 당화 부위는 밑줄로 표시하였다.

도 6은 북미 PRRSV GP5 기준 n-말단 서열 (서열 1; 종 NVSL 97-7895)과 유럽 PRRSV GP5 N-말단 아미노산 서열의 정렬을 설명한다. 대략 200개의 아미노산 단백질중 전체 GP5 단백질의 정렬을 나타내는데, 여기에서, 단백질중 N-연결 당화 부위에서 51번 아스파라긴 "NGT"는 굵게 표시하였다 (즉, 서열 15에서 53번 아스파라 긴).

바람직한 실시태양의 상세한 설명

정의

본원에서 사용되는 바, "허용가능한 담체"는 조성물중의 다른 성분들에 대하여 유해하지 않고, 그것이 적용되는 물질에 대하여 유해하지 않은 담체를 지칭한다. "치료학적으로 허용가능한 담체"는 조성물중의 다른 성분들에 대하여 유해하지 않고, 그의 인간 또는 다른 동물 수용자에게 유해하지 않는 담체를 지칭한다. 조성물중의 다른 성분들과 관련하여, "유해하지 않다"라는 것은 담체가 다른 성분들과 반응하지 않거나, 다른 성분들을 분해하지 않거나, 또는 다르게는, 그들의 효능에 간섭하지 않을 것이라는 것을 의미하는 것이다. 다른 성분들의 효능에 간섭한다는 것은 단순히 성분을 희석시킨다는 것을 포함하는 것은 아니다. 동물과 관련하여, "유해하지 않다"라는 것은 담체가 식물 또는 동물에 해롭거나 치명적인 것은 아니라는 것을 의미하는 것이다.

본원에서 사용되는 바, "보조제"는 면역 반응을 유도할 수 있는 항원의 능력을 증진시켜 주는, 항원과 함께 사용되는 임의의 물질을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "투여"는 폴리뉴클레오티드, 그의 폴리펩티드 또는 조성물을 대상자에게 제공하는 임의의 수단을 지칭한다. 투여 수단의 비제한적인 일례로는 피하 주사, 정맥내 주사, 진피내 주사, 비경구 주사, 근육내 주사, 무침 주사, 전기천공, 경구 전달, 비내 전달, 구비강 전달, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "항원"은 숙주에서 면역 반응을 유도하는 임의 실체를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "공통 서열"은, 2개 이상의 상동성 서열을 정렬하고, 공통된 아미노산, DNA 또는 RNA 서열을 나타내는 새로운 서열을 유도해냄으로써 생성된 아미노산, DNA 또는 RNA 서열을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "저당화 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체"는, 생성된 GP5 변이체 단백질내 N-연결 당화 부위의 갯수를 감소시키기 위하여 하나 이상의 N-연결 당화 부위를 포함하는 원래의 또는 비-변이체 아미노산 서열이 변화된 PRRSV GP5 단백질을 지칭한다. 이러한 정의하에서, 동일한 갯수의 당화 부위를 함유하는 원래의 GP5 서열을 갖는 GP5 단백질을 생산하기 위하여 이. 콜라이에서 원래의 또는 비-변이체 GP5 단백질을 발현시켜서는 저당화 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체를 생산할 수 없을 것이다.

본원에서 사용되는 바, "면역 반응"은, 특정 항원에 결합, 분해, 또는 다르게는 그를 저해하는 항체 및/또는 세포 (예로서, T 림프구)를 생산하는 것을 지칭한다. 관련 어구로서, 예를 들면, "면역 반응 증강"은 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 항원에 대하여 면역화된 숙주의 반응을 임의로 측정가능하게 증강시키는 것을 지칭한다. 예를 들면, 면역 반응을 측정가능하게 증강시킨다는 것은 면역 반응을 증강시키기 위하여 제공되는 구조상의 변형을 갖지 않는 항원으로 면역화된 대조군 동물에서 관찰되는 생산 수준과 비교할 때, 중화 항체의 생산을 증가 (즉, 항체 역가 증가)시키는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

"감염성 RNA 분자"는 증식 허용 숙주 세포내로 도입되었을 때, 기능성 비리온 생산에 필요한 모든 요소를 코딩하는 RNA 분자를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "감염성 클론"은 감염성 RNA 분자를 코딩하는 DNA 분자를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "북미 PRRSV"는 북미 PRRSV 단리체와 관련된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 PRRSV, 예로서, NVSL 97-7895 종 ([Truong et al, Virology, 325:308-319] 및 그에 포함되어 있는 참고 문헌) 또는 IAF-Klop, MLV, ATCC VR-2332, ATCC VR-2385, IAF-BAJ, IAF-DESR, IAF-CM, IAF 93-653, IAF 93-2616, IAF 94-3182, IAF 94-287 종 ([Pirzadeh et al. Can. J. Vet Res, 62: 170-177] 및 그에 포함되어 있는 참고 문헌)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서, 북미 PRRSV 단리체와 관련된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 PRRSV는 GP5 코딩 영역이 서열 1과 85％ 이상의 단백질 서열 일치성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 PRRSV이다.

본원에서 사용되는 바, "유럽 PRRSV"는 북미 PRRSV 단리체와 관련된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 PRRSV, 예로서, 렐리스타드 종 ([Wissink et al., J. Gen. Virol. 85:3715, 2004] 및 그에 포함되어 있는 참고 문헌)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서, 유럽 PRRSV 단리체와 관련된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 PRRSV는 GP5 코딩 영역이 서열 15와 85％ 이상의 단백질 서열 일치성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 PRRSV이다.

본원에서 사용되는 바, "일치성(％)"은 소정 길이의, 최적으로 정렬된, 2개의 DNA, RNA 또는 단백질 세그먼트 내에서 일치하는 서열내 요소 (즉, 아미노산 또는 뉴클레오티드)의 갯수를 지칭한다. "일치성(％)"을 산출하기 위해서는 일치하는 요소의 갯수를 소정 길이의 정렬된 세그먼트내 요소의 총 갯수로 나누고, 100을 곱한다. 일치성(％)이 단백질에 대한 기준으로 사용되는 경우, 특정 아미노산 잔기는 일치하지 않을 수 있지만, 그럼에도 불구하고, 이는 유사한 화학적 성질을 갖는 아미노산 잔기 (예컨대, 산성 또는 염기성, 소수성, 친수성, 수소 결합 공여체 또는 수령체 잔기)로 치환하는 것을 반영하는 보존적 아미노산 치환물인 것으로 이해된다. 그러한 치환이 분자의 작용상의 성질을 변화시키지 않을 수 있다. 결과적으로, 단백질 서열의 일치성(％)은 보존적 치환을 원인으로 하여 증가될 수 있다.

도입

돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 당단백질 5 (GP5)는 가장 풍부한 외피 당단백질이며, 생체내 중화 항체의 주요 유도자이다. 3개의 잠정적 N-연결 당화 부위 (N34, N44, 및 N51)가 GP5 엑토도메인에 위치하는데, 여기에는 주요 중화 에피토프 또한 존재한다. 이들 잠정적 당화 부위중 어느 것이 PRRSV 바이러스 생활사, 및 중화 항체의 유도에서 글리칸 부위의 역할에 사용되는지 측정하기 위하여, 본 발명자는 이들 부위에 단일 및 다중 아미노산 치환을 함유하는 GP5 돌연변이체 패널을 생성하였다. 야생형 (wt) 뿐만 아니라, 돌연변이체 단백질의 일시적인 발현과, 이후의 생화학적 연구를 통해 성숙한 GP5가 3개 부위 모두에서 고-만노스형 당 부분을 함유하는 것을 밝혀냈다. 이어서, 이들 돌연변이를 전장의 cDNA 클론내로 혼입시켜 감염성 PRRSV를 회복시켰다. 본 발명자의 결과를 통해 N44 잔기를 포함하지 않는 돌연변이는 감염성 자손을 생산하지 않았음을 입증하였는데, 이는 N44가 바이러스 감염성에 가장 중요한 아미노산 잔기라는 것을 시사한다. N34, N51, 및 N34/51에 돌연변이를 수반하는 바이러스는 wt PRRSV 보다 낮은 역가로 성장하였고, MARC-145 세포에서 세포병변 효과가 저하된 것으로 나타났다. 혈청 중화 검정법에서, 돌연변이체 바이러스는 wt PRRSV-특이 항체에 의한 중화에 대하여 감수성이 증진된 것으로 나타났다. 추가로, 돼지에 돌연변이체 바이러스를접종하였을 때에는 돌연변이체 뿐만 아니라, PRRSV에 대하여도 현저히 고 수준으로 중화 항체를 유도하였고, 따라서, 이를 통해 GP5의 엑토도메인내 글리칸 잔기의 손실이 이들 바이러스의 시험관내 중화에 대한 감수성 뿐만 아니라, 근접한 중화 에피토프의 면역원성도 증진시킨다는 것이 제안되었다. 이러한 결과는 보호 효능이 증진된 PRRSV 백신의 개발을 위해서는 매우 유의적이어야 한다.

중화 항체는 PRRSV로부터의 보호에 대한 주요 상관물인 것으로 알려져 있다. 본 발명자는 PRRSV GP5 단백질의 당화 부위를 제거한 경우, (1) PRRSV 회복기 혈청에 의해 중화될 수 있는 변형된 PRRSV 종의 능력, 및 (2) 돼지에 접종하기 위하여 사용될 때, PRRSV-중화 항체를 전례없는 수준으로 생산할 수 있는 이러한 변형된 PRRSV 종의 능력을 상당 증진시킨다는 것을 발견하게 되었다. 이러한 개념을 PRRSV 감염에 대하여 면역화시키기 위하여 사용되는 임의의 생존 (wt 또는 약독화된) 바이러스에 적용시키는 것은 PRRSV 감염에 대하여 효과적인 보호능을 부여하는 그의 사용에 있어서 상당한 효과를 미칠 것이다.

현재, PRRSV 감염에 대하여 면역화시키는 주요 접근법이 3개 존재한다: (1) 약독화된 생백신, (2) 불활성화된 백신 (wt PRRSV에 기초하여 시험관내에서, 화학적으로 불활성화된 것이다), 및 (3) 한 무리의 동물 모두에게 조직적인 방식으로 독성 wt PRRSV를 사용한 고의적인 감염 사용. 이러한 3개의 방법중 어느 것이 가장 효과적인지에 관하여 수차례 논의되었고, 많은 논쟁이 있었다. 본 발명은 면역화를 위해 사용되는 접근법과는 상관없이 유익할 것이다. 생존 PRRSV의 단백질의 당화 수준을 변형시키기 위한 생존 PRRSV의 유전자 변경은 불활성화된 백신을 생산하기 위하여 사용되는 약독화된 PRRSV 백신 종, 또는 wt PRRSV 종, 또는 대량 감염에 의해 한 무리에 직접 접종하기 위하여 사용되는 wt PRRSV 종에서 수행될 수 있다.

돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV)는 말 동맥염 바이러스 (EAV), 젖산 탈수소효소-촉진 바이러스 (LDV), 및 원숭이 출혈열 바이러스 (SHFV) 또한 포함하는 니도바이랄(Nidovirales) 목내의 아르테리비리대(Arteriviridae) 과에 속한다. 바이러스 게놈은 길이가 대략 15.0 kb인 선형 (+) 스트랜드 RNA 분자이며, 5'-말단에 캡 구조와 3'-말단에 폴리(A) 테일을 갖는다. 8개의 오픈 리딩 프레임 (ORF)이 바이러스 게놈에서 코딩된다. 처음 2개의 오픈 리딩 프레임 (ORF1a 및 ORF1ab)은 폴리단백질 프로세싱, 게놈 전사 및 복제에 관여하는 바이러스 비-구조 (NS) 폴리단백질을 코딩한다. ORF2-7에서 코딩되는 바이러스 구조 단백질은 5' 종단에 공통된 리더 서열을 갖는 mRNA의 3'-공말단 네스티드 세트로서 합성되는 6개의 서브게놈의 캡핑 및 폴리아데닐화된 mRNA로부터 발현된다. 주요 바이러스 외피 단백질은 당단백질 5 (GP5)로서, 이는 바이러스 게놈중 ORF5에서 코딩된다. GP5는 크기가 대략 25 kDa인 당화된 막횡단 단백질이다. 이는 잠정적 N-말단 신호 펩티드를 갖고, 성숙한 단백질의 처음 40개의 잔기를 포함하는 작은 엑토도메인에 위치하는 3개의 잠재적인 N-연결 당화 부위를 소지한다. EAV 및 LDV에서, 주요 외피 당단백질은 바이러스 매트릭스 (M) 단백질인 ORF6 유전자 산물과 디설파이드-연결 이종이량체를 형성한다. PRRSV GP5와 M 단백질 사이에서도 유사한 상호작용이 관찰되었지만, 상호작용의 모드는 아직 정의되지 못했다. GP5와 M 단백질의 이종이량체 형성이 감염성 PRRSV의 어셈블리에서 중요한 역할을 할 수 있을 것으로 간주되었다. 그의 바이러스 어셈블리에서의 역할 이외에도, GP5는 감염되기 쉬운 숙주 세포내로 바이러스가 유입되는 것에 관여하는 것으로 보인다. GP5는 PRRSV에 대한 생체내 표적 세포인 돼지 폐포 대식세포 (PAMs)내로의 유입을 위한 시알로어드헤신인 숙주 세포 수용체와 상호작용하는 것으로 추정되었다. 수용체 인식에 있어 GP5의 역할은 N-말단 엑토도메인내 주요 중화 에피토프가 존재하고, 따라서, 감염 과정에서 GP5 엑토도메인이 중추적인 역할을 하는 것을 암시하는 것이 입증되었다.

GP5 엑토도메인의 N-연결 글리칸은 단백질이 적절하게 작용하는데 중요할 수 있다. 일반적으로, N-연결 당화는 단백질의 정확한 폴딩, 표적화, 및 생물학적 활성에 중요하다. 다수의 외피 보유 바이러스에서, 외피 단백질은 당 부분 첨가에 의해 변형되고, 외피 단백질의 N-연결 당화는 수용체 결합, 막 융합, 세포내로의 침투, 및 바이러스 출아와 같이 바이러스 당단백질의 다양한 작용을 한다. 최근 연구를 통해 단백질 폴딩 및 세포내 수송 뿐만 아니라, 생물학적 활성에서 한탄 바이러스 당단백질의 N-연결 당화의 역할과, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA) 단백질의 항원성이 입증되었다. 추가로, 바이러스 외피 단백질의 당화는 바이러스-중화 항체 반응을 회피, 차단 또는 최소화하기 위하여 수개의 상이한 외피 보유 바이러스가 사용하는 바이러스 면역 회피 및 지속을 위한 기전이라는 것은 명백한 것이다. 이러한 효과에 대한 일례는 SIV 및 HIV-1, HBV, 인플루엔자에 대하여, 더욱 중요하게는 아테리바이러스 LDV에 대하여 보고되었다.

최근, 본 발명자들의 실험을 비롯한 수개의 실험으로부터 PRRSV에 대한 역 유전 시스템이 개발되었다고 보고되었다. 감염성 클론을 사용한 돌연변이 연구를 통해서 아테리바이러스의 바이러스 게놈의 전사 및 복제 기전에 관하여 보다 잘 이해하게 되었다는 것은 분명하다. 따라서, 감염성 바이러스를 생성하거나, 생체내에서 중화 항체를 유도할 때 PRRSV의 GP5의 생물학적 활성에 있어서의 N-연결 당화의 중요성을 조사하기 위하여, 본 발명자는 각각의 잠재적 N-연결 당화 부위가 개별적으로 또는 다양하게 조합되어 돌연변이화된, 일련의 돌연변이체 GP5 단백질을 작제하였다. 그의 당화 패턴, 감염성 바이러스 회복에서의 역할, 및 실험상의 접종을 통해 wt PRRSV 또는 돌연변이체 바이러스에 대하여 증가된 항체에 의한 교차 중화에서의 역할에 대하여 생성된 돌연변이체 단백질을 조사하였다. 본 발명자들이 얻은 데이타는, 고-만노스형 글리칸을 사용하는 당화를 위해서는 잠정적 당화 부위 3개 모두가 사용되며, 44번 잔기의 GP5 단백질 당화가 감염성 PRRSV의 회복에 중요하다는 것을 나타낸다. 매우 중요하게, 중화 및 항체 반응 연구로부터 본 발명자들이 얻은 데이타는, PRRSV에 의한 천연 감염이 앞서 다른 바이러스에 대하여 기술된 바와 같이 글리칸 차폐 기전에 기초한 면역 회피를 포함할 수 있다는 것을 시사하며, 이로써 PRRSV-감염된 동물에서 관찰되는 다소 무력한 보호적 체액성 면역 반응을 설명하는데 도움을 줄 수 있다.

N-연결 당화 부위 및 불활성화 방법

당단백질에서 N-연결 당화는 전형적으로 Asn-Xaa-Ser/Thr (NXS/T) 서열 (여기에서, Xaa (X)는 Pro를 제외한 임의의 아미노산 잔기이다)에서 발생한다. 그들을 불활성화시키기 위하여 다양한 돌연변이가 N-연결 당화 부위에 도입될 수 있다. 바람직한 불활성화 방법은 아스파라긴 잔기를 아스파라긴 이외의 임의의 아미노산을 코딩하는 잔기로 치환하는 것을 포함한다. 본 발명의 더욱 바람직한 실시태양에서, 아스파라긴 잔기는 알라닌 또는 글루타민 잔기로 치환된다.

N-연결 당화 부위, 및 특히, 서열 1의 GP5 기준 단백질중 34번 아스파라긴 및/또는 51에 상응하는 N-연결 당화 부위를 불활성화시키는 다른 방법 또한 본원에서 주시된다. Xaa 위치에서의 특정 아미노산, 예로서, 프롤린, 트립토판, 아스파테이트, 글루타메이트 또는 류신을 치환하는 것을 또한 이용하여 N-연결 당화 부위를 불활성화시킬 수 있다 [Kasturi et al., Biochem J. 323 (2):415-9, 1997]. 별법으로, N-연결 당화 부위의 마지막 하이드록시 아미노산 위치 (즉, NXS/T 서열중 세린 또는 트레오닌 잔기)를 임의의 비-하이드록시 아미노산 (즉, 세린 또는 트레오닌을 제외한 임의의 아미노산)으로 치환하는 것을 또한 이용하여 N-연결 당화 부 위를 불활성화시킬 수 있다. N-연결 당화 부위를 불활성화시키기 위하여 사용된 비-하이드록시 아미노산의 일례로는 시스테인을 포함한다 [Kasturi et al., J. Biol. Chemistry 270(24), 14756-14761, 1995].

아미노산 치환 이외에도, N-연결 당화 부위를 불활성화시키는 다른 유형의 돌연변이화, 예로서, 아미노산 삽입 또는 아미노산 결실 또한 본 발명에서 주시된다. NXS/T 서열에서 중요한 아미노산 (즉, 아스파라긴 잔기)을 제거함으로써 N-연결 당화 부위를 불활성화시키는 결실에 의해 N-연결 당화 부위는 용이하게 불활성화될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. X 잔기 또는 세린/트레오닌 잔기의 결실은 유사하게, 자연적으로 발생된 서열에서 S 또는 T 잔기에 이어서 다른 S 또는 T 잔기로 이어지는 것이 아닌 특정의 N-연결 당화 부위를 불활성화시킬 수 있다. X가 비-하이드록시 아미노산일 경우 (즉, 세린 또는 트레오닌 아닐 경우), N 잔기의 카복시 말단 종단에 임의의 아미노산 잔기를 삽입하는 것이 N-연결 당화 부위를 불활성화시킬 수 있다. X 잔기의 카복시 말단 종단에 임의의 비-하이드록시 아미노산을 삽입하는 것도 N-연결 당화 부위를 불활성화시킬 수 있다.

요약컨대, 본 발명을 실시하기 위하여 사용되는 돌연변이의 중요한 특징은 GP5 단백질의 34번 아스파라긴 및/또는 51번 아스파라긴 부위에서 N-연결 당화를 불활성화시킨다는 것으로 이해된다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 이러한 돌연변이의 중요한 특징은 단백질의 특정 영역 (즉, 서열 1의 GP5 기준 단백질중 34번 아스파라긴 및/또는 51번 아스파라긴에 상응하는 잔기)에서 당화를 방지하는 것이라고 여겨진다. 이들 부위에서 당화를 방지함으로써, 보통 야생형 바이 러스의 중요한 에피토프를 차폐시키는 당 잔기는 제거되고, 이로써 면역 반응이 증강되도록 유도할 수 있다. 결과적으로, 다수의 상이한 유형의 돌연변이 (즉, 아미노산 치환, 삽입 또는 결실)을 사용하여 동정된 N-연결 당화 부위를 불활성화시킬 수 있고, 면역 반응이 증강되도록 유도하는 항원을 수득할 수 있을 것이라고 기대된다.

본 발명의 PRRSV 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 설명

본 발명이 방법은 다양한 여러 공급원으로부터 유래될 수 있는, 다양한 여러 폴리뉴클레오티드를 사용함으로써 실시될 수 있다. 모든 폴리뉴클레오티드가 갖는 공통된 특징은, 서열 1의 기준 GP5 단백질중 34번 아스파라긴 또는 51번 아스파라긴, 34번 아스파라긴 및 아스파라긴 54 둘 다에 상응하는 N-연결 당화 부위가 불활성화된 저당화 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체를 코딩한다는 점이다. 서열 1의 기준 GP5 단백질중 34번 아스파라긴 및 아스파라긴 54 둘 다에 상응하는 N-연결 당화 부위를 동정하기 위하여 비-변이체와 정상적으로 당화된 PRRSV GP5 폴리펩티드 서열을 서열 1의 기준 GP5 단백질과 함께 정렬할 수 있다. 그러한 정렬의 일례는 도 5 및 6에 나타낸다. 이러한 정렬에 사용된 특정 서열을 표 1에 설명한다.

불활성화될 수 있고, 본 발명의 방법에 사용될 수 있는, 서열 1의 기준 GP5 단백질중 34번 아스파라긴 또는 51번 아스파라긴에 상응하는 N-연결 당화 부위를 동정하기 위하여, 원하는 북미 PRRSV 단리체 (도 5) 또는 유럽 PRRSV 단리체 (도 6)중 어느 것의 GP5 단백질을 서열 1의 기준 GP5 단백질 (북미 종 NVSL 97-7895)과 함께 정렬한다. 기준 단백질로서 서열 1의 GP5 단백질을 사용하여 당업자는 임의의 GP5 단백질내 N-연결 당화 부위를 용이하게 동정할 수 있고, 본 발명의 저당화 GP5 단백질 변이체를 작제할 수 있다. 따라서, "서열 1의 기준 GP5 단백질중 ((34번 아스파라긴 및/또는 51번 아스파라긴)에 상응하는"이라는 용어는 임의의 GP5 단백질내 N-연결 당화 부위에 대한 기술어로서의 역할을 한다는 것은 자명하다.

저당화 GP5 단백질은 서열 1-13, 북미 PRRSV 공통 서열, 예로서, 서열 14에 대하여 아미노 서열 수준이 85％ 이상 일치하는 북미 PRRSV 단리체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 북미 PRRSV 단리체, 또는 북미 PRRSV 공통 서열로부터 수득될 수 있다. 저당화 GP5 단백질은 또한 서열 15, 유럽 PRRSV 공통 서열 예로서, 서열 15에 대하여 아미노 서열 수준이 85％ 이상 일치하는 유럽 PRRSV 단리체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 유럽 PRRSV 단리체, 또는 유럽 PRRSV 공통 서열로부터 수득될 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 저당화 저당화 GP5 변이체를 수득하기 위하여 임의의 공급원으로부터 얻은 폴리뉴클레오티드를 표준 부위-특이적 돌연변이 유발 기법에 의해 돌연변이화하여 그가 저당화 GP5 변이체 폴리펩티드를 코딩할 수 있도록 할 수 있다. 별법으로, 원하는 저당화 GP5 변이체 폴리펩티드를 코딩하는, 완전히 합성된 DNA 서열을 작제할 수 있다. 이는 전형적으로, 폴리펩티드 서열을 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열로 전환시키는 서열 분석 프로그램, 예로서, "역 번역(back translate)" (GCG 위스콘신 패키지(GCG Wisconsin Package)™, 캘리포니아주 샌디에고에 소재하는 엑설리스 인코포레이티드(Accelrys, Inc.))을 사용하여 달성된다. 원하는 경우, 적합한 "코돈 바이어스(bias)"를 "역 번역" 프로그램에 통합시켜 원하는 발현 숙주 (즉, 포유동물 또는 효모)에서 사용하기 적절한 코돈을 통합하는 합성 유전자를 디자인할 수 있다.

서열 1의 기준 GP5 단백질중 51번 아스파라긴에 상응하는 N-연결 당화 부위는 도 5에 제시한 대표적인 북미 PRRSV 단리체 모두, 및 대표적인 유럽 PRRSV 렐리스타드 종 (도 6)에 존재한다. 이러한 일례의 비제한적인 북미 및 유럽 PRRSV 종에서, 상기 위치의 N-연결 당화 부위는 서열 "NGT"를 포함한다. 그러나, 다른 PRRSV 변이체는 본원에 교시된 본 방법을 위해서 불활성화도 될 수 있는 상기 위치 에 구조적으로 상호 호환가능한 기타의 N-연결 당화 부위 (즉, NXS 또는 T)를 포함할 수 있을 것으로 기대된다. 이러한 N-연결 당화 부위는 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열에서 51번 아스파라긴을, 기타 아미노산 잔기, 예로서, 글루타민 또는 알라닌을 코딩하는 코돈으로 치환함으로써 불활성화될 수 있다. 이러한 경우, 저당화 북미 PRRSV GP5 단백질 변이체에서 상응하는 아미노산 서열은 서열, 예로서, "QGT", "AGT", 또는 "XGT" (여기에서, X는 아스파라긴 이외의 임의의 아미노산이다)를 포함할 것이다. 이들 또는 기타의, 51번 아스파라긴에 상응하는 N-연결 당화 부위가 불활성화된, 북미 PRRSV GP5 단백질 단리체의 저당화 변이체는 또한, 다른 N-연결 당화 부위가 불활성화된 다른 저당화 GP5 변이체와 조합될 수 있다. N-연결 당화 부위를 불활성화시키는 기타 방법으로는 상기 기술된 NXS/T 서열중 "X" 또는 "S/T" 잔기의 아미노산 치환, 아미노산 결실 또는 아미노산 삽입을 포함한다.

서열 1의 기준 GP5 단백질중 34번 아스파라긴에 정확하게 상응하는 N-연결 당화 부위는 오직 본원에 나타낸 (도 5) 특정의 대표적인 북미 PRRSV 단리체에만 존재한다. 더욱 특히, GP5 단백질로서, 대표적인 북미 PRRSV 단리체 IAF-BAJ (서열 3), 94-3182 (서열 7), 및 94-287 (서열 8)의 GP5 단백질은 서열 1의 기준 GP5 단백질중 34번 아스파라긴에 정확하게 상응하는 N-연결 당화 부위를 함유하고, N-연결 당화 부위 "NSS"를 포함한다. 물론, 본원에서 제시하지 않은 기타의 PRRSV GP5 단리체 또한 서열 1의 기준 GP5 단백질중 34번 아스파라긴에 정확하게 상응하는 N-연결 당화 부위를 함유할 것이며, 이들 기타 GP5 단백질의 저당화 변이체 또한 본원에 기술된 본 방법을 사용하여 수득될 수 있다는 것도 기대된다. 서열 3, 7, 및 8 또는 34번 아스파라긴 N-연결 당화 부위를 함유하는 기타 PRRSV 단리체의 N-연결 당화 부위는 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열에서 34번 아스파라긴을, 기타 아미노산 잔기, 예로서, 글루타민 또는 알라닌을 코딩하는 코돈으로 치환함으로써 불활성화될 수 있다. 34번 아스파라긴의 N-연결 당화 부위가 "NSS"일 경우, 저당화 북미 PRRSV GP5 단백질 변이체에서 상응하는 아미노산 서열은 서열, 예로서, "QSS", "ASS", 또는 "XSS" (여기에서, X는 아스파라긴 이외의 임의의 아미노산이다)를 포함할 것이다. 별법으로, "NSS" 서열의 세린 잔기는 비-하이드록시 아미노산 (즉, 세린이 아니거나, 트레오닌이 아닌 것)으로 치환될 수 있다. 이러한 경우, 저당화 북미 PRRSV GP5 단백질 변이체에서 상응하는 아미노산 서열은 "NSX" (여기에서, X는 아스파라긴 이외의 임의의 아미노산이다)를 포함할 것이다. "NSS" 서열중 2개의 세린 잔기 사이 (즉, 35번과 36번 세린 사이)에 비-하이드록시 아미노산을 삽입하는 것도 특정의 당화 부위를 불활성화시키기 위하여 사용될 수 있다.

서열 1의 기준 GP5 단백질중 34번 아스파라긴에 정확하게 상응하는 N-연결 당화 부위가 결여되어 있는 다른 북미 PRRSV 단리체에서, 30번 잔기 (도 5의 서열 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 11, 13에서 "NAS"), 및 33번 잔기 (도 5의 서열 3, 8에서 "NNS"; 서열 6, 10에서 "NSS"; 서열 11, 13에서 "NDS")에 위치하는 기타 N-연결 당화 부위 또한 불활성화될 수 있다. 다시 말하면, 다른 북미 단리체내의, 서열 1의 기준 GP5 단백질중 30번 및 33번 잔기에 상응하는 아미노산 위치에 위치하는 N-연결 당화 부위 또한 불활성화될 수 있고, 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 이론으로 제한하지 않고, 서열 1의 기준 단백질의 29번 잔기와 35번 잔기 사이에 위치하는 PRRSV GP5 단백질의 특정 영역이, 다양한 별개의 아미노 서열을 허용할 수 있는 초가변 영역 (도 5)인 것으로 보인다 (도 5; [Pirzadeh et al, Can. J. Vet Res., 1998, 62: 170-177]도 참조할 수 있다). 비록 특정의 자연적으로 발생된 PRRSV 단리체가 이러한 영역내 N-연결 당화 부위를 함유하지 않을지라도 (즉, 서열 5의 북미 단리체; 서열 15의 유럽 단리체), 기타 단리체는 이러한 영역내 1 내지 3개의 당화 부위를 함유할 수 있다. 결과적으로, 서열 1의 GP5 기준 단백질중 29번 잔기와 35번 잔기 사이에 위치하는 영역내 소정의 GP5 단백질의 당화 부위들 중 어느 하나를 불활성화시키는 것이 PRRSV GP5 단백질에 대한 면역 반응이 증강되도록 유도하는 조성물 또는 방법으로서 주시되고 있다. 추가로, 서열 1의 GP5 기준 단백질중 29번 잔기와 35번 잔기 사이에 위치하는 영역내 소정의 GP5 단백질의 당화 부위들중 1 초과 또는 모두를 불활성화시키는 것이 PRRSV GP5 단백질에 대한 면역 반응이 증강되도록 유도하는 조성물 또는 방법으로서 주시되고 있다.

북미 및 유럽 PRRSV 서열의 정렬은, 서열 1의 기준 GP5 단백질중 51번 아스파라긴에 상응하는 N-연결 당화 부위 또한 대표적인 유럽 PRRSV 단리체에 존재한다는 것을 나타낸다. 이러한 특정의 경우, N-연결 당화 부위는 서열 "NGT"를 포함하고, 서열 1 참고 서열의 51번 아스파라긴은 서열 15의 53번 아스파라긴에 상응한다. 이러한 N-연결 당화 부위는 상응하는 유럽 PRSSV 폴리뉴클레오티드 서열에서 53번 아스파라긴을, 기타 아미노산 잔기, 예로서, 글루타민 또는 알라닌을 코딩하는 코돈으로 치환함으로써 불활성화될 수 있다. 이러한 경우, 저당화 유럽 PRRSV GP5 단백질 변이체에서 상응하는 아미노산 서열은 서열, 예로서, "QGT", "AGT", 또는 "XGT" (여기에서, X는 아스파라긴 이외의 임의의 아미노산이다)를 포함할 것이다. 이들 또는 기타의, 51번 아스파라긴에 상응하는 N-연결 당화 부위가 불활성화된, 유럽 PRRSV 단리체의 저당화 변이체는 또한, 다른 N-연결 당화 부위가 불활성화된 다른 저당화 GP5 변이체와 조합될 수 있다.

저당화 GP5 변이체 단백질을 사용하여 PRRSV 감염으로부터 돼지를 보호하기 위한, 생백신, 사멸백신, 또는 약독화된 백신을 제조할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 저당화 GP5 변이체 단백질은 감염성 PRRSV RNA를 생산할 수 있는 감염성 PRRSV 클론으로 조작된다. 저당화 GP5 변이체 단백질를 코딩하도록 조작될 수 있는 감염성 북미 PRRSV 클론에 관한 설명은 (미국 특허번호 제6,500,662호, [Nielsen et al., J. Virol. 77:3702-11, 2003], 및 [Truong et al., Virology 325:308-19, 2004])에서 찾아볼 수 있다. 백신에서 사용하기 위한 PRRSV 바이러스를 수득하기 위하여 돌연변이화될 수 있는 북미 PRRSV 감염성 클론 서열로는 북미 종 NVSL 97-7895 (서열 16) 및 종 VR-2332 (서열 17)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 저당화 GP5 변이체 단백질를 코딩하도록 조작될 수 있는 감염성 유럽 PRRSV 클론에 관한 설명은 미국 특허번호 제6,268,199호에서 찾아볼 수 있다. 백신이 생존 또는 약독화된 PRRSV를 포함하는 실시태양에서, 서열 1의 기준 GP5 단백질중 N44에 상응하는 N-연결 당화 부위 (즉, 도 5 및 6에서 "NLT" 서열)의 당화가 PRRSV의 감염성에는 필요하기 때문에 이 부위는 불활성화되지 않는다. 유럽 PRRSV 단리체의 경우, 서열 1의 기준 GP5 단백질중 N44에 상응하는 N-연결 당화 부위는 대표적인 유럽 PRRSV 종 렐리스타드의 46번 아스파라긴에서 시작되는 NLT 서열이다 (서열 15; 도 6). 유럽 PRRSV 종의 N46 N-연결 당화 부위 또한 감염성에 필요하고, 생존 또는 약독화된 PRRSV 백신이 사용되는 본 발명의 실시태양에서는 불활성화되지 않는다.

별법으로, 저당화 GP5 변이체 단백질이 DNA 백신과 함께 돼지내로 도입될 수 있다. 그러한 DNA 백신은 전형적으로 포유동물 세포에서 활성인 프로모터가 상기 저당화 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 상기의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되어 있는 DNA 분자를 포함한다. 저당화 GP5 변이체 단백질의 발현을 유도하기 위하여 사용될 수 있는 프로모터는 CMV (거대세포바이러스) 즉시 초기 프로모터, RSV (라우스 육종 바이러스) 긴 말단 반복서열 프로모터, 및 SV40 (원숭이 바이러스 40) T-항원 프로모터를 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 특정 바람직한 실시태양에서, 이러한 프로모터는 CMV 프로모터이다.

추가의 다른 실시태양에서, 저당화 GP5 변이체 단백질을 발현시키는 단리된 폴리뉴클레오티드는 PRRSV 이외의 바이러스 벡터를 포함한다. PRRSV 이외의 바이러스 벡터로는 백시니아 바이러스 벡터, 단순 헤르페스 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 및 TGEV 벡터를 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 그러한 벡터는 다양한 공개공보, 예로서, 미국 특허번호 제7,041,300호 ( TGEV 벡터의 경우) 제6,692,750호 (알파바이러스 벡터의 경우)에 기재되어 있다.

치료학적으로 허용가능한 담체 및 보조제

본 발명의 실시에서, 저당화 GP5 변이체 폴리펩티드 또는 저당화 GP5 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 치료학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 배합될 수있다. 그러한 담체의 비제한적인 일례로는 생리학적 염수 또는 다른 유사한 염수 용액, 단백질, 예로서, 혈청 알부민 단백질, 완충액, 예로서, 탄산염, 인산염, 포스포네이트, 또는 트리스(Tris) 기반 완충액, 계면활성제, 예로서, NP40 또는 트리톤(Triton)X100, 및 폴리에틸렌 글리콜 중합체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 담체의 임의의 조합물이 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 생존 또는 약독화된 PRRSV 바이러스를 포함하는 조성물을 위한 바람직한 담체는 농도가 50 내지 100 mg/ml인 dl-α-토코페롤 아세테이트이다.

저당화 GP5 변이체 폴리펩티드, 또는 저당화 GP5 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 조성물에서 보조제를 사용하는 것이 또한 주시된다. 그러한 보조제는 전형적으로 자연계에서 수성이거나 오일성이다. 사용될 수 있는 보조제로는 수산화알루미늄, 퀼 A, 알루미나겔 현탁액, 광유, 글리세리드, 지방산, 지방산 부산물, 마이코박테리아, 및 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드, 또는 그의 임의의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 사용될 수 있는, 다양한 유형의 CpG 보조제는 미국 특허번호 제6,977,245호 및 제 6,406,705호에 기재되어 있다.

세포 면역 반응을 강화시키는 다른 보조제 (즉, T 보조 세포 (Th₁ 및 Th₂) 하위집단 강화제)를 사용하는 것이 또한 주시된다. 그러나 보조제로는 인터루킨 1 (IL-1), IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, 감마 인터페론 (g-IFN), 세포 괴사 인자, MDP (뮤라밀 디펩티드), 면역자극제 복합체 (ISCOM), 및 리포좀을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

조성물 투여는 피하 주사, 정맥내 주사, 진피내 주사, 비경구 주사, 근육내 주사, 무침 주사, 전기천공, 경구 전달, 비내 전달, 구비강 전달, 또는 그의 임의의 조합에 의해 달성될 수 있다. 무침 주사는 전형적으로 장치, 예로서, 아그로-제트(Agro-Jet)® 주사기 (캐나다 몬트리올에 소재하는 메디컬 인터네셔날 테크놀러지스(Medical International Technologies))를 사용하여 수행한다.

실시예 1

하기의 실시예는 각종의 저당화 북미 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 각종 PRRSV 폴리뉴클레오티드의 작제, PRRSV 항원에 대한 면역 반응이 증강되도록 유도하기 위하여 사용하는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물, 및 돼지의 PRRSV 항원에 대한 면역 반응이 증강되도록 유도하기 위하여 폴리뉴클레오티드 및 조성물을 사용하는 방법을 설명한다.

물질 및 방법

세포, 배지, 및 항체. MARC-145 세포를 10％ 우태아 혈청 (FBS), 및 성장 배지 1ml당 100 유니트의 페니실린, 20 유니트의 스트렙토마이신 및 20 유니트의 카나마이신을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)에서 증식시켰다. 이들 세포를 RNA 전기천공, 바이러스 감염, 바이러스 성장, 및 플라크 검정법에 사용하였다. 새끼 햄스터 신장 (BHK-21) 세포는, 얼즈 염(Earl's salt)과 함께 5％ PBS 및 상기 언급한 항생제를 함유하는 최소 필수 배지 (MEM)에 유지시켰다. GP5의 일시적 발현, 이어서, 면역 형광염색 검정법 (IFA) 또는 방사선표지 및 면역침전 실험을 위해 BHK-21 세포를 사용하였다. 모든 세포를 37℃ 및 5％ CO₂ 환경에서 유지시켰다. PRRSV GP5 및 M 단백질에 대한 토끼의 다클론성 항체는 칼 에이. 가뇽(Carl A. Gagnon)(캐나다 몬트리올에 소재하는 유니버시티 오브 퀘벡)으로부터 흔쾌히 제공받았다. 뉴클레오캡시드 단백질 (N)에 대한 단클론성 항체 (SDOW17)는 미국 국립 수의 과학 연구소(National Veterinary Services Laboratories) (NVSL, 미국 아이오와주 에임스 소재)로부터 구입하였다. 항-마우스 알렉사(Alexa)-488은 몰레큘라 프로브스, 인코포레이티드(Molecular Probes, Inc.) (미국 오레곤주 유진 소재)로부터 입수하였다.

GP5를 코딩하는 플라스미드 및 PRRSV 감염성 클론의 유전자 조작

pBR322내 전장의 PRRSV 감염성 cDNA 클론 (FL12; 서열 16)을 EcoRV 및 BstZ17 I 제한 효소로 분해하고, 동일한 효소 부위를 사용하여, PRRSV의, 대다수의 ORF2, 완전 ORF3-7, 및 전체 3'UTR을 포함하는 약 4.9 kbp의 단편을 pBR322에서 클로닝하였다. 이러한 중간 플라스미드는 GP5내의 잠재적인 N-연결 당화 부위 (N34, N44, 및 N51)에 돌연변이를 도입시키는 돌연변이 유발을 위한 주형으로서의 역할을 하였다 (도 2). 표준 기법을 사용하여 프라이머 (표 2)를 사용하는 중첩 연장 PCR을 이용함으로써 돌연변이 유발을 수행하였다.

본 연구에서 사용된 프라이머 및 그의 서열. 밑줄친 코돈 서열은 돌연변이 부위를 나타낸다.

PCR 산물을 BsrG I 및 BstE II 제한 효소로 분해하고, 중간 플라스미드에서 역으로 복위시켰다. 원하는 돌연변이를 함유하는 클론은 서열화에 의해 동정하고, 확인하였다. GP5의 전체 코딩 영역을 서열화하여 추가의 돌연변이가 상기 클로내 존재하지 않는다는 것을 확인하였다. 동일한 제한 효소 부위를 사용하여 전장 cDNA 클론으로, GP5 코딩 영역내 돌연변이를 함유하는 중간 플라스미드로부터 얻은 EcoRV-Pac I 단편을 되돌려 놓았다. 전장의 클론내 GP5 코딩 영역을 다시 PRRSV 특이 내부 프라이머를 사용하여 서열화하여 돌연변이가 존재하는 것을 확인하였다.

GP5가 제1 시스트론이고, 뇌심근염 바이러스 (EMCV) 내부 리보좀 도입 부위 (IRES) 및 M 코딩 서열로 이어지는 이시스트론성 벡터 (도 1A)에서 wt GP5 및 개별 돌연변이체를 클로닝하였다. 상보성 연구를 위해 CMV 프로모터 구동형 벡터 (pcDNA 3.0™, 미국 캘리포니아주 마운틴뷰에 소재하는 클론테크 라보라토리즈 인코포레이티드(Clontech Laboratories, Inc.))에서 전장의 GP5도 클로닝하였다. 이 러한 이유로 GP5 코딩 영역을 PCR 증폭시키고, 클로닝하고, 서열화하였다.

시험관내 전사 및 전기천공

전장 플라스미드를 AcII로 분해하고, 주형으로서 선형화된 DNA를 사용함으로써 제조사 (미국 텍사스주 오스틴에 소재하는 엠비온 인코포레이티드(Ambion, Inc.))의 권고에 따라, 그리고 앞서 기재된 바와 같이 mMESSAGE mMACHINE Ultra T7™ 키트를 사용하여 캡핑된 RNA 전사체를 생성하였다. 반응 혼합물을 DNaseI로 처리하여 DNA 주형을 분해하고, 페놀과 클로로포름으로 추출하고, 최종적으로 이소프로판올로 침전시켰다. 글리옥살 아가로스 겔 전기영동에 이어서 브롬산 에티디움 염색을 함으로써 시험관내 전사체의 통합성을 분석하였다.

MARC-145 세포를 전기천공하여 대략 5.0 ㎍의 시험관내 전사체를 MARC-145 세포로부터 단리된 총 RNA 5.0 ㎍과 함께 상기 세포에 도입하였다. 4.0 mm 큐벳에서 250V, 950 μF로 바이오-래드 진 펄서 엑셀(Bio-Rad Gene Pulser XCell)™ (미국 캘리포니아주 헤큘레스에 소재하는 바이오-래드 인코포레이티드(Bio-Rad, Inc.))을 사용하여 1.25％ DMSO를 함유하는 400 ㎕의 DMEM중 약 2x10⁶개의 세포를 1회 펄스하였다. 소량의 전기천공된 세포를 24-웰 플레이트에 플레이팅하여 전기천공 후 48시간째에 N 단백질의 발현을 조사하였는데, 이는 게놈 복제 및 전사를 나타낼 것이다. 일단, 간접 면역 형광염색 검정법 (IFA)을 사용하여 N 단백질의 발현이 확인되면, 60-mm 플레이트중 대량의 전기천공된 세포로부터 전기천공 후 48시간째에 수집하고, 정화하고, 순수한 MARC-145 세포상에 통과시켰다. IFA를 사용하여 N 단백질의 발현과 함께, 세포병변 효과 (CPE)에 대하여 감염된 세포를 관찰하였다. CPE과 양성 형광, 2개 모두를 나타내는 감염된 세포로부터의 상등액을 감염성 바이러스를 함유하는 것으로 지정하였다. 확인 후, 바이러스 스톡을 배양하고, 추가 연구를 위해 소량의 분취량으로 -80℃에서 냉동시켰다. 모든 실험에서, FL 12 함유 wt PRRSV 게놈, 및 FL12pol-함유 중합효소-결손 PRRSV 게놈을 대조군으로서 사용하였다.

대사 방사선표지 및 단백질 분석

6-웰 플레이트내 BHK-21 세포를 3.0의 MOI로 재조합 백시니아 바이러스 (vTF7-3)로 감염시킨 후, T7 RNA 중합효소 프로모터하에 wt 또는 다양한 돌연변이체 GP5를 코딩하는 이시스트론성 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다. 제조사의 프로토콜 (미국에 소재하는 라이프 테크놀러지스(Life Technologies))에 따라 리포펙트아민2000(Lipofectamine2000)™를 사용하여 DNA 형질감염을 수행하였다. 형질감염 후 16시간째에 세포를 PBS로 2회에 걸쳐 세척하고, 1시간 동안 메티오닌/시스테인을 함유하지 않는 DMEM에서 굶주리게 하고, 3시간 동안, 배지 1 ml당 100 μCi의 익스프레³ ⁵S³⁵S 프로테인 라벨링 믹스(Expre³⁵S³⁵S Protein Labeling Mix) (미국 보스톤에 소재하는 NEN 라이프 사이언스(NEN Life Sciences))를 함유하는, 0.6 ml의 메티오닌/시스테인을 함유하지 않는 DMEM로 방사선표지하였다. 방사선표지 후, 세포를 냉각 PBS로 3회에 걸쳐 세척하고, 세포 추출물을 300 ㎕의 방사면역침전 검정 (RIPA) 완충액 (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1％ Triton X-100, 0.1％ SDS, 1％ 데옥시콜레이트나트륨, 및 1x 프로테아제 저해제)에서 제조하였다. 정화된 세포 추출물을 토끼 항-GP5 또는 항-M 단백질 항체와 함께 40 ℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 100 ㎕ RIPA 완충액중 대략 4.0 mg의 단백질 A 세파로스 (스웨덴 웁살라 파마시아(Pharmacia)) 슬러리를 첨가하고, 추가로 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 면역침전된 복합체를 3회에 걸쳐 500 ㎕의 RIPA 완충액으로 세척하고, 추가 분석을 위해 사용하였다.

엔도글리코시다제 H (엔도 H) 처리를 위해 면역침전된 복합체를 20 ㎕의 1x 변성 완충액 (0.5％ SDS, 1.0％ β-머캅토에탄올)에 재현탁시키고, 10분 동안 끓였다. 상등액을 수집하고, 1xG5 완충액 (0.05 M 시트르산나트륨, pH 5.5)으로 조절하고, 100 유니트의 엔도 H (미국 매사추세츠주 베벌리에 소재하는 뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))와 함께 16시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 분해되지 않은 대조군 샘플은 유사하게 처리하되, 단, 어떤 엔도 H도 첨가하지 않았다. 엔도 H 분해 후, 샘플을 동량의 2 x SDS-PAGE 샘플 완충액과 혼합하고, 5분 동안 끓이고, 단백질 마커 (프로테인 플러스 프리시즌 스탠다드, 바이오-래드, 인코포레이티드(Protein Plus Precision Standard, Bio-Rad, Inc)와 함께 변성 조건하에서 SDS-12％ PAGE에 의해 분석하였다. 겔을 15분 동안 10％ 아세트산으로 고정시키고, 물로 3회에 걸쳐 세척하고, 30분 동안 0.5 M 살리실산나트륨으로 처리하고, 건조시키고, 최종적으로 -70℃에서 X-선 필름에 노출시켰다. 펩티드 N-글리코시다제 F (PNGase F) (뉴잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드) 분해를 위해, 면역침전된 복합체를 1x G7 완충액 (0.05 M 인산나트륨, pH 7.5, 1.0％ NP-40)에 재현탁시키고, 16시간 동안 37℃에서 2 유니트의 효소와 인큐베이션시켜 분해를 실시하였다. 튜니카마이신 (미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마(Sigma))의 존재하에 GP5의 합성을 조사하기 위하여 1시간 동안 형질감염된 세포를 배지 1 ml당 2.0 ㎍의 튜니카마이신으로 처리하고, 상기와 같이 3시간 동안 약물 존재하에서 방사선표지를 실시하였다.

방사선표지된 세포외 비리온 또는 세포내 바이러스 발현된 GP5를 수득하기 위하여, MARC-145 세포를 wt 또는 돌연변이체 PRRSV로 감염시켰다. 감염 후 48시간째에 세포를 1시간 동안 굶주리게 하고, 24시간 동안 90％의 메티오닌/시스테인을 함유하지 않는 DMEM, 및 10％의 보통 DMEM을 함유하는 배지 1 ml당 100 μCi의 익스프레³ ⁵S ³⁵S 프로테인 라벨링 믹스로 방사선표지하였다. 표지한 후, 배양 상등액을 수거하고, 세포 파편을 제거하고, 4℃에서 3시간 동안 100,00O x g로 세포외 비리온을 펠릿화하였다. 바이러스 펠릿을 200 ㎕의 RIPA 완충액에 재현탁시키고, 항-GP5 항체로 면역침전시키고, 엔도 H로 처리하거나, 처리하지 않고 단백질을 조사하였다. 세포내 바이러스 발현된 GP5의 면역침전을 위해 상기와 같이 감염을 수행하고, 감염 후 24시간째에 세포를 1시간 동안 굶주리게 하고, 상기와 같이 세포 추출물을 제조하기 2시간 전에 방사선표지하였다.

바이러스 성장 동역학 및 플라크 검정법

MARC-145 세포를 세포당 3.0의 MOI로 돌연변이체 또는 wt PRRSV로 감염시키고, 37℃ 인큐베이터에서 인큐베이션시켰다. 감염 후 여러 시점에서, 감염된 세포로부터 유래된, 분취량의 배양 상등액을 수집하고, 상등액중 바이러스 역가를 측정하고, 1 ml당 조직 배양 감염량 50 (TCID₅₀/ml)으로 표시하였다. 바이러스 성장 동역학을 3회 실시하였다. 돌연변이체 바이러스의 플라크 형태를 조사하기 위하여, MARC-145 세포를 사용하여 플라크 검정법을 실시하였다. 세포를 10배 희석된 개별 바이러스의 일련의 희석액으로 37℃에서 1시간 동안 감염시켰다. 감염된 세포 단층를 PBS로 세척하고, DMEM-5％ FBS 함유 0.8％ 시플라크(Seaplaque) 아가로스 (미국 메인주 로크랜드에 소재하는 FMC 바이오프러덕츠(FMC Bioproducts))로 오버레이하였다. 96시간째, 아가로스 마개를 제거하고, 세포 단층을 염색액 (20％ 포름알데히드, 9.0％ 에탄올, 및 0.1％ 크리스탈 바이올렛)과 함께 30분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 세포를 물로 완만하게 세척하여 과량의 염료를 제거하고, 대기 건조시켜 플라크를 조사하고 계수하였다.

트란스로 wt GP5를 발현시킴에 의한 바이러스 회복의 상보성

BHK-21 세포를 pcDNA-GP5로 형질감염시켰다. 형질감염 후 40시간째에 세포를 수거하고, 돌연변이체 GP5를 코딩하는 전장의 PRRSV cDNA로부터 유도된 캡핑된 시험관내 전사체로 전기천공시켰다. 전기천공된 세포를 새로운 배지로 희석하고, 6-웰 플레이트에 플레이팅시켰다. 전기천공된 세포로부터의 상등액을 전기천공 후 48시간째에 수집하고, 원심분리하여 세포 파편을 제거하고, 순수한 MARC-145 세포를 감염시키기 위하여 사용하였다. 상기 기술된 바와 같이, 감염 후 48시간째에 감염된 MARC-145 세포를 IFA에 의해 N 단백질의 발현에 대하여 조사하였다. 양성 세포의 갯수를 계수하고, 이를 상등액중 생산된 의사(pseudo)-입자의 갯수로 지정하였다. 3개의 독립 실험으로부터 평균 양성 세포 갯수를 산출하고, 세포내로 형질감염된, 시험관내에서 전사된 RNA 1 ㎍당 생성된 의사-입자의 갯수로서 제시하였다.

혈청-중화 (SN) 검정법

혈청 샘플중 PRRSV-중화 항체의 역가는 앞서 기술된 형광 포커스 중화 검정법을 사용하여 측정하였다. 200 TCID₅₀의, FL 12 (wt PRRSV), 또는 GP5 돌연변이체 코딩 바이러스, FL-N34A, FL-N51A, 및 FL-N34/51A중 어느 것으로 구성된 시험감염 바이러스 200 TCID₅₀의 존재하에 시험 혈청의 일련의 희석액을, 5％ 우태아 혈청을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지에서 60분 동안 37℃에서 배양하였다. 48시간 먼저 시딩된 융합성 MARC-145 세포를 함유하는 96-웰 미세적정 플레이트에 혼합물을 첨가하였다. 5％ CO₂를 함유하는 습윤 대기에서 24시간 동안 37℃에서 인큐베이션시킨 후, 50％ 메탄올 및 50％ 아세톤 용액을 사용하여 10분 동안 세포를 고정시켰다. PBS를 사용하여 철저하게 세척한 후, 1:500의 희석율을 사용하여 단클론성 항체 SDOW17로 RRSV의 N 단백질의 발현을 검출한 후, 1:100 희석율의 FITC-접합된 염소 항-마우스 IgG (미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마)와 함께 인큐베이션시켰다. 중화 역가는 대조군 웰에 존재하는 포커스중 90％를 저해하는 최고 희석율의 역수로서 표시하였다.

GP5 돌연변이체 및 wt PRRSV를 사용한 돼지의 실험적 접종

GP5 돌연변이체 바이러스 (FL-N34A, FL-N51A, 및 FL-N34/51A) 및 FL12 (wt PRRSV)의 고역가 스톡 (MARC 145 세포에서 3회 계대접종하여 수득)을 사용하여 어린 돼지를 감염시켰다. PRRSV 감염은 없다고 승인받은 특정-발병성미생물-부재 무리로부터 최근에 이유시킨 21일된 돼지를 구입하였다. ELISA (메인주 포트랜드에 소재하는 아이덱스 랩스(Iddex Labs))에 의해 시험된 바, 모든 동물은 항-PRRSV 항체에 대하여 음성이었다. 군당 3마리의 돼지를 FL12 wt PRRSV 또는 돌연변이체 FL-N34A, FL-N51A, 및 FL-N34/51A로 감염시켰다. 모든 경우에서, 접종물은 2 ml에 희석된 10⁵ TICD50으로 구성되었고, 이를 목 근육내로 투여하였다. 접종받은 동물의 직장의 온도를 접종 후 (PI) 15일 동안 모니터하였다. PI 4, 7 및 14째에 MARC 145 세포상에서의 통상의 분리에 의해 바이러스 혈증을 측정하였다. 혈청 샘플을 PI 총 49일간의 기간 동안 매주 채취하였다. 혈청 샘플을 사용하여 각 돌연변이체 및 wt PRRSV에 대한 동종 및 이종 교차-중화 역가를 검출하였다.

결과

PRRSV GP5 발현 및 특징화

PRRSV 종 97-7895의 GP5는 3개의 잠정적 당화 부위 (N34, N44, 및 N51)를 갖는다. GP5의 당화 패턴을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 먼저, EMCV로부터 유래된 IRES 측면에 위치하는 GP5 및 M 단백질의 코딩 영역이 T7 RNA 중합효소 프로모터의 조정하에 배치되어 있는 이시스트론성 벡터를 생성하였다 (도 1A). 이시스트론성 벡터를 작제한 이론적 근거는, GP5과 M 단백질은 서로 상호작용하는 것으로 알려져 있거나 (LDV 및 EAV 경우), 또는 그러한 것으로 추정된다는 것이고 (PRRSV의 경우), 그러한 상호작용이 GP5의 단백질 폴딩, 당화, 세포내 수송, 및/또는 다른 생물학적 활성에 중요할 수 있다는 것이다.

이시스트론성 플라스미드의 형질감염에 의해 GP5 및 M을 일시적으로 발현시킨 후, 방사선 표지 및 항-GP5 항체로 면역침전시킴으로써 2개의 주요 단백질 종을 밝혀냈다. 질량 약 25.5 kDa을 따라 이동하는 단백질 종은 전체적으로 당화된 형태의 GP5 (도 1B, 레인 2)이다. 각 N-연결 당화는 단백질에 약 2.5 kDa의 분자량을 가하는 바, 이는 3개의 잠재적인 당화 부위 모두가 가능하게는 GP5 당화에 사용된다는 것을 시사하는 것이다. 19.0 kDa 단백질 종은 항-M 항체로 면역침전되었기 때문에 (레인 7), 이는 바이러스 M 단백질이다. 본 결과는, GP5 및 M 단백질, 2개 모두를 발현시키는 세포에서 GP5 및 M 단백질은 서로 상호작용한다는 것을 시사한다. 고-만노스형 올리고당 쇄를 제거하는 효소인 엔도 H로 처리하였을 때 GP5의 크기는 약 18 kDa로 축소된 반면, M 단백질의 크기에는 변함이 없었다 (레인 3). 단백질 백본으로부터의 모든 유형의 당을 제거하는 효소인 PNGase F (레인 4)로 GP5를 처리하는 것, 또는 튜니카마이신 존재하의 GP5 합성 (레인 5)은 엔도-H로 처리한 단백질 보다 좀더 빠른 전기영동 이동상으로 이동하는 단백질을 수득하였다. 이는, 튜니카마이신 처리 또는 PNGase F로 분해하는 것은 비당화된 단백질을 생성하는 반면, 엔도-H 처리는 각 N-연결 당화 부위에 N-아세틸글루코사민 잔기를 보유하는 단백질을 생성하기 때문인 것으로 예측된다. 분자량이 약 30 kDa인 눈에 띠는 단백질 종은 항-M 항체로 면역침전되었음에 주목할 만하다. 이러한 단백질의 정제는 알려진 바 없지만, 이는 M 단백질과 상호작용하는 세포 단백질일 수 있다.

상기 연구로부터 얻은 결과를 통해, 비당화된 형태 및 전체적으로 당화된 형태의 GP5의 겉보기 분자 크기는 각각 18.0 kDa 및 25.5 kDa이라고 제안되었다. 3개의 잠재적인 당화 부위 모두가 전체적으로 당화된 형태의 GP5 생성에 사용되는 것으로 보인다. 이들 부위에 첨가되는 글리칸 부분은 엔도 H에 의해 분해되기 쉽기 때문에 고-만노스형이다. 추가로, 본 결과는 비당화된 형태 및 전체적으로 당화된 형태의 GP5, 2개 모두가 M 단백질과 상호작용한다는 것을 시사한다.

GP5 당화에 사용되는 N-연결 당화 부위 분석

GP5내 잠재적인 N-연결 당화 부위 모두가 또는 그중 일부가 당 부분 첨가에 사용되는지 여부를 보다 정확히 측정하기 위하여, 3개의 잠재적인 당화 부위 N34, N44, 및 N51 모두가 (도 2A) 개별적으로 또는 여러 조합으로 (도 2B) 알라닌으로 변경되어 있는 이시스트론성 플라스미드에서 일련의 돌연변이체를 생성하였다. 플라스미드-형질감염된 세포에서, 단백질을 방사선표지하고, 항-GP5 항체로 면역침전시켰다. 면역 복합체는 처리하지 않은 채로 남겨두거나, 엔도 H로 처리하고, SDS-PAGE로 조사하였다. 도 2C에 제시한 데이타를 통해 알 수 있는 바와 같이, 단일 돌연변이 (N34A, N44A 또는 N51A)를 수반하는 돌연변이체 GP5 단백질은 대략 23.0 kDa 단백질 종 (레인 4, 6 및 8, 화살촉 표시)을 따라 이동하였다. 엔도 H 처리시, 이들 단백질은, 엔도 H 처리 이후의 wt GP5 (레인 3)와 유사하게, 약 18.0 kDa 단백질 종 (각각 레인 5, 7, 및 9)을 따라 이동하였다. 단백질의 전기 영동에서 근소한 차이는, wt 단백질이 2개의 잔기를 함유하는 단일 돌연변이체와 비교하여 엔도 H 처리 후 3개의 N-아세틸글루코사민 잔기 모두를 보유할 것이라는 사실을 가장 잘 반영하는 것이다. 이중 돌연변이체 (N34/44A, N44/51A 및 N34/51A)는 약 20.5 kDa 단백질 (레인 10, 12 및 14)에 가깝게 이동하고, 엔도 H 처리시, 단백질의 크기는 18.0 kDa (레인 11, 13, 및 15)으로 축소된 단백질 종을 생산하였다. 삼중 돌연변이체 (N34/44/51A)는 18.0 kDa 단백질 (레인 16)에 따라 이동하고, 엔도 H 분해에 대하여 내성을 띠는 (레인 17) 단백질을 생성하였다.

따라서, 상기 돌연변이 연구로부터, 전체적으로 성숙한 PRRSV GP5를 생성하기 위한 당화를 위해서는 3개의 잠재적인 당화 부위 모두가 사용된다는 것은 명백하다. 3개의 당화 부위 모두가 고-만노스형 글리칸 부위에 의해 변형된 것으로 보인다.

GP5 돌연변이체를 갖는 감염성 PRRSV 바이러스의 회복

감염성 PRRSV의 생성에서 N-연결 당화의 중요성을 평가하기 위하여 돌연변이체 GP5 단백질의 코딩 영역을 전장 cDNA 클론내로 삽입하였다. 클론으로부터 생산된 캡핑된 시험관내 전사체를 MARC-145 세포내로 전기천공시키고, MARC-145 세포 생성에 대하여 조사하였다. 본 발명자들의 결과를 통해, 감염성 바이러스는 전기천공되어 N34, N51, 및 N34/51에 돌연변이를 함유하는 전장의 전사체가 도입된 세포로부터 용이하게 회복된 것으로 나타났다. 그러나, 바이러스 회복과 유사한 조건하에서 다른 돌연변이체 바이러스를 회복시키고자 반복된 시도는 성공하지 못했다. 비록 회복된 바이러스의 성장 동역학은 wt 바이러스의 것과 유사하지만, N34 및 N51에 돌연변이를 함유하는 FL-N34A 및 FL-N51A 바이러스의 총 수율은 MARC-145 세포에서 wt PRRSV의 것보다 대략 1 로그 작았지만, 이중 돌연변이 (N34/51A)를 갖는 FL-N34/51A의 것은 대략 1.5 로그 작았다 (도 3A). 감염된 세포로부터의 RNA를 RT-PCR 증폭시킨 후, 뉴클레오티드 서열화함으로써, 이들 바이러스는 안정적이고, 원하는 돌연변이를 함유하고, 다른 어떤 돌연변이도 전체 전체 GP5 영역에서 검출되지 않았다고 나타내었다 (데이타는 나타내지 않음).

돌연변이체 바이러스의 플라크 표현형을 모니터하기 위하여 MARC-145 세포상에서 바이러스 플라크 검정법을 실시하였다. wt PRRSV에 의해 생성된 플라크는 투명하고, 뚜렷한 반면, 돌연변이체 바이러스는 상이한 표현형을 갖는 플라크를 생산하였다. FL-N34A, FL-N51A 및 FL-N34/51A 바이러스는 보다 덜 뚜렷한 플라크를 생성하였고, 플라크내 다수의 세포는 정상으로 보였다 (도 3B, 흰색 화살표 표시). 추가로, FL-N51A, FL-N34/51A는, 바이러스가 세포 단층을 투명하게 하지 못한 몇몇 플라크를 생산하였다 (도 3B, 검은색 화살표 표시). 이러한 데이타는 회복된 돌연변이체 바이러스가 실제로는 wt PRRSV와 비교하여 세포병변성을 덜 띤다는 것을 시사한다.

본 발명자는 돌연변이체 주형 FL-N44A, FL-N31/44A, FL-N44/51A, 및 FL-N31/44/51A를 갖는 감염성 PRRSV를 회복시킬 수 없는 바, GP5 코딩 영역내의 돌연변이가 RNA의 몇몇 다른 작용, 예로서, 게놈 RNA를 입자내로 패키징하는 것에 영향을 줄 가능성이 있다. 이러한 점을 처리하기 위하여 본 발명자들은 감염성 PRRSV 생성시 다르게는 결손된 돌연변이체 RNA 주형의 패키징을 트란스로 wt GP5를 발현시키는 세포가 지지할 수 있는지 여부에 관하여 조사하였다. pcDNA-GP5로 형질감염된 BHK-21 세포를 전기천공하여 시험관내 전사체를 도입하고, 전기천공 후 48시간째에 배양 상등액을 수집하고, 사용하여 순수한 MARC-145 세포를 감염시켜 PRRSV 의사-입자의 생산을 측정하였다. 의사-입자가 생성될 경우, 본 발명자들은 이들 감염된 MARC-145 세포에서 N 단백질이 발현되는 것을 관찰할 수 있을 것으로 기대하였다. N의 발현은 오직 순수한 MARC-145 세포가, 의사-입자가 세포내로 유입된 후 복제를 개시하는, 전장의 캡시드화된 돌연변이체 RNA 게놈을 받았을 경우에만 가능한 것이다. 앞서 회복될 수 없었던 모든 돌연변이체들중 본 발명자들은 2개의 돌연변이체 전장의 게놈 (FL-N44A 및 FL-N34/44A)을 함유하는 의사-입자를 회복시킬 수 있었다 (도 3C). 돌연변이체 바이러스-감염된 배양물에서 각각의 녹색 형광 세포는 하나의 감염성 의사-입자를 나타낸다. 이들 입자는 외피상에는 오직 작용성 wt GP5만을 함유하지만, 게놈내에는 비작용성 돌연변이체 GP5에 대한 코딩서열을 함유하는 바, 주변 세포로 확산되는 감염성 입자를 생산할 수는 없다. 다른 돌연변이체 주형 (FL-N44/51A, 및 FL-N31/44/51A)을 갖는 의사-감염성 입자를 회복시키려는 다수의 시도는 성공하지 못했다.

이들 실험으로부터 생산된 감염성 의사-입자의 갯수에 대한 양적 추정을 통해 세포내로 전기천공된 돌연변이체 RNA 1 ㎍당 대략 1000개의 입자가 생산된다고 제안된다 (도 3D). 이는 wt GP5를 코딩하는 RNA로 수득된 것보다 대략 100배 적은 것이다. 그렇게 저수준으로 감염성 의사-입자가 생산되는 것은, wt GP5를 발현시킨 약 5-10％의 세포들에서 N 단백질의 발현에 의해 나타난 바와 같이, 이들 세포만이 전장의 전사체를 받았다라는 사실 때문일 수 있다. 형질감염된 세포에서 wt GP5가 낮은 수준으로 발현되는 것은 이들 의사-비리온의 생산 수준이 낮기 때문일 수도 있다.

돌연변이체 바이러스로 혼입된 GP5 및 감염된 세포에서 발현된 것의 조사

형질감염된 세포로부터 생산된 감염성 비리온으로 혼입된 GP5 단백질의 성질을 측정하기 위하여, 본 발명자들은 wt 및 돌연변이체 바이러스로 감염된 세포로부터 방사선표지된 PRRSV를 생성하였다. 초원심분리하여 배양 상등액중에 존재하는 세포외 비리온을 펠릿화하고, 이들 비리온내 존재하는 GP5는 항-GP5 항체를 사용하여 면역침전시킨 후, 이어서 전기영동 분석에 의해 조사하였다. 비리온내로 혼입된 wt GP5는 광범위하게 확산된 밴드의 약 25-27 kDa 단백질 종을 따라 이동하였고 (도 4A, 레인 1), 이는 부분적으로는 엔도 H 분해에 내성을 띠는 (레인 2) 결과를 나타내었다. 비리온내로 혼입된 돌연변이체 GP5 (N34A 및 N51A)는 엔도 H에 대하여 감수성이었다. 엔도 H 분해 후에 생성된 산물의 크기에 기초하여, 이들 단일 부위 돌연변이체내 오직 1개의 글리칸 부분만이 감수성인 반면, 그 나머지는 내성을 띠는 것으로 보인다. 대조적으로, 이중 돌연변이체 GP5 (N43/51A)는 엔도 H에 대하여 내성을 띠었다. 추가로, 돌연변이체 바이러스로부터의 GP5의 엔도 H 분해는 또한 극소량의 GP5 단백질 백본을 또한 생산하였는데, 이는 이들 바이러스가 엔도 H-내성인 것 뿐만 아니라, 엔도 H-감수성 글리칸 부분도 함유하는 GP5 단백질을 혼입하고 있음을 시사하는 것이다.

이시스트론성 벡터로 형질감염된 세포에서 wt 뿐만 아니라, 돌연변이체 GP 단백질도 엔도 H에 대하여 완전히 감수성이기 때문에 (도 1 및 2), 본 발명자들은 PRRS 비리온상의 GP5가 주로 엔도 H 내성 형태를 함유한다는 것을 관찰하고 놀랐다. 엔도 H 내성 형태의 단백질 또한 감염된 세포에서 합성되는지를 조사하기 위하여 wt 또는 돌연변이체 PRRSV로 감염된 MARC-145 세포를 방사선표지하고, GP 단백질을 항-GP5 항체로 면역침전시키고, 엔도 H 분해하고, 또는 엔도 H 분해하지 않고 전기영동에 의해 분석하였다. 상기 실험 결과는 도 4B에 나타낸다. 대다수의 wt GP5는 3개 부위 모두에서 엔도 H-내성 글리칸을 함유한 반면 (레인 2 및 3), 2개의 단일 돌연변이체는 오직 하나의 부위에서만 엔도 H-내성 글리칸을 함유하였다 (레인 4-7). 이중 돌연변이체에서 글리칸 부분중 몇몇은 내성인 반면, 그 나머지는 엔도 H (레인 8 및 9)에 대하여 감수성이다. 엔도 H-내성 패턴이 비리온-관련 GP5에 대하여 관찰되는 것과 유사하지만, GP5 및 M 단백질 모두를 발현시키는 세포에서 관찰되는 것과는 상이하다 (도 1 및 2). 이러한 결과는 다른 바이러스 단백질이 GP5상의 추가의 글리칸 변형에서 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다.

GP5의 저당화가 특이 항체에 의해 중화될 수 있는 PRRSV 능력에 미치는 영향

바이러스 수용체와의 상호작용에 관여하는 바이러스 당단백질의 당화 수준은 비리온이 바이러스-중화 항체와 반응할 수 있는 능력에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 이러한 현상이 PRRSV 경우에서 발생하는지 실험하기 위하여, 당화 패턴이 변경된 PRRSV GP5 돌연변이체 (FL-N34A, FL-N51A 및 FL-N34/51A)를 회복기 항혈청에 의해 중화될 수 있는 그들의 능력에 관하여 PRRSV wt (FL12)와 비교하였다. 이들 위해, 본 발명자들은 wt PRRSV로 감염된 4마리의 동물로부터 얻은 회복기 항혈청 (감염후(p.i.) 47일째)을 사용하였다. 유사한 용량 (2,000 TCID₅₀)의 감염성 PRRSV GP5 돌연변이체 (FL-N34A, FL-N51A 및 FL-N34/51A) 뿐만 아니라, 감염성 클론-유래된 wt PRRSV (FL 12)도 혈청-중화 검정법에서 본 발명자들의 표준 검정법 프로토콜에 따라 시험감염 바이러스로 사용하고, 4개의 항-wt PRRSV (FL12) 혈청 세트를 기준으로서 사용하였다. 표 3은 상이한 종말점 혈청 중화 역가를 수득하였음을 나타낸다. 보통, p.i. 47-54일째 수집된 PRRSV wt-회복기 혈청 샘플은 중간 수준의 wt PRRSV 중화 활성 (1:8 내지 1:32, 표 3 및 4)을 포함하고, 이는 wt PRRSV에 의한 감염의 전형적인 것으로, 상대적으로 약하고 더딘 중화 항체 반응의 특성을 반영하는 것이다. 그러나, SN 검정법에서 시험감염 바이러스로서 저당화 PRRSV 돌연변이체 (GP5 엑토도메인상에 1개 또는 2개의 글리칸 부분이 결손되어 있는 것)를 사용한 경우, 기준 혈청의 종말점을 현저히 증가시켰고, 종말점 역가는 6 내지 22배 범위로 증가하였다 (표 3). 이러한 관찰을 통해, 1개, 및 특히 2개의 글리칸 부위가 제거되는 것이 특정 항체에 대한 중화 에피토프의 접근성을 증가시킨다라는 것이 명확히 제안된다. 이러한 결과는 SN 검정법에서는 전체적으로 당화된 GP5를 함유하는 wt PRRSV를 전형적으로 사용하기 때문에, 다르게는 미검출될 수 있는, wt PRRSV-감염된 회복기 혈청내에 상당량의 PRRS V-중화 항체가 존재한다는 것을 시사하는 것으로 보인다.

PRRSV GP5 당화 패턴의 변경이 중화 항체와 반응할 수 있는 감염성 비리온의 능력에 미치는 효과. 표 3의 숫자는 중화를 나타내는 역 종말점 희석율 (SN 종말점)에 상응하는 것이다.

GP5의 저당화가 생체내에서 중화 항체를 유도할 수 있는 PRRSV의 능력에 미치는 영향

바이러스 외피 당단백질로부터 당질이 제거된 경우, 이러한 돌연변이체가 숙주의 생체내 접종에 사용되었을 때, 돌연변이체 바이러스에 대한 중화 항체는 고역가로 생산되고; 몇몇 경우에서는, wt 바이러스에 대한 항체를 wt 바이러스 그 자체보다 고역가로 유도한다는 놀랄 만한 효과가 보고되었다. 본 발명자들은 동일한 용량의, wt PRRSV FL12, 또는 당화 패턴이 변경된 각각의 돌연변이체를 사용하여 돼지를 감염시켰다. 흥미롭게도, p.i. 4, 7, 및 10일째 이루어진 직장 온도 평가와 바이러스 혈증의 평가에 의한 임상적/바이러스학적 평가시, 어떤 돌연변이체에 대해서도 발병성의 약독화 또는 악화에 관한 증거도 없이, 모든 군에서 FL12에 대하여 앞서 기술된 것과 유사한 패턴의 감염을 나타내었다 (데이타는 나타내지 않음). 그러나, 48일간의 기간 동안 이들 동물로부터 얻은 혈청을 순차적으로 샘플링한 결과, PRRSV-중화 항체 반응 유도의 동역학에서 wt PRRSV와 돌연변이체 사이에는 현저한 차이를 나타내었다 (표 4A 및 4B). 돌연변이체는 wt PRRSV에 의해 발생된 것보다 더욱 먼저, 보다 강한 동종 중화 항체 반응을 발생시켰고, 결국, 돌연변이체의 경우, 특성상 활발치 못하고 충분치 못한 PRRSV-중화 항체 반응의 성질은 교정되는 것으로 보인다 (표 4B). 돌연변이체-동종 중화 항체의 동역학 양상 (표 4B)은 PRRSV를 제외한, 예로서, 인플루엔자 또는 슈도레이비스 바이러스와 같은 다른 바이러스 감염에 대하여 기술된 것과 일치하는 보다 통상적인 중화 항체 혈청전환을 나타낸다. GP5 당화 돌연변이체로 감염시킨 경우, wt PRRSV 그 자체로 감염시켰을 때의 반응보다 현저히 높은 wt PRRS V-특이 중화 항체 반응이 유도되었다는 사실이 가장 중요한 것이다. 돌연변이체 바이러스 FL-N34 및 FL-N51A는 wt PRRSV에 대한 중화 항체 역가를 wt PRRSV 그 자체보다 5배 높은 (p<0.05) 수준으로 유도한 반면, 돌연변이체 FL-N34/51는 wt PRRSV 그 자체보다 6-배 높은 (p<0.01) wt PRRSV-중화 항체 역가를 유도하였다 (표 4B).

표 4A. PRRSV GP5의 당화 패턴 변경이 wt PRRSV (4A) 또는 감염성, 동종 종 (4B)에 대한 중화 항체를 유도할 수 있는 PRRSV 종의 능력에 미치는 효과. (*) 표 4A 및 B에 있는 숫자는 군 (n=3)에 대한 SN 종말점의 기하 평균에 상응한 것이다.

논의

본 연구에서 본 발명자들은 감염성 바이러스 회복에서 PRRSV GP5 당화의 영향, 항체에 의해 중화될 수 있는 돌연변이체 바이러스의 능력에 있어서 그의 역할, 및 생체내 중화 항체 유도에 있어서 그의 역할에 대하여 조사하였다. 본 발명자들은 GP5내 3개의 잠재적인 당화 부위 (N34, N44, 및 N51) 모두가 글리칸 부분 첨가에 사용된다는 것을 발견하게 되었다. 본 발명자들의 결과를 통해 N44 부위에서의 글리칸 첨가가 감염성 바이러스 회복에 가장 중요하다는 것이 밝혀졌다. 추가로, 본 발명자들의 결과를 통해 저당화 형태의 GP5를 함유하는 PRRSV가 항체에 의한 중화에 대하여 아주 감수성이며, 돌연변이체 바이러스는 동종 돌연변이체 바이러스 뿐만 아니라, wt PRRSV에 대해서도 현저히 높은 수준의 중화 항체를 유도한다는 것을 나타낸다.

단일 또는 다중 부위에서 변경된 돌연변이체를 사용함으로써 3개의 잠재적인 N-연결 당화 부위 모두가 GP5내 글리칸 첨가에 사용된다는 것을 확인하였다 (도 2). PRRSV GP5 단백질은 형질감염된 세포에서 M 단백질과 공발현될 때, 엔도 H 감수성 고-만노스형 글리칸을 함유한다는 것이 생화학적 연구를 통해 나타났다. 비리온내로 혼입된 대다수의 GP5는 엔도 H에 대하여 내성을 띤 반면 (도 4A), 형질감염된 세포에서 M 단백질의 존재하에 발현된 GP5는 전체적으로 엔도 H 감수성이고, 흥미로운 대상이다. 형질감염된 세포에서 M 단백질의 존재하에 발현될 때 GP5는 대개는 ER에 또는 시스-골지 영역에 축적되고, 따라서, 엔도 H 감수성인 상태로 남게 될 수 있다. 그러나, PRRSV-감염된 세포에서 GP5는 추가의 바이러스 단백질과 상호작용할 수 있고, 다른 바이러스 단백질과의 복합체 형성을 통해 ER 또는 시스-골지 너머로 GP가 수송되는 것은 촉진된다. 이러한 해석과 일치하는 것으로서, 본 발명자들은 wt 또는 돌연변이체 PRRSV-감염된 세포에서 GP5 단백질 또한 엔도 H에 대하여 내성을 띤다는 것을 관찰하게 되었다. 본 발명자들은 감염된 세포의 ER에서 합성되는 GP5는, 대다수의 GP5 분자가 PRRSV 비리온내로 혼입되기 이전에 엔도 H 내성을 획득하게 되는 중간- 및/또는 트란스-골지 영역으로 수송된다. PRRSV를 포함한 아테리바이러스를 사용한 수개의 연구를 통해 GP5 및 M 단백질이 이종이량체를 형성하고, 이것이 바이러스 감염성에 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 제안한다. EAV 및 LDV에서는 이황화 가교결합 형성을 통해 GP5와 M 단백질이 직접 상호작용한다는 것이 입증되었다. 그러한 상호작용은 N-연결 올리고당 측쇄의 추가 프로세싱 이전에, 가정컨대, GP5가 ER 또는 시스-골지 구획 밖으로 수송되지 이전에 발생할 수 있다.

wt 및 돌연변이체 비리온내로 혼입된 GP5의 엔도 H 내성 패턴은 상이하다는 것은 흥미로운 일이다. wt PRRSV에서 대다수의 GP5는 엔도 H 내성인 반면, 단일 부위 돌연변이체 비리온 (FL-N34A 및 FL-N51A)에서 대부분의 GP5 분자는 엔도 H 감수성이었다 (도 4A). 추가로, 이들 돌연변이체에서 2개의 글리칸 부위중 오직 1개만 감수성이고, 나머지 하나는 내성을 띠었다. 이중 돌연변이체 (FL-N34/51A) 비리온 또한 글리칸을 함유하는 GP5를 혼입하고 있는데, 이중 몇몇도 엔도 H에 대한 감수성이었다. 이러한 데이타는, wt 뿐만 아니라, 돌연변이체 PRRSV 비리온도 상이한 부위에 상이한 글리칸 부분을 함유하는 혼합된 GP5 분자 집단을 혼입하고 있다는 해석과 일치하는 것이다. 차별적으로 당화된 형태의 GP5가 PRRSV 비리온내로 혼입되었다는 것을 입증하는 이전의 연구는 본 발명자들의 해석을 추가로 강화시켜 준다. 비리온내로 혼입된 GP5의 엔도 H 감수성 패턴으로부터, 비록 N44 부위에 엔도 H 감수성 글리칸을 갖는 몇몇 GP5 분자가 비리온내로 혼입될지라도 N44 부위는 엔도 H 내성 글리칸을 함유할 수 있다고 추측하는 것은 흥미로운 일이다. GP5내 다양한 부위에서의 상기와 같은 특이한 패턴의 글리칸과 비리온내로의 다양한 형태의 GP5 혼입이 PRRSV 감염된 동물에서 관찰되는 것과 같은 면역 반응 패턴과 어떤 관련성이 있는지에 관한 것은 여전히 연구되어야 하는 상태로 남아있다.

최근 연구에서는, 렐리스타드 PRRSV의 GP5내 2개의 N-연결 당화 부위 (N46 및 N53)중 N46 잔기의 당화가 바이러스 입자 생산을 위해서는 더욱 강력히 요구되었다고 나타내었다. 감염성 바이러스 수율은 N46에 돌연변이를 가질 경우 대략 100배 감소되었다. 본 발명자들의 결과를 통해, N44 (북미 PRRSV의 경우)에 글리칸 첨가가 감염성 PRRSV의 회복을 위해서는 절대적으로 필요하다는 것을 제안한다. 이어서, 가능하게는 PRRSV의 유럽 및 북미 단리체는 감염성 바이러스 생산을 위한 N-연결 당화에 대한 요건에 있어서 다소 상이할 수 있다. 이와 관련하여, 렐리스타드 바이러스는 오직 2개의 N-연결 당화 부위를 함유하는 반면, 본 발명자들이 본 연구에서 사용한 북미 단리체는 3개의 상기 부위를 함유한다는 것에 주목할 만하다.

GP5는 PRRSV-중화 항체 생성과 보호 면역에 관여하는 PRRSV의 가장 중요한 당단백질이다. 본 발명자들의 결과를 통해, GP5 엑토도메인내 34번 잔기와 51번 잔기에 글리칸이 존재하지 않을 경우, 생육성 PRRSV 돌연변이체를 생성하면서, 항체에 의한 중화에 대한 이들 돌연변이체의 감수성 뿐만 아니라, 근접한 중화 에피토프의 면역원성을 둘 다 증진시킨다는 것이 밝혀졌다. 돌연변이체 PRRSV의 GP5에 글리칸이 존재하지 않을 경우의 중간 효과는 wt PRRSV로 감염된 되재로부터 얻은 회복기 혈청에 의한 중화에 대한 바이러스의 감수성이 증가되었다는 것이다 (표 3). HIV-1 및 SIV를 사용한 연구를 통해, gp160의 가변 루프내 글리칸의 획득 또는 제거가 중화에 대한 그들의 감수성을 변화시키는 것으로 나타났다. 따라서, 글리칸은 바이러스 외피 당단백질 생합성시 적어도 2가지 유형의 필수적인 역할을 한다고 가정되었다. 하나의 경우에서, 글리칸 결실이 당단백질의 결손을 일으키고, 이로써 바이러스 종의 전반적인 생육성에서 결손을 일으킨다. 본 발명자들은 PRRSV GP5중 N44의 글리칸이 유사한 역할을 하는 것으로 가정하였다. 두번째 경우에서, 글리칸은 잠재적으로 항체에 의한 중화에 대하여 바이러스 단백질을 차폐시키는 역할을 한다. PRRSV GP5의 경우, N34 및 N51의 글리칸이 유사한 역할을 할 수 있다. HIV에서, "글리칸 차폐"는 중화 면역 반응으로부터의 회피를 설명하기 위한 1차 기전이며, 이로써 생체내에서 HIV를 지속시킬 수 있다고 가정되었다. 이는 PRRSV와의 몇몇 유사한 비교를 이끌어낸다. 개개의 동물에서 수개월 동안 지속된 것으로 알려진 PRRSV로 감염시킬 경우, 바이러스-특이 중화 면역 반응을 유도함으로써 특이한 양상을 제시한다. PRRSV로 감염된 동물은 일반적으로 검출가능한 PRRSV-중화 항체 반응을 확립시키는데 소요되는 정상적인 시간보다 더욱 장시간이 소요된다는 것이 잘 확립되었다. 일단 확립되면, 이러한 PRRSV-중화 반응은 약하고, 동물에 따라 현저히 달라진다. 중화 항체 반응의 지연은 근접한 면역우세 데코이 에피토프 (아미노산 위치 27번 내지 30번)가 존재하기 때문인 것으로 추정되는데, 이는 중화 에피토프 (아미노산 위치 37번 내지 45번) (26, 38)에 대한 반응을 차단하거고/거나 저속화시키는, 강한, 조기의 비-보호적 면역 반응을 일으키는 것이다. 이는 PRRSV-중화 항체 반응의 비정형적인 특징에 관한 타당한 설명이 될 수 있지만, 여전히 시험되어야 할 필요가 있다. 본 발명자들의 실험에서, 데코이 에피토프의 결실은 감염성 PRRSV의 회복에 대하여 치명적임을 입증하였고 [Ansari et al, 비공개 데이타], 따라서, 이러한 가설을 시험하기는 어렵다.

PRRSV-중화 반응의 특수한 성질을 설명하는 대체 또는 보충적 기전이 HIV 및 SIV에 대하여 제안된 "글리칸 차폐"로 여겨질 수 있다. 본 발명자들의 연구에서 1개 또는 2개의 글리칸 부분이 결손된 돌연변이체 PRRSV를 사용함으로써, SN 검정법에서는 wt PRRSV를 사용하기 때문에 다르게는 검출될 수 없었던, PRRSV-감염된 동물의 혈청내 대량의 PRRSV 중화 항체가 존재한다는 증거를 최초로 제공하였다. PRRSV-중화 항체는 숙주 반응에 존재하기는 하지만, GP5상의 글리칸 부분에 의해 중화 에피토프가 차단되거나 차폐되기 때문에 감염성 wt PRRSV 비리온과 반응할 수는 없다.

아테리바이러스에서 당단백질의 당화에 의한 중화 이탈에 대한 중요한 전례는 젖산 탈수소효소-촉진 바이러스 (LDV)에 대하여 기재되었다. LDV는 그의 주요 당단백질인 VP-3의 과도한 차폐 때문에 항체 중화에 대하여 고도로 내성을 띠지만, LDV중 특정의 자연적으로 발생된 종은 VP-3의 엑토도메인상에서 2개의 당화 부위가 손실되었기 때문에 고도로 중화되기 쉽다. 흥미롭게도, 이러한 중화-민감성 표현형은 용이하게 중화될 수 있는 LDV 종이 습득하는 숙주내의 고도한 향신경성과 상관관계에 있다. 그러한 신경발병성 증진은 아마도, 가능하게는 글리칸이 차폐되지 않았음에 기인한, 신경 세포내 수용체와 바이러스 당단백질와의 상호작용의 촉진을 반영하는 것이다. PRRSV로 접종하기 위하여 본 발명자들이 사용한 새끼 돼지 모델에서, 비록 본 발명자들이 온도 및 바이러스 혈증 측정에 있어서 본 발명자들의 관찰을 제한하고 있지만, 돌연변이체 PRRSV 중 임의의 것과 PRRSV 사의의 발병성 차이를 검출할 수는 없었다. 상이한 실험 조건 (즉, 임신한 경산돈 모델)하에서는 이들 돌연변이체 PRRSV의 발병성에 있어서 몇몇 변경이 관찰될 가능성도 있다. 비록 그의 존재에 관하여 이전 보고에서 제안된 바 있지만, 자연적으로 발생된 저당화 PRRSV 종을 발견하는 것이 비일비재한지 여부는 알려져 있지 않다.

본 발명자들의 실험에서 주목할 만한 관찰은, 생체내에서 돼지를 감염시켰을 때, GP5 돌연변이체가 감염 잠복기에 상당한 크기의 wt PRRSV-중화 반응을 증가시키는 능력에 있어서 wt PRRSV를 능가할 수 있다는 점이다 (표 4A). 유사한 사례로, 본 발명자들은 동종 PRRSV 돌연변이체에 대하여 보다 높은 중화 역가를 관찰하였을 뿐만 아니라, wt PRRSV에 대한 상당 크기의 역가 또한 관찰하였다 (표 4A). 추가로, 반응은 먼저 발생하였고, 중화 역가는 p.i. 14일째 검출할 수 있었으며, 이러한 관찰은 전형적으로 wt PRRSV 감염에서는 감지되지 못했다 (표 4B). PRRSV 돌연변이체로 감염된 돼지로부터 얻은 혈청에 의한 wt PRRSV의 중화가 증가하였다는 것은 글리칸이 존재할 경우 중화 항체를 유도하지 못하는 중화 에피토프(들)을 글리칸이 차단하였음을 제안하는 것이다. 이러한 관찰은 보다 우수하고, 보다 효능이 있는 PRRSV 백신 디자인에 대하여 매우 유의적인 것이며, 합리적으로 디자인된, 신규의 백신은 중화 항체의 생산을 증진시키기 위해서는 GP5의 당화 패턴에 변형을 수반하여야 한다는 것을 제안한다. 추가로, PRRSV의 면역학적으로 탁월한 당단백질로부터 당질을 제거하는 것이 동종 면역화 종뿐만 아니라, 다른 비관련 PRRSV 종에 대한 SN 역가의 증가에 미치는 효과를 연구하는 것이 중요할 것이다.

실시예 2. 북미 및 유럽 PRRSV 단리체에서의 N-연결 당화 부위 동정

불활성화될 수 있고, 본 발명의 방법에 사용될 수 있는, 서열 1의 기준 GP5 단백질중 34번 아스파라긴 또는 51번 아스파라긴에 상응하는 N-연결 당화 부위를 동정하기 위하여, 원하는 북미 PRRSV 단리체 (도 5) 또는 유럽 PRRSV 단리체 (도 6)중 어느 것의 GP5 단백질을 서열 1의 기준 GP5 단백질 (북미 종 NVSL 97-7895)과 함께 정렬한다. 본 실시예에서는 요툰-하인(Jotun-Hein) 정렬 방법 [Hein, JJ. Li Methods in Enzymology, Vol. 183 : pp. 626-645, 1990]을 사용하여 DNASTAR, 인코포레이티드(DNASTAR, Inc.) (미국 위스콘신주 매디슨 소재)로부터 입수한 MegAlign™ 프로그램을 사용하여 정렬시켰다. 다중 서열 정렬 변수는 갭 패널티 11, 및 갭 길이 패널티 3이었다. 쌍 비교를 위해 Ktuple 값 2를 사용하였다.

도 5에서, 서열 1의 기준 GP5 단백질중 51번 아스파라긴에 상응하는 N-연결 당화 부위는 제시된 모든 북미 PRRSV 단리체에 존재하고 N-연결 당화 부위 "NGT"를 포함한다는 것은 명백하다. 이러한 N-연결 당화 부위는 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열에서 51번 아스파라긴을, 기타 아미노산 잔기, 예로서, 글루타민 또는 알라닌을 코딩하는 코돈으로 치환함으로써 불활성화될 수 있다. 이러한 경우, 저당화 북미 PRRSV GP5 단백질 변이체에서 상응하는 아미노산 서열은 서열, 예로서, "QGT", "AGT", 또는 "XGT" (여기에서, X는 아스파라긴 이외의 임의의 아미노산이다)를 포함할 것이다. 이들 또는 기타의, 51번 아스파라긴에 상응하는 N-연결 당화 부위가 불활성화된, 북미 PRRSV GP5 단백질 단리체의 저당화 변이체는 또한, 다른 N-연결 당화 부위가 불활성화된 다른 저당화 GP5 변이체와 조합될 수 있다.

서열 1의 기준 GP5 단백질중 34번 아스파라긴에 정확하게 상응하는 N-연결 당화 부위는 오직 특정의 북미 PRRSV 단리체에만 존재한다는 것도 도 5로부터 명백하다. 더욱 특히, GP5 단백질로서, 대표적인 북미 PRRSV 단리체 IAF-BAJ (서열 3), 94-3182 (서열 7), 및 94-287 (서열 8)의 GP5 단백질은 서열 1의 기준 GP5 단백질중 34번 아스파라긴에 정확하게 상응하는 N-연결 당화 부위를 함유하고, N-연결 당화 부위 "NSS"를 포함한다. 이러한 서열 3, 7, 및 8의 N-연결 당화 부위는 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열에서 34번 아스파라긴을, 기타 아미노산 잔기, 예로서, 글루타민 또는 알라닌을 코딩하는 코돈으로 치환함으로써 불활성화될 수 있다. 이러한 경우, 저당화 북미 PRRSV GP5 단백질 변이체에서 상응하는 아미노산 서열은 서열, 예로서, "QSS", "ASS", 또는 "XSS" (여기에서, X는 아스파라긴 이외의 임의의 아미노산이다)를 포함할 것이다.

서열 1의 기준 GP5 단백질중 34번 아스파라긴에 정확하게 상응하는 N-연결 당화 부위가 결여되어 있는 다른 북미 PRRSV 단리체에서, 30번 잔기 (도 5의 서열 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 11, 13에서 "NAS"), 및 33번 잔기 (도 5의 서열 3, 8에서 "NNS"; 서열 6, 10에서 "NSS"; 서열 11, 13에서 "NDS")에 위치하는 기타 N-연결 당화 부위 또한 불활성화될 수 있다. 다시 말하면, 다른 북미 단리체내의, 서열 1의 기준 GP5 단백질중 30번 및 33번 잔기에 상응하는 아미노산 위치에 위치하는 N-연결 당화 부위 또한 불활성화될 수 있고, 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.

도 6에서, 서열 1의 기준 GP5 단백질중 51번 아스파라긴에 상응하는 N-연결 당화 부위 또한 대표적인 유럽 PRRSV 단리체에 존재하고, 이는 N-연결 당화 부위 "NGT"를 포함한다는 것은 명백하다. 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열에서, 이러한 N-연결 당화 부위는 51번 아스파라긴을 다른 아미노산 잔기, 예로서, 글루타민 또는 알라닌을 코딩하는 코돈으로 치환함으로써 불활성화될 수 있다. 이러한 경우, 저당화 유럽 PRRSV GP5 단백질 변이체에서 상응하는 아미노산 서열은 서열, 예로서, "QGT", "AGT", 또는 "XGT" (여기에서, X는 아스파라긴 이외의 임의의 아미노산이다)를 포함할 것이다. 이들 또는 기타의, 51번 아스파라긴에 상응하는 N-연결 당화 부위가 불활성화된, 유럽 PRRSV 단리체의 저당화 변이체는 또한, 다른 N-연결 당화 부위가 불활성화된 다른 저당화 GP5 변이체와 조합될 수 있다.

상기와 관련하여 본 발명의 수개의 잇점들은 달성되고 성취된다고 이해될 것이다.

본 발명의 원리, 및 그에 따라 당업자가 다양한 실시태양에서 본 발명을 최상으로 사용할 수 있도록 하는 그의 실질적인 적용과, 주시되고 있는 특정 용도로 적합화된 다양한 변형도 함께 최상으로 설명하기 위하여 실시태양이 선택되었고, 설명되었다.

본 발명의 범주로부터 벗어나지 않는 한, 본원에 기술되고 설명되어 있는 구성과 방법은 다양한 변형될 수 있는 바, 상기의 설명에 포함되어 있거나 첨부하는 도면에 제시되어 있는 모든 내용은 제한한다기보다는 설명적인 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 본 발명의 깊이와 범주는 상기 기술한 예시적인 실시태양중 어느 것으로도 제한되지 않아야 하며, 이하 첨부된 하기의 청구 범위와 그의 등가물에 따라서만 한정되어야 한다.

각종 특허와 비특허 참고 문헌이 본원에 개시되어 있고, 이들 각각은 본원에서 그의 전문이 참고 문헌으로서 명백하게 인용되고 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Board of Reagents University of Nebraska-Lincoln Pattnaik, Asit K <120> Methods and Compositions for Vaccination of Animals with PRRSV Antigens with Improved Immunogenicity <130> 46589-62814 <160> 26 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 200 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 1 Met Leu Gly Arg Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Arg Leu Leu Ser 1 5 10 15 Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Ala Leu Val Asn Ala Asn 20 25 30 Ser Asn Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys 35 40 45 Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Lys Asp Lys Phe Asp Trp Ala Val 50 55 60 Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly 65 70 75 80 Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val 85 90 95 Ser Thr Ala Gly Phe Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr 100 105 110 Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Ala 115 120 125 Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn 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115 120 125 Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe 130 135 140 Leu Leu Asp Ser Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile 145 150 155 160 Ile Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Asp Gly His Leu Ile Asp Leu 165 170 175 Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Val Thr Lys Val 180 185 190 Ser Ala Glu Gln Trp Cys Arg Pro 195 200 <210> 4 <211> 200 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 4 Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Val Gly Tyr Cys Ser Gln Leu Pro Phe 1 5 10 15 Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Ala Leu Val Asn Ala Ser 20 25 30 Ser Thr Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Ile Cys 35 40 45 Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Asn Glu Lys Phe Asp Trp Ala Val 50 55 60 Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly 65 70 75 80 Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val 85 90 95 Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr 100 105 110 Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala 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<221> misc_feature <222> (94)..(94) <223> Xaa can be Ile or Val <220> <221> misc_feature <222> (164)..(164) <223> Xaa can be Gly, Arg, Lys, or Gln <400> 14 Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gln Leu Pro Phe 1 5 10 15 Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Ala Leu Val Asn Ala Ser 20 25 30 Asn Xaa Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Ile Cys 35 40 45 Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Asn Xaa Lys Phe Asp Trp Ala Val 50 55 60 Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly 65 70 75 80 Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Xaa Thr Val 85 90 95 Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr 100 105 110 Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Ala 115 120 125 Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe 130 135 140 Leu Leu Asp Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile 145 150 155 160 Ile Glu Lys Xaa Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu 165 170 175 Lys Arg Val Val 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ggagcaactc 660 atgtgctaac caacctgcca ctcccgcaga ggcctaagcc tgaagacttt tgcccttttg 720 agtgtgctat ggctgacgtc tatgatattg gtcatggcgc cgtcatgtat gtggccaaag 780 ggaaagtctc ctgggcccct cgtggcgggg atgaggcgaa atttgaaact gtccctaggg 840 agttgaagtt gatcgcgaac caactccaca tctccttccc gccccaccac gcagtggaca 900 tgtctaagtt tgtgttcata gcccctggga gtggtgtctc tatgcgggtc gagtgcccac 960 acggctgtct ccccgctaat actgtccctg aaggtaactg ctggtggcgc ttgtttgact 1020 cgctcccact ggacgttcag aacaaagaaa ttcgccgtgc caaccaattc ggctatcaaa 1080 ccaagcatgg tgtcgctggc aagtacctac aacggaggct gcaagctaat ggtctccgag 1140 cagtgactga tacagatgga cccattgtcg tacagtattt ctctgttagg gagagctgga 1200 tccgccactt cagactggcg gaagagccta gcctccctgg gtttgaagac ctcctcagaa 1260 taagggtaga gcccaatacg tcgccattga gtgacaaggg tggaaaaatc ttccggtttg 1320 gcagtcacaa atggtacggt gctggaaaga gagcaaggaa agcacgctct ggtatgacca 1380 ccacagtcgc tcaccgcgcc ttgcccgctc gtgaaatcca gcaagccaaa aagcacgagg 1440 atgccggcgc tgataaggct gtgcatctca ggcactattc tccgcctgcc gacgggaact 1500 gtggttggca ctgcatttcc gccatcgcca accgaatggt gaattccaaa tttgaaacta 1560 ctcttcccga gagggtgaga ccttcagatg actgggctac tgacgaggac cttgtgaaca 1620 ccatccaaat tctcaagctc cctgcggcct tggacaggaa cggtgcttgt gttggcgcca 1680 aatacgtgct taagctggaa ggcgagcatt ggactgtctc tgtgaccctt gggatgtccc 1740 cttctttgct cccccttgaa tgtgttcagg gctgttgtga gcataagagc ggacttggtc 1800 ccccagatgc ggtcgaagtt ttcggatttg accctgcctg ccttgaccga ctggctgagg 1860 taatgcactt gcctagcagt gtcatcccag ctgctctggc cgaaatgtcc ggcgacccca 1920 actgtccggc ttccccggtc actactgtgt ggactgtttc acaattcttt gcccgccaca 1980 gaggaggaga gcaccctgat caggtgcgct taggaaaaat catcagcctt tgtcaagttg 2040 ttgaggaatg ctgttgccat cagaataaaa ccaaccgggc caccccggaa gaggttgcgg 2100 caaggattga tcagtacctc catggtgcaa caagtcttga agaatgcttg attaggcttg 2160 agagggtttg cccgccgagc gctgcggaca ccttctttga ttggaatgtt gtgctccctg 2220 gggttggggc ttcaactcag acaaccaaac agctccatgt caaccagtgc cgcgctctgg 2280 ttcctgtcgt gactcaagag cctttggaca aagactcagt ccctctgacc gccttctcgc 2340 tgtccaattg ctactatcct gcacaaggtg acgaggttcg tcaccgtgag aggctaaact 2400 ccgtactctc taagctggag ggggttgttc gtgaggaata tgggctcacg ccaactgaac 2460 ctggcccgcg acccgcacta ccgaacgggc tcgtcgaact taaagaccag atggaggagg 2520 atctgctgaa actagtcaac gcccaggcaa cttcagaaat gatggcctgg gcagccgagc 2580 aggttgatct gaaagcttgg gtcaaaaact acccacggtg gacaccgcca ccccctccac 2640 caagagttca gcctcgaaaa acaaagtctg tcaagagctt gccagggaac aaacctgtcc 2700 ccgctccacg caggaaggtc agatctgatt gtggcagccc gattttgatg ggcgacaatg 2760 ttcctgacgg tcgggaagat ttgactgttg gtggccccct tgatctttcg acaccatccg 2820 agccgatgac acctctgagt gagcctgcac ttatgcccgc gttgcaatat atttctaggc 2880 cagtgacatc tttgagtgtg ctggccccag ttcctgcacc gcgtagaact gtgtcccgac 2940 cggtgacgcc cttgagtgag ccaatttttg tgtctgcacc gcgacacaaa tttcagcagg 3000 tggaagaagc gaatctggcg gcaacaacgc tgacgcacca ggacgaacct ctagatttgt 3060 ctgcatcctc acagactgaa tatgaggctt ctcccctaac accactgcag aacatgggta 3120 ttctggaggt gggggggcaa gaagctgagg aagttctgag tgaaatctcg gatacactga 3180 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caggtcgatg gcgg 24 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> synthetic <400> 26 gtcggccgcg acttaccttt agag 24

Claims

서열 1의 기준(reference) GP5 단백질중 34번 아스파라긴 또는 51번 아스파라긴에 상응하는 1개 이상의 N-연결 당화 부위가 불활성화된 저당화(hypoglycosylated) 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) GP5 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 투여함으로써 PRRSV 항원에 대한 돼지의 면역 반응이 증강되도록 유도하는 것을 포함하는, PRRSV 항원에 대한 돼지의 면역 반응이 증강되도록 유도하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 감염성 PRRSV RNA 분자를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 감염성 PRRSV RNA 분자를 코딩하는 DNA 분자를 포함하는 것인 방법.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 감염성 PRRSV RNA 분자가 북미 PRRSV 유도체 또는 유럽 PRRSV 유도체인 방법.
제2항에 있어서, 상기 감염성 PRRSV RNA 분자는, 서열 1의 기준 GP5 단백질중 34번 아스파라긴 또는 51번 아스파라긴에 상응하는 1개 이상의 N-연결 당화 부 위가 불활성화된 저당화 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체 단백질을 코딩하는 북미 PRRSV 유도체인 방법.
제5항에 있어서, 서열 1의 51번 아스파라긴에 상응하는 N-연결 당화 부위가 불활성화된 것인 방법.
제5항에 있어서, 서열 1의 기준 GP5 단백질중 34번 아스파라긴 및 51번 아스파라긴에 상응하는 상기 N-연결 당화 부위 둘 다가 불활성화된 것인 방법.
제7항에 있어서, 상기 N-연결 당화 부위 둘 다가, 상기 34번 아스파라긴 및 상기 51번 아스파라긴을 코딩하는 코돈을 아스파라긴 이외의 아미노산을 코딩하는 코돈으로 대체함으로써 불활성화된 것인 방법.
제8항에 있어서, 다른 아미노산을 코딩하는 상기 코돈이 알라닌 또는 글루타민 잔기를 코딩하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 코돈이 알라닌 잔기를 코딩하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는, 포유동물 세포에서 활성인 프로모터가 저당화 GP5 단백질을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결 되어 있는 DNA 분자를 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 프로모터가 CMV 프로모터인 방법.
제1항에 있어서, 상기 N-연결 당화 부위는, 상기 51번 아스파라긴을 코딩하는 코돈을 아스파라긴 이외의 아미노산을 코딩하는 코돈으로 대체함으로써 불활성화된 것인 방법.
제13항에 있어서, 다른 아미노산을 코딩하는 상기 코돈이 알라닌 또는 글루타민 잔기를 코딩하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 34번 아스파라긴에 상응하는 상기 N-연결 당화 부위는, 상기 34번 아스파라긴을 코딩하는 코돈을 아스파라긴 이외의 아미노산을 코딩하는 코돈으로 대체함으로써 불활성화된 것인 방법.
제15항에 있어서, 다른 아미노산을 코딩하는 상기 코돈이 알라닌 또는 글루타민 잔기를 코딩하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는, 서열 1의 기준 GP5 단백질중 34번 아스파라긴 및 51번 아스파라긴에 상응하는 상기 N-연결 당화 부위 둘 다가 불 활성화된 저당화 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체 단백질을 코딩하는 것인 방법.
제17항에 있어서, 상기 N-연결 당화 부위 둘 다가, 상기 34번 아스파라긴 및 상기 51번 아스파라긴을 코딩하는 코돈을 아스파라긴 이외의 아미노산을 코딩하는 코돈으로 대체함으로써 불활성화된 것인 방법.
제18항에 있어서, 다른 아미노산을 코딩하는 상기 코돈이 알라닌 또는 글루타민 잔기를 코딩하는 것인 방법.
제17항에 있어서, 상기 N-연결 당화 부위중 하나는, 상기 34번 아스파라긴 또는 상기 51번 아스파라긴을 코딩하는 하나의 코돈을 아스파라긴 이외의 아미노산을 코딩하는 코돈으로 대체함으로써 불활성화된 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 조성물을 피하 주사, 정맥내 주사, 진피내 주사, 비경구 주사, 근육내 주사, 무침(needle free) 주사, 전기천공, 경구 전달, 비내 전달, 구비강(oronasal) 전달, 또는 그의 임의의 조합에 의해 투여하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 조성물이 치료학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것인 방법.
제22항에 있어서, 상기 담체가 단백질, 완충액, 계면활성제, 및 폴리에틸렌 글리콜 중합체, 또는 그의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 조성물이 보조제(adjuvant)를 추가로 포함하는 것인 방법.
제24항에 있어서, 상기 보조제가 수산화알루미늄, 퀼(Quil) A, 알루미나겔 현탁액, 광유, 글리세리드, 지방산, 지방산 부산물, 마이코박테리아, 및 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드, 또는 그의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 백시니아 바이러스 벡터, 단순 헤르페스 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 및 TGEV 벡터로 구성된 군으로부터 선택되는 바이러스 벡터를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, PRRSV 항원에 대한 상기 돼지의 면역 반응 증강이 상기 돼지에 의한 PRRSV 중화 항체의 생산 증가를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 돼지가 경산돈(sow), 미경산돈(gilt), 수퇘지(boar), 또는 새끼 돼지(piglet)인 방법.
제1항에 있어서, 저당화 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 직접 합성, 북미 PRRSV 단리체 GP5 뉴클레오티드 서열의 돌연변이 유발, 또는 북미 PRRSV 공통(consensus) GP5 뉴클레오티드 서열의 돌연변이 유발에 의해 수득되는 것인 방법.
제29항에 있어서, 상기 북미 PRRSV 단리체 GP5 뉴클레오티드 서열은 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12 및 서열 13으로 구성된 군으로부터 선택되는 펩티드를 코딩하는 것인 방법.
제29항에 있어서, 상기 공통 북미 PRRSV GP5 뉴클레오티드 서열이 서열 14와 85％ 이상 일치하는 공통 GP5 단백질을 코딩하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 저당화 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 직접 합성, 유럽 PRRSV 단리체 GP5 뉴클레오티드 서열의 돌연변이 유발, 또는 공통 유럽 PRRSV GP5 뉴클레오티드 서열의 돌연변이 유발에 의해 수득되는 것인 방법.
제32항에 있어서, 상기 유럽 PRRSV 단리체 GP5 뉴클레오티드 서열이 서열 15와 85％ 이상 일치하는 GP5 단백질을 코딩하는 것인 방법.
제33항에 있어서, 상기 유럽 PRRSV GP5 뉴클레오티드 서열이 서열 15인 방법.
서열 1의 기준 GP5 단백질중 34번 아스파라긴 또는 51번 아스파라긴에 상응하는 1개 이상의 N-연결 당화 부위가 불활성화된 저당화 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) GP5 폴리펩티드 변이체를 포함하는 조성물을 돼지에게 투여함으로써 PRRSV 항원에 대한 돼지의 면역 반응이 증강되도록 유도하는 것을 포함하는, PRRSV 항원에 대한 돼지의 면역 반응이 증강되도록 유도하는 방법.
서열 1의 기준 GP5 단백질중 51번 아스파라긴에 상응하는 1개 이상의 N-연결 당화 부위가 불활성화된 저당화 북미 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 치료학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
제36항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 감염성 북미 PRRSV RNA 분자를 포함하는 것인 조성물.
제36항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 감염성 북미 PRRSV RNA 분자를 코딩하는 DNA 분자를 포함하는 것인 조성물.
제36항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는, 포유동물 세포에서 활성인 프로모터가 상기 저당화 북미 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되어 있는 DNA 분자를 포함하는 것인 조성물.
제39항에 있어서, 상기 프로모터가 CMV 프로모터인 조성물.
제36항에 있어서, 상기 N-연결 당화 부위는, 상기 51번 아스파라긴을 코딩하는 코돈을 아스파라긴 이외의 아미노산을 코딩하는 코돈으로 대체함으로써 불활성화된 것인 조성물.
제41항에 있어서, 아스파라긴 이외의 아미노산을 코딩하는 상기 코돈이 알라닌 또는 글루타민 잔기를 코딩하는 것인 조성물.
제36항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는, 서열 1의 북미 기준 GP5 단백질중 34번 아스파라긴 및 51번 아스파라긴에 상응하는 상기 N-연결 당화 부위 둘 다가 불활성화된 저당화 북미 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체 단백질을 코딩하는 것인 조성물.
제43항에 있어서, 상기 N-연결 당화 부위 둘 다가, 상기 34번 아스파라긴 및 상기 51번 아스파라긴을 코딩하는 코돈을 아스파라긴 이외의 아미노산을 코딩하는 코돈으로 대체함으로써 불활성화된 것인 조성물.
제44항에 있어서, 다른 아미노산을 코딩하는 상기 코돈이 알라닌 또는 글루타민 잔기를 코딩하는 것인 조성물.
제43항에 있어서, 상기 N-연결 당화 부위중 하나는, 상기 34번 아스파라긴 또는 상기 51번 아스파라긴을 코딩하는 하나의 코돈을 아스파라긴 이외의 아미노산을 코딩하는 코돈으로 대체함으로써 불활성화된 것인 조성물.
제36항에 있어서, 상기 치료학적으로 허용가능한 담체가 단백질, 완충액, 계면활성제, 및 폴리에틸렌 글리콜 중합체, 또는 그의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제34항에 있어서, 1종 이상의 보조제를 추가로 포함하는 조성물.
제48항에 있어서, 상기 보조제가 수산화알루미늄, 퀼 A, 알루미나겔 현탁액, 광유, 글리세리드, 지방산, 지방산 부산물, 마이코박테리아, 및 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드, 또는 그의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성 물.
제48항에 있어서, 인터루킨 1 (IL-1), IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, 감마 인터페론 (g-IFN), 세포 괴사 인자, MDP (뮤라밀 디펩티드), 면역자극제 복합체 (ISCOM), 및 리포좀으로 구성된 군으로부터 선택되는 제2 보조제를 추가로 포함하는 조성물.
제36항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 백시니아 바이러스 벡터, 단순 헤르페스 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 및 TGEV 벡터로 구성된 군으로부터 선택되는 바이러스 벡터를 포함하는 것인 조성물.
서열 1의 기준 GP5 공통 단백질중 51번 아스파라긴에 상응하는 1개 이상의 N-연결 당화 부위가 불활성화된 저당화 북미 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체, 및 치료학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
서열 1의 기준 GP5 단백질중 51번 아스파라긴에 상응하는 1개 이상의 N-연결 당화 부위가 불활성화된 저당화 북미 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제53항에 있어서, 서열 1에서 34번 아스파라긴 및 51번 아스파라긴에 상응하 는 N-연결 당화 부위 둘 다가 불활성화된 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
제53항에 있어서, 감염성 북미 PRRSV RNA 분자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제53항에 있어서, 감염성 북미 PRRSV RNA 분자를 코딩하는 DNA 분자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제53항에 있어서, 포유동물 세포에서 활성인 프로모터가 상기 저당화 북미 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되어 있는 DNA 분자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제57항에 있어서, 상기 프로모터가 CMV 프로모터인 단리된 폴리뉴클레오티드.
제53항에 있어서, 51번 아스파라긴에 상응하는 상기 N-연결 당화 부위는, 상기 51번 아스파라긴을 코딩하는 코돈을 아스파라긴 이외의 아미노산을 코딩하는 코돈으로 대체함으로써 불활성화된 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
제59항에 있어서, 다른 아미노산을 코딩하는 상기 코돈이 알라닌 또는 글루 타민 잔기를 코딩하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
제53항에 있어서, 서열 1의 기준 GP5 단백질중 34번 아스파라긴에 상응하는 N-연결 당화 부위가 불활성화된 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
제61항에 있어서, 상기 34번 아스파라긴을 코딩하는 코돈을 아스파라긴 이외의 아미노산을 코딩하는 코돈으로 대체함으로써 얻어진 단리된 폴리뉴클레오티드.
제61항에 있어서, 다른 아미노산을 코딩하는 상기 코돈이 알라닌 또는 글루타민 잔기를 코딩하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
제61항에 있어서, 상기 N-연결 당화 부위중 하나는, 상기 34번 아스파라긴 또는 상기 51번 아스파라긴을 코딩하는 하나의 코돈을 아스파라긴 이외의 아미노산을 코딩하는 코돈으로 대체함으로써 불활성화된 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
제53항에 있어서, 백시니아 바이러스 벡터, 단순 헤르페스 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 및 TGEV 벡터로 구성된 군으로부터 선택되는 바이러스 벡터를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
서열 1의 기준 GP5 단백질중 51번 아스파라긴에 상응하는 1개 이상의 N-연결 당화 부위가 불활성화된 저당화 북미 PRRSV GP5 폴리펩티드 변이체인 단리된 폴리펩티드.