CN110923248A

CN110923248A - 猪繁殖与呼吸综合征病毒、疫苗及其制备方法和用途

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Publication number: CN110923248A
Application number: CN201811102079.3A
Authority: CN
Inventors: 熊炜; 孔杨; 沈元; 崔玉娟; 柴强强
Original assignee: Beijing Zhongliankang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Zhongliankang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-09-20
Filing date: 2018-09-20
Publication date: 2020-03-27
Anticipated expiration: 2038-09-20
Also published as: CN110923248B

Abstract

本发明提出了分离的核酸、分离的多肽、微生物、筛选微生物的方法、猪繁殖与呼吸综合征疫苗及其制备方法、制备抗体的方法、抗体、人工抗体、制剂在制备药物或者试剂盒中的用途和试剂在制备试剂盒中的用途。与SEQ ID NO：1相比，该分离的核酸具有选自下列的至少一种突变：c.32G>A、c.59T>G、c.89A>G、c.95G>A、c.194A>G和c.370T>G。发明人通过将JK100病毒在Marc‑145细胞和动物肺脏中交替传代，获得一种新型猪繁殖与呼吸综合征病毒，该病毒在机体内可以实现短时间诱导高水平的中和抗体和特异性的细胞免疫反应，起到较好地免疫应答效果。

Description

猪繁殖与呼吸综合征病毒、疫苗及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域。具体地，本发明涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒、疫苗及其制备方法和用途。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)俗称猪蓝耳病，在世界范围内广泛存在。PRRS于1987年在美国首次发生，分别在1991年欧洲和1992年美国分离到病原。1992年5月世界动物卫生组织将该病列为B类传染病。我国是在1996年由郭宝清首次分离到猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，目前被我国列为“二类传染病”。

PRRS在临床上表现为妊娠母猪发生流产、早产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍，仔猪和育肥猪出现呼吸道症状，并伴随生长缓慢病死率高等。但是该病可以表现为隐性感染和持续感染，同时导致猪免疫机能降低，还能跟其它多种病原微生物共同作用，造成其他相关疾病，给该病的防治造成极大困难。

PRRSV有两大显著的免疫学特征，同时也是PRRS防控中遇到的最大难题。一是抗体依赖的感染增强作用(ADE)，即低水平抗体的存在，不是提供保护，而是介导和加强感染。猪在感染PRRSV后会迅速产生抗体应答，但感染早期产生的抗体主要是非中和抗体，而低水平的中和抗体直到感染后4周左右才能检测到，这就导致了ADE作用。二是持续性感染，即猪机体内病毒的持续存在和病原污染场内感染猪群的持续性存在。PRRSV引起的持续感染，可能是通过阻碍机体内干扰素的诱导和/或通过专嗜性细胞中抗病毒蛋白活性来逃避机体的免疫。细胞免疫监视系统不易将病毒从感染猪体中清除，从而导致长期的病毒血症和持续感染的原因。

研究表明：PRRS病毒GP5蛋白是最主要的保护性抗原蛋白，能够诱导产生较高水平的中和抗体。GP5蛋白的外功能区包含一个非中和表位(A表位)和一个中和表位(B表位)，诱骗表位(decoy epitop)A表位的存在导致机体降低对中和表位B表位的免疫应答，此外B表位上及其周围的糖基化位点也降低了其免疫原性。PRRSV感染后抑制IFN-a的产生以降低风险信号的水平，诱导机体产生非中和活性的多个克隆抗体，并通过GP5蛋白上N端糖基化位点掩盖中和表位，延迟中和抗体的产生，这是病毒建立免疫逃避以及形成持续性感染的主要机制。

然而，目前能够在短时间内诱导高水平的中和抗体和特异性的细胞免疫反应的病毒仍有待开发。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

专利申请号为CN00121274.5的中国专利申请中公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒JK100。但是，其病毒效价低，以此制备成的疫苗保护效果不好，反而有引起ADE的危险。现有市售的经典株蓝耳弱毒活疫苗为VR2332株、Ch-1R株、R98株，这些疫苗也存在免疫初期中和抗体和细胞免疫产生时间晚(28天)、抗体水平达不到一定阈值的情况下、引发ADE作用等问题。

有鉴于此，发明人通过将JK100病毒在Marc-145细胞和动物肺脏中交替传代，不仅可以提高病毒的滴度，并且造成了病毒在GP5蛋白上诱骗表位和糖基化位点的改变，削弱了其对中和抗体产生的影响，诱导机体较早地产生较高效价的中和抗体，起到较好的免疫应答效果。

为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，与SEQ ID NO：1相比，所述核酸具有选自下列的至少一种突变：c.32G>A、c.59T>G、c.89A>G、c.95G>A、c.194A>G和c.370T>G。发明人通过将JK100病毒在Marc-145细胞和动物肺脏中交替传代，获得一种新型猪繁殖与呼吸综合征病毒(本发明亦称作“JK101病毒”)。与JK100病毒相比，JK101病毒的GP5基因上存在上述六个突变位点，因此造成了GP5蛋白上诱变表位和糖基化位点的改变，削弱了其对中和抗体产生的影响，诱导机体较早地产生较高效价的中和抗体，起到较好的免疫应答效果。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与SEQ IDNO：2相比，所述多肽具有选自下列的至少一种突变：p.11C>Y、p.20I>S、p.30N>S、p.32S>N、p.65E>G和p.124F>V。发明人通过将JK100病毒在Marc-145细胞和动物肺脏中交替传代，获得的JK101病毒与JK100病毒相比，GP5基因编码的多肽上存在上述六个突变位点，因此造成了GP5蛋白上诱变表位和糖基化位点的改变，削弱了其对中和抗体产生的影响，诱导机体较早地产生较高效价的中和抗体，起到较好的免疫应答效果。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种微生物。根据本发明的实施例，所述微生物具有前面所述的分离的核酸和/或前面所述的分离的多肽。发明人通过将JK100病毒在Marc-145细胞和动物肺脏中交替传代，获得一种微生物—JK101病毒，该病毒与JK100病毒相比，GP5基因上产生突变，且由该基因编码的多肽也产生突变，造成了GP5蛋白上诱变表位和糖基化位点的改变，削弱了其对中和抗体产生的影响，诱导机体较早地产生较高效价的中和抗体，起到较好的免疫应答效果。

根据本发明的实施例，所述微生物为病毒，于2018年07月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15472。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种筛选微生物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：使候选微生物在Marc-145细胞与动物肺脏内交替传代，以便得到传代后的微生物；对所述传代后的微生物进行特定基因序列分析及所述特定基因编码的氨基酸序列分析，其中，与SEQ ID NO：1相比，所述特定基因序列具有选自下列的至少一种突变：c.32G>A、c.59T>G、c.89A>G、c.95G>A、c.194A>G和c.370T>G；和/或与SEQ ID NO：2相比，所述氨基酸序列具有选自下列的至少一种突变：p.11C>Y、p.20I>S、p.30N>S、p.32S>N、p.65E>G和p.124F>V是所述候选微生物作为目标微生物的指示。由此，利用本发明的方法能够筛选出可以获得具有上述基因和多肽突变的猪繁殖与呼吸综合征病毒的初始病毒(即目标微生物)，并且该方法操作简便，适于规模化应用。

根据本发明的实施例，所述传代后的微生物为前面所述的微生物。

根据本发明的实施例，所述交替传代是采用下述方式进行的：动物肺脏内传代3次，Marc-145细胞内传代4次，动物肺脏内传代5次，Marc-145细胞内传代3次，动物肺脏内传代7次，Marc-145细胞内传代2次，动物肺脏内传代7次，Marc-145细胞内传代1次，动物肺脏内传代9次，Marc-145细胞内传代1次。

根据本发明的实施例，在进行所述交替传代之前，将所述候选微生物进行如下处理：将所述候选微生物在Marc-145细胞中传代10～20代，以便得到增殖的微生物；将所述增殖的微生物注入动物体内，3～6天后收集动物肺脏中的所述候选微生物，制成悬液；将所述悬液在Marc-145细胞中传代3～6代，以便获得待交替传代的微生物。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种猪繁殖与呼吸综合征疫苗。根据本发明的实施例，所述猪繁殖与呼吸综合征疫苗包括下列的至少之一：前面所述的分离的核酸、分离的多肽和微生物。本发明的疫苗施用于机体后，能够在较短的时间内诱导高水平的中和抗体和特异性的细胞免疫反应，下一次在PRRSV感染后产生的中和抗体和特异性的细胞免疫反应能够有效地清除病毒，具有较好的免疫效果。

根据本发明的实施例，所述猪繁殖与呼吸综合征疫苗进一步包括免疫增强剂，所述免疫增强剂包括下列的至少之一：聚肌苷酸-聚胞苷酸：25μg/头份；CTL表位多肽：50μg/头份；和CpG寡脱氧核苷酸：25μg/头份。

根据本发明的实施例，所述猪繁殖与呼吸综合征疫苗进一步包括：冻干保护剂，所述冻干保护剂包括下列的至少之一：1.2重量份的明胶；2重量份的蔗糖；4重量份的海藻糖；4重量份的大豆蛋白胨；1重量份的聚乙烯吡咯酮；1重量份的甘露醇；1重量份的谷氨酸；和1重量份的精氨酸。

根据本发明的实施例，所述微生物是以溶液形式提供的，所述微生物含量不低于10^7.5TCID₅₀/mL/头份。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备前面所述猪繁殖与呼吸综合征疫苗的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将所述免疫增强剂、冻干保护剂以及核酸、多肽或者微生物进行混合处理，以便得到混合液；以及将所述混合液进行冻干处理，以便得到所述猪繁殖与呼吸综合征疫苗。由此，利用本发明的方法能够得到效价高且稳定性强的疫苗，并且该方法操作简便，适于规模化应用。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备抗体的方法，所述抗体针对猪繁殖与呼吸综合征。根据本发明的实施例，所述方法包括：使动物接触下列的至少之一：前面所述的分离的核酸、分离的多肽和微生物和从接触后的所述微生物的血液中分离所述抗体。由此，利用本发明的方法能够在短时间内诱导产生高水平的抗体，从而可以起到较好的免疫应答效果。并且，该方法操作简便，适于规模化应用。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种抗体。根据本发明的实施例，所述抗体是通过前面所述制备抗体的方法制备的。由此，本发明的抗体具有较好的特异性识别PRRSV病毒，从而产生特异性的细胞免疫反应，起到清除PRRSV病毒的效果。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种人工抗体。根据本发明的实施例，该人工抗体与前面所述抗体具有相同的抗原决定簇。由此，本发明的人工抗体具有较好的特异性识别PRRSV病毒，从而产生特异性的细胞免疫反应，起到清除PRRSV病毒的效果。

在本发明的又一方面，本发明提出了制剂在制备药物或者试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗猪繁殖与呼吸综合征，所述试剂盒用于诊断猪繁殖与呼吸综合征，所述制剂中含有下列的至少之一：前面所述的分离的核酸、分离的多肽、微生物、猪繁殖与呼吸综合征疫苗、抗体或人工抗体。利用本发明的药物可以在短时间内诱导机体产生高水平的中和抗体和特异性的细胞免疫反应，起到较好的免疫应答效果。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的不同培养时间病毒的电镜图，其中A为对照(0％细胞病变)，B为30h(25％细胞病变)，C为48h(50％细胞病变),D为60h(75％细胞病变)；

图2显示了根据本发明一个实施例的电泳图；以及

图3显示了根据本发明一个实施例的CTL杀伤率的分析示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明提出了分离的核酸、分离的多肽、微生物、筛选微生物的方法、猪繁殖与呼吸综合征疫苗及其制备方法、制备抗体的方法、抗体、人工抗体、制剂在制备药物或者试剂盒中的用途，下面将分别对其进行详细描述。

分离的核酸

在本发明的一个方面，本发明提出了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，与SEQ IDNO：1相比，该核酸具有选自下列的至少一种突变：c.32G>A、c.59T>G、c.89A>G、c.95G>A、c.194A>G和c.370T>G。发明人通过将JK100病毒在Marc-145细胞和动物肺脏中交替传代，获得一种新型猪繁殖与呼吸综合征病毒(本发明亦称作“JK101病毒”)。与JK100病毒相比，JK101病毒的GP5基因上存在上述六个突变位点，因此造成了GP5蛋白上诱变表位和糖基化位点的改变，削弱了其对中和抗体产生的影响，诱导机体较早地产生较高效价的中和抗体，起到较好的免疫应答效果。

需要说明的是，SEQ ID NO：1为JK100病毒中编码GP5蛋白的基因序列，具体核苷酸序列如下所示：

分离的多肽

在本发明的又一方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与SEQ IDNO：2相比，该多肽具有选自下列的至少一种突变：p.11C>Y、p.20I>S、p.30N>S、p.32S>N、p.65E>G和p.124F>V。发明人通过将JK100病毒在Marc-145细胞和动物肺脏中交替传代，获得的JK101病毒与JK100病毒相比，GP5基因编码的多肽上存在上述六个突变位点，因此造成了GP5蛋白上诱变表位和糖基化位点的改变，削弱了其对中和抗体产生的影响，诱导机体较早地产生较高效价的中和抗体，起到较好的免疫应答效果。

需要说明的是，SEQ ID NO：2为JK100病毒中编码GP5蛋白的多肽序列，具体氨基酸序列如下所示：

微生物

根据本发明的实施例，该微生物为病毒，于2018年07月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15472。

筛选微生物的方法

在本发明的又一方面，本发明提出了一种筛选微生物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：使候选微生物在Marc-145细胞与动物肺脏内交替传代，以便得到传代后的微生物；对传代后的微生物进行特定基因序列分析及特定基因编码的氨基酸序列分析，其中，与SEQ ID NO：1相比，特定基因序列具有选自下列的至少一种突变：c.32G>A、c.59T>G、c.89A>G、c.95G>A、c.194A>G和c.370T>G；和/或与SEQ ID NO：2相比，所述氨基酸序列具有选自下列的至少一种突变：p.11C>Y、p.20I>S、p.30N>S、p.32S>N、p.65E>G和p.124F>V是候选微生物作为目标微生物的指示。

需要说明的是，本发明所描述的“特定基因”即为GP5基因。发明人通过使候选微生物在Marc-145细胞与动物肺脏内交替传代，若传代后的微生物中GP5基因或者GP5基因编码的多肽存在上述突变，则该候选微生物即为所需的目标微生物。由此，利用本发明的方法能够筛选出可以获得具有上述基因和多肽突变的猪繁殖与呼吸综合征病毒的初始病毒(即目标微生物)，并且该方法操作简便，适于规模化应用。

根据本发明的实施例，传代后的微生物为前面所述的微生物。发明人发现，若经过交替传代后获得JK101病毒，则该候选微生物即为所需的目标微生物，例如JK100病毒。

需要说明的是，本发明对于动物的种类不作严格限定，可以根据实际情况灵活选择，例如鼠、兔、猪、狗等。

根据本发明的实施例，交替传代是采用下述方式进行的：动物肺脏内传代3次，Marc-145细胞内传代4次，动物肺脏内传代5次，Marc-145细胞内传代3次，动物肺脏内传代7次，Marc-145细胞内传代2次，动物肺脏内传代7次，Marc-145细胞内传代1次，动物肺脏内传代9次，Marc-145细胞内传代1次。发明人经过大量实验得到上述较优交替传代方式，由此，准确筛选出能够获得具有上述基因和多肽突变的猪繁殖与呼吸综合征病毒的初始病毒(即目标微生物)，并且该方法操作简便，适于规模化应用。

根据本发明的实施例，在进行交替传代之前，将候选微生物进行如下处理：

(1)将候选微生物在Marc-145细胞中传代10～20代，以便得到增殖的微生物。由此，使得候选微生物增殖富集，并且具有一定的滴度。

根据本发明的具体实施例，传代次数为18代，由此所得到的增殖微生物(病毒)的滴度不低于10⁷TCID₅₀/mL/头份。通过多次传代，达到病毒富集的目的，以便提高病毒量，有利于感染吸附动物肺脏。

(2)将增殖的微生物注入动物体内，3～6天后收集动物肺脏中的候选微生物，制成悬液。由此，以便提高候选微生物在动物肺脏的吸附能力。

(3)将悬液在Marc-145细胞中传代3～6代，以便获得待交替传代的微生物。由此，使得微生物既可以适应动物肺脏中的培养环境，也可以适应细胞中的培养环境，同时达到富集的目的。

开始阶段微生物虽然可以吸附在动物组织中，但繁殖传代能力是十分弱的，需要选定具有这方面能力的病毒到体外其适合的细胞系中进行培养富集，再回传到动物体内吸附繁殖，如此往复使毒株逐渐适应体内和体外两种培养方式，从而选育得到既适应动物组织又适应体外培养细胞的病毒株。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对分离的核酸、分离的多肽和微生物所描述的特征和优点，同样适用于该筛选微生物的方法，在此不再赘述。

猪繁殖与呼吸综合征疫苗

在本发明的又一方面，本发明提出了一种猪繁殖与呼吸综合征疫苗。根据本发明的实施例，该猪繁殖与呼吸综合征疫苗包括下列的至少之一：前面所述的分离的核酸、分离的多肽和微生物。本发明的疫苗施用于机体后，能够在较短的时间内诱导高水平的中和抗体和特异性的细胞免疫反应，下一次在PRRSV感染后产生的中和抗体和特异性的细胞免疫反应能够有效地清除病毒，具有较好的免疫效果。

根据本发明的实施例，猪繁殖与呼吸综合征疫苗进一步包括免疫增强剂，免疫增强剂包括下列的至少之一：聚肌苷酸-聚胞苷酸(本发明亦称Poly(I:C))：25μg/头份；CTL表位多肽：50μg/头份；和CpG寡脱氧核苷酸(本发明亦称CPG ODN)：25μg/头份。发明人经过大量实验得到上述较优的免疫增强剂组成，由此能够进一步使得机体在短时间内诱导高水平的中和抗体和特异性的细胞反应。

根据本发明的具体实施例，CTL表位多肽具有如下所示的氨基酸序列：TMPPGFELY(SEQ ID NO：3)

根据本发明的具体实施例，CPG ODN具有如下所示的核苷酸序列：5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’(SEQ ID NO：4)

根据本发明的实施例，猪繁殖与呼吸综合征疫苗进一步包括：冻干保护剂，所述冻干保护剂包括下列的至少之一：1.2重量份的明胶；2重量份的蔗糖；4重量份的海藻糖；4重量份的大豆蛋白胨；1重量份的聚乙烯吡咯酮；1重量份的甘露醇；1重量份的谷氨酸；和1重量份的精氨酸。发明人经过大量实验得到上述较优冻干保护剂的组成，由此，以便降低微生物在冻干过程对于结构、活性的破坏，使得疫苗中微生物仍保持较高的活性，从而提高免疫效果。

根据本发明的实施例，微生物是以溶液形式提供的，微生物含量不低于10^7.5TCID₅₀/mL/头份。由此，使得疫苗中微生物具有较高的活性，并且可以使机体在短时间内诱导高水平的中和抗体和特异性的细胞反应。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对分离的核酸、分离的多肽和微生物所描述的特征和优点，同样适用于该猪繁殖与呼吸综合征疫苗，在此不再赘述。

制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗的方法

在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备前面所述猪繁殖与呼吸综合征疫苗的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将免疫增强剂、冻干保护剂以及核酸、多肽或者微生物进行混合处理，以便得到混合液；以及将混合液进行冻干处理，以便得到猪繁殖与呼吸综合征疫苗。由此，利用本发明的方法能够得到效价高且稳定性强的疫苗，并且该方法操作简便，适于规模化应用。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对猪繁殖与呼吸综合征疫苗所描述的特征和优点，同样适用于该制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗的方法，在此不再赘述。

制备抗体的方法

在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备抗体的方法，抗体针对猪繁殖与呼吸综合征。根据本发明的实施例，该方法包括：使动物接触下列的至少之一：前面所述的分离的核酸、分离的多肽和微生物和从接触后的所述微生物的血液中分离所述抗体。由此，利用本发明的方法能够在短时间内诱导产生高水平的抗体，从而可以起到较好的免疫应答效果。并且，该方法操作简便，适于规模化应用。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对分离的核酸、分离的多肽和微生物所描述的特征和优点，同样适用于该制备抗体的方法，在此不再赘述。

抗体

在本发明的又一方面，本发明提出了一种抗体。根据本发明的实施例，该抗体是通过前面所述制备抗体的方法制备的。由此，本发明的抗体具有较好的特异性识别PRRSV病毒，从而产生特异性的细胞免疫反应，起到清除PRRSV病毒的效果。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对制备抗体的方法所描述的特征和优点，同样适用于该抗体，在此不再赘述。

人工抗体

本领域技术人员能够理解的是，前面针对抗体所描述的特征和优点，同样适用于该人工抗体，在此不再赘述。

制剂在制备药物或试剂盒中的用途

在本发明的又一方面，本发明提出了制剂在制备药物或试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，该药物用于治疗猪繁殖与呼吸综合征，所述试剂盒用于诊断猪繁殖与呼吸综合征，该制剂中含有下列的至少之一：前面所述的分离的核酸、分离的多肽、微生物、猪繁殖与呼吸综合征疫苗、抗体或人工抗体。利用本发明的药物可以在短时间内诱导机体产生高水平的中和抗体和特异性的细胞免疫反应，起到较好的免疫应答效果，从而有效地治疗猪繁殖与呼吸综合征。而且，若机体患有猪繁殖与呼吸综合征，那么上述制剂能够在机体内产生特异性免疫反应，通过对该免疫反应进行免疫学检测，以便准确地判断出机体是否患有猪繁殖与呼吸综合征，达到准确诊断的目的。

本发明所使用的术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病(例如预防猪繁殖与呼吸综合征)或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将本文所述药物给予有需要的个体。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对分离的核酸、分离的多肽和微生物所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

1、JK100增殖培养和浓缩，确定注射小鼠的剂量和毒价(TCID₅₀)

选择形态正常的Marc-145细胞，待细胞形成单层即70％-80％时，弃去旧营养液，用PBS液将细胞表面轻柔的洗一遍，将PRRSV JK100病毒接种单层的Marc-145细胞，置于CO₂培养箱内37℃吸附1h，弃去上清，加入适量的2％DMEM维持液，37℃继续培养2-4d，每日镜检观察(图1)，当细胞出现70％-80％以上病变时，收获病毒悬液，-80℃连续3次冻融并合并，8000r/min离心15min，去除细胞碎片，收集上清的病毒液，放置-80℃保存。按照相同方法继续传代培养10-20代，用Reed-Muench法对不同细胞代次培养毒测定TCID₅₀，培养至18代，病毒滴度已经高于10⁷TCID₅₀/ml。

2、小鼠肺脏器官病毒附着适应，PCR检测病毒附着量，收获病毒

选取步骤1中培养至20代的PRRSV JK100病毒，小鼠尾静脉注射病毒液0.1ml。小鼠攻毒后第4天(1-6天每天提取肺脏组织RNA进行PCR检测，根据检测第4天病毒附着量达到最高，参见图2)处死小鼠，完整剥离小鼠肺脏，置于灭菌组织研磨器内，在无菌条件下PBS溶液研磨肺脏制成病毒悬液。

3、PRRSV病毒对Marc-145细胞的适应培养。

病毒悬液4℃下2000r/min离心20min，取上清接种单层Marc-145细胞扩增病毒，CO₂培养箱内37℃吸附1h，弃去上清，加入适量的2％DMEM维持液，37℃继续培养3-5d，每日镜检观察，当细胞出现70％-80％以上病变时，收获病毒悬液，-80℃连续3次冻融并合并，5000r/min离心10min，去除细胞碎片，收集上清的病毒液。按照相同方法继续传代培养5代，检测病毒TCID₅₀。选取培养至5代的细胞适应病毒，小鼠尾静脉注射病毒液0.1ml。

4、病毒在小鼠肺脏器官和体外Marc-145细胞上交替培养适应，收获病毒

小鼠攻毒后第4天，处死小鼠，完整剥离小鼠肺脏，置于灭菌组织研磨器内，在无菌条件下PBS溶液研磨肺脏制成病毒悬液。将制成的病毒悬液小鼠尾静脉注射0.1ml，按照相同方法在小鼠体内攻毒吸附传代3代。收集小鼠适应病毒悬液，在Marc-145上进行细胞培养4代，收集细胞适应病毒，小鼠尾静脉注射0.1ml。如此反复，病毒在小鼠肺脏器官和体外Marc-145细胞上经过4轮交替培养适应，逐渐增大小鼠体内传代次数，减少细胞传代次数。最后将交替传代5轮后的病毒液在Marc-145细胞传代培养至病毒滴度高于10^7.5TCID₅₀/mL，收集病毒液。将最后收集的病毒命名为JK101。

5、病毒的单克隆纯化、筛选和保存建株

步骤4得到的滴度高于10^7.5TCID₅₀/ml的病毒液，在Marc-145细胞上进行病毒空斑纯化：将JK101做10^-1-10^-5系列梯度稀释接种于6孔板单层Marc-145细胞，每个稀释度做两孔，每孔接种0.2ml，同时设立不接毒的空白对照，轻轻摇匀，置于37℃，5％CO₂培养箱中吸附2小时，取出6孔板，弃残液，每孔加入40-50℃琼脂糖和维持液(1：1)的混合液4ml，冷却凝固形成第一层覆盖物，培养板倒置，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养48h，48h后每空加入含有中性红的40-50℃琼脂糖和维持液(1：1)的混合液4ml，冷却凝固形成第二层覆盖物，置于37℃，5％CO₂培养箱培养1天。挑出在细胞上形成的明显可见的单个病毒空斑，共挑选若干(≥10)空斑克隆，分别转移到单层Marc-145细胞，置于37℃，5％CO₂培养箱培养7天传一代，待细胞出现明显病变时收集病毒，经3次冻融处理后，8000r/min 4℃离心15min，取上清，45000r/min离心2h，用原体积1/20的TE缓冲液(10mMTris-HCl pH8.0，1.0mM EDTA)稀释沉淀，置于-20℃保存备用。

6、克隆株的筛选

6.1、Marc-145传代的稳定性

步骤5得到的若干克隆株，Marc-145细胞传代20代，每代或者每隔四代进行基因测序，进行基因序列分析和蛋白氨基酸分析，确定遗传稳定性。

6.2、阳性血清中和测定

将测好TCID₅₀的病毒悬液稀释成100TCID₅₀，阳性血清样品均经过紫外灯(254nm)处理照射45min后，再经过56℃水浴灭活30min，将所有阳性血清样品用不含血清的DMEM进行2倍倍比稀释后(1:2～1:128)(按100μL/孔)，在上述各孔内加入相同体积稀释好的病毒液，混匀，37℃孵育1h后，再将血清-病毒混合液按一式两份加到含有Marc-145细胞单层的96孔微量培养板上。37℃、5％CO₂条件下培养4d～5d，观察细胞病变，测定病毒克隆株与阳性血清抗体的中和能力。

7、基因序列信息，所具特点的分子基础，关键氨基酸的变化

经步骤6筛选出稳定性好、中和抗体结合能力强的克隆株JK101。

表1 GP5主要基因突变情况，引起的氨基酸改变

经过序列分析，和原始毒株JK100相比，在GP5上一共发现了6处的突变，其中N30和S32上的两处突变对蛋白性质改变有重大的作用，第30位氨基酸天冬酰胺(N)即在诱骗表位(A表位)之中(²⁷A/VLVN³⁰)，又属于GP5上四个糖基化位点其中之一(30，33，44，51)，N30的突变引起了糖基化的去除，同时介于诱骗表位A表位和中和表位B表位(³⁷SHLQLIYNL⁴⁵)S32的突变，可能导致蛋白构象的改变，有利于中和表位的暴露，使得中和抗体较早较高水平的表达。同时N30这个位点又处在诱骗表位中，其突变也可能抑制了诱骗表位的折叠和暴露，阻止了机体对它的免疫应答，减少了前期非中和抗体的产生。这种改变使得JK101成为了PRRSV潜在的疫苗候选株。

8、免疫增强剂的配制

免疫增强剂成分：

Poly(I:C)：25μg/头份

CTL表位多肽(TMPPGFELY)：50μg/头份

CpG ODN(5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’)：25μg/头份

使用PBS定容到目标剂量，室温下混合孵育15min。

9、疫苗的制备

9.1、制备冻干保护剂：蒸馏水中按照比例加入明胶1.2质量％、蔗糖2质量％、海藻糖4质量％、大豆蛋白胨4质量％、聚乙烯吡咯酮(PVP)1质量％、甘露醇1质量％、谷氨酸1质量％和精氨酸1质量％，充分溶解后，于高压蒸汽灭菌30min，冷却后备用。

9.2、经过步骤6的遗传稳定性和中和抗体检测筛选出克隆株JK101作为疫苗制备备选毒株，先将免疫增强剂添加入病毒液(病毒含量应≥10^7.5TCID₅₀/ml/每头份)中，混匀，再将含有免疫增强剂的病毒液与冻干保护剂等体积混合，定量分装后加盖，置于冻干机内进行冷冻真空冻干。免疫注射前，将病毒冻干粉用PBS溶解，混匀使用。

10、选育毒株在疫苗研发中的应用，与JK100和市售经典毒株的对比

10.1、体液免疫应答测定：中和抗体滴度检测

4周龄PRRS抗体阴性的健康仔猪，分为5组，每组5只，第一组为健康对照组，第二组为免疫增强剂对照组(PBS与免疫增强剂混匀，无病毒冻干粉)，第三组为JK101免疫组(JK101病毒冻干粉)，第四组为JK100免疫组(JK100病毒冻干粉)，第五组为市售勃林格VR2332疫苗产品。每头猪接种1ml。疫苗接种后每周采血监测其中和抗体水平。

病毒中和试验(间接免疫荧光法)：

a.所用血清样品均经过紫外灯(254nm)处理照射45min后，再经过56℃水浴灭活30min；

b.所有被检样品用不含血清的DMEM进行2倍倍比稀释后(1:2～1:128)(按100μL/孔)，与相同体积含100TCID50的PRRSV混合(VR2332,MN184,or ATP任选一种)于37℃作用1h；

c.取100μL的混合液，按一式两份加到含有Marc-145细胞单层的96孔微量培养板上。孵育1h后，每孔再加入100μL含2％马血清、HEPES和混合抗生素的DMEM，然后将培养板置于37℃的CO₂培养箱中培养48h；

d.将培养板中的细胞用80％丙酮在室温下固定10min，风干；

e.试验孔加入抗PRRSV核衣壳蛋白特异性单抗SDOW17(1:5000)，37℃孵育2h；

f.洗板后每孔加入Alexa Fluor 488标记的羊抗鼠IgG(H+L)(1:3000)，反应1h；

g.洗板后每孔加入60％甘油，避光保存；

h.用荧光显微镜观察结果。以能够抑制90％以上荧光的稀释倍数作为该样品的病毒中和抗体滴度。

表2中和抗体滴度统计

已有报道，猪血清中PRRSV中和抗体滴度与保护性之间的关系，当中和抗体滴度达到1：16时可以保护母猪，防止产生繁殖障碍，并阻止胎盘感染；当中和抗体滴度≥1：8时，可以保护仔猪，防止病毒血症；而当中和抗体滴度达到1：32时，能够完全消除病毒。从这些研究中说明，中和抗体滴度大于等于16时可以保护猪免受PRRSV感染。

本实验中，JK101毒株制备而成的疫苗，普遍在第三周(21天)中和抗体水平达到1：16，相较JK100和VR2332能够较快的将中和抗体滴度提高至保护猪免受感染的水平，并且在其后达到并维持1：32的中和抗体滴度峰值水平。

10.2、细胞免疫应答：特异性CTL测定(乳酸脱氢酶释放法)

步骤(10.1.)5组疫苗分别免疫后6周。使用乳酸脱氢酶法测定特异性CTL：将效应细胞与靶细胞以100：1的比例各100μl混合于96孔培养板中37℃、5％CO₂，孵育4h。每孔分别吸出100ul上清至ELISA板中，再加入100μl预先配好的底物溶液，室温避光显色30min。最后每孔加入30μl终止液，于570nm波长下测定OD值。同时设立自发释放孔(营养液孔)和最大释放孔(裂解液孔)。计算CTL杀伤率，杀伤率％＝(实验孔OD值-自发释放孔OD值)/(最大释放孔OD值-自发释放孔OD值)×100％。

为了对比选育毒株制备疫苗、JK100和市售经典毒株的免疫效果。主要做了两方面的实验内容，一是从中和抗体滴度水平上，二是刺激细胞免疫应答水平。

结果如图3所示，从中和抗体监测数据来看，经过小鼠和Marc-145交替传代培育的毒株JK101制备而成的弱毒疫苗，与JK100毒株相比，中和抗体滴度水平高；与市售勃林格VR2332相比，虽然中和抗体滴度水平差不多，但是较为早期地出现了高水平的中和抗体，这就为一定程度解决ADE现象提供了可能。并且，加入的细胞免疫增强剂也在一定程度上刺激了细胞免疫，整体提高了疫苗免疫效果。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京中联康生物科技股份有限公司

<120> 猪繁殖与呼吸综合征病毒、疫苗及其制备方法和用途

<130> PIDC3183331

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 603

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1

<400> 1

atgttggaga aatgcttgac cgcgggctgt tgctcgcaat tgctttcttt gtggtgtatc 60

gtgccgttct gttttgctgt gctcgccaac gccagcaacg acagcagctc ccatctacag 120

ctgatttaca acttgacgct atgtgagctg aatggcacag attggctagc taacaaattt 180

gattgggcag tggagagttt tgtcatcttt cccgttttga ctcacattgt ctcctatggt 240

gccctcacta ctagccattt ccttgacaca gtcgctttag tcactgtgtc taccgccggg 300

tttgttcacg ggcggtatgt cctaagtagc atctacgcgg tctgtgccct ggctgcgttg 360

acttgcttct tcattaggtt tgcaaagaat tgcatgtcct ggcgctacgc gtgtaccaga 420

tataccaact ttcttctgga cactaagggc ggactctatc gttggcggtc gcctgtcatc 480

atagagaaaa ggggcaaagt tgaggtcgaa ggtcatctga tcaacctcaa aagagttgtg 540

cttgatggtt ccgtggcaac ccctataacc agagtttcag cggaacaatg gggtcgtcct 600

tag 603

<210> 2

<211> 200

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 2

<400> 2

Met Leu Glu Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gln Leu Leu Ser

1 5 10 15

Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Val Leu Ala Asn Ala Ser

20 25 30

Asn Asp Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys

35 40 45

Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asn Lys Phe Asp Trp Ala Val

50 55 60

Glu Ser Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly

65 70 75 80

Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Ala Leu Val Thr Val

85 90 95

Ser Thr Ala Gly Phe Val His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr

100 105 110

Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Thr Cys Phe Phe Ile Arg Phe Ala

115 120 125

Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ala Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe

130 135 140

Leu Leu Asp Thr Lys Gly Gly Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile

145 150 155 160

Ile Glu Lys Arg Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asn Leu

165 170 175

Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Val Ala Thr Pro Ile Thr Arg Val

180 185 190

Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Pro

195 200

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 3

<400> 3

Thr Met Pro Pro Gly Phe Glu Leu Tyr

1 5

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 4

<400> 4

Thr Cys Cys Ala Thr Gly Ala Cys Gly Thr Thr Cys Cys Thr Gly Ala

1 5 10 15

Cys Gly Thr Thr

20

Claims

1.一种分离的核酸，其特征在于，与SEQ ID NO：1相比，所述核酸具有选自下列的至少一种突变：c.32G>A、c.59T>G、c.89A>G、c.95G>A、c.194A>G和c.370T>G。

2.一种分离的多肽，其特征在于，与SEQ ID NO：2相比，所述多肽具有选自下列的至少一种突变：p.11C>Y、p.20I>S、p.30N>S、p.32S>N、p.65E>G和p.124F>V。

3.一种微生物，其特征在于，所述微生物具有权利要求1所述的分离的核酸和/或权利要求2所述的分离的多肽；

任选地，所述微生物为病毒，于2018年07月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15472。

4.一种筛选微生物的方法，其特征在于，包括：

使候选微生物在Marc-145细胞与动物肺脏内交替传代，以便得到传代后的微生物；

对所述传代后的微生物进行特定基因序列分析及所述特定基因编码的氨基酸序列分析，

其中，与SEQ ID NO：1相比，所述特定基因序列具有选自下列的至少一种突变：c.32G>A、c.59T>G、c.89A>G、c.95G>A、c.194A>G和c.370T>G；和/或

与SEQ ID NO：2相比，所述氨基酸序列具有选自下列的至少一种突变：p.11C>Y、p.20I>S、p.30N>S、p.32S>N、p.65E>G和p.124F>V是所述候选微生物作为目标微生物的指示；

任选地，所述传代后的微生物为权利要求3所述的微生物；

任选地，所述交替传代是采用下述方式进行的：

动物肺脏内传代3次，Marc-145细胞内传代4次，动物肺脏内传代5次，Marc-145细胞内传代3次，动物肺脏内传代7次，Marc-145细胞内传代2次，动物肺脏内传代7次，Marc-145细胞内传代1次，动物肺脏内传代9次，Marc-145细胞内传代1次；

任选地，在进行所述交替传代之前，将所述候选微生物进行如下处理：

将所述候选微生物在Marc-145细胞中传代10～20代，以便得到增殖的微生物；

将所述增殖的微生物注入动物体内，3～6天后收集动物肺脏中的所述候选微生物，制成悬液；

将所述悬液在Marc-145细胞中传代3～6代，以便获得待交替传代的微生物。

5.一种猪繁殖与呼吸综合征疫苗，其特征在于，包括下列的至少之一：

权利要求1所述的分离的核酸；

权利要求2所述的分离的多肽；和

权利要求3所述的微生物；

任选地，进一步包括免疫增强剂，所述免疫增强剂包括下列的至少之一：

聚肌苷酸-聚胞苷酸：25μg/头份；

CTL表位多肽：50μg/头份；和

CpG寡脱氧核苷酸：25μg/头份；

任选地，进一步包括：冻干保护剂，所述冻干保护剂包括下列的至少之一：

1.2重量份的明胶；

2重量份的蔗糖；

4重量份的海藻糖；

4重量份的大豆蛋白胨；

1重量份的聚乙烯吡咯酮；

1重量份的甘露醇；

1重量份的谷氨酸；和

1重量份的精氨酸；

任选地，所述微生物是以溶液形式提供的，所述微生物含量不低于10^7.5TCID₅₀/mL/头份。

6.一种制备权利要求5所述猪繁殖与呼吸综合征疫苗的方法，其特征在于，包括：

将所述免疫增强剂、冻干保护剂以及核酸、多肽或者微生物进行混合处理，以便得到混合液；以及

将所述混合液进行冻干处理，以便得到所述猪繁殖与呼吸综合征疫苗。

7.一种制备抗体的方法，所述抗体针对猪繁殖与呼吸综合征，其特征在于，包括：

使动物接触下列的至少之一：权利要求1所述的分离的核酸、权利要求2所述的分离的多肽和权利要求3所述的微生物；

从接触后的所述微生物的血液中分离所述抗体。

8.一种抗体，其特征在于，所述抗体是通过权利要求7所述方法制备的。

9.一种人工抗体，其特征在于，所述人工抗体与权利要求8所述抗体具有相同的抗原决定簇。

10.制剂在制备药物或者试剂盒中的用途，其特征在于，所述药物用于治疗猪繁殖与呼吸综合征，所述试剂盒用于诊断猪繁殖与呼吸综合征，所述制剂中含有下列的至少之一：

权利要求1所述的分离的核酸；

权利要求2所述的分离的多肽；

权利要求3所述的微生物；

权利要求5所述猪繁殖与呼吸综合征疫苗；

权利要求8所述的抗体或权利要求9所述的人工抗体。