CN1489472A - 改良型猪肺炎支原体菌苗疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供改良猪肺炎支原体(Myccoplasmahyopneumoniae)菌苗疫苗组合物，所述疫苗组合物在单剂给予后有利地提供针对感染的免疫。所述组合物包含灭活猪肺炎支原体菌苗和佐剂混合物，所述疫苗在单剂给予后提供对抗猪肺炎支原体感染的免疫，引发特异性针对猪肺炎支原体菌苗的免疫反应，其中包括细胞介导的免疫和局部(分泌性IgA)免疫。在优选实施方案中，所述佐剂混合物包含丙烯酸聚合物(最优选Carbopol)以及可代谢油(如一种或多种不饱和萜烯烃，优选角鲨烯或角鲨烷)和聚氧乙烯－聚丙烯嵌段共聚物(如Pluronic)的混合物。所述疫苗组合物可以可选地包括防腐剂，优选硫柳汞和/或EDTA。

Description

改良型猪肺炎支原体菌苗疫苗
                    发明领域
本申请要求2000年12月19日申请的共同未决临时申请序号60/256,637的优先权，所述临时申请的完整公开内容特此通过引用结合到本文中。
本发明涉及诱导针对猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)的保护性免疫的改良方法，具体地说，在一个剂量内使用有效免疫接受动物对抗猪肺炎支原体感染的灭活猪肺炎支原体菌苗。
                    发明背景
猪肺炎支原体是猪支原体肺炎的病原体。该疾病导致重量增量降低和喂养效率降低，是养猪业经济损失的重要原因。该疾病导致持续几周的持续性咳嗽、被毛失去光泽、生长迟缓和外观不壮实。在感染动物尤其是在腹顶端和心叶观察到特征性病变紫色到灰色实变区。虽然该疾病的死亡率低，但受感染的猪常常易于受到机会病原体的二次感染，从而导致死亡或应激。每年的经济损失估计在2亿到2.5亿美元之间。
猪肺炎支原体是生长缓慢、没有细胞壁、难培养的细菌。由于呼吸道内还存在一种常见的第二种病原体猪鼻支原体(Myoplasmahyorhinis)，因此常常难以从呼吸道中分离猪肺炎支原体。该疾病通过咳嗽产生的飞沫以及与感染或恢复期的病原携带猪直接接触而传播。感染动物和未感染动物混居导致早期和频繁的再感染。感染通常开始于携带病原的母猪下仔时感染小猪。由于猪群集中管理技术的影响，感染在生命后期用才变得明显。当断乳后把猪集中起来时，通常发生其它感染。在六周龄或更大的猪常常观察到明显的疾病。感染猪的生长率和饲料转化率显著降低。使用抗生素治疗昂贵并且需要长期使用。再感染也是一个问题。目前疫苗是避免感染及其影响的最有效方法。
Fort Dodge Animal Health(FDAH)销售猪肺炎支原体菌苗，名为SuvaxynRespifendMH，用作保护健康的猪对抗猪肺炎支原体引起的临床体征的疫苗。该疫苗含有佐剂Carbopol，推荐作为两剂疫苗用于至少一周龄大的猪，在第一次免疫后两到三周给予第二剂。然而，两剂量疫苗有明显的缺陷，即为了提供对抗疾病的完全保护，需要第二次处理动物。
因此，本发明的一个目标是提供对抗猪肺炎支原体的有效疫苗，该疫苗通过单剂量给予，引发保护性免疫，预防其引起的疾病。
本发明的另一个目标是提供适用于猪的对抗猪肺炎支原体所引起的感染和疾病的疫苗组合物，所述疫苗组合物可以与其它菌苗和/或类毒素联合使用。
本发明的再一个目标是提供预防或缓解其致病微生物是猪肺炎支原体的疾病的方法，该方法利用增强所述菌苗的免疫原性的佐剂制剂，以便在给予一剂所述疫苗后引发保护性免疫。
本发明的其它目的和特点将由下面的详细描述而变得明显。
                    发明简述
本发明涉及用于免疫动物以对抗猪肺炎支原体感染的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含：免疫量的灭活猪肺炎支原体菌苗；佐剂混合物，所述佐剂混合物包括丙烯酸聚合物以及可代谢油和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的混合物；药学上可接受的载体，所述疫苗组合物在单剂给予后，引发针对猪肺炎支原体的保护性免疫。
另一方面，本发明提供用于免疫动物以对抗猪肺炎支原体感染的免疫原性组合物，所述组合物包含灭活猪肺炎支原体菌苗和上述佐剂混合物以及药学上可接受的稳定剂、载体或稀释剂剂。所述佐剂在该疫苗组合物内的最终浓度通常约1-25％(v/v)，优选约5-12％(iv/v)。所述组合物也可以包括其它疫苗成分，包括来自一种或多种病原体的灭活菌苗或纯化类毒素，所述病原体例如副猪嗜血菌(Haemonphilus parasuis)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multiocida)、猪链球菌(Streptococcum suis)、大叶性肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)、支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)和钩端螺旋体(leptospira)，可以通过肌内途径、皮下途径、口服途径、喷雾剂途径或鼻内途径给予所述组合物。
又一方面，本发明提供保护动物以对抗猪肺炎支原体所引起的疾病的方法，该方法给予单剂包含灭活猪肺炎支原体菌苗和所述佐剂混合物的上述疫苗。
                    发明详述
本文引用的所有专利、专利申请和其它文献特此通过引用完整地结合到本文中。如有不一致，以本公开内容为准。
本文所用“菌苗”是这样一种细菌收获物：所述细菌收获物已经被灭活，当其与某种佐剂组合后给予动物时，能够引发保护性免疫以对抗疾病或感染。
“佐剂”指包含一种或多种物质的组合物，所述物质增强疫苗组合物内猪肺炎支原体菌苗的免疫原性和功效。
本说明书和权利要求内使用的术语MHDCE指猪肺炎支原体DNA细胞等同物。
“免疫量”指提供针对猪肺炎支原体的免疫的菌苗量。“免疫量”取决于物种、品种、年龄、大小、健康状态以及动物之前是否接受过对抗同样病原体的疫苗。
本发明提供适于单剂接种的对抗猪肺炎支原体的疫苗。本发明的疫苗包括增强所述菌苗的免疫原性的佐剂混合物，因此一次给予就引发保护性免疫。
可以通过本领域内的标准方法从新鲜收获的培养物制备所述疫苗(例如，见美国专利5,338,543或美国专利5,565,205，以及下面的实施例2)。也就是说，可以在例如PPLO(胸膜肺炎样生物)完全培养基[Difco].Laboratories]的培养基内繁殖猪肺炎支原体。通过标准技术如测定色度变化单位(CCU)监测所述猪肺炎支原体的生长，当达到足够高的滴度后收获。所述贮液在用于配制疫苗前，可以通过常规方法进一步浓缩或冻干。可以使用其它方法，例如在Thomas等，Agri-Practice，第7卷No.5，第26-30页描述的那些方法。
本发明的疫苗包含灭活猪肺炎支原体菌苗、佐剂混合物以及一种或多种药学上可接受的载体。适用的载体包括水性媒介，例如盐水、磷酸盐缓冲液、基本必需培养基(MEM)或用HEPES缓冲剂配制的MEM。
在本发明疫苗组合物中使用的佐剂混合物增强免疫反应，所述佐剂混合物包括丙烯酸聚合物以及可代谢油和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的混合物，所述可代谢油例如不饱和萜烯烃或其氢化产物，最好是角鲨烷(2，3，10，15，19，23-六甲基二十四烷)或角鲨烯。所述丙烯酸聚合物可以是均聚物或共聚物。所述丙烯酸聚合物最好是卡波姆。卡波姆可以买到，商品名为Carbopol。丙烯酸聚合物在例如美国专利2,909,462和3,790,665有介绍，其公开内容通过引用结合到本文中。所述聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物是表面活性剂，最好是液体表面活性剂，帮助悬浮固体和液体成分。所述表面活性剂可以作为聚合物买到，商品名为Pluronic。优选表面活性剂是泊洛沙姆401，可以买到，商品名为PluronicL121。
本发明疫苗组合物中存在的免疫原性刺激佐剂混合物量(v/v)通常约1％到25％，优选约2％到15％，更优选约5％到12％。所述佐剂混合物的使用量以及所述佐剂内两种成分的比例将根据其它菌苗或纯化类毒素的加入而变化。所述佐剂混合物一般包含可代谢油、丙烯酸聚合物以及聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，在水性媒介内配制成乳浊液。
在该佐剂混合物中，可代谢油的量约10到150ml/L，丙烯酸聚合物的量约0.5到10g/L。在所述佐剂混合物的优选实施方案中，所述可代谢油以及聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的混合物是角鲨烷和PluronicL121(泊洛沙姆401)的混合物，其量为约50到100ml/L，羧亚甲基聚合物是Carbopol 934P(Carbamer 934P)，其量为约2ml/L。一般所述佐剂混合物中丙烯酸聚合物与可代谢油/聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物混合物的比例是约1∶25到1∶50。
优选丙烯酸聚合物是B.F Goodrich销售的Carbopol 934 P NF和941 NF，它们是丙烯酸与聚烯丙基蔗糖的交联聚合物，化学式为(CH2CHOOOH)n。这些聚合物形成水凝胶，适合用水性载体配制。优选聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物是BASF销售的非离子表面活性剂PluronicL121、L61、L81或L101。
可以通过肌内途径、皮下途径、鼻内途径、腹膜内途径或口服途径给予本发明的疫苗，最好通过肌内途径或皮下途径。
本发明的疫苗一般采取水包油乳剂的形式，包含灭活猪肺炎支原体、可代谢油、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物以及丙烯酸聚合物。所述疫苗最好包含浓度范围0.5到10g/L的丙烯酸聚合物。所述疫苗最好包含浓度范围2到6ml/L的可代谢油。所述疫苗最好包含浓度范围1到3ml/L的聚氧乙烯-丙烯嵌段共聚物。
为用于单剂给予，所述疫苗应当最好包含相当于约1×108到3×1011MHDCE/ml量的猪肺炎支原体菌苗，最好约1×109到3×109MHDCE/ml。肌内、皮下或腹膜内给予每只动物约1-5mL，最好2mL。口服或鼻内给予1-10mL，最好2-5mL。
下面的实施例将进一步举例说明本发明，而不限制本发明的范围。
                     实施例1
         疫苗组合物的猪肺炎支原体菌苗制备物
病毒贮液描述。可以从多种容易获得的来源获得猪肺炎支原体。在一个实施方案中，可以使用猪肺炎支原体P-5722-3株。所述培养物得自C.Armstrong，Purdue University，West Lafayette，Indiana。收到猪肺炎支原体培养物后，在猪肺炎支原体肉汤上传代七次，建立母种。
细胞培养物。在培养基内培养猪肺炎支原体18-144小时，培养基含Bacto PPLO粉末、酵母提取物、葡萄糖、L-半胱氨酸盐酸盐、氨苄青霉素、乙酸铊、酚红、消泡剂、正常无菌猪血清和水。为进行灭活，将二吖丙啶(BEI)直接加入发酵容器内的生产培养物。将pH调到7.4，然后按照常规程序收获，获得猪肺炎支原体菌苗。
制备疫苗组合物。
防腐剂组合物和使用的比例。加入不超过0.01％的硫柳汞和不超过0.07％的乙二胺四乙酸四钠(EDTA)，保存所收获的菌苗。所述生长培养基内氨苄青霉素U.S.P.的浓度是0.250克/升。根据收获液体的体积，最终产品中的残余氨苄青霉素浓度将有变化，成品内的残余氨苄青霉素浓度不超过30ug/mL。
产品的标准化。通过DNA荧光测定定量支原体(Mycoplasma)浓缩物。
如下制备可代谢油(包含一种或多种萜烯烃)和聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物的混合物(如Squalane/Pluronic L121混合物)：在900mL纯化水内溶解10g氯化钠、0.25g氯化钾、2.72磷酸氢二钠、0.25磷酸二氢钾、20mL Pluronic L121(BASF Corporation)、40mL Squalane(Kodak)、3.2mL Tween 80，然后定容到1000ml。混合后，对所述成分进行高压蒸汽灭菌。然后匀浆所述混合物，直到形成稳定的乳浊液。可以加入福尔马林达到0.2％的终浓度，或加入硫柳汞达到1∶10,000的终浓度。
组装各个单位形成系列。无菌操作，将满意的猪肺炎支原体浓缩物与所述佐剂、防腐剂和稀释剂混合加入装备有搅拌器的无菌容器，混合时间不少于30分钟。
1,000,000个剂量(每剂量2mL)的量：  ％v/v
支原体浓缩物(＞1.0×1010MHDCE/mL) 400,000mL  20.0
角鲨烷/Pluronic L121混合物 100,000mL  5.0
Carbopol(2％w/v水溶液) 200,000mL  10.0
1％硫柳汞水溶液(w/v)和7％EDTA(四钠盐)(w/v) 18,000mL  0.9
无菌盐水 1,282,000mL  64.1
该系列的pH调到7.0±0.2。
MHDCE＝猪肺炎支原体DNA细胞等同物
装瓶和封口最终容器的方法和技术。所述产物通过无菌200-500微米滤器元件总体过滤，在用于装瓶操作的房间里按照9 CFR 114.6规定条件装瓶进无菌的最终容器。用橡胶塞子封闭所述玻璃或塑料容器，并用铝封条(aluminum seal)压折封口。每个2.0mL剂量包含不少于2×109猪肺炎支原体DNA细胞等同物。
测试效力。如下测试成品的大量生产或最终容器样品的效力：
效力测定方法：使用Harlan Sprague Dawley或其它可接受供应商的同批六到七周龄ICR雌性小鼠。用每种未知和参考菌苗接种需要至少20只小鼠。保留至少五只小鼠作为未接种对照。测试菌苗和参考菌苗各自完全混合。使用配有25号5/8英寸针头的无菌一次性注射器，在小鼠腹股沟区皮下接种1/10宿主动物剂量(0.2mL)。每组小鼠在单独的单位内饲养，自由进食和饮水14天。然后麻醉每只小鼠。将麻醉的小鼠仰面放置。用一只手压住小鼠头部，使一只前腿从身体伸出。使用解剖刀在伸出的前腿和胸之间制造一个长约1/2英寸长的皮肤切口，切断肱动脉。使用不带针头的3.0mL注射器，收集在切口汇集的血。将血排放入标记的试管，使其凝结。凝结的试管在1,000×g离心，从结块分离血清。各个血清保存在-20℃或更冷，等待测试。
血清学测试：使用ELISA程序测量小鼠对参考菌苗和/或未知菌苗的抗体反应。使用得自Dynatech的Disposable Immulon II平底微量滴定板或其等同物以及ELISA读板器进行所述ELISA程序。
测试试剂：
磷酸盐缓冲盐溶液-Tween(PBST)(用5N NaOH或5N HCl将pH调到7.2到7.4)。
每升含量
成分 升
NaCl 8.50克
NaH2PO4 0.22克
Na2HPO4 1.19克
Tween-20 0.50ml
去离子水定容 1,000.00ml
甘氨酸缓冲溶液(GBS)(用5N NaOH或5N HCl将pH调到9.5到9.7)
成分   每升含量
甘氨酸  0.75克
NaCl  8.50克
去离子水定容  1,000.00ml
阳性对照血清：阳性对照血清是来自用猪肺炎支原体菌苗接种的小鼠的血清的汇总。
缀合物和底物：
从Kirkegaard and Perry Laboratories，Inc.获得亲和纯化的抗小鼠IgG过氧化物酶标记的缀合物(目录号074-1802)。确定缀合物最佳稀释度的程序如下。从Kirkegaard and Perry，Inc.获得过氧化物酶底物溶液(ABTS)。
滴定缀合物：用每孔100ul包被液包被Immulon II平底板，所述包被液每mL含20ug溶解于10mM GBS的猪肺炎支原体全细胞抗原。该板在37℃±2℃温育一小时以上，然后转移到2-7℃放置18小时以上、一周以下。使用前，该板用PBST洗涤三次，每次洗涤之间浸泡一分钟，然后轻扣甩干。制备阳性对照血清在PBST中1∶40的稀释物，将所述稀释的阳性血清加入板上的一半孔中(100uL/孔)。在另一半孔内加入PBST。该板在室温下温育一小时，然后洗涤三次。所述缀合的血清顺序用PBST两倍稀释，从1∶100稀释开始，直到1∶10,240稀释度。在阳性血清的四个孔和PBST的四个孔内加入各个缀合物稀释度100ul，在室温下反应半小时。洗板四次，每孔加入100ul过氧化物酶底物溶液(abts)。在Tλ＝450的双波长设置下读板。从阳性对照血清值减去PBST对照的值，并选出阳性对照血清读数在0.850到1.050之间的缀合物稀释度。
测试抗原：
猪肺炎支原体抗原是全细胞制备物，由Fort Dodge Animal Health提供。
如下进行ELISA：使用Dynatech Immulon II平底微量滴定板。用甘氨酸缓冲盐溶液(GBS)重建一小管冻干的猪肺炎支原体全细胞抗原至10ml。重建的支原体蛋白浓度是20μg/mL。然后在板上的所有孔内加入100μl(2μg)稀释抗原。所述板在37℃±2℃温育一小时以上，然后转移到2-7℃放置18小时以上、一周以下。所述板用PBST洗涤三次，每次洗涤之间浸泡一分钟，然后轻扣甩干。血清用PBST以1∶40稀释。每块板包括一式四份的阳性对照血清。每孔的样品体积是100μl。在同一块板上一式两份地测定顺序测试血清样品和参考血清样品。所述板在室温温育一小时，然后用PBST洗涤三次。所有孔内加入100μl用PBST稀释的抗鼠IgG过氧化物酶标记的缀合物(Kirkegaard and Perry)，所述孔在室温下温育30分钟。用PBST洗涤板四次。在所有孔内加入100μl过氧化物酶底物溶液(ABTS)，使机器针对PBST对照孔调空白，温育板直到阳性血清对照达到0.850到1.050之间的OD405(450)。针对PBST孔调空白，读板。为使测试有效，接种参考菌苗的小鼠的血清的平均值必须最小为0.500，未接种对照小鼠的血清的平均值必须最大不超过0.100。或者接种参考菌苗的小鼠的血清的平均值与未接种对照小鼠的血清的平均值之间的差异必须大于或等于0.400。
如下计算和评价系列接种物、参考接种物和对照的平均值：判定结果满意的前提条件是：测试菌苗必须显示等于或大于参考的平均平均光密度值。或者，根据单侧斯氏T检验，测试菌苗不能显著低于参考菌苗(置信水平p≤0.05)。计算得到的任何等于或大于1.686的T值将指出参考和测试菌苗之间的显著差异，从而导致拒绝测试菌苗。计算得到的任何小于1.686的T值将指出满意的系列。由于任何与产品效力无关的原因被所述测试认为不满意的任何测试菌苗都接受再测试，并认为最初的测试无效。
                           实施例2
测试疫苗：
根据实施例1中详细描述的程序制备用于测试的疫苗，每个剂量包含2×109猪肺炎支原体DNA细胞等同物(MHDCE)，使用5％的可代谢油(包括一种或多种萜烯烃)与聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物的混合物(角鲨烷/Pluronic L121混合物)以及0.2％丙烯酸聚合物(Carbopol)作为佐剂。
                           实施例3
本研究设计用于证明：用实施例2所述疫苗在三周龄单剂接种猪诱导四个月的免疫期(duration of immunity，DOI)。
本研究包括两个独立的动物试验。两个试验内所有的猪在接种时都是血清学阴性(抗体滴度＜10)，表明所有猪对猪肺炎支原体敏感。对照组内的所有猪在攻击前都保持血清学阴性。这表明在接受接种的猪体内的免疫反应是由所述疫苗引起，而不是由于任何环境暴露引起。
在第一个试验中，通过高水平强毒猪肺炎支原体(4×106支原体)攻击评估实施例2所述疫苗以及一种商业化产品Ingelvac M.hyo(由Boehringer Ingelheim(BI)生产)。用实施例2所述疫苗肌内(IM)接种18-21日龄的二十二(22)只猪，用Ingelvac M.hyo[serial 271 032]接种八(8)只猪。使用二十二(22)只猪作为攻击对照，10只猪作为未攻击对照。接种后四个月用强毒猪肺炎支原体攻击接种组和攻击对照组的猪。用实施例2所述疫苗接种的猪的平均肺病变是15.9％，攻击对照组的平均肺病变是19.6％。尽管用比Iowa State University(ISU)推荐剂量更高的剂量攻击猪，但用实施例2所述疫苗接种组的平均肺病变少于对照组，然而，该差异并不显著(p＝0.19)。同样的，当用相同攻击剂量在同一组猪中评价商业化产品Ingelvac M.hyo时，也观察到相似水平的肺病变(14.6％)。在Ingelvac M.hyo接种组和对照组之间(p＝0.27)，以及在Ingelvac M.hyo接种组和用实施例2所述疫苗接种的组之间，也没有显著差异。
在第二个试验中，接种后四个月用ISU建议水平(1.0×106生物)的强毒猪肺炎支原体攻击评价实施例2所述疫苗。在21日龄用一剂量所述疫苗接种二十三(23)只猪，25只猪作为攻击对照，7只猪作为未攻击对照。接种后四个月用强毒猪肺炎支原体攻击在接种组和攻击对照组内的猪。对照组的平均肺病变是10.4％，接种组的平均肺病变是5.5％。在接种组和对照组之间有显著差异(p＝0.031)。这表明：实施例2所述疫苗有效刺激保护性免疫，这种保护性免疫在单剂量接种三周龄的猪后能够持续至少四个月。
当合并并分析这两个试验中与实施例2所述疫苗有关的数据后，接种组的平均肺病变显著低于对照组的平均肺病变。
总之，用实施例2所述疫苗单剂量接种三周龄猪四个月后诱导针对强毒猪肺炎支原体攻击的保护性免疫。
实验数据
在本研究中进行两个单独的试验。在试验一，使用Microsoft Excel随机化程序将六十七(67)只猪分配为四个组。二十四(24)只猪在18-21日龄接受按照实施例2制备的一剂量疫苗的肌内(IM)接种。二十四(24)只猪用作攻击对照，10只猪用作未攻击对照。用商业化产品Ingelvac M.hyo[serial 271 032，Boehringer Ingelheim(BI)]按照说明书的指导肌内接种九只猪。五只猪(两只猪用实施例2所述疫苗接种，一只猪用BI疫苗接种，两只猪是对照)在接种保持期内由于与接种无关的原因死亡。接种组和攻击对照组的其它猪在接种后四个月接受14mL强毒猪肺炎支原体(1.4×106生物)的攻击。攻击后30天无痛苦处死所有四个组的猪，计数该试验中每只猪的肺病变。
在第二个试验中，二十五(25)只猪在21日龄接受一剂量按照实施例2制备的疫苗的肌内接种。二十五(25)只猪用作攻击对照，10只猪用作未攻击对照。两只猪由于与接种无关的原因死亡，一只猪在接种保持期内被错误地卖掉。接种组和攻击对照组内剩余的猪在接种后四个月接受10mL强毒猪肺炎支原体(1.0×106生物)的攻击。两只猪在攻击后的观察期内由于与接种/攻击无关的原因死亡。攻击后30天无痛苦处死所有所有三个组内剩余的猪，计数该试验中每只猪的肺病变。
接种：
接种组的每只猪在颈侧肌内接受一剂量2mL所述测试疫苗。
攻击和尸体剖检：
强毒猪肺炎支原体攻击贮液是冰冻(-70℃)的肺匀浆物，由IowaState University(ISU)的Dr.Eileen Thacker制备。所述攻击贮液经证实是纯的，每mL含约107猪肺炎支原体生物。推荐的攻击剂量是10mL以1∶100稀释的贮液(即1.0×106生物)。
第一个试验中接种组和攻击对照组内的猪接受14ml以1∶100稀释的贮液(即1.4×106生物)的攻击。第二个试验中的猪根据推荐接受10ml以1∶100稀释的贮液(即1.0×106生物)的攻击。
在攻击的当天，在温水中快速融化所述匀浆物，按照ISU的推荐用无菌猪肺炎支原体生长培养基稀释。给予猪镇静剂，所述镇静剂是含50mg/mL Xylazine、50mg/mL Ketamine和100mg/mL Telazol的Xylazine-Ketamine-TelazolTM混合物。按照0.01-0.02mL/磅体重给予所述麻醉混合物。每只猪气管内接受一剂量14mL(第一个试验)或10mL(第二个试验)所述攻击材料。为保证针头位置正确，在给予攻击剂量前用注射器抽气。未接种的未攻击对照猪饲养在单独的房间内，不进行攻击。
攻击后(DPC)30天，无痛苦处死所有猪。取出肺，由不了解试验组的人员计数总肺病变。
样品收集和测试：
在接种当天(0 DPV)、接种后一个月(1 MPV)、4 MPV/0 DPC和30 DPC，从所有猪收集血液样品，使用竞争性ELISA试剂盒(由DAKOCo.制造)检测抗猪肺炎支原体的血清抗体。所述血清样品保存在-20℃直到测试。
数据分析：
通过方差分析(ANOVA)比较接种组和未接种组间的肺病变计数。将肺计数用反正弦函数转化，以改善残差分布(distribution ofresidual)。
结果和讨论
血清学：使用商业化竞争性ELISA试剂盒测试两个试验中所有猪体内抗猪肺炎支原体的血清抗体，其中所有测定使用1∶10的血清稀释度。所有猪在接种时都是血清学阴性(抗体滴度＜10)，这表明所有猪都对猪肺炎支原体敏感。对照组的所有猪在攻击前保持血清学阴性。这表明接种猪体内的免疫反应是由所述疫苗引起的，而不是任何环境暴露引起的。接种组内所有的猪和攻击对照组内大部分猪(试验一22只猪中的18只，试验二25只猪中的15只)在攻击后都转化为对猪肺炎支原体呈血清学阳性，而所有未受攻击的猪保持血清学阴性。这提示：所述攻击是猪肺炎支原体特异性的。测试猪的血清学状态综述于表1。
第一个试验中的免疫原性测试：
进行第一个试验以确定实施例2所述疫苗是否能够刺激强的免疫性，所述免疫性能够在接种后四个月保护猪，抵抗比ISU推荐水平更高水平的攻击。本试验还比较实施例2所述疫苗以及商业化Ingelvac M.hyo在接种后四个月刺激保护性免疫的能力。
二十二只猪用FDAH Suvaxyn MH-One接种，八只猪用注册产品Ingelvac M.hyoserial 271,032接种，然后用每只猪1.4×106生物(ISU推荐每只猪1.0×106生物，见5.5小节)的所述攻击材料攻击这些猪。二十二只猪用作攻击对照，10只猪用作未攻击对照。肺病变百分率综述于表2。用实施例2所述疫苗接种的猪的平均肺病变是15.9％，攻击对照组的平均肺病变是19.6％。甚至当用更高剂量猪肺炎支原体攻击猪时，用实施例2所述疫苗接种的组的平均肺病变仍少于对照组。然而，该差异并不显著(p＝0.19)。同样的，当用相同攻击剂量在同一组猪中评价商业化产品Ingelvac M.hyo时，也获得相似水平的肺病变(14.6％)。在Ingelvac M.hyo接种组和对照组之间(p＝0.27)以及在Ingelvac M.hyo接种组和实施例2所述疫苗接种组之间(p＝0.88)没有显著差异。
虽然在接受实施例2的组中记录到并不显著的病变数量减少，但本试验获得的数据提示：在本试验中使用的更高攻击剂量(1.4×106生物)可能太高，甚至对于商业化Ingelvac产品刺激的猪免疫也是如此。该攻击水平可能并不适合于使用20-25只猪的组规模进行的接种/攻击研究评价，虽然使用更大的组大小可能证明该显著性。
第二个试验中的免疫原性测试：
试验二中接种组和攻击对照组内的猪在接种后四个月用ISU推荐的攻击剂量(1.0×106生物)进行评价，以证明四个月的DOI。肺病变百分率综述于表3。对照组的平均肺病变是10.4％。接种组的平均肺病变是5.5％。在接种组和对照组之间有显著差异(p＝0.031)。这指出：实施例2所述疫苗有效刺激保护性免疫，所述保护性免疫在用单剂量接种三周龄的猪后持续至少四个月。
评价两个试验的综合结果：
虽然两个试验显著不同，但组的试验效应不是显著的。两个试验间组效应的幅度相似。因此，可以在不考虑试验的情况下评价组效应。由于对完整模型的分析显示：组和试验之间的相互作用不显著，因此这支持两个试验中组效应相同的观点，并支持将两个试验的数据组合成单一分析。如此，当组合两个试验中与实施例2所述疫苗有关的数据，将组和试验作为独立变量，分析肺病变的反正弦转化变量时(约化模式，reduced model)，组在统计学上是有意义的(p＝0.013)。
表1：对照组和接种组的猪对猪肺炎支原体的血清学状态小结
试验一
              阳性/阴性(1∶10)
组 猪的数量  ODPV  -1DPC  30DPC
FDAH疫苗 22  0/22  0/22  22/22
BI疫苗 8  0/8  4/8  8/8
攻击对照 22  0/22  0/22  18/22
未攻击对照 10  0/10  0/10  0/10
试验二
                          阳性/阴性(1∶10)在
组 猪的数量  ODPV  -3DPC  30DPC
FDAH疫苗 23  0/23  6/23  23/23
对照 25  0/25  0/25  14/25
未攻击对照 7  0/7  0/7  0/7
表2：试验一肺病变百分率小结(超剂量) *
组 猪的数量  平均肺病变百分率 P-值
FDAH疫苗 22  15.90％ 0.19**
BI疫苗 8  14.60％ 0.27***
对照 22  19.60
未攻击对照 10  0％ 0.88****
*按每只猪1.4×106生物的剂量攻击猪(ISU推荐的剂量是每只猪1.0×106生物)
**FDAH疫苗组和对照之间的比较
***BI疫苗组和对照组之间的比较
****BI疫苗组和FDAH疫苗组之间的比较
表3：试验二肺病变百分率小结(推荐剂量)
组 猪的数量  平均肺病变百分率 P-值
FDAH疫苗 23  5.50％ 0.031**
对照 25  10.40％
未攻击对照 7  0.77％
*按ISU推荐剂量攻击猪(每只猪1.0×106生物)
**FDAH疫苗组和对照之间的比较
                          实施例4
评价本发明疫苗组合物在单剂给予后六个月对毒力攻击诱导的 长期免疫性
使用实施例1和2内所述的基本相同的程序以及使用下面显示的量，制备测试疫苗A。
                            测试疫苗A
1,000,000剂的量(每剂量2mL)： ％v/v
支原体浓缩物(＞1.0×1010 MHDCE/ml) 1200,000mL  60.0
角鲨烷/Pluronic L121混合物 200,000mL  10.0
Carbopol(2％w/v水溶液) 200,000mL  10.0
1％(w/v)硫柳汞水溶液和7％(w/v)EDTA(四钠盐) 18,000mL  0.9
无菌盐水 382,000mL  19.1
该系列的pH调到7.0±0.2。
MHDCE＝猪肺炎支原体DNA细胞等同物
小结
本评价包括三十三只21日龄的猪。二十只猪在三周龄接受一剂量疫苗A的肌内接种。十只猪作为未接种对照，三只猪作为未攻击环境对照。
所有猪在接种时都是血清学阴性(抗体滴度＜10)，这表明这些猪对猪肺炎支原体敏感。对照组内所有的猪在攻击前保持血清学阴性。这表明接受接种的猪体内的免疫反应是由疫苗引起的，而不是由于任何环境暴露引起的。
接种后六个月，用强毒猪肺炎支原体(每只猪1.0×106生物)攻击20只接种的猪和10只未接种的对照猪。三只猪作为未攻击对照。接种猪的平均肺病变评分是3.6％，攻击对照猪的平均肺病变评分是14.6％。接种组的肺病变显著少于对照组(p＝0.0215)。
本评价中获得的数据证明：测试疫苗A在单剂接种后诱导六个月的针对强毒猪肺炎支原体攻击的长期保护性免疫。
试验设计
使用Microsoft Excel随机化程序，将三十三只21日龄的猪随机分配到三个组(接种组、攻击对照组和未攻击环境对照组)。二十只猪在三周龄接受一剂量测试疫苗A的肌内接种。十只猪作为攻击对照，三只猪作为未攻击环境对照。接种后六个月按每只猪10mL强毒猪肺炎支原体(1.0×106生物)培养物攻击接种组和攻击对照组的猪。三只未接种的猪用作未攻击对照。攻击后26天无痛苦处死接受攻击的猪和未接受攻击的对照，计算每只猪的肺病变。
接种组的每只猪在颈侧肌内接受一剂量2mL所述测试疫苗。
攻击和尸体剖检：
强毒猪肺炎支原体攻击贮液是冰冻(≤-70℃)的肺匀浆物，由IowaState University(ISU)的Dr.Eileen Thacker制备。所述攻击贮液经证实是纯的，每mL含约107猪肺炎支原体生物。
用10mL以1∶100稀释的贮液(即1.0×106生物)攻击猪。
在攻击的当天，在温水中快速融化所述匀浆物，按照ISU的推荐用无菌猪肺炎支原体生长培养基稀释。给予猪镇静剂，所述镇静剂是含50mg/mL Xylazine、50mg/mL Ketamine和100mg/mL Telazol的Xylazine-Ketamine-TelazolTM混合物。按照0.01-0.02mL/磅体重给予所述麻醉混合物。每只猪气管内接受一剂量10mL(第二个试验)所述攻击材料。为保证针头位置正确，在给予攻击剂量前用注射器抽气。未接种的未攻击对照猪饲养在单独的房间内，不进行攻击。
攻击后(DPC)26天，无痛苦处死所有猪。取出肺，如实施例3所述计数总肺病变。
样品收集和测试：
在接种当天(0 DPV)、35 DPC、-1 DPC和26 DPC，从所有猪收集血液样品，使用竞争性ELISA试剂盒(由DAKO Co.制造)检测抗猪肺炎支原体的血清抗体。所述血清样品保存在-20℃直到测试。
数据分析：
通过单因素方差分析(ANOVA)比较接种组和对照组间的肺病变计数。将肺计数用反正弦函数转化，以改善残差分布。由于所述肺病变评分的正态假设是有问题的，因此使用Wilcoxon秩和检验分析肺病变评分以及肺病变评分的反正弦转化值。显著性水平设为p＜0.05。报告来自非参数Wilcoxon秩和检验结果。
结果和讨论
血清学
使用商业化竞争性ELISA试剂盒测试两个试验中所有猪体内抗猪肺炎支原体的血清抗体，其中所有测定使用1∶10的血清稀释度。按照试剂盒说明书测试结果存在怀疑的样品在数据分析中作为阳性处理。所有猪在接种时都是血清学阴性(抗体滴度＜10)，这表明所有猪都对猪肺炎支原体敏感。对照组的所有猪在攻击前保持血清学阴性。接种后，二十只接种猪中的十五只(15/20)变为对猪肺炎支原体血清学阳性至少一次(在35 DPV和-1 DPC收集的样品)。这表明接种猪体内的免疫反应是由所述疫苗引起的，而不是任何环境暴露引起的。所有接种猪和攻击对照组内的十只猪有四只猪在攻击后都转化为对猪肺炎支原体呈血清学阳性，而所有未受攻击的猪保持血清学阴性。测试猪的血清学状态综述于表4。
肺病变评分
接种后六个月用强毒猪肺炎支原体(每只猪1.0×106生物)攻击用测试疫苗A接种的二十只猪和十只未接种对照猪。三只猪用作未攻击对照。二十只接种猪中有八只(40％)在攻击后没有出现肺病变，而对照组的10只猪中仅一只猪(10％)没有肺病变。肺病变的百分率综述于表5。接种猪的平均肺病变评分是3.6％，攻击对照猪的平均肺病变评分是14.6％。接种组内的肺病变显著少于对照(p＝0.0215)。
表4： 本研究中猪对猪肺炎支原体的血清学状态 *
                                    阳性数量(1∶10)/总数
组     处理        猪的数量   0 DPV **   35 DPV   -1 DPC ***   26 DPC
1       疫苗/攻击    20          0/20       9/20      12/20        20/20
2       对照/攻击    10          0/10       0/10      0/10         4/10
3       对照/未攻击  3           0/3        0/3       0/3          0/3
*使用商业化试剂盒，通过ELISA测定所述血清学样品中的抗猪肺炎支原体血清抗体。
所有样品在血清稀释度1∶10测试。按照试剂盒说明书解释结果。
在1∶10存在怀疑的样品认为是阳性。
**DPV＝接种后天数
***DPC＝攻击后天数
表5：在用猪肺炎支原体攻击的猪和未攻击对照中肺病变评分(％)
小结
                                                              平均值的    平均值的
                         猪的数      平均肺病                 95％CL*下  95％CL上
 组       处理           量          变评分(％)     标准差    限          限        P值**
 1        疫苗/攻击      20          3.6            7.6       0.07        7.19      0.0215
 2        对照/攻击      10          14.6           20.0      0.33        28.94
 3        对照/未攻击    3           1.8            1.8       -2.67       6.27
*CL＝置信度
**P值来自于组1和组2的比较。
如表4和表5的数据所示，在用测试疫苗A单剂给予三周龄的猪后，测试疫苗A诱导六个月的针对强毒猪肺炎支原体攻击的保护性免疫。

Claims (18)

1.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物用于免疫动物以对抗由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)引起的感染，所述疫苗组合物包含：
免疫量的猪肺炎支原体菌苗；
一种佐剂混合物，所述佐剂混合物包含丙烯酸聚合物以及可代谢油和聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物的混合物；
药学上可接受的载体，所述疫苗组合物在单剂给予后引发针对猪肺炎支原体的保护性免疫。
2.权利要求1的疫苗组合物，其中所述佐剂混合物的组成为：丙烯酸聚合物以及可代谢油和聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物的混合物，所述可代谢油包括一种或多种萜烯烃，其中丙烯酸聚合物与可代谢油/聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物混合物的比例为约1∶25到1∶50。
3.权利要求1的疫苗组合物，其中所述佐剂混合物为所述疫苗组合物的约1-25％(v/v)。
4.权利要求3的疫苗组合物，其中所述丙烯酸聚合物的终浓度为约1％(v/v)，所述萜烯烃/聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物混合物的终浓度为约5％到10％(v/v)。
5.权利要求3的疫苗组合物，其中所述佐剂混合物为所述疫苗组合物的约2％到15％(v/v)。
6.权利要求5的疫苗组合物，其中所述佐剂混合物为所述疫苗组合物的约5％到12％(v/v)。
7.权利要求1的疫苗组合物，其中所述可代谢油是角鲨烷或角鲨烯。
8.权利要求6或7的疫苗组合物，其中所述丙烯酸聚合物是Carbopol。
9.权利要求1-8中任一项的疫苗组合物，所述疫苗组合物还包含至少一种选自以下的菌苗：副猪嗜血菌(Haemonphilus parasuis)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multiocida)、猪链球菌(Streptococcum suis)、大叶性肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)、支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholeraesuis)和钩端螺旋体(leptospira)细菌。
10.一种保护动物免患猪肺炎支原体所引起的疾病的方法，所述方法包括给予所述动物一种疫苗组合物的步骤，所述疫苗组合物包含：
免疫量的猪肺炎支原体菌苗；
一种佐剂混合物，所述佐剂混合物包含丙烯酸聚合物以及可代谢油和聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物的混合物；
药学上可接受的载体，所述疫苗组合物在单剂给予后引发针对猪肺炎支原体感染的保护性免疫。
11.权利要求10的方法，其中所述细菌的免疫量是约1×108到3×1011MHDCE/ml。
12.权利要求11的方法，其中所述细菌的免疫量是约1×109到3×109MHDCE/ml。
13.权利要求10的方法，其中所述给予步骤的给药方式是肌内、皮下、腹膜内、气溶胶、口服或鼻内给药。
14.权利要求10的方法，其中所述佐剂混合物的组成为：丙烯酸聚合物以及可代谢油和聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物的混合物，所述可代谢油包括一种或多种萜烯烃，所述佐剂混合物的终浓度是约1-25％(v/v)。
15.权利要求14的方法，其中所述佐剂混合物中的丙烯酸聚合物是Carbopol。
16.权利要求14的方法，其中所述佐剂混合物内的可代谢油是选自角鲨烯和角鲨烷的萜烯烃。
17.权利要求10-16中任一项的方法，所述方法还包括同时给予至少一种选自以下的其它菌苗：副猪嗜血菌、多杀巴斯德氏菌、猪链球菌、大叶性肺炎放线杆菌、支气管炎博德特氏菌、猪霍乱沙门氏菌和钩端螺旋体细菌。
18.一种疫苗，所述疫苗为水包油乳剂形式，包含灭活猪肺炎支原体、可代谢油、聚氧乙烯-聚丙烯嵌段共聚物和丙烯酸聚合物。
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