JPH07504653A - 不活化マイコプラズマヒオニューモニエ及びその利用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３０、請求項２９の方法で調製した混合ワクチン。

３１、請求項３０のワクチンの有効量を動物に投与することを特徴とする細菌性 感染から動物を免疫する方法。

３２、少なくとも部分的に精製した形のマイコプラズマヒオニューモ＝ｚ［Ｍ、 　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｌｐ　４４抗原と免疫学的に許容できるキャリヤ とを含むことを特徴とするワクチン。

３３、ＤＥＡＥデキストラン及び水酸化アルミニウムの組合せをアジュバントと してさらに有する請求項３２のワクチン。

このバクテリアは１９６５年に初めて同定された１、マイコブラズ不活化マイコ プラズマヒオニューモニエ及びその利用方法 本発明は１９９２年２月２７日付は特許出願第０７／８４１６３２号の一部継続 出願である。これに言及して同出願内容を本願の内容に組み込む。

１吸□□□分万 本発明はマイコプラズマ　ヒオニューモニエ［Ｍｙｃｏｐｌａｓ■ａ　ｈｙｏｐ ｎｅｕｇａｎｎｉａｅ］のワクチン及びその診断薬の調製方法に関する。

発明の背景 ブタ［５ｗ１ｎｅ］の慢性肺炎は、ここ１００年近くブタ［５ｗ１ｎｅｌの生産 における主たる課題とされてきた。この疾病は慢性的な咳、鈍いヘヤコート［ｄ ｕｌｌ　ｈａｉｒ　ｃｏａｔｌ、何週間も続く発育不良や繁殖不全の様相を引き 起こし、低い生存率、高い死亡率を特徴としている。特に腹面肺尖端部及び肺底 区小葉［ｖｅｎｔｒａｌ　ａｐｉｃａｌａｎｄ　ｃａｒｄｉａｃ　１ｏｂｅｓ］ における硬変（コンソリデージョン）の紫色から灰色にかけての特徴的病変箇所 が感染した動物に観察されている。死は二次感染またはストレスによって引き起 こされるものと忠われる。慢性肺炎の原因の一つはマイコプラズマヒオニューモ ニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］感染である・経済的損失だけ考えて みても年間２００万ドル〜２５０万トルと見積もられる。

マヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｌＩＯｎｉａｅ］は緩慢に生育する 、偏向性の［ｆａｓｔｉｄｉｎｕｓ］細菌で細胞壁を有していない、、呼吸管か らこの細菌を単離することは、同じ呼吸管にいる一般的な２次因子［ａ　ｃｏ＋ ｕ＋ｏｎ　５ｅｃｎｎｄｕｒｙ　ａｇｅｎｔ］であるマイコプラズマ　ヒオリニ ス［Ｍ、　ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ］のために一般に困難である。

この疾病は咳が起こす噴霧質（エアロゾル）によって拡散し、また、感染したり 回復期にあるキャリヤブタ［５ｗ１ｎｅ］との直接の接触によって拡散する。非 感染の動物を感染動物と一緒にさせておくことは早期感染ならびに頻繁な再感染 の原因となる。

感染はしばしば分娩中のキャリヤ雌ブタ［５ｏｖｌから小ブタ［ｐｉｇｌｅｔ］ へのものから始まるのが一般である。もっとも今日の家畜管理技術のゆえに、感 染は加齢が進むまで目立たないことが多いかもしれない。追加的感染は一般に乳 離れ直後のプールされたブタ［ｐｉｇ］に多（見られる。明らかな疾病は通常６ 週齢またはそれ以上のブタ［ｐｉｇ］に見られる。平均的な動物の成長率は餌変 換率で約２２％減り、約１６％遅れることになる。

屠殺した動物を調査した結果、マイコプラズマ肺炎に典型的な病変がブタ［５ｗ １ｎｅ］の３０〜８０％に見られた。１３州中の３３７群［ｈｅｒｄ］からの結 果が、その群の９９％がマイコプラズマ肺炎に典型的な肺炎障害のあるブタ［ｈ ｏｇ］を有していることが分かった。したがって効果的な予防法及び治療法に対 する必要性には大きなものがある。

チアムリン［ｔｉａｍｕｌｉｎ］、トリメトプリム［ｔｒｉｍｅｔｈｎｐｒｉｓ ｌ、テトラサイクリン［ｔｅｔｒａｃｙｃｌ　ｉｎｃ］及びリンコマイシン［ｌ 　１ｎｃｏ＋＋＋ｙｃｉｎ］にはそれなりの利益があった。しかし抗生物質は高 価であり、継続的な使用が必要とされる。また、再感染は今日にも通じる永遠の 課題である。しかも抗生物質はマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｌの拡散を効果的に阻止するものとは考えられていない。

病原菌を保有していない群を維持することによる予防法は可能だが、マイコプラ ズマヒオニューモニエ［１１，ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｌの再導入［ｒｅｉ ｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ］が生ずる。

一般にワクチンは、抗原の４つの範鴫の中から１つを採用している。すなわち、 非自然界ルートで得られた生きた微生物、生きている微生物を希釈したもの、微 生物を殺したもの、そして微生物の断片またはただ１つだけの抗原または産物で ある。

いずれの場合も目標とする所は、問題の疾病を起こすことなく抗原を提供するこ とである。ホルマリン、アジド［ａｚｉｄｅ］、凍結融解［ｆｅｅｚｅ−ｔｈａ ｗ］、音波処理、熱処理、急速減圧、洗剤（特に非イオン洗剤）、リゾチーム、 フェノール、タンパク分解酵素、βプロピオラクトン［β−ｐｒｏｐｉｏｌａｃ ｔｏｎｅ］など、多数の異なる不活化剤［ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ａｇｅｎ ｔ］や手段が採用されている。

マイコプラズマには関係のないある種のバクテリアの不活化としてチメロサール ［ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌｌがＧｒｅｅｎｂｅｒｇらの米国特許第３５２２７９０ 号、およびＭ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｌｕｇｇｌｅｔｏｎらの米国特許 第２９０８６１４号に提案されている。Ｒａｇｌａｎｄらの米国特許第５００４ ６０７号はバクテリデをホルマリンで不活化するものであるが（第４欄第５９行 ）、その後にやはりチメロサールを防腐剤［ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ］として 添加している。しかしチメロサールはこれまでマイコプラズマヒオニューモニエ ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｌをワクチン利用するのに不活化すること に使われていない。

Ｓｍ１ｔｈ　Ｋ１１ｎｅ　Ｂｅｅｃｈａｍが販売しているＲｅ５ｐｉＳｕｒｅ［ 商標］ワクチンは、オイルアジュバントを加えた化学的に不活化されたマイコプ ラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕ■ｎｎ１ａｃｌワクチンである 。Ｐｅｔｅｒｓｅｎらは、Ｐｒｏｃ、　Ａｍｅｒ、＾５ｓｏｃ−５ｗ１ｎｅ　Ｐ ｒａｃｔ、の第１７〜２１頁（１９９１年３月）に、有効なワクチン利用として ホルマリンでマイコプラズマヒオニューモニエ［１，ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｅｌを不活化して細菌ワクチン（バクテリン［ｂａｃｔｅｒｉｎ］）を産出する 方法について開示している。Ｆａｕｌｄｓらは米国特許第４９８５２４３号で、 ワクチンを調製するため凍結融解［ｆｒｅｅｚｅ−ｔｈａｗ］を使うてマイコプ ラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｎｐｎｅｕ＋５ｏｎｉａｅ］から抗原を抽 出している。

ワクチンとしての利用可能性がある抗原を発現させるため組み換えＤＮＡ技術も 利用されている。５ｃｈａｌｌｅｒらの米国特許第４８９４３３２号。

マイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕ■ｏｎｉａｅ］ハ溶解 されて、そのタンパク質の面から分析されている。例えばｆｉｓｅらにより、Ｊ ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１６９：　５５４［１−５５ ５５（１９８７）。

しかしどれが感染防御免疫応答［ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｉ膳■ｕｎｅ　ｒｅｓ ｐｏｎｓｅ］を引き出す決定的なタンパク質なのかに関する知見は確立されてい ない。

これまで多数のワクチンが抗原の免疫原性を促進させるためアジュバントを使っ ている。、シかしアジュバントがどのように作用するかのメカニズムは全体的に 知られたわけではない。ある種のアジュバントは抗原を緩慢に放出することによ って免疫応答を促進するものとされているが、他の種のものはそれ自体が強い免 疫原的［ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ］であって相乗作用効果があるとされている。

いろいろなワクチンに使われているアジュバントとしては、オイルと水との乳濁 液、完全７０インドアジユバント、不完全フロインドアジュバント、コリネバク テリウム　パルブム［ｃ、　ｐｕｒｖｕｍコ、ヘモフィラス［Ｈｅｍｏｐｈｊｌ ｕｓ］、マイコバクテリウムブチリカム［Ｍ、　ｂｕｔｙｒｊｃｕ園］、水酸化 アルミニウム、デキストランサルフェート、酸化鉄、アルギン酸ナトリウム、バ クトーアジュバント［Ｂａｃｔｏ−Ａｄｊｕｖａｎｔ］、ポリアミノ酸やアミノ 酸のコポリマーのようなある種の合成ポリマー、サポニン、イオタカラギーナン ［１ｏｔａ　ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ］、　Ｒｅｇｒｅｓｓｉｎ（商標）、　Ａ ｖｉｒｉｄｉｎｅ（商標）、モノオレイン酸マンニット［Ｍａｎｎｉｔｅ　ｍｏ ｎｏｏｌｅａｔｅ］、パラフィン油、そしてムラミル　ジペプチド［ｓ＋ｕｒａ ｗｙｌ　ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ］がある。

Ｙｏｓｈ　ｉｄａらは米国特許第３９１７８１９号で水酸化アルミニウムのゲル をホルマリン様で殺菌したマイコプラズマスイニューモニエ［Ｍ、　ｓｕｉｐｎ ｅｕｍｏｎｉａｅｌワクチンのアジュバントとして使っているが、Ｄａｙａｌｕ は、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ：　Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｌｙｃｏｐ ｌａｓｍａ　Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］５ｏｎｉａ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、　Ｓｍ １ｔｈ　Ｋ１１ｎｅ　Ｂｅｅｃｈａｍ、１−１５　（１９９０）で、その第１２ 頁においてＫｏｂｉｓｃｈらが（１９８７）マイコプラズマヒオニューモニエ［ Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕ＋ｏｏｎｉａｅ］ワクチン中に水酸化アルミニウムを使っ ていることを述べている。　ＫｉｓｈｉｍａらはＶｅｔｃｒｉｎａｒｙ　Ｍ、　 ｈｙｏｐｎｅｕｍｎｎｉｎｅｌｉｃｒｏｂｉｎｌｏｇｙ、１３：　３３５−４２ 　（１９８７）で、デキストランサルフェートをアジドで殺したマイコプラズマ ワクチンにアジュバントとして使っている。細菌型ワクチンの分野以外のものと しては、ルーマニア特許第７５１００号が水酸化アルミニウムおよびＤＥＡＥデ キストランをアジュバントとして使ったウィルスワクチンを提案している。しか しこの組合せは、マイコプラズマとのアジュバントとしては言うまでもな（、い かなる細菌とのものとしても未だ知られた状態にない。

法を提供することである。抗体の検出可能量の産生のような検出可能な免疫応答 であっても必ずしも予防できないかもしれない。したがってブタ［５ｗ１ｎｅｌ をマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｓ＋ｏｎｉａｅ］感 染から予防しようとするワクチンがこれまで試みられてきたが、予防の実効性あ るレベルまでには至っていない。

發息！υｉ！ 本発明の一目的は、ワクチン中に加えると予防的免疫応答を引き出すマイコプラ ズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｌの細菌ワクチン（ バクテリン）を調製する方法を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、その抗原性と予防的免疫応答引出能力とを維持しつ つマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｒ＋ｅｕ＋ａｏｎ　ｉａｅ 　］を不活化する方法を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、他の細菌ワクチンを干渉することもなく、また他の 細菌ワクチンに干渉されることもないマイコブラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　 ｈｙｏｐｎｅｕ■ｎｎ１ａｅｌ用のワクチンを提供することである。

本発明のもう一つの目的は、相乗作用的な組合せワクチンを提供することである 。

本発明のもう一つの目的は、特にワクチン中のマイコプラズマヒオニューモニエ バクテリンのような細菌性抗原を十分に提供するアジュバントを提供することで ある。

本発明のもう一つの目的は、培養したマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　 ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］が病原性（または病毒性）　［ｖｉｒｕｌｅｎｔ ］か否かを調べる検査法を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、免疫化された動物に効果的な予防的応答を引き出す ことを促す水酸化アルミニウムとＤＥＡＥデキストランとの細菌型アジュバント を調製することである。

好ましい実施例ではマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕ■ ｏｎｉａｅ］に対する有効ワクチンを調製するための従来法とは対舷的に、本発 明では有効ワクチンを調製するのにチメロサール（エチル水銀チオサリチル酸ナ トリウム）で不活化した低回数継代［ａ　ｌｏｗ　ｐａｓｓａｇｅ］のマイコプ ラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］と、水酸化アル ミニウムとＤＥＡＥデキストランとの組合せのアジュバントとを採用している。

このワクチンはそれを注射したブタ［ｐｉｇ］にマイコブラズマヒオニューモニ エ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕ■ｎｎ１ａｅ］に対する予防効果を付与する。このワ クチンを従来通りブタ［５ｗ１ｎｅ］に付与されている他のワクチンと組合せて 使うこともできる。

ましい　流側の親日 マイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｖｎｐｎｅｕｓｓｏｎｉａｅｌ感染 に対する予防ワクチンを調製するため、本発明は不活化した細菌を採用する。多 くの微生物は感染力［１ｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ］を失い、多数式にわたって培養 されると抗原を変える。実際、小児マヒ［ｐＯ目０］用の標準的ワクチンは、神 経組織または脳組織でもはや生育できない病原性［ｐａｔｈｏｇｅｎｉｅｉｔｙ ｌの多くを失うように、何代にもわたって培養生育させて変異されてきた生のポ リオウィルスが生体である。こうしたウィルスでは重要な抗原自体は変化してい ないのである。

マイコプラズマヒオニューモ＝　工［Ｍ、　ｈｙｎｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］の適 切な株［５ｔｒａｉｎ］としては、さまざまなソース［５ｏｕｒｃｅｌから得る ことができる。簡単なソースの一つはマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　 ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］について記載している上記出版物のいずれかの著 者から得るルートである。また、多くの株はＡＴＣＣとかＮＲＲＬのような寄託 機関から得ることもできる。ＡＴＣＣだけでも６株のマイコプラズマヒオニュー モニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕ■ｏｎｉａｅ］を販売対象として挙げている。こ の病気が広範囲にわたって多発していることに鑑みるとき、肺の分泌物または疾 病動物から採取した組織からマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐ ｎｅｕｍｎｎｉ８ｃ］を回収［ｒｅｃｏｖｅｒ］　Ｌ／、適当な培地［ｃｕｌｔ ｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ］に接種することで得ることができる。

しかしマイコプラズマヒオニューモニエ［１，ｈｙｎｐｎｅｕ■ｏｎｉａｅ］は 培養中にその抗原を急速に変化させることがある。およそ５０代の継代［ｐａｓ ｓａｇｅ］以上の多回数継代の株は、その感染力［１ｎｒｅｃｔｉｖｉｔｙコを 失い、相対的に微弱な免疫防＠［ｉｍｍｕｎｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ］を誘い 出すものとなる。したがって、動物宿主［ａｎｉｍａｌ　ｈａｓｔ］における感 染能を保持している新しく単離した株または培養した株を採用することが好まし い。どれだけの回数の継代が問題なのかについては知られていないが、本発明は およそ１０代以上継代していないマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙ ｏｐｎｅｕｍｏｎ　ｉａｅ　］株で好ましくは出発しており、より好ましくは大 規模生産前の状態では約５代またはそれ以下だけのもので出発している。少ない 継代回数の培養株を使うことによって抗原がその自然の状態を保持し、したがっ て感染微生物に対する感染防御免疫応答を引き出すものと考えられる。

本発明においては、大規模生産は１０代以下の継代株で行われた。５代継代した 株でも感染性［１ｎｆｅｃｔｉｏｕｓ］がある。株が感染力［１ｎｆｃｃｔｉｖ ｉｔｙｌを失い、感染防御免疫応答を引き出さな（なる継代回数は、その株の種 類によって異なるが、一般に約１０代〜約５０代の間であると思われる。本発明 の目的に合わせて、「低回数継代［１ｏｗ−ｐａｓｓａｇｅ］Ｊとは動物をして 自然感染から実質的に感染防御免疫応答を引き出すことがなお効果的にできる株 を意味する。

最近のデータは、表面抗原ｐ４４が感染防御免疫を引き出すのに必要であること を示唆しているが、これは予防された動物がこの抗原に対する高い抗体レベルを 有していることから言われることである。さらにｐ４４に対して向けられる抗体 は細菌の生育を予防する。

その細菌がワクチン中において使用できるか否かを決定する一方法は、ｐ４４に 対する抗体の存在下でその細菌を培養することである。その抗体が細菌の成長に 何の影響も示さないなら、その細菌は抗原を持たないか、または抗原を変化させ てしまっていると推論することができる。こうした結果は、その細菌が効力を持 たないから、それで細菌ワクチンを調製するよりはむしろ捨ててしまった方がよ いことを示している。別法は、多くの標準的イムノアッセイまたはタンパク質ア ッセイのどれかを、サンプルの細菌がｐ４４を含有しているか否かの決定に利用 することである。

マイコプラズマヒオニューモニエ［１１，ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］株が有 効なバクテリンを調製するにはあまりにも長い期間培養生育させたのではないか と疑ったり、それを発見したときは、その株は細菌で動物に感染させることによ って新しくして、感染細菌を回収すればよい。これと同様の技術を、培養した株 が有効なワクチンを供給するのに十分に新鮮であるか否かを決定するアッセイと して採用することができる。マイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐ ｎｅｕｍｏｎｉａｅ］株はその感染力［１ｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙコを失ってもワ クチン調製にとってなお有効であるが、ワクチンという目的にとっては細菌の大 規模生産のために感染性［１ｎｆｅｃｔｉｏｕｓｌがあるか、低回数継代のシー ドストック［５ｅｅｄ　５ｔｏｃｋ］を使う方が好ましい。

ヒト株を含むマイコプラズマの他の種［５ｐｅｃｉｅｓ］も研究者、寄託機関な どから入手することができる。このようなマイコプラズマの種としては、マイコ プラズマアルギニー二［Ｌ　ａｒｇｉｎｉｎ目、マイコプラズマボビス［Ｍ、　 ｂｏｖｉｓ］、マイコプラズマカリフォルミカム［Ｍ、　ｃａｌｉｆｏｒｓｉｃ ｕ鳳］、マイコプラズマコンシャンクテイベ［Ｍ、　ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｅ ］、マイコブラズマフロキュラレ［Ｍ、　ｆｌｏｃｃｕｌａｒｅコ、マイコプラ ズマガリセプティカム［Ｍ、　ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｉ＋］、マイコプラズ マホモニス［Ｍ、　ｈｏｍｏｎｆｓ］、マイコプラズマ　ヒオリニス［Ｍ、　ｈ ｙｏｒｈｉｎｉｓ］、マイコプラズマヒオシノビエ［Ｍ、　ｈｙｏｓｙｎｏｖｉ ａｅ］、マイコプラズマ　リポファシェンス［Ｍ、　１ｉｐｏｆａｃｉｅｎｓ］ 、マイコプラズマ　ミコイデス［Ｍ、　ｍｙｃｏｉｄｅｓ］、マイコプラズマボ ビス［Ｍ、　ｏｒａｌｅ］、及びマイコプラズマニューモニエ［Ｍ、　ｐｎｅｕ ｉ＋ｏｎｉａｅ］がある。

採用されるマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｉｍｏｎｉ ａｅ］は感染性があるので、そうした病気をブタ［５ｗ１ｎｅｌに与えることは 望まないであろう。そこで本発明では、細菌を不感染性にするため細菌にチメロ サール（エチル水銀チオサリチル酸ナトリウム）の不活化量をまず添加すること によって細菌を不活化させている。ここで「チメロサール」とは、それと開成の もの及び、同じように不活化的に機能するが化学的には異なる化合物［ｃｏｍｐ ｏｕｎｄｓｌを含む。例えば細菌に水銀イオンを供給する別の化合物も使用する ことができ有効である。７実際の応用する段においてはいかなる理論にも拘束さ れたくはないが、なぜチメロサール不活化がより効果的な予防ワクチンを提供す るのかの一つの理由は、その細菌自体の最小限の変化［ｓ＋ｉｎｉｍａｌ　ａｌ ｔｅｒａｔｉｏｎ］によるものと考えられる。音波処理とか界面活性剤溶解［ｄ ｅｔｅｒｇｅｎｔ　１ｙｓｉｓ］のような一定の不活化方法は、細胞膜′［■ｅ ｍｂｒａｎｅ］を破壊することによって細菌を不活化するものである。ホルムア ルデヒド処理とか熱処理のようなほかの不活化方法は、タンパク質を変性させる ことで細菌を不活化するものである。これとは対照的にチメロサールはその働き （作用）［ａｃｔｉｏｎ］がより特異的で、感染防御免疫応答を引き出すために 必要とされる抗原に少しも影響しない。

チメロサール不活化の適切な１方法は、細菌培養全体、またはマイコプラズマヒ オニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｎｐｎｅｕ■ｏｎｉａｅ］培養物［ｃｕｌｔｕｒｅ ｓ］もしくは感染している動物の組織または体液から分離した細菌、に市販の１ ０％チメロサールを添加することである。マイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ 、　ｈｙｏｐｎｅｕｓｏｎｉａｅｌを完全に不活化するのに必要とされるチメロ サールの最終濃度は、その細菌濃度と使用環境によって変わってくるであろう。

成長温度（約３５℃）近くに２４時間、約０．０１％濃度のチメロサールを維持 すれば、その細菌を不活化するのに効果がある。

この量は、そのように処理された培養物［ｃｕｌｔｕｒｅｓ］からは生きたマイ コブラズマヒオニューモニエ［１１，ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｌが培養され 得ないのであるから、致死量でもあると考えられる。

チメロサールは動物にそのワクチンを注射する前にその製品から除去しておいて もよい、１しかしチメロサールのこの量は、不活化細菌を含むワクチンを受ける 動物を有意に損傷するのに十分な量ではない。したがってチメロサールの除去は 必要とされるものではなく、むしろそれをそのまま防腐剤として作用させる方が 好ましい。

こうして得た不活化マイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍ ｏｎｉａｅｌは、またマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕ ｍｏ旧ａｅ］ｒバクテリン」とも呼ばれるものであるが、ワクチンとして直接採 用することができる。その有効量は、投与される動物の種、品種、齢、大きさ、 健康状態、およびその動物が以前同じ有機物に対するワクチンを投与されたこと があるかどうかなどによって異なる。ワクチンに添加される他の成分ならびに投 与の経路もまた、有効量に影響するであろう。抗原の各バッチは個々に補正［ｃ ａｌｉｂｒａｔｅ］　Ｌ／でもよい。有効量は当業者なら、異なる量を秩序立て て試行錯誤することにより容易に決定することができる。

ｐ４４抗原は出願人の殺したワクチンの有効性に有意に貢献することは明らかで ある。したがって例えばワクチン製品中のｐ４４のレベルをモニターすることは 有効な品質管理たり得る。

また、ｐ４４抗原のみ、または他の抗原と共にそれを単離することができ、チメ ロサールで殺したバクテリンの代わりにそれを使うことができる。この抗原は、 ワクチンとして使うときはマイコブラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｎｐｎ ｅｕｍｏｎｉａｅ］以外の抗原あるいはその他の微生物と混合してもよい。ｐ４ ４はまた、自己重合することもできるし、化学的に池の物質に結びついて、より よい免疫原を提供することもある。

予防ワクチン生産の別の面は、自然感染を実質的に予防するのに十分な感染防御 免疫応答を高めるためアジュバントを使用することである。バクテリンまたはシ ングル［ｓｉｎｇｌｅ］タンパク質の免疫原性を促進するため、水酸化アルミニ ウム及び／又はＤ　ＥＡ　Ｅデキストラン（ジエチルアミノエチルエーテルデキ ストラン）を含有するアジュバントを使ってもよい。水酸化アルミニウムの濃度 は非常に広く、投与の経路によって約１．５％までのレンジである。０．１〜１ ．０％のレンジの濃度が典型的である。ＤＥＡＥデキストランの濃度も同様に広 く、例えば約６％まで使うことができる。ワクチン中の水酸化アルミニウム及び ＤＥＡＥデキストランの最も好ましい濃度は、約０．２４％〜約０．３９％の水 酸化アルミニウムと、約１．５％のＤＥＡＥデキストランである。

ＤＥＡＥデキストランはさまざまな分子量のものが市販されている。本願におけ る実施例では分子量５００．０００ダルトンのＤＥＡＥデキストランを使ってい るが、これ以外の分子量のものでもアジュバントとして使うことができる。デキ ストランサルフェートもアジュバントとして使ってみたが結果はそれほどよ（な かった。

好ましい細菌はマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎ ｉａｅｌであるが、ここに記載の組合せアジュバント［ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ 　ａｄｊｕｖａｎｔ］は他の細菌、特に他の種類のマイコプラズマと共にでも使 うことができる。水酸化アルミニウムとＤＥＡＥデキストランの最適濃度は、細 菌の種類および調製法［ｐｒｅｐａｒａｔｉｎｎ］によって異なるが、本発明に 従う者が一方の濃度を固定させておいて他方の濃度を変更させ、いずれが最も予 防効果があるかを決定することによって容易に知ることができる。

１アジユバントの濃度を変更することは別のアジュバントの好ましい濃度を変更 することになる可能性がある。アジュバントの好ましい組合せは、使用されるバ クテリンならびにワクチンを接種される動物の如何に左右される。

本願は、特にマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｗ＋ｏｎ ｉａｅ］、ボルデテラ　ブロンキセプテイ力［Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｂｒｎｎ ｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ］及び、バスツーレラ　マルトシダ［Ｐａ５ｔｅｕｒｅｌ ｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ］のＡ型及びＢ型、とのアジュバンｉ・の有効性を示 すものであるが、作用のメカニズムについてはいかなる細菌からのバクテリンで も機能するものと考えられている。その高められた免疫応答効果の程度はバクテ リン如何で異なるが、細菌感染から受ける有益な効果はいずれでも維持されてい る。

アジュバントと共にされているか否かに無関係に、バクテリンまたは分離された タンパク質は、予防接種に使用可能なビークル（担体）と混ぜ合わせられる。よ く知られた例としては、無菌水、生理食塩水、あるいは緩衝溶液などがある。懸 濁性［５ｕｓｐｅｎｄａｂｉｌｉｔｙ］及び溶液中の分散性を高めるため添加剤 を使ってもよい。ワクチンを運搬するビークルの多くの従来例が知られているが 、それらは上記の引例中に言及されている。投与の経路および投与を受ける動物 の条件によってどのような適切なビークルを選択するかは当業者に知られている 所である。

免疫感作は、いずれかの従来経路によって行われる。例えば経口、経鼻［１ｎｔ ｒａｎａｓａｌ］、　ｘアゾールおよび注射（筋肉内［ＩＭ。

ｈｙｏｐｎｅｕｓ＋ｎｎ１ａｅコ］、皮下［ＳＣ］、血管内［ＩＶ］、皮肉［Ｉ Ｄ］その他の方法の）がある。投与の経路はワクチン接種される動物如何、ワク チン接種経験の有無、またそのワクチンを投与する人の都合などによって異なる 。反復的にワクチンを接種するときは、最初または最後の接種から長い時間の経 過後の免疫応答を高めるため定期的に時間間隔をとって行うのが好ましい。ワク チン接種行為間の時間間隔がどのくらいかは、動物の齢および状態によって異な る。最初の接種のときはその間隔は一般に１週間より長いもので、好ましくは約 ２〜３週間である。以前に接種したことがある動物の場合は、約１年に１回、懐 妊前または懐妊中の予防接種が好ましい。

投与するワクチン量はそのバクテリン濃度、投与経路、および動物如何によって 容易に決定される。以下に挙げる実施例から、どれほどの投与量が適切であるか は明らかである。重要なことは、投与ｆｉ［ｄｏｓａｇｅ］が自然感染に対し少 なくとも部分的に予防効果を提供するということである。

マイコプラズマヒオニューモ−：ｒ−［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］バ クテリンは、都合により、あるいは効果を高めるため、それ単独か、または池の ワクチンと組合せて使う。混合ワクチンは複数感染に対する予防をもたらすこと が好ましい。特に関心が持たれるのはマイコブラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　 ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｌとボルデテラ　ブロンキセプテイ力［Ｂｏｒｄｃ ｔｅｌ　ｌａ　ｂｒｎｎｃｈｉｓｅｐｔｉａ］およびバスツーレラマルトシダ［ Ｐａ５ｔｅｕｒｅｌｌａ　ｗｕｌｔｏｃｉｄａ］のＡ型、Ｄ型の組合せである。

というのはこれら３つの全てがブタの大半の疾病の原因となっているからである 。また、このような組合せをしても互いに相手に干渉したり感染防御免疫応答を 刺激したりすることはない。

その他のワクチンも全く別の手段で不活化してもよい。マイコプラズマヒオニュ ーモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕ＋＋＋ｏｎｉｎｅ］と組合せられるその他のワ クチンはマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ］バクテリン用のアジュバントと両立できるものでなければならない。

マイコプラズマヒオニューモニｘ　［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｊａｅ］バク テリンはまた、生物学的被検体［ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｔｅｓｔ　ｓａｍｐｌ ｅ］がマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｌ の抗原またはそれら抗原に対する抗体を有しているか否かを決定する診断目的の ための抗原としても使うことができる。

動物のマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］ 感染のアッセイとしては、検出可能に標識した本発明のマイコプラズマヒオニュ ーモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏ旧ａｅ］バクテリンの存在下で、感染して いると疑われている問題の動物からの抗体含有の生物学的被検体をインキュベー トし、結合を検知するのが典型的な例である。

こうして本発明ではこの面に関し、マイコプラズマヒオニューモ＝工［Ｍ、　ｈ ｙｎｐｎｃｕ＋＋ｏｎｉｕｅコバクテリ〉を、細胞［ｅｅｌｌ］、細胞断片［ｃ ｅｌｌ　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ］あるいは可溶性タンパク質を固定することができ る固相の支持体、例えばマイクロタイタープレート［■１ｃｒｏｔｉｔｅｒ　ｐ ｌａｔｅ］のようなものと組合すことができる。こうした支持体はその後適当な 緩衝液で洗浄され、抗体を含有する被検体で処理される。固相の支持体はもう一 度緩衝剤で洗浄して結合していない抗体を除去する。標識したマイコブラズマヒ オニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅコを加え、支持体に３回目 の洗浄を行い、なお結合していない標識された抗原を除去する。次に上記の固相 支持体上に結合した標識の量を従来法で検出する。

ここで「固相支持体」とは抗原または抗体を結合することができる支持体のすべ てをいう。よく知られた支持体ないしキャリヤとしては、ガラス、ポリスチレン 、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然 及び人工のセルロース（特にニトロセルロース）、ポリアクリルアミド、アガロ ース、及び磁鉄鉱がある。キャリヤの性質としては本発明の目的にとっては、あ る程度可溶性があってもよくまた可溶性がなくてもよい。支持体の材料は結合す る分子が抗原または抗体に結合可能である限りどんな構造的形態［ｓｔｒｕｃｔ ｕｒａｌｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ］でもよい。したがって支持体の形態はビ ーズのような球体でも、試験管の内壁あるいは棒の周面のような円筒体でもよい 。あるいはシート状、試験紙などのような平らな面でもよい。好ましい支持体と してはポリスチレンのビーズがある。当業者なら抗原または抗体に結合する多く の適当なキャリヤを知るだろうし、日常の実験から推測することも可能だろう。

あるいは、バクテリン粒子自体が、それ自体固相として十分に大きいと考えるこ ともできよう。そう考えられる場合には、バクテリンを抗体含有のサンプルに混 合すれば凝集の成否が分かる。

マイコブラズマヒオニューモ＝工［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｓ＋ｎｎ１ａｅ］特異 的抗体が検出可能に標識できる１方法は、その抗体を一定の酵素と結合させて、 それをエンザイムイムノアッセイ（Ｅ　Ｉ　Ａ）で使用するか、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ で使用するかである。次にこの酵素は、後に基質に露出するのであるが、例えば 分光光度計、蛍光定量法的手段あるいは裸眼観察で検出することができる化学的 部分［ｃｈｅ■１ｃａｌ　ｍｏｉｅｔｙ］を生成するように基質と反応する。マ イコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］特異的抗 体を検出可能に標識するのに使用することができる酵素としては、例えばホース ラディツシュペルオキシダーゼ［ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒ。

ｘｉｄａｓｅ］、マレートデヒドロゲナーゼ（リンゴ酸脱水素酵素）［ｉ＋ａｌ ａｔｅ　ｄｃｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｃｌ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ［５ ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ　ｎｕｃｌｅａｓｅコ、δ−Ｖ−ステロイドイソメ ラーゼ［δ−Ｖ−ｓｔｅｒｏｉｄ　ｉｓｏｇ＋ｅｒａｓｅ］、酵母アルコールデ ヒドロゲナーゼ［ｙｅａｓｔ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｄｃｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｃｌ 、ａ−グリセロホスフェート　デヒドロゲナーゼ［ａ　−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏ ｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅコ、トリオースホスフェート　イソ メラーゼ［ｔｒｉｎｓｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｉｓｎｍｅｒａｓｅ］、アルカ リホスファターゼ［ａｌｋｕｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ］、アスパラギ ナーゼ［ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｃ］、グルコースオキシダーゼ［ｇｌｕｃｎｓ ｅｏｘｉｄａｓｅ］、β−ガラクトシダーゼ［β−ｇａｌａｃｔｎｓｉｄａｓｅ ］、リボヌクレアーゼ［ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ］、ウレアーゼ［ｕｒｅａｓ ｅコ、カタラーゼ［ｃａｔａｌａｓｅ］、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナ ーゼ［ｇｌｕｃｎｓｅ−６−ｐｈｃ＞５ｐｈａｔｅ　ｄｃｈｙｄｒｏｇｅｎａｓ ｃｌ、グルコアミラーゼ［ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ］、及びアセチルコリンエ ステラーゼ［ａｅｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅｌなどがある。

いろいろなイムノアッセイのうちのいずれかを使って検出することができる。例 えば、バクテリンを放射性的に標識することによってラジオイムノアッセイ（’ ＲＩＡ）を使用して抗体結合を検出することができる。ＲＩＡに関する明快な解 説は１ａｒｋ。

Ｔ、　Ｓ、らのＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｉｎ　Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎ　ｉａｅコｏｌｅｃｕ ｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ 　Ｃｏａ＋ｐａｎｙ、　ＮＹ　（１９７８）のＣｈａｒｄ、　Ｔ、によるｒＡｎ 　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｔｏｎ　ｔｏ　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ　Ａｓ５ａｙ　ａ ｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓＪと題する章にある。

ここにこれに言及して記載に代える。

放射性同位元素はガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターを使って 、あるいはオートラジオグラフィーによって検出することができる。本発明の目 的にとって特に有効な同位元素は、”Ｈｌ　’２５１１　”ＩＩＩ　３５Ｓｌ　 １４ｃｌ及び好ましくは、１２５■である。

バクテリンを蛍光化合物で標識することもできる。蛍光標識されたバクテリンを 適当な波長の光に当てると、蛍光することによりその存在を検知することができ る、最もよく使われている蛍光標識化合物としては、フルオレセインイソチオシ アネート、ローダミン、フィコエリセリン［ｐｈｙｃｎｅｒｙｔｈｅｒｉｎ］、 フィコシアニン、アロフィコシアニン、Ｏ−７タルアルデヒド、及びフルオレサ ミンがある１゜ バクテリンは１ｓ２Ｅｕその他のランタニド系列のもののような蛍光発色金属を 使って検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレン三アミン 五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キ レート基を使ってバクテリンに結合することができる。

バクテリンはまた、化学発光化合物に結合させることによって検出可能に標識す ることができる。化学発光のタッグを付けられたバクテリンは、化学反応すると きに生ずる発光が検出されることによって決定できる。特に有効な化学発光標識 化合物としては、例えば、ルミノール、イソルミノール、セロマチイック　アク リジニウムエステル［ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ　ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ　ｅｓｔｅ ｒ］。

イミダゾール、アクリジニウム塩［ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ　５ａｌｔコ、シュウ 酸エステル［ｏｘｕｌａｔｅ　ｅｓｔｅｒ］がある。

同様に、生物発光化合物も本発明の標識として使うことができる。生物発光とは 、触媒タンパク質が化学発光反応率を高める生物学系中に発見される化学発光の 一種である。生物発光タンパク質の有無は発光があるか否かを調べることによっ て決定される。本発明の目的にとって重要な生物発光化合物としてはルンフェリ ン、ルシフェラーゼ、エクオリン［ａ６ｑｕｏｒｉｎ］がある。

標識の検出は、例えばもしその検出可能な標識が放射性ガンマ線エミッターであ るなら、シンチレーションカウンターによって、また、もしその標識が蛍光物質 であるなら、蛍光光度計によって行うことができる。毒素標識の場合には、検出 はその酵素用の基質を使う比色法［ｃｎｌｎｒｉｍｅｔｒｉｃ　ｍｅｔｈｎｄｌ によって行うことができる。検出はまた同様に調製した対照と比較して基質の酵 素反応の程度を肉眼で観察することにより行うこともできる。

検出可能に標識した抗体の集中［ｆｎｃｉ］の検出は、疾病または機能障害状態 の徴候であり、サンプル中にあるマイコブラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙ ｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］を測定するのに使うことができる。本発明の目的にと ってこうした分析により検出された細菌は生物学的サンプル中に存在し得る。そ れを含有するサンプルはいずれも使うことができる。しかし診断的な本発明から 受ける利益の一つは侵襲的（または観血的）な組織の除去を行わな（でも済むと いう点である。したがって好ましくはサンプルは、例えば鼻、喉、または肺の液 体のような生物学的液である。しかし本発明はこのようなサンプルを使うことに のみ限定されるものではなく、当業者がその他のサンプルを使うことを含むもの である。

イン・サイツユ［ｉｎ　５ｉｔｕ］検出は動物から組織標本を除去し、本発明の 標識した抗体の組合せを標本に供与することによって行うことができる。その抗 体（または断片）は、好ましくは標識した抗体（または断片）を生物学的サンプ ルに適用［ａｐｐｌｙｌまたは被ｌ［ｏｖｅｒｌａｌ’］することによって供与 される。このような工程を通してマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙ ｎｐｎｅｕ■ｏｎｉａｅ］の有無を決定することができるだけでなく、検査して いる組織の中のマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙａｐｎｅｕｍｎｎ ｉａｅ］の分布状態［ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｎｎ］も知ることができる。本発明 を使うことによって当業者は微細構造学的方法（例えば染色法）の幅広い中から いずれかを修正して上記イン・サイツユ［ｊｎ　５ｉｔｕ］検出を行うことが容 易に考察できるであろう。

ｐ４４を含有しているか否かを決定するために細菌を検査することは、Ｃ１１ｄ ｅのＭ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］ｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｍ、　ｈｙｏｐｎ ｅｕｍ。

ｎ１ｕｅ］ｙｃｏｐｌａｓｓ＋ｏｌｏｇｙ第１巻、Ｒａｚｉｎら編集（１９８３ 年）の第４０５−４１０頁のｌ”Ｇｒｏｗｔｈ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　Ｔｅ５ ｔｓＪのように、従来の成長抑制アッセイによって行うことができるであろう。

好適な抗体が、単離したｐ４４またはｐ４４を含有する精製画分で動物を免疫感 作してその血清を回収するか、ＷｉｓｅらのＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｅｔｅ ｒｉｎｌｎｇＬ　１６９：第５５４６−５５５５頁（１９８７年）に記載のよう にしてモノクローナル抗体を産生ずることによって作ることができる。あるいは サンプルが抗原を有しており、固相及び／又は標識がｐ４４に直接または間接に 結合可能な抗体を有しているときは上記イムノアッセイフォーマットのいずれを も使うことができる。

本発明に関するさらなる説明は次の実施例［ｗｏｒｋｉｎｇ　ｅｘａｍｐｌｅ］ で行う。

実施例１・　マイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍ（）旧 ｕｅコの調製 マイクプラズマヒオニューモ＝工［Ｍ、　ｈｖｏｐｎｅｕ＋５ｎｎｉａｃ］株１ １を＾ｍｅＳｉｔ＞ｗａの１Ｏｖａ　５ｔｕｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｖ ｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｌｅｄｉｃｉｎｅ　Ｒ ｅ５ｅｕｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｔｔｕｔｅのＤｒ、　Ｒｉｃｈｎｒｄ　Ｒｏｓｓから 入手した肺ホモジネートで培養した後移したブタから取得し、５代議代培養した 。そのつど典型的なコロニーを選んだが、成長はマイコプラズマヒオニューモニ エ［１！、　ｈｙｏｐｎｅｕ■ｎｎ１ａｅｌの単一特異性抗血清によって抑制さ れることが示された。この細菌はブタを感染させるのに使ったが、病毒性［ｖｉ ｒｕｌｅｎｃｅ］を維持していることが確認された。感染した細菌を回収しさら に５代議代培養した。

細菌の大規模生産をマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕ諺 ０旧ａｅ］を３５℃土２℃で２０〜１００時間撹拌しながら液体培地で生育させ ることにより行った。成長は、培地の１部分［ａｎ　ａｔｉｑｕｏｔ］中の細胞 をアクリジンオレンジで染色し顕微鏡で数えてモニターした。培地はハンクス液 ３０％、プレインハート　インフュージョン［Ｂｒａｉｎ　Ｈｅａｒｔ　Ｉｎｆ ｕｓｉｏｎｌｏ、４９％、ＰＰＬＯブロスパウダー０．５２％、Ｍａｚｕアンチ フオーム［Ｍａｚｕａｎｔｉｆｎｒｍ］０　、００２５％、１５〜２０％酵母エ キス４％、酸沈降ブタ血清１０％、ウマ血清１０％および残りの％のｐＨ７゜２ ±０．２の水から構成した。

実施例２．　マイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕ■０旧ａ ｅ］の不活化 ６力月以内に調製した１０％のチメロサール溶液をｐＨ７゜２±０．２の培養物 に１　：　１０００の比率で添加し、チメロサールの終濃度が１　＋　１０，０ ００となるようにした。このように処理した培養物を３５℃±２℃で撹拌しなが ら２４時間インキニージョンした。この処理後には成長可能な細菌は全く検出さ れなかった。

この培養物［ｃｕｌｔｕｒｅ］を遠心分離機にかけ、０．０１％濃度を維持する ため必要に応じてチメロサールを追加した。そのＩくクチリンの力価［ｐｎｔｅ ｎｃｙ］をｌｌ１ｓｅらのＪｏｕｒｎａｌ　ｎｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ。

１６９：　５５４６−５５５５　（１９８７）に記載のようにｐ４４に対するモ ノクローナル抗体を使ってウェスタンプロットアッセイすることによりｐ４４タ ンパク質を測定して決定した。その他のｐ４４に特異的なモノクローナル抗体ま たはポリクローナル抗体は精製したｐ４４タンパク質で動物を免疫させ、所望の 抗体を従来法に従い取得することによって調製することができる。

ｐ４４のユニット数を、イムノプロットをスキャニングし、各イムノプロットに つき背景密度［ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ　ｄｅｎｓｉｔｙ］を減算することによっ て決定した。その密度を１００に分割しＮａｔ　ｉｏｎ。

ａｌ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　５ｅｒｖｉｃｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（Ｎ ＶＳＬ）の相対力価プログラムバーンヨン’１．０　（Ｒｅｌｐｏｔ）にプログ ラムのインストラクションに従い入力した。各試験の連続的サンプルに与えられ る相対力価を標準的なｐ４４ユニット値で掛は算し、その試験連続サンプルのｐ ４４価を決定した。

実施例３．　ワクチン生産 各ドースが少なくとも５０ユニツＩ・のｐ４４を有するようにワクチンを調製し た４、ワクチンｌ１１１に対する各成分の最終的濃度はｐ４４が７０ユニツトで 、ｐＨ７，２のリン酸緩衝生理食塩水中で水酸化アルミニウム０．３％、ＤＥＡ 　Ｅデキストラン１．５％、チメロサール０．０１％になるようにした。ワクチ ンの有効使用期限は満足のいく力価試験の日から２４力月である。

実施例４：　免疫感作 このワクチンを筋肉的注射または皮下注射で投与した。若いブタに対する投与量 は５〜７日に１ｍｌのワクチン、２３〜２８日に１ｍｌであった。あるいは離乳 時に１１を投与し、３週間後に１ｉ＋１を投与するのでもよい。懐妊ブタには分 娩前５週間、分娩前２週間、そしてその後の分娩については分娩前１〜２週間に 、２１を注射した。雄ブタ［ｂｏａｒ］は１年に１度２１投与されればよい。

１１０頭のブタへのワクチン接種の有効性につき、これら１１０＠のほかに、上 述の７種の異なる細菌型ワクチン製品を使った６０頭の対照ブタについて示され た。筋肉的注射箇所に局所箇所に観察された。ワクチン接種によると考えられる 接種後の臨床変化［ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｓｉｇｎ］は観察されなかった。ワクチ ン接種したブタの接種後の体重測定および出産率は対照ブタのものと変わりがな かった。これらの結果については表１に示す通りである。

実施例５：　ｆｉ合ワクチン 上記のマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏ旧ａｅｌバ クテリンのワクチンおよびその他の従来からある不活化ボルデテラ　ブロンキセ プティ力［Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ］、およびパ スッーレラマルトシダ［Ｐａ５ｔｅｕｒｅｌｌａ　ｉ＋ｕｌｔｏｃｉｄａ］のＡ 型、Ｄ型剤を混合して次の組合せをつくった　すなわち上記４種全部の混合ワク チンＡ、マイコプラズマヒオニューモニエ［１！、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｅ］バクテリンのみのワクチンＢ１ボルデテラ　ブロンキセプテイ力［Ｂｏｒｄ ｅｔｅｌｌａ　ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ］およびパスッーレラマルトシダ ［Ｐａ５ｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ］Ａ型、Ｄ型のみのワクチンＣ である。これらのワクチンを表２に従い投与した。これと同じプロトコル［ｐｒ ｏｔｏｃｏ目は別の実施例にも使った。ボルデテラ　ブロンキセプティ力［Ｂｏ ｒｄｅｔｅｌｌａ　ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ］、バスツーレラマルトシダ ［Ｐａ５ｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ］その他の細菌型抗原のソース は米国特許第４５５９３０６号に記載のものを使うことができる。

実施例６．　混合ワクチンでの免疫感作マイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、 　ｈｙｏｐｎｅｕｉｏｎｊａｅ］バクテリンを有するボルデテラ［Ｂｏｒｄｅｔ ｅｌ　ｌａ］およびパスッーレラ［Ｐａ５ｔｅｕｒｅｌｌａ］Ａ型り型バクテリ ンの力価、およびマイコプラズマヒオ０−−モニｘ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕ＋ｏ ｏｎｉａｃ］バクテリンを有しないボルデテラ［ＢｏｒｄｅＬｅｌｌａ］および バスッーレラ［ｒ’ａｓｔｅｕｒｅｌｌａ］Ａ型り型バクテリンの力価を標準的 工程に従いマウスを使って測定した。結果を表３に示す。マイコプラズマヒオニ ューモニエ［Ｍ。

ｈｙｏｐｎｅｕｍｏ旧ａｅ］ワクチンの追加がほかのワクチンの効果に何ら有害 なものではないことが明らかである。

抗体の力価についてもマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ。

ｈｙｏｐｎｅｕｍｏ旧ａｅｌバクテリンを有するボルデテラ　ブロンキセプティ 力［Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ］およびパスッーレ ラ　マルトシダ［Ｐａ５ｔｅｕｒｅｌｌａ　ｗ＋ｕｌｔｏｃｉｄａ］Ａ型り型ワ クチン、およびマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎ ｉａｅ］バクテリンを有しないボルデテラ　ブロンキセブティ力［Ｂｏｒｄｅｔ ｅｌｌａ　ｂｒｏｎｃｈｊｓｅｐｔｊｃａ］およびパスッーレラ　マルトシダ［ Ｐａ５ｔｅｔ＋ｒｅｌｌａ　１ｏｕｉｔｏｃｉｄａ］Ａ型り型ワクチンにおける 抗体力価の変化を比較することで測定した。結果を表４に示すが、マイコブラズ マヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｔａｅ］バクテリンの追加は 抗体力価を向上さぜるようである。

同様にボルデテラ　ブロンキセプティ力およびパスッーレラマルトシダＡ型り型 の効果も示すが、それらはマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎ ｅｕｍｏｎｉａｅ］ワクチンの効果にマイナスに影響するものではなくその効果 を向上させるものであることが明らかである。この事実を示すデータは表５の通 りである。

ブタノマイコプラズマヒオ＝　、　−モニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕ＋ｌｏｎ　 ｉａｅ］感染による成長抑制効果を解消して成長促進する効果を明らかにするた め、種々のワクチンについてマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐ ｎｃｕｍｏｎｉａｃ）に感染させたものと対照との比較をした。３表６にその統 計的結果が示されている１゜ワクチン接種したものと接種していない対照との比 較を、２つの微生物でチャレンジして行った。ワクチン接種は０〜２１日に１順 当たり１１の投与量のワクチンＡを筋肉内注射して行った。マイコプラズマヒオ ーユーモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｓ＋ｎｎ１８ｅコを３５日、３６日、およ び３７日に１順当たり２＋ｏｌ鼻内［ｊｎｔｒａｎａｓａｕｙ、１投与して行っ た。バスツーレラ　マルトシダ［Ｐａ５ｔｅｕｒｅｌ　Ｉａｍｕ　Ｉ　ｔｏｅ　 ｉｄａ　］を６５０に１順当たり１ｍｌ鼻内噴霧し、１順当たり０．２ｍｌを肺 胞内［ｉｎｔｒａｐｕ１ｍｏｎａｒｙ］投与した。さまざまなパラメータを比較 検討したが、その結果を表７に示す。

実施例７　継代回数の相違による効果の比較この実施例では、こウシ血清［ｃａ ｌｆ　５ｅｒｕ＋ｎ］に採用されたマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈ ｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｌの高継代株ＪＡを比較的新しい株１１Ａと比較した 。高継代株の力価は３゜８　Ｘ　Ｉ　Ｏ’ＣＣＵ／ｍｌであるのに対し、低継代 株の力価は３．８Ｘ１０　’ＣＣ１１／ａ＋１であった。そのバクテリンを不完 全フロインドアジュバントと５０１５０に混合した。チャレンジした細菌は１０ ７２ＣＣＵ／ｍｌの力価であった。８週齢の４頭のブタからなる各グループに２ １のバクテリンをＯ８目および２１日目に筋肉内注射した。

ブタを０８目、２８日目および５６日目に体重測定した。チャレンジした細菌を １順当たり２■ｌ、２８日目、２９日目および３０日目に噴霧器で鼻内投与した 。動物たちを５６日目に殺し病状を分析した。。

すべての動物が肺機能障害点数、チャレンジ後の病的臨床徴候およびワクチン接 種後の抗マイコブラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｌの抗体力価につき測定された。予防率［ｐｅｒｃｅｎｔ　ｐｒｎｔｅｃｔｉ＋ 川］は、対照の値用ら接種動物の値を差し引いた値を対照の値で割ったものを１ ００倍した数値である。低回数継代のマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　 ｈｙｎｐｎｅｕ＋１ｏｎｉｎｅ］バクテリンは予防率８２％であったが、高回数 継代マイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｎｐｎｅｕ＋５ｏｎｉａｅ］ バクテリンは３０％に過ぎなかった。いかなるバクテリンも接種しなかった対照 動物は予防率Ｏ％であった。

実施例８・　不活化剤の比較 異なる３種の不活化剤を使って調製したワクチンの予防率につき評価した。いず れの場合もマイコプラズマヒオニューモ二ｘ　［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉ ａｅｌのバルク１００Ｋ＋１を１：１０．０００倍のチメコサール、０．２５％ のホルマリンまたは０．０５％のβ−プロピオラクトン［β−ｐｒｏｐｉｏｌａ ｃｔｏｎｅ］で不活化した。各調製物を２４，０００ｇで９０分間、遠心分離機 にかけて抗原を濃縮した。ペレットをｌＱｍｌ液中に再懸濁し１０倍濃縮液をつ くった。３％の水酸化アルミニウム１．８ｓ＋１を各々に加えて、各々の２ｍｌ をＯ８目及び２週間日毎に約５週齢のブタ８頭各々に注射した。

ブタは最後のワクチン接種後１４日、１５日、１９日及び２２日目にチャレンジ を受けた。各ブタには鼻内に噴霧器を使ってンイコプラズマヒオニューモニエ［ Ｍ、　ｈｙｎｐｎｅｕ■（）旧ａｅ］の標準的チャレンジ６１を投与した３、こ の最初のチャレンジから４週間後にブタを殺した。ワクチン接種の都度、また、 チャレンジした日及び屠殺の日に、各ブタから血液を採取した。ワクチン接種し たブタは全てチャレンジ前に七ロコンバート［５ｅｒｎｃｎｎｖｅ「ｔ］シたが 、対照ブタはチャレンジ後までセロコンバー・トしなかった。肺機能障害が殺し たブタに数えられた。データを表８に示す。

実施例９：　投与経路の異同の比較 ８週齢のブタ４頭を各群から選び、経口、鼻内、または筋肉内のいずれかの経路 で予防接種した。最初の予防接種は、低回数継代のマイコプラズマヒオニューモ ・ユニ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｎｎｉａｅ］バクテリンを使って実施例７のプ ロトコルのままに接種し、別の群には別の方法で予防接種した。バクテリン１ｗ ＋１に対して、１（ｌａｇのアブリジン［ａｖｒｉｄｉｎｅ］、Ｑ、Ｑ５ｍｌの 無水エタノール［ａｂｓｏｌｕｔｅ　ｅｔｈａｎｏｌＦ、０　、２４　ｍｌのイ ンターリピッド［１ｎｔｅｒ目ｐｉｄ］、０．２ｍｌの２％水酸化アルミニウム 及び０．５ｍｌのインターロイキン２　（２００υ／ｍｌ）のアジュバントが使 われた。第２回目の投与は筋肉内注射によって投与された。鼻内注射には、先の 丸い針で１１を各鼻孔内に染み込ませた。経口投与はワクチンをミルクに混合さ せた上、グラウンドコーンで濃縮して与えることで行った。予防率は上記実施例 ７と同様に測定した。筋肉内注射のブタは４６％の予防率、経口及び鼻内投与の ブタは３７！ンの予防率であった。

実施例１Ｏ：　さまざまなアジュバントの比較実施例７と同じ方法で低継代マイ コブラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕ■ｏｎｔａｅ］のバクテリ ンを不完全フロインドアジュバントと実施例９のアジュバントとの筋肉内注射で 上記評価基準下に比較した。予防率は、不完全フロインドアジュバントで３０％ 、実施例９のアジュバントで４６％であった。

さらに、実施例９のアジュバントと他の２つのアジュバントを鼻内投与して比較 してみた。第１のアジュバントは１０＋ｇのアブリジンと、０．１５ｍ１の無水 エタノール、０．８５ｍ１の１０％インターリビット、５ＱｍｇのＴＤＭ／ＭＰ Ｌ及び、０．１８ｍ１の２％水酸化アルミニウムをバクテリン１１中に含むもの 、第２のアジュバントは、０．５ｍｌのＤＥＡＥデキストラン（４００１ｇ／■ Ｉ）及びＯ’、　５　ｍｌのインターロイキン２　（２００Ｕ／ｍｌ）をバクテ リ２１ｍｌ中に含むものである。実施例７の評価基準による予防率は実施例９の アジュバントにつき３７％、上記第１アジユバントにつき４６％、第２アジユバ ントにつき６４％であった。ＤＥＡＥデキストラン（分子量約５００．０００） 含有のアジュバントは著しく効果的であることが明らかである。

実施例１１：ＤＥＡＥデキストランと水酸化アルミニウムの異なる量によるアジ ュバントの効果 母［ａ　ｃｎｍｍｎｎ　ｄｅｎｎｍｉｎａｔｎｒｌとすることによって有効であ ること、また、ＤＥＡＥデキストランの使用も有効であることが示されている。

したがってこれら２つの組合せをアジュバントとして用いることは有効であると 推定される。これら２つのさまざまな濃度についてその有効性を比較検討した。

５１類のワクチンを試すため３週〜４週齢のブタを６群に分け、実施例４のバク テリンおよびアジュバントの１ドーズを３週間に２回の間隔でワクチン接種した 。非接種の対照群Ｆも使用した。第２回目の接種後７０目に全部のブタに３日間 連続して標準的病原性のマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅ ｕｍｏ旧ａｅ］を２１鼻内に噴霧してチャレンジした。チャレンジ後４週間口に ブタを殺し肺機能障害の如何を調べるため肺を検査した。結果を表９に示す。

最初のワクチン接種のとき及びチャレンジのときにブタから採血し血清抗体力価 をＥＬＩＳＡで決定した。抗マイコブラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐ ｎｅｕ＋＋ｕ）ｎｉａｅ］抗体の幾何平均力価［ｇｅｏ＋ｏｅｔｒｉｃ　ｍｅａ ｎ　ｔｉｔｅｒ］を測定した。データを表１０に示す。

実施例１２：　マイコプラズマ抗原に対する抗体によるマイコプラズマ成長抑制 に関する分析 マイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］の成長 を抑制する能力に関してさまざまなタンパク質に対する抗体の効果を試験した。

そのタンパク質が予防的抗原であるか否かを測定するためである。異なる抗体を 各々添加するために６枚のプレートを用いた。、モノクローナル抗体はｒｉｓｅ らのＪｏｕｒｎａｌ　ｎｒＢａｃｔｃｒｉ萌＋ＩｇＬ　１６９：第５５４６５５ ５５頁に使われたものと同じであり、ハイブリドーマを保持するマウスの腹水液 を排水させて得た。抗体製剤［ｔｈｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｐｒｅｐａｒａｔｉ ｎｎｓ］は腹水液抗−ｐ７０マイコプラズマヒオニューモ＝　ｘ　［Ｍ、　ｈｙ ｎｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］、熱処理した抗−ｐ４４マイコブラズマヒオニューモ ニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］、抗−ｐ７０マイコプラズマヒオリ ニス［Ｍ、　ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ］、熱処理した抗−ｐ７０マイコプラズマヒオ リニス［Ｍ、　ｈｙｎｒｈｉｎｉｓ］、陰性標準抗−マイコプラズマヒオニュー モニエ［Ｍ。

ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎ　ｉａｅ］血清、及び陽性標準抗−マイコプラズマヒオニ ューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］血清である。熱処理は、補体 を不活化するために行われた。というのは補体は生育を非特異的に抑制すること が知られているからである。

各プレートごとに抗体サンプルを、希釈せずに、また、１／２．１／４．１／８ に各々希釈して試験した。各々の２５〆ｌを６■のＷｈａｔ＋ａａｎ濾紙ディス クに添加した。各々の４種の希釈物をペトリ皿に均等に間隔を空けて置き一晩イ ンキユベーションした。マイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅ ｕｍｏｎｉａｅ］の保存培養物［５ｔｏｃｋ　ｃｕｌ、ｔｕｒｅｓ］を１７１Ｏ に希釈し０．５１の希釈培養物を各皿に添加し、３０秒間待って残りの液体を抗 体サンプル添加前に注いだ。１　、５　ｍｍ以上のマイコプラズマヒオニューモ ニエ［Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］の生育阻止ゾーンを有意なものと考 えた。結果を表１１に示す。結果は、補体の如何に関係な（抗−ｐ４４がマイコ プラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｎｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］の生育を抑制 すること、また、抗−ｐ７０の抑制活性はすべて補体によるものであることを示 している。

実施例１３：　ｐ４４ワクチンとその投与マイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ 、　ｈｙｏｐｎｃｕｍｏｎｉａｅ］ｐ　４４をマイコプラズマヒオニューモニエ ［Ｍ、　ｈｙｎｐｎｅｕｍｎｎｉｎｅ］細菌の溶菌及び当業者に知られている通 常のタンパク質分離及び精製工程で細菌から精製する。少な（とも約５０ユニツ トのｐ４４を使って上記実施例３のバクテリンと置き換え、実施例３のアジュバ ントと混合して実施例４のプロトコルに従い投与した。

ｐ４４含有の混合ワクチンを上記実施例６で提供された混合ワクチン中のマイコ プラズマヒオニューモニエ［Ｍ、　ｈｙｎｐｎｅｕｍｏｎ実施例１４　ワクチン 製剤中のｐ４４レベルの分析Ｗｉｓｅらの抗体またはこれと同等なものを使って ワクチン製剤中のｐ４４レベルにつき分析し、ブタに予防効果があるとされる対 照ワクチン製剤中のｐ４４レベルと比較する。

表１ 表２ 注意、括弧内の数字は約５週齢でマイコプラズマの効力をチャレンジされたブタ の数である。

表３ マウスに対する藁効 幾何平均抗体力価 表５ マイコブラズマヒオニューモニエの抗体力価の幾何平均表６ 体重増加および肺機能障害 表７ マイコブラズマヒオニユーモニエおよびパスツーレラマルトシダの重複チャレン ジＰ、　ｍｕｌｔｏｃｉｄａＨ＊とは、バスッーレラマルトシダのこと。

不活化処理の予防効果 表９ さまざまなアジュバントの肺機能障害に対する効果表１０ 抗体力価に対するさまざまなアジュバントの効果抗マイコプラズマヒオニューモ ニエの幾何平均力価表１１ マイコプラズマヒオニューモニエの成長に対する抗体の効果マイコブラズマヒオ ニューモニエの表面成長抑制のｍｌ注意　！、　ｈｙｏｐｎｅｕａ＋ｏｎｉａｅ ＄とは、マイコプラズマ・ヒオニューモニエのこと。

菫、　ｈｙｏｒｈｉｎｉｓｔｔとは、マイコプラズマヒオリニスのこと。

フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＰＴ、ＳＥ ）、　ＣＡ、ＪＰ（７２）発明者　ウェルター、シイ、ジョセフアメリカ合衆国 、５０３２１　アイオワ州、デス　モインズ、サウスウエスト　トエンティエイ ツス　プレース　３９０６

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. １．生きているマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉ ａｅ］細菌を不活化濃度のチメロサールに接触させて不活化マイコプラズマヒオ ニューモニエ［Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｃ］のバクテリンを調製すること を特徴とするマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｅ］バクテリンワクチンの調製方法。
2. ２．請求項１の方法により産生されたマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ．ｈ ｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］のバクテリンワクチン。
3. ３．マイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］が低 回数継代株であることを特徴とする請求項１の調製方法。
4. ４．請求項３の方法により産生されたマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ．ｈ ｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］のバクテリンワクチン。
5. ５．上記マイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］ バクテリンを水酸化アルミニウム及びＤＥＡＥデキストランを有するアジュバン トと混合することを特徴とする請求項１のバクテリンワクチンの調製方法。
6. ６．請求項５の方法により調製されたマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ．ｈ ｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ〕バクテリンワクチン。
7. ７．十分な水酸化アルミニウムとＤＥＡＥデキストランが添加されてワクチン中 の水酸化アルミニウムの最終濃度が約０．２４％から約０．３９％、ＤＥＡＥデ キストランの最終濃度が約１．５％となるようにされた請求項５のバクテリンワ クチンの調製方法。
8. ８．請求項７の方法で調製されたマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ．ｈｙｏ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］のバクテリンワクチン。
9. ９．請求項２のワクチンの有効量を動物に投与することを特徴とする細菌性感染 から動物を免疫する方法。
10. １０．請求項４のワクチンの有効量を動物に投与することを特徴とする細菌性感 染から動物を免疫する方法。
11. １１．請求項６のワクチンの有効量を動物に投与することを特徴とする細菌性感 染から動物を免疫する方法。
12. １２．請求項８のワクチンの有効量を動物に投与することを特徴とする細菌性感 染から動物を免疫する方法。
13. １３．不活化するか弱毒化した細菌と、水酸化アルミニウム及びＤＥＡＥデキス トラン含有のアジュバントとを含むことを特徴とする細菌型ワクチン。
14. １４．請求項１３のワクチンの有効量を動物に投与することを特徴とする細菌性 感染から動物を免疫する方法。
15. １５．細菌がマイコプラズマであることを特徴とする請求項１３のワクチン。
16. １６．請求項１５のワクチンの有効量を動物に投与することを特徴とする細菌性 感染から動物を免疫する方法。
17. １７．細菌がマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｅ］であることを特徴とする請求項１５のワクチン。
18. １８．請求項１７のワクチンの有効量を動物に投与することを特徴とする細菌性 感染から動物を免疫する方法。
19. １９．マイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］が 低回数継代株であることを特徴とする請求項１７のワクチン。
20. ２０．請求項１９のワクチンの有効量を動物に投与することを特徴とする細菌性 感染から動物を免疫する方法。
21. ２１．試薬が標識されるか固相に結合させられて請求項２の方法で産生したマイ コプラズマヒオニューモニエ［Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］バクテリンを 含むことを特徴とするイムノアッセイ試薬。
22. ２２．マイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］ま たはマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］に対 する抗体を有していると疑われている生物学的サンプルまたはその一部に請求項 ２１の試薬を接触させ、マイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕ ｍｎｉａｅ］抗原に対する抗体への結合について該試薬に結合する抗体の存否を 測定することを特徴とするマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ．ｈｙｏｎｅｕ ｍｏｎｉａｅ］またはマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍ ｏｎｉａｅ］に感染した動物のイムノアッセイ。
23. ２３．マイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］株 またはマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］バ クテリンをｐ４４マイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｎｉ ａｅ］に対する抗体に接触させ、結合の有無を検出することを特徴とするマイコ プラズマヒオニューモニエ［Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］株またはそのバ クテリンが有効なワクチンを産生するか否かを決定する方法。
24. ２４．抗体がモノクローナル抗体である請求項２３の方法。
25. ２５．チメロサールで不活化し、ＤＥＡＥデキストランと水酸化アルミニウムと を有するアジュバントと混合した、低回数継代マイコプラズマヒオニューモニエ ［Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］を含有するワクチンで免疫され、それによ って非免疫のブタよりマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍ ｏｎｉａｅ］感染に対する抵抗力を強くされたブタ。
26. ２６．請求項１のマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎ ｉａｅ〕バクテリンワクチンを弱毒化または殺菌されたボルデテラブロンキセプ ティカ［Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ］及び／又はバスツ ーレラマルトシダ［Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ］と混合するこ とを特徴とする混合ワクチンの調製方法。
27. ２７．請求項２６の方法で調製した混合ワクチン。
28. ２８．請求項２７のワクチンの有効量を動物に投与することを特徴とする細菌性 感染から動物を免疫する方法。
29. ２９．請求項５のマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｉ ａｅ］バクテリンを弱毒化または殺菌されたボルデテラブロンキセプティカ［Ｂ ｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ］及び／又はパスツーレラマ ルトシダ［Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ］と混合することを特徴 とする混合ワクチンの調製方法。
30. ３０．請求項２９の方法で調製した混合ワクチン。
31. ３１．請求項３０のワクチンの有効量を動物に投与することを特徴とする細菌性 感染から動物を免疫する方法。
32. ３２．少なくとも部分的に精製した形のマイコプラズマヒオニューモニエ［Ｍ． ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］ｐ４４抗原と免疫学的に許容できるキャリヤとを 含むことを特徴とするワクチン。
33. ３３．ＤＥＡＥデキストラン及び水酸化アルミニウムの組合せをアジュバントと してさらに有する請求項３２のワクチン。