ME00570B - Poboljšana bakterijska vakcina mycoplasma hyopneumoniae - Google Patents

Abstract

Pronalazak obezbeđuje poboljšanu kompoziciju bakterijske vakcine  Mycoplasma hyopneumoniae , koja poželjno obezbeđuje  imunitet  od infekcija posle jednog davanja. Kompozicija  se  sastoji od inaktivirane bakterije  Mycoplasma hyopneumoniae  i smeše pomoćnih sredstava, koje u kombinaciji, obezbeđuju imunitet na  Mycoplasma hyopneumoniae  infekcije posle  jednog davanja i izazivaju  imuni  odgovor specifičan  na  bakteriju  Mycoplasma hyopneumoniae,  uključujući imunitet posredovan ćelijama i lokalni (sekrecija IgA) imunitet. U poželjnom izvođenju, smeša pomoćnih sredstava se sastoji od polimera akrilne kiseline , najpoželjnije Ćarbopol-a i smeše metaboličnog ulja, kao što su jednom ili više nezasićeni terpenski ugljovodonici poželjno skvalen ili skvalan  i  polioksietilen-polipropilen blok kopolimera kao što je Pluronic®. Kompozicija vakcine može opciono uključivat i konzervanse, poželjno timerosol i/ili EDTA.

Description

Ova prijava zahteva prioritet nerešene privremene prijave sa serijskim brojem 60/256, 637 podnete 19 decembra 2000, i ovde se upućuje na ceo pronalazak.

Pronalazak se odnosi na poboljšane postupke za izazivanje zaštitnog imuniteta protiv Mycoplasma hyopneumoniae, naročito koji uključuju inaktivanu bakteriju Mycoplasma hyopneumoniae u količini efikasnoj da imunizira životinju primaoca protiv infekcije Mycoplasma hyopneumoniae u jednoj dozi.

Myeoplasma hyopneumoniae je etiološki agens svinjske mikoplazmatiče upale pluća. Bolest je važan uzrok ekonomskog gubitka u industriji svinja zbog postignute smanjene težine i slabe efikasnosti hranjenja. Bolest uzrokuje hroničan kašalj, slabu životinjsku dlaku, zaostajanje u rastu i neuspešan izgled, koji traje nekoliko nedelja. Kod zaraženih životinja primećene su površine karakterističnih lezija od crvenih do sivih koje se integrišu, naročito u prednjem vršnom i srčanom režnju. Mada bolest izaziva malo smrtnih slučajeva, napadnute svinje su često sklone sekundarnoj infekciji oportunističkih patogena, što rezultuje smrću ili stresom. Samo su ekonomski gubici procenjeni između 200 i 250 miliona dolara godišnje.

Mycoplasma hyopneumoniae je izbirljiva bakterija koja polako raste i koja nema ćelijski zid. Veoma često ju je teško izolovati iz respiratornog trakta zbog Mycoplasma hyorhinis, uobičajenog sekundarnog agensa koji je takođe smešten u respiratornom traktu. Bolest se prenosi aerosolom, dobijenim kašljanjem i direktnim kontaktom sa bolesnom ili konvalescentnom svinjom nosiocem. Mešanje zaraženih životinja i nezaraženim životinja dovodi do ranih i čestih ponovnih infekcija. Infekcija često počinje infekcijom prasića od noseće krmače prilikom prašenja. Zbog načina upravljanja krdom, infekcija ne mora da bude očigledna nego tek kasnije u životu. Dodatne infekcije uglavnom su primećene posle odbijanja od sisanja kada se svinje objedine. Očigledna bolest se normalno primeti kod svinja u šestoj nedelji starosti ili kasnije. Odnos rasta i odnos konverzije hrane su primetno smanjene kod bolesnih životinja. Lečenja sa antibioticima su skupa i zahtevaju produženu upotrebu. Ponovna infekcija je takođe problem. Vakcine su sada najefikasniji postupak za izbegavanje infekcija i njihovih posledica.

Fort Dodge Animal Health (FDAH) prodaje bakteriju Mycoplasma hyopneumoniae pod imenom Suvaxyn® Respifend® MH koja se koristi kao vakcina da bi se zaštitile zdrave svinje od kliničkih znaka izazvanih sa Mycoplasma hyopneumoniae. Vakcina sadrži Carbopol kao pomoćno sredstvo i preporučena je kao vakcina u dve doze za svinje koje su stare bar jednu nedelju, sa drugom dozom dve ili tri nedelje posle prve vakcinacije. Međutim, vakcine u dve doze imaju očigledni nedostatak u tome što zahtevaju drugi postupak sa. životinjama u cilju obezbeđivanja potpune zaštite protiv bolesti.

Prema tome predmet ovog pronalaska je da se obezbedi efikasna vakcina protiv Mycoplasma hyopneumoniae koja izaziva zaštitni imunitet i sprečava bolest izazvanu sa organizmom davanjem jedne doze vakcine.

Drugi predmet ovog pronalaska je obezbeđivanje kompozicije vakcine pogodne za upotrebu kod svinja protiv infekcije i bolesti izazvane sa Mycoplasma hyopnenmoniae, koja može biti korišćena u kombinaciji sa drugim bakterijama i/ili toksoidima.

Još jedan predmet ovog pronalaska je da obezbedi postupak za sprečavanje ili ublažavanje bolesti gde je organizam izazivač Mycoplasma hyopneumoniae, korišćenjem formulacije sa pomoćnim sredstvima koja poboljšava imugeno svojstvo bakterije tako da izaziva zaštitni imunitet posle jedne doze vakcine.

Drugi predmeti i karakteristike pronalaska će postati očigledne iz dole izloženog detaljnog opisa.

Ovaj pronalazak se odnosi na kompoziciju vakcine za imuniziranje životinje protiv infekcije. Mycoplasma hyopneumoniae koja sadrži imunizirajuću količinu inaktivirane bakterije Mycoplasma hyopneumoniae; smešu pomoćnih sredstava koja obuhvata polimer akrilne kiseline i smešu metaboličnog ulja i polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimera; i farmaceutski prihvatljivih nosača, gde kompozicija vakcine, posle jednog davanja, izaziva zaštitni imunitet protiv Mycoplasma hyopneumoniae.

U drugom aspektu, prikazani pronalazak obezbeđuje kompoziciju sa imunogenim svojstvom za imunizaciju životinje protiv infekcije Mycoplasma hyopneumoniae, koja se sastoji od inaktivirane bakterije Mycoplasma hyopneumoniae zajedno sa gore navedenim pomoćnim sredstvima i farmaceutski prihvatljivim stabilizatorima, nosačima ili razblaživačima. Pomoćno sredstvo je uglavnom prisutno u ovoj kompoziciji vakcine u krajnjoj koncentraciji od oko 1-25% (v/v) i poželjno oko 5-12% (v/v). Kompozicija takođe može da uključuje druge komponente vakcine, uključujući inaktivirane bakterije ili prečišćene toksoide, iz jednog ili više patogena, kao što su Haemonphilus parasuis, Pasteurella multiocida, Streptococcum suis, Actionobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis i leptospira i može biti davana intramuskulamo, subkutanozno, oralno, aerosolom ili intranazalnim putem.

U još jednom aspektu, prikazani pronalazak obezbeđuje postupak za zaštitu životinja protiv bolesti izazvane Mycoplasma hyopneumoniae davanjem jedne doze gore pomenute vakcine koja sadrži inaktiviranu bakteriju Mycoplasma hyopneumoniae i smešu pomoćnih supstanci.

Svi ovde citirani patenti, patentne prijave i druga literatura obuhvaćeni su referencom u svojoj celosti. U slučaju nedoslednosti, prikazani pronalazak će preovladati.

Ovde korišćen izraz 'bakterijska vakcina' je sakupljena bakterija koja je inaktivirana i koja u kombinaciji sa izvesnim pomoćnim sredstvima može izazvati zaštitni imunitet protiv bolesti ili infekcije kada se daje životinjama. 'Pomoćno sredstvo' označava kompoziciju koja sadrži jednu ili više supstanci koje pojačavaju imugeno svojstvo i efikasnost bakterije Mycoplasma hyopneumoniae u kompoziciji vakcine.

U opisu i zahtevima korišćen izraz MHDCE označava Mycoplasma hyopneumoniae DNA ćelijske ekvivalente.

'lmunizirajuća količina' je količina bakterijske vakcine koja će obezbediti imunitet vis a vis Mycoplasma hyopneumoniae. 'Imunizirajuća količina' će zavisiti od vrste, pasmine, starosti, veličine, zdravstvenog stanja i da li je životinja prethodno bila vakcinisana protiv istog organizma.

Ovaj pronalazak obezbeđuje vakcinu protiv Mycoplasma hyopneumoniae koja je pogodna za imunizaciju u jednoj dozi. Vakcina prema ovom pronalsku uključuje smešu pomoćnih sredstava koja povećava imugeno svojstvo bakterije i na taj način obezbeđuje jedno davanje za izazivanje zaštitnog imuniieta.

Vakcina može biti pripremljena od sveže sakupljenih kultura postupcima standardnim u stanju tehnike (videti, na primer, US patent 5, 338, 543 ili US patent 5, 565, 205 kao i dole primer 2). To jest, organizam može rasti u medijumu za kulture kao što je PPL ('Pleuropneumonia-like organisam') kompletni medijum [Dificoj. Laboratories]. Rast organizama je praćen standardnim tehnikama kao što je određivanje jedinica koje menjaju boju (CCU-color changing units) i sakupljanjem kada je postignut dovoljno visok titar. Štokovi moraju dalje biti koncentrovani ili liofilizirani

konvencionalnim postupcima pre uključivanja u formulaciju vakcine. Mogu se koristiti drugi postupci, kao što su oni opisani kod Thomas, et al, Agri Practice, Vol. 7 Br. 5, str. 26-30,.

Vakcina prema ovom pronalasku se sastoji od inaktivirane bakterije Mycoplasma hyopneumoniae u kombinaciji sa smešom pomoćnih sredstava i jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača. Nosači pogodni za upotrebu uključuju vodeni medijum, na primer, rastvor soli, rastvor soli sa fosfatnim puferom, minimalni esencijalni medijum (MEM) ili MEM sa HEPES puferom.

Smeša pomoćnih sredstava za upotrebu u kompoziciji vakcine ovog pronalaska povećava imuni odgovor i sastoji se od smeše polimera akrilne kiseline sa smešom metaboličkog ulja, na pr. nezasićenih terpenskih ugljvodonika ili njihovim proizvoda hidrogenizacije, poželjno skvalana (2,3,10,15,19,23-heksametiltetrakozana) ili skvalena i polioksietilen polioksipropilen blok kopolimera. Takav polimer akrilne kiseline može bitihomopolimer ili kopolimer. Polimer akrilne kiseline je poželjno karbomer. Karbomeri su komercijalno dostupni pod komercijalnim imenom Carbopol. Polimeri akrilne kiseline su opisani, na primer, u US patentima 2, 909, 462 i 3, 790, 665 čiji opisi su uključeni ovde kao reference. Polioksietilen- polioksipropilen blok polimeri su površinski aktivna sredstva, poželjno tečna površinski aktivna sredstva, koja pomažu u suspendovanju čvrstih i tečnih komponenti. Površinski aktivne supstance su komercijalno dostupne kao polimeri pod komercijalnim imenom Pluronic®. Poželjno površinski aktivno sredstvo je poloksamer 401 koji je komercijalno dostupan pod imenom Pluronic® LI21.

Smeša pomoćnih sredstava koja stimuliše imunogeno svojstvo je tipično prisutna u kompoziciji vakcine prema pronalasku u v/v količini od oko 1% do 25%, poželjno od oko 2% do 15%, poželjnije oko 5% do 12% v/v. Količina smeše pomoćnih sredstava koja se koristi i odnosa dve komponente pomoćnih sredstava može varirati u zavisnosti od dodavanja drugih bakterijskih vakcina ili prečišćenih toksoida. Smeše pomoćnih supstanci generalno se sastoje od metaboličkog ulja, polimera akrilne kiseline i polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimera formulisanih kao emulzija u vodenom medij umu.

U ovoj smeši pomoćnih sredstava, metaboličko ulje i polimer akrilne kiseline mogu biti prisutni u količini u opsegu od oko 10 do 150 ml/1 i oko 0.5 do 10 g/1, respektivno. U poželjnom izvođenju smeša pomoćnih supstanci, smeša metaboličnog-ulja i polioksletil-en-polioksipropilen-blok kompolimernih komponenti je smeša skvalana i Pluronic® L121 (poloxamer 401) koja može biti prisutna u količini od oko 50 do 100 ml/L i karboksimetilen polimer je Carbopol 934P (Carbamer 934P) koji može biti prisutan u količini od oko 2 ml/1. Tipično, smeša pomoćnih supstanci sadrži oko 1:25 do 1:50 polimera akrilne kiseline u odnosu na smešu metaboličkog ulja/polioksietilen-polipropilen blok kopolimera.

Poželjni polimeri akrilne kiseline su oni koje prodaje B. F. Goodrich kao Carbopol 934 P NF i 941 NF koji su polimeri akrilne kiseline umrežene sa polialilsaharozom i koji imaju hemijsku formulu (CH2CHOOOH)n. Ovi polimeri daju vodeni gel koji pogodno formuliše sa vodenim nosačima. Poželjni polioksietilen-polipropilen blok kompolimeri su nejonska površinski aktivna sredstva koje prodaje BASF kao Pluronic® L121, L61, L81 ili L101. Vakcina prema ovom pronalsku može se davati intramuskulamo, subkutanozno, intranazalno, intraperitonealno ili oralnim putem, poželjno intramuskulamim ili subkutanoznim putem.

Vakcina prema pronalasku generalno se sastoji od inaktivirane Mycoplasma hyopneumoniae, metaboličnog ulja, polioksietilen-polipropilen blok polimera i polimera akrilne kisleline u obliku ulja u vodenoj emulziji. Vakcina poželjno sadrži polimer akrilne kiseline u koncentraciji u opsegu od 0. 5 do 10 g/1. Vakcina poželjno sadrži metaboličko ulje u koncentraciji u opsegu od 2 do 6 ml/1. Vakcina poželjno sadrži polioksietilen-propilen blok kopolimer u koncentraciji opsega od 1 do 3 ml/1.

Za jedinično davanje, vakcina bi poželjno sadržala količinu bakterijske vakcine Mycoplasma hyopneumoniae koja odgovara oko 1x108 do 3x1011 MHDCE/ml, poželjno oko lxl09 do 3xl09 MHDCE/ml. Oko jedan do pet ml, poželjno 2 ml, može se davati životinji, intramuskulamo, subkutanozno ili intraperitonealno. Jedan do deset ml, poželjno 2 do 5 ml, može biti dato oralno ili intranazalno.

Sledeći primeri imaju nameru da dalje prikažu pronalazak bez ograničavanja njegovog obima.

PRIMER 1

PRIPREMANJE KOMPOZICIJE BAKTERIJSKE VAKCINE MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE

OPIS VIRUSNIH ŠTOKOVA. Mycoplasma hyopnenmoniae može biti dobijena iz brojnih lako dostupnih izvora. U jednom izvođenju, može biti korišćen soj P-5722-3 Mycoplasma hyopneumoniae. Kultura je dobijena od C. Armstrong, Purdue University, West Lafayette, Indiana. Posle prijema kulture Mycoplasma hyopnenmoniae, bila je dodata u Mycoplasma hyopneumoniae buljon, sedam puta da bi se ustanovilo originalno seme.

ĆELIJSKA KULTURA. Mycoplasma hyopneumoniae je rasla u medijumu koji sardrži Bacto PPLO prah, ekstrakt kvasca, glukozu, L-cistein hidrohlorid, ampicilin, alijum acetat, fenol crveno, sredstvo protiv stvaranja pene, normalni sterilni svinjski serum i vodu u periodu od 18-144 sati. Za

inaktivaciju, dodat je binarni etilenimin (BEI) direktno pri proizvodnji kulture u fermentacioni sud. pH je prilagođen na 7. 4 i zatim je sakupljena prema konvencionalnim postupcima da bi se obezbedila bakterija Mycoplasma hyopneumoniae.

PRIPREMANJE KOMPOZICIJE VAKCINE

Kompozicija konzervanasa i korišćene proporcije. Sakupljena bakterija je konzervisana dodavanjem timerozala i tetranatrijumove soli etilen diamin tetra sirćetne kiseline (EDTA) ne više od 0. 01% i 0. 07% respektivno. U medijumu za rast prisutan je ampicilin U. S. P. sa 0. 250 grama/litri. Koncentracija zaostalog ampicilina će varirati u krajnjem proizvodu u zavisnosti od zapremine sakupljene tečnosti, tako da koncentracija zaostalog ampicilina u završnom proizvodu ne prelazi 30 ug/ml.

STANDARDIZACIJA PROIZVODA. Koncentrat Mycoplasma-e je kvantifikovan sa DNA fluorometriskim testom.

Smeša metaboličkog ulja koja se sastoji od jednog ili više terpenskih ugljovodonika i polioksietilen-polipropilen blok kopolimera, na pr., smeša Skvalan/Pluronic L121, je pripremljena rastvaranjem 10 g natrijum hlorida, 2. 72 dibaznog natrijum fosfata, 0. 25 monobaznog natrijum fosfata, 20 ml Pluronic L121 (BASF Corporation), 40 ml skvalana (Kodak-), 3. 2 ml Tween 80 i 900 ml prečišćene vode, do 1000 ml. Posle mešanja, sastojci su bili u autoklavu. Smeša je zatim homogenizirana dok nije nastala stabilna emulzija. Može biti dodat formalin do krajnje koncentracije od 0. 2% ili može biti dodat timerozal do krajnje koncentracije od 1: 10 000.

SPAJANJE JEDINICA DA BI SE NAPRAVILA SERIJA.

Zadovoljavajući koncentrati Mycoplasma hyopneumoniae su aseptički spojeni sa pomoćnim sredstvima, konzervansima i razblaživačima u sterilnim posudama snabdevenim sa mešalicom i mešanim ne manje od 30 minuta.

POSTUPAK I TEHNIKE PUNJENJA I ZATAPANJA KRAJNJIH POSUDA. Proizvod može biti ceo proceđen kroz sterilni filter od 200-500 mikrona i punjen pod uslovima navedenim u 9 CRF 114. 6 u sterilne krajnje posude u sobi označenoj za operaciju punjenja. Staklene ili plastične posude su zatvorene sa gumenim zapušačem i savijanjem zatvorene sa aluminijumskim zatvaračem. Svaka doza od 2. 0 ml će sadržati ne manje od 2 x 109 Mycoplasma hyopneumoniae DNA ćelijskih ekvivalenata.

TESTIRANJE AKTIVNOSTI. Uzorci glavne mase ili iz krajnjih posuda završnog proizvoda mogu biti testirani na aktivnost na sledeći način:

Proba postupka za testiranje aktivnosti: Korišćeni su ICR ženski miševi, šest do sedam nedelja stari, jedne konsignacije od Harlan Sprague Dawley-a ili drugog prihvatljivog snabdevača. Minimum od 20 miševa je potreban za imunizaciju sa svakom nepoznatom i referentnom bakterijom. Minimum od pet miševa je uzet kao kontrola bez ubrizgavanja. Testirane i referentne bakterije su pojedinačno potpuno promešane. Sterilni, špricevi za jednu upotrebu, za odmeravanje 25, sa iglama od 5/8 inča su korišćeni za ubrizgavanje miševima subkutanozno u region prepona 1/10 (jedne desetine)

doze životinje domaćina (0. 2 ml). Svaka grupa miševa je smještena

zasebnu jedinicu i omogućen joj je slobodan prilaz hrani i vodi u toku 14 dana. Svaki miš je zatim anesteziran. Anestezirani miševi su smešteni na leđa. Koristeći jednu ruku, glava je držana dole i jedna prednja noga je ispružena u odnosu na telo. Korišćenjem skalpela, napravljen je rez na koži približno dugačak 1/2 inča, između ispružene prednje noge i toraksa, prekidajući ručnu arteriju. Korišćenjem šprice od 3. 0 ml, bez igle, sakupljena je krv koja je curila iz reza. Krv je ispuštena u obeleženu epruvetu za testiranje i omogućeno je da se zgruša. Epruvete sa zgrušanom krvi su centrifugirane na l,000xg da bi se odvojio serum od ugruška. Individulani serumi su čuvani na -20°C ili na još hladnijem do testiranja.

SEROLOŠKO TESTIRANJE: ELISA postupak je korišćen za merenje odgovora antitela miša na referentnu i/ili nepoznatu bakteriju. ELISA Postupak je izvođen korišćenjem jednokratnih Immulon II mikrotitarskih ploča sa ravnim dnom (Disposable Immulon II Flat-Bottom Microtiter Plates) od Dynatech-a ili ekvivalentnih i čitača za ELISA ploča.

REAGENSI ZA TEST:

Rastvor soli puferisan sa fosfatima-Tween (PBST-Phosphate Buffered Saline-Tween) (pH podešen na 7. 2 do 7. 4 sa 5M NaOH ili 5M HC1).

Puferisani rastvor soli i glicina (GBS-Glycine Buffered Saline) (pH podešen na 9. 5 do 9. 7 sa 5M NaOH ili 5M HC1).

Serum za pozitivnu kontrolu: Serum za pozitivnu kontrolu su objedinjeni serumi iz miševa vakcinisanih sa bakterijom Mycoplasma hyopneumoniae.

Konjugat i supstrat

Afinitetno prečišćen, anti-miš IgG peroksidazno-obeležen konjugat je dobijen iz Kirkegaard and Perry Laboratories, Ine. (Kataloški br. 074-1802). Postupak za određivanje optimalnog razblaženja konjugata je detaljno opisan dole. Rastvori supstrata peroksidaze (ABTS) su dobijeni od Kirkegaard and Perry, Ine. Titracija konjugata: Imulon II ploča sa ravnim dnom je prevučena sa 100 ul po otvoru 20 ug po ml Mycoplasma hpopneumoniae celim ćelijski antigenom razblaženim u 10 mM GBS. Ploča je inkubirana ne manje od jednog sata na 37°C+2°C i premeštena je na 2-7°C za ne manje od 18 sati i ne više od jedne nedelje. Pre korišćena ploča je isprana tri puta sa PB ST, sa vremenom od jednog minuta za natapanje između svakog ispiranja i lupkana je da se osuši. Pripremljeno je razblaženje seruma za pozitivnu kontrolu 1: 40 u PBST razblaženi pozitivni serum' (100 ul/otvoru) je dodat u jednu polovinu otvora na ploči. PBST je dodat u drugu polovinu otvora. Ploča je inkubirana u toku jednog sata na sobnoj temperaturi, posle čega je ploča isprana tri puta. Konjugovani serum je serijski razblažen sa PBST dvostruko, polazeći od 1: 100 razblaženjem i završavanjem sa razblaženjem 1: 10, 240. 100 ul od svakog razblaženja konjugata je dodato u četiri otvora pozitivnog seruma i četiri otvora PBST-a i omogućeno je da reaguju pola sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane četiri puta i dodato je 100 ul rastvora supstrata peroksidaze (abts) u otvore. Ploča je čitana na dvojnoj talasnoj dužini podešenoj na T λ=450. Razblaženje konjugata je izabrano da daje očitavanja od 0. 850 do 1. 050 za serum pozitivne kontrole kada se vrednost PBST kontrole oduzme od vrednosti seruma pozitivne kontrole.

Test antigen:

Antigen Mycoplasma hyopneumoniae je celi ćelijski preparat i dobijen je od Fort Dodge Animal Health.

ELISA je izveden na sledeći način: Korišćene su Immulon II mikrotitarske ploče sa ravnim dnom (Dynatech Immulon II Flat-Bottom Microtiter Plates). Jedna fiola liofiliziranog antigena ćele ćelija Mycoplasma hyopneumoniae je rekonstruisana do deset ml sa puferisanim rastvorom soli i glicina (GBS). Koncentracija rekonstruisanog Mycoplasma proteina je 20 μl/ml. 100 μl (2 μl/ml. razblaženog antigena je zatim dodato u sve otvore na ploči. Ploča je inkubirana na 37°C ± 2°C ne manje od jednog sata i zatim je premeštena na 2-7°C za najmanje 18 sati i maksimalno jednu nedelju. Ploče su isprane tri puta sa PB ST, sa natapanjem od jednog minuta između svakog ispiranja, i zatim lupkanjem da se osuše. Serumi su razblaženi 1: 40 u PBST. Serum pozitivne kontrole će biti uključen u kvadriplikatu na svakoj ploči. Zapremina uzorka po otvoru je 100 μl. Uzorci serije testiranog seruma i uzorci referentnog seruma će biti testirani u duplikatu na istoj ploči. Ploče su inkubirane u toku jednog sata na sobnoj temperaturi i isprane su tri puta sa PBST. Dodato je 100 μl anti-miš IgG peroksidazno-obeleženog konjugata (Kirkegaard and Perry), razblaženog u PBST u sve otvore i otvori su inkubirani u toku 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane četiri puta sa PBST-om. U sve otvore dodato je 100 μ1 rastvora supstrata peroksidaze (ABTS) i ploče su inkubirane dok serum za pozitivnu kontrolu ne dostigne OD405 (450) 0. 850 do 15050 kada je u mašini PBST iz kontrolnog otvora. Ploče su čitane naspram PBST otvora. Da bi test bio validan, serum miševa kojima je ubrizgana referentna bakterija mora proizvesti minimum prosečne vrednosti od 0. 500 i serum nevakcinisanih kontrolnih miša ne sme preći maksimalnu prosečnu vrednost od 0.100. Ili, razlika između prosečne vrednosti seruma miševa kojima je ubrizgana referentna bakterija i seruma nevakcinisanih kontrolnih miševa mora biti veća nego ili jednaka 0. 400.

Srednje vrednosti za serijsko vakcinisanje, referentno vakcinisanje i kontrole je izračunato i procenjeno na sledeći način: Da bi se smatrao zadovljavajućim, bakterijski test mora pokazivati prošek srednje vrednosti optičke gustine jednak ili veći od referentne. Ili, korišćenjem Studentovog T-testa sa jednim krajem, bakterijski test ne mora značajno biti (p<0. 05 nivo pouzdanosti) niži nego za referentnu bakteriju. Bilo koja izračunata T- vrednost jednaka, ili veća od 1. 686 će pokazivati značajnu razliku između referentne i testirane bakterije, i prouzrokovaće da bakterijski test bude odbačen. Bilo koja izračunata T-vrednost manja od 1. 686 će ukazivati na zadovoljavajući serijal. Bilo koji bakterijski test određen testom da je nezadovoljavajući iz bilo kog razloga nevezanog sa efikasnošću proizvoda je ponovo testiran i inicijalni test se smatra nevažećim.

PRIMER 2

TEST VAKCINA:

Vakcina za testiranje je pripremljena prema postupcima opisanim u primeru 1 korišćenjem 5% smeše mataboličnog ulja koje se sastoji od jednog ili više terpenskih ugljovodonika i polioksietilen-polipropilen blok kopolimera (Skvalan/Pluronic L121 smeša) i 0. 2% polimera akrilne kiselina (Carbopol) kao pomoćnog sredstva i 2x109 M. hyopneumoniae DNA ćelijskog ekvivalenta (MHDCE) po dozi.

PRIMER 3

Ova studija je osmišljena da pokaže trajanje imuniteta (DOI) u toku četiri meseca kod svinja indukovanog vakcinacijom sa jednom dozom vakcine Primera 2 u trećoj nedelji starosti.

Dva odvojena eksperimenta na životinjama su izvedena za ovu studiju. Sve svinje u oba eksperimenta su bile sero-negativne (titar antitela<10) u vreme vakcinacije, ukazujući da su životinje bile osetljive na Mycoplasma hyopneumoniae. Sve svinje u kontrolnoj grupi ostale su sero-negativne pre izazivanja. Ovo ukazuje da je imuni odgovor kod vakcinisanih svinja poticao od vakcine, a ne zbog izlaganja okolini.

U prvom eksperimentu, vakcina prema primeru 2 je procenjena zajedno sa komercijalno dostupnim proizvodom, Ingelvac M. hypo® proizvedenim od Boehringer Ingelheim (BI), izazivanjem sa visokim nivoom virulentne M. hyopneumoniae (4xT06 organizma). Dvadeset dve (22) svinje starosti od 18 21 dana su vakcinisane sa vakcinom iz primera 2 intramuskulamo (IM) i osam (8) svinja sa Ingelvac M. hyo®[serija 271 032]. Dvadeset dve (22) svinje su služile kao izazivana kontrola i 10 svinja kao ne-izazivana kontrola. Svinje u vakcinisanoj i izazvanoj kontrolnoj grupi su izazivane sa virulentnim M. hyopneumoniae četiri meseca posle vakcinacije. Svinje vakcinisane sa vakcinom iz primera 2 imale su prosečno plućne lezije 15. 9% a izazivane kontrolne svinje imale su u prošeku plućne lezije 19. 6%. Prošek plućnih lezija u vakcinisanoj grupi sa vakcinom iz primera 2 je bio manji nego kod kontrolnih i ako su snažne svinje bile izazivane sa višom dozom nego što je preporučena od strane Univerziteta države Ajova (Iowa State University(ISU)), međutim razlika nije bila značajna (p=0.19). Prema tome, kada je komercijalni proizvod, Ingelvac M hyo®, procenjivan u istoj grupi životinja izazivanjem sa istom dozom, takođe je primećen sličan nivo plućnih lezija (14. 6%). Takođe nije postojala značajna razlika između grupe vakcinisane sa Ingelvac M. hyo® i kontrolne grupe (p=0. 27) i između grupe vakcinisane sa Inglevac M. hypo® i grupe vakcinisane sa vakcinom iz primera 2.

U drugom eksperimentu, vakcina iz primera 2 je procenjena izazivanjem sa virulentom M. hyopneumoniae pri nivou sugerisanom od ISU (1.0xl06 organizama) četiri meseca posle vakcinacije. Dvadeset tri (23) svinje su vakcinisane sa jednom dozom vakcine pri starosti od 21 dan, 25 svinja je služilo kao izazivana kontrola i 7 svinja kao neizazivana kontrola. Svinje u vakcinisanoj i izazvanoj kontrolnoj grupi su izazivane sa virulentnom M. hyopneumoniae četiri meseca posle vakcinacije. Kontrolna grupa je imala prosečno plućne lezije 10. 4% a vakcinisana grupa je imala prosečno plućne lezije 5. 5%. Bila je značajna razlika između vakcinisane grupe i kontrolne grupe (p=0. 031). Ovo ukazuje da je vakcina iz primera 2 efikasna u stimulaciji zaštitinog imuniteta, koji može trajati četiri meseca posle vakcinacije jednom dozom kod svinja starih tri nedelje.

Kada su sakupljeni i analizirani podaci oba eksperimenta koji se odnose na vakcinu iz primera 2, prosečne plućne lezije vakcinisane grupe su značajno niže nego kontrolne grupe.

U zaključku, vakcina iz primera 2 izaziva zaštitni imunitet protiv izazivanja sa virulentnom M. hyopneumoniae četiri meseca posle vakcinacije sa jednom dozom kod svinja u trećoj nedelji starosti.

EKSPERIMENTALNI PODACI

Dva odvojena eksperimenta su izvedena u ovoj studiji. U prvom eksperimentu, šezdeset sedam (67) svinja je dodeljeno u četiri grupe korišćenjem Microsoft Exel programa za nasumičnu raspodelu. Dvadeset četiri (24) svinje starosti od 18-21 dana su vakcinisane sa jednom dozom vakcine pripremljenom prema primeru 2 intramuskulamo (IM). Dvadeset četiri (24) svinje su služile kao izazivana kontrola i deset (10) svinja kao neizazivana kontrola. Devet svinja je vakcinisano IM sa komercijalnim proizvodima, Inglevac M. hyo®, [serija 271 032, proizvedenim od Boehringer Ingelheim (BI)], po navedenom uputstvu. Pet svinja (dve svinje vakcinisane sa vakcinom iz primera 2, jedna sa BI vakcinom i dve kontrole) su uginule u toku perioda vakcinacije iz razloga koji nisu u vezi sa vakcinacijom. Preostale svinje u vakcinisanim grupama i izazivanoj kontrolnoj grupi su izazivane sa 14 ml virulentne M. hyopneumoniae (1. 4xl06 organizama) četvrtog meseca posle vakcinacije. Svinje u sve četiri grupe su eutanizirane 30 dana posle izazivanja i procenjene su plućne lezije za svaku svinju u eksperimentu.

U drugom eksperimentu, dvadeset pet (25) svinja starosti 21 dan je vakcinisano IM sa jednom dozom vakcine pripremljene prema primeru 2, Dvadeset pet (25) svinja je služilo kao izazivane kontrole i 10 svinja kao neizazivane kontrole. Dve svinje su uginule iz razloga koji nisu u vezi sa vakcinacijom i jedna svinja je greškom prodata u toku perioda vakcinacije. Preostale svinje u vakcinisano] i izazivanoj kontrolnoj grupi su izazivani sa 10 ml virulentnog M. hyopneumoniae (1. 0xl06 organizama) četiri meseca posle vakcinacije. Dve svinje su umrle u toku posmatranja posle izazivanja iz razloga koji nisu u vezi sa vakcinacijom/izazivanjem. Preostale svinje u sve tri grupe su eutanizirane 30 dana posle izazivanja i procenjene su plućne lezije za svaku svinju u eksperimentu.

Vakcinacija:

Svakoj svinji u vakcinisanoj grupi je data jedna doza od 2 ml testirane vakcine IM sa strane u vrat.

Izazivanje i autopsija:

Viralentni M. hyopneumoniae štok za izazivanje, smrznuti (-70°C) homogenat pluća je pripremila Dr. Eileen Thacker sa Univerziteta države Ajova (ISU). Rastvor za izazivanje je potvrđeno da je čist i da je sadržao približno 107 M. hyopneumoniae organizama po ml. Preporučena doza za izazivanje je 10 ml 1:100 razblaženog stoka (tj. 1,0xl06 organizma).

Svinje u vakcinisanim i izazivanim kontrolnim grupama u prvom eksperimentu su izazavane sa 14 ml 1: 100 razblaženog stoka, (tj. 1.4 xl06 organizama). Svinje u drugom ispitivanju su izazvane sa 10 ml 1:100 razblaženog stoka (tj. 1.0xl06 organizama) kao što je preporučeno.

Na dan izazivanja, homogenat je brzo otopljen u toploj vodi i razblažen prema preporukama ISU korišćenjem sterilnog medijuma za rast M.hyopneumoniae. Svinjama je dat sedativ, smeša Xylazine-Ketamine-Telazol™ koja se sastoji od 50 mg/mt Xylazine-a, 50 mg/ml Ketamine-a i 100 mg/ml Telazol-a. Anestetička smeša je data IM pri 0.01-0.02 ml/lb telesne težine. Svakoj svinji dato je pojedinačno 14 ml (prvi eksperiment) ili 10 ml doze (drugi eksperiment) materijala za izazivanje, intra-trahealno. Da bi se osiguralo ispravno postavljanje igle, vazduh je izvučen iz šprica pre davanja doze za izazivanje. Nevakcinisane neizazivane kontrolne svinje su zadržane u odvojenim sobama i nisu izazivane.

Tridesetog dana posle izazivanja (DPI), sve svinje su eutanizirane. Pluća su uklonjena i većina plućnih lezija je procenjena individualno bez znanja o testiranoj grupi.

Sakupljanje uzoraka i testiranje

Uzorci krvi su sakupljeni od svih svinja na dan vakcinacije (0 DPV), jedan mesec posle vakcinacije (1 MPV), 4 MPV/0 DPI i 30 DPI zbog serumskih antitela protiv M. hyopneumoniae koja su detektovana sa kompetativnim ELISA kit-om (napravljenim od DAKO Co. ). Pre nego što su testirani, uzorci seruma su čuvani na -20°C.

Analize podataka

Procene plućnih lezija su poređene između vakcinisanih i nevakcinisanih grupa analizom varijanse (ANOVA). Plućne procene su transformisane sa arcsin-om da bi se poboljšala raspodela ostataka.

REZULTATI I DISKUSIJA

Serologija: Sve svinje u oba eksperimenta su testirane na serumska antitela protiv M. hyopneumoniae komercijalnim kompetitivnim ELISA kitom, korišćenjem 1: 10 serumskog razblaženja za sva testiranja. Sve svinje su bile seronegativne (titar antitela <10) u vreme vakcinacije, ukazujući da su životinje bile osetljive na M. hyopneumoniae. Sve svinje u kontrolnoj grupi su ostale seronegativne pre izazivanja. Ovo ukazuje da imuni odgovor kod vakcinisanih svinja je poticao od vakcine, a ne zbog izlaganja okolini. Sve svinje u vakcinisanoj grupi i većina svinja u izazivanoj kontrolnoj grupi (18 od 22 svinje u prvom eksperimentu i 15 od 25 u drugom eksperimentu) sero-konvertovane M. hyopneumoniae posle izazivanja dok neizazivane životinje su ostale sero-negativne. Ovo ukazuje da je izazivanje bilo M. hyopneumoniae specifično. Serološki status testiranih životinja je ukratko prikazan u Tabeli 1.

Testiranje imunogenog svojstva u prvom eksperimentu:

Prvi eksperiment je izveden da se odredi da li vakcina iz primera 2 može da stimuliše jak imunitet koji može štititi naspram višeg nivoa izazivanja nego onog preporučenog od ISU četiti meseca posle vakcinacije. Ovaj eksperiment takođe upoređuje vakcinu iz primera 2 sa komercijalno dostupnom, Ingelvac M. hyo®, u sposobnosti stimulisanja zaštitnog imuniteta četiri meseca posle vakcinacije.

Dvadeset dve svinje vakcinisane sa FDAH Suvaxyn MH-One i osam svinja sa licenciranim proizvodom, Ingelvac M. hyo® serija 271, 032 su izazivane sa 1. 4xl06 organizama po svinji materijala za izazivanje (1. 0xl06 organizama po svinji je preporučeno od ISU, videti Odeljak 5. 5). Dvadeset i dve svinje su služile kao izazivane kontrole i 10 svinja kao neizazivane kontrole. Procenti plućnih lezija su ukratko dati u Tabeli 2 Svinje vakcinisane sa vakcinom prema primera 2, imaju prosečno plućne lezije 15. 9% a izazivane kontrolne svinje imaju prosečno plućne lezije 19. 6%. Bilo je manje plućnih lezija u grupi vakcinisanoj sa vakcinom iz primera 2 nego kod kontrolnih čak i kada su svinje izazivane višim dozama M. hyopneumoniae. Međutim, razlika nije bila značajna (p=0. 19). Prema tome, kada je procenjivan komercijalni proizvod Ingelvac M. hyo® u istoj grupi životinja izazivanjem sa istom dozom, dobijen je sličan nivo plućni lezija (14. 6%). Ne postoji značajna razlika između grupa vakcinisanih sa Ingelvac M. hyo® i kontrolne grupe (p=0. 27) i između grupe vakcinisane sa Ingelvac M. hyo® i grupe vakcinisane sa vakcinom iz primera 2 (p=0. 88).

Mada je neznatno numeričko smanjenje u lezijama zabeleženo u grupi koja je primila vakcinu iz primera 2, podaci dobijeni u ovom eksperimentu sugerišu da viša doza za izazivanje (1. 4 x106 organizama) korišćena u ovom eksperimentu je verovatno ekstremna, čak i za imunitet svinja stimulisan sa komercijalnim Inglavec proizvodom. Ovaj nivo izazivanja verovatno nije odgovarajući za studije procene vakcinacije/izazivanja korišćenjem veličine grupe od 20-25, mada sa većom grupom moguće da bi značaj bio dokazan.

Testiranje imunogenog svojstva u drugom eksperimentu:

Svinje u vakcinisanoj i izazivanoj kontrolnoj grupi u drugom eksperimentu su procenjivane sa dozom za izazivanje (1. 0xl06 organizama) kao što preporučuje ISU, četiri rneseca posle Vakcinacije da bi se pokazao četvoromesečni DOL Procenat plućnih lezija je ukratko izložen u Tabeli 3. Kontrolna grupa je imala prosečno plućnih lezija 10. 4%. Vakcinisana gupa je imala prosečno plućnih lezija 5. 5%. Postoji značajna razlika između vakcinisanih i kontrolnih grupa (p=0. 031). Ovo ukazuje daje vakcina iz primera 2 efikasna u stimulisanju zaštitnog imuniteta, koji može trajati bar četiri meseca posle vakcinacije sa jednom dozom, kod svinja koje su stare tri nedelje.

Procenjivanje sakupljenih rezultata iz oba eksperimenta:

Dok su dva eksperimenta bila značajno različita, efekat eksperimenta na grupu nije bio značajan. Magnituda efekta grupe je bila slična između dva eksperimenta. Prema tome, efekat grupe može biti procenjivan bez obzira na eksperimant. S obzirom da analize potpunog modela pokazuju da interakcija između grupe i eksperimenta nije bila značajna, ovo podržava mišljenje da je efekat grupe bio isti u oba eksperimanta i opravdava spajanje podataka iz dva eksperimenta u jednu analizu. Tako, kada su podaci koji se odnose na vakcinu primera 2 iz oba eksperimenta spojeni i varjabla transformisana arcsin-om za plućne lezije je analizirana sa grupom, a eksperiment kao nezavisna promenjiva (redukovan model), grupa je statistički značajna (p=0. 013).

TABELA 1: Kratak pregled serološkog statusa za M. hvopneumoniae kod kontrolnih i vakcinisanih svinja

TABELA 2 Kratak pregled plućnih lezija u prvom eksperimentu (prekoračena doza)* ;TABELA 3 Kratak pregled procenata plućnih lezija u drugom eksperimentu (preporučena doza) ;Primer 4 ;Procenjivanje dugotrajnog imuniteta izazvanog sa kompozicijom vakcine prema pronalsku protiv virulentnog izazivanja šest meseci posle davanja jedne doze ;Korišćenjem suštinski istog postupka opisanog u primerima 1 i 2 i korišćenjem dole prikazane količine, pripremljena je test vakcina A. ;KRATAK PREGLED ;Trideset tri svinje od 21 dan su upisane za ovo procenjivanje. Dvadeset svinja starosti od tri nedelje je vakcinisano sa jednom dozom vakcine A intramuskulamo (IM). Deset svinja je poslužilo kao nevakcinisane kontrole i tri svinje kao neizazivana kontrola okoline. ;Sve svinje su bile seronegativne (titar antitela <10) u vreme vakcinacije ukazuje da su životinje bile osetljive na M. hyopneumoniae. Sve svinje u kontrolnim grupama su ostale seronegativne pre izazivanja. Ovo ukazuje da je imuni odgovor kod vakcinisanih svinja bio od vakcine, a ne zbog izlaganja okolini. ;Šest meseci posle vakcinacije, 20 vakcinisanih svinja i 10 nevakcinisanih kontrolnih svinja je izazivano sa virulentnim M. hyopneumoniae (1. 0xl06 organizama po svinji). Tri svinje su služile kao neizazivane kontrole. Vakcinisane svinje su imale u proseku procenjene plućne lezije 3. 6%, a izazivane kontrolne svinje su imale u proseku procenjene plućne lezije 14. 6%. Plućne lezije u vakcinisanoj grupi su bile značajno manje nego kontrolnim (p=0. 0215). ;Podaci dobijeni u ovom procenjivanju pokazuju da test vakcina A izaziva dugoročni zaštitini imunitet protiv izazivanja sa virulentnom M. hyopneumoniae šest meseci posle vakcinacije sa jednom dozom. ;Plan eksperimenta ;Trideset tri svinje stare 21 dan su nasumično raspoređene u tri grupe (vakcinisanu grupu, izazivanu kontrolnu grupu i neizazivanu kontrolnu grupu okoline) korišćenjem Microsoft Excel programa nasumične raspodele od Iitter-a. Dvadeset svinja starosti od tri nedelje je bilo vakcinisano sa jednom dozom test vakcine A intramuskulamo. Deset svinja je poslužilo kao izazivane kontrole i tri svinje kao neizazivane kontrole okoline. Svinje u vakcinisanoj grupi i izazivanoj kontroli su izazivane sa 10 ml virulentne M. hyopneumoniae (1. 0xl06 organizama) kulturom po svinji, šest meseci posle vakcinacije. Tri nevakcinisane svinje su korišćene kao neizazivana kontrola. Izazivane svinje i neizazivane kontrole su eutanazirane 26 dana posle izazivanja i procenjene su plućne lezije kod svake svinje. ;Svakoj svinji u vakcinisanoj grupi je data doza od 2 ml test vakcine IM sa strane u vrat. ;Izazivanje i autopsija ;Virulentni štok M. hyopneumoniae za izazivanje, i zamrznuti (<70°C) homogenat pluća je pripremila Dr. Eileen Thacker sa Univerziteta države Ajova (ISU). Potvrđeno je da je štok za izazivanje čist i da sadrži približno 7 M. hyopneumoniae organizama po ml. ;Svinje su izazivane sa 10 ml stoka razblaženja 1: 100 (tj., približno 1. 0xl06 organizama). ;Na dan izazivanja, homogenat je otopljen brzo pod toplom vodom i razblažen prema preporukama ISU korišćenjem Sterilnog medijuma za rast M. hyopneumoniae. Svinjama je dat sedativ, smeša Xylazine-Ketamine-Telazol™ koja se sastoji od 50 mg/ml Xylazine-a, 50 mg/ml Ketamine-a i 100 mg/ml Terlazol-a. Anestetička smeša je data IM pri 0. 01-0. 02 ml/lb telesne težine. Svakoj svinji data je pojedinačna doza 10 ml materijala za izazivanje (lxl06 organizama), intra-trahealno. Da bi se osiguralo ispravno postavljanje igle, vazduh je izvučen iz šprica pre davanja doze za izazivanje. Nevakcinisane neizazivane kontrolne svinje su zadržane u odvojenim sobama i nisu izazivane. ;26-tog dana posle izazivanja (DPI), sve svinje su eutanazirane. Pluća su uklonjena i procenjena je većina plućnih lezija kao što je opisano u Primeru 3 ;Sakupljanje uzorka i testiranje ;Uzorci krvi su sakupljeni od. svih svinja na dan vakcinacije (0 DPV), 35 DPV, -1 DPI i 26 DPI za određivanje serumskih antitela protiv M. hvopneumoniae što je detektovano sa kompetativnim ELISA kitom (napravljenim od DAKO Co. ). Uzorci seruma su čuvani na <-20°C pre testiranja. ;Analiza podataka ;Procene lezija pluća su poređene između vakcinisanih i kontrola sa jednosmemim ANOVA. Procene plućnih lezija su bile transformisane sa arc sin-om da bi se poboljšala raspodela ostataka. S obzirom da je normalna pretpostavka za plućne lezije dovedena u pitanje, i procene plućnih lezija i arc sin transformisane procene plućnih lezija su analizirane sa Wilcoxon Rank sumarnim testom. Nivo značajnosti je podešen na p<0. 05. Rezultati iz neparametarskog, Wilcoxon Rank sumarnog testa su bili korišćeni za svrhe izveštavanja. ;REZULTATI I DISKUSUJA Serologija ;Sve svinje su testirane na serumska antiteia protiv M. hyopneumoniae sa komercijalnim kompetirivnim ELISA kitom, korišćenjem razblaženja seruma 1: 10 za sva testiranja. Uzorci sa sumljivim rezultatima testa po instrukcijama kita su tretirani kao pozitivni u analizi podataka. Sve svinje su bile sero-negativne (titar antiteia <10) u vreme vakcinacije, ukazujući da su životinje bile osetljive na M. hyopneumoniae. Sve svinje u kontrolnoj grupi su ostale sero-negativne pre izazivanja. Posle vakcinacije, petnaest od dvadeset vakcinanata (15/20) su postali sero-pozitivni na M. hyopneumoniae bar jednom (uzorci sakupljeni 35 DPV i -1DPC). Ovo ukazuje da je imuni odgovor kod vakcinisanoh svinja bio usled vakcine, a ne zbog izlaganja okolini. Sve vakcinisane svinje i četiri od deset svinja u izazivanoj kontrolnoj grupi su postale seropozitivne na M. hyopneumoniae posle izazivanja dok neizazivane životinje su ostale sero-negativne. Serološki status je ukratko prikazan u Tabeli 4. ;Procenjivanje plućnih lezija ;Dvadeset vakcinisanih svinja sa test vakcinom A i deset nevakcinisanih kontrolnih svinja su bile izazivane sa virulentim M. hyopneumoniae (1. 0xl06 organizama po svinji), šest meseci posle vakcinacije. Tri svinje su služile kao neizazivane kontrole. Osam od dvadeset vakcinanata (40%) nije razvilo plućne lezije posle izazivanja dok u kontrolnoj grupi samo jedna od 10 svinja (10%) nema plućne lezije. Procenti plućnih lezija su ukratko dati u Tabeli 5. Vakcinisane svinje imaju prosek procenjenih plućnih lezija 3. 6% i izazivne kontrolne svinje imaju prosek procenjenih plućnih lezija 14. 6%. Plućne lezije u vakcinisanoj grupi su bili značajno manje nego u kontrolnim (p=0. 0215). ;*P vrednost je iz poređenja grupe 1 i grupe 2.

Kao što se može videti iz podataka prikazanih u tabeli 4 i 5, test vakcina A izaziva zaštitni imunitet protiv virulentne M. hyopneumonia izazivane šest meseci posle davanja jedne doze svinjama vakcinisanim u trećoj nedelji starosti.

Claims (18)

1.Kompozicija vakcine za imunizaciju životinja protiv infekcije Mycoplasma hyopneumoniae, naznačena time, što uključuje imunizirajuću količinu bakterije Mycoplasma hyopneumoniae; smešu pomoćnih sredstava koju čine polimer akrilne kiseline i smeša metaboličnog ulja i polioksietilen-propilen blok kopolimer; i farmaceutski prihvatljiv nosač, gde kompozicija vakcine posle jednog davanja izaziva zaštitni imunitet od Mycoplasma hyopneumoniae.

2.Kompozicija vakcine prema zahtevu 1, naznačena time, što se smeša pomoćnih sredstava sastoji od polimera akrilne kiseline i smeše metaboličnog ulja koje se sastoji od jednog ili više terpenskih ugljovodonika i polioksietilena i polioksietilen-polipropilen blok kopolimera u odnosu od oko 1:25 do 1:50 polimera akrilne kiseline u odnosu na smešu metabolično ulje/polioksietilen-polipropilen blok kopolimer.

3.Kompozicija vakcine prema zahtevm 1, naznačena time, što smeša pomoćnih sredstava čini oko 1-25% v/v kompozicije vakcine.

4.Kompozicija vakcine prema zahtevu 3, naznačena time, što polimer akrilne kiseline je prisutan u koncentraciji od oko 1% v/v i smeša terpenski ugljovodonici/polioksietilen-polipropilen blok kopolimer je ' prisutna u krajnjoj koncentraciji od oko 5% do 10% v/v.

5.Kompozicija vakcine prema zahtevu 3, naznačena time, što smeša pomoćnih sredstava se sastoji od oko 2% - l5% v/v kompozicije vakcine.

6.Kompozicija vakcine prema zahtevu 5, naznačena time, što smeša pomoćnih sredstava se sastoji od oko 5% -12% v/v kompozicije vakcine

7.Kompozicija vakcine prema zahtevu 1, naznačena time, što metabolično ulje je skvalan ili skvalen.

8.Kompozicija vakcine prema zahtevu 6 i 7, naznačen time, što polimer akrilne kiseline je Carbopol.

9.Kompozicija vakcine prema bilo kom zahtevu 1-8, naznačena time, što dalje uključuje bar jednu bakteriju izabranu iz grupe koju čine Haemonphilus parasuis, Pasteurella multiocida, Streptococcum suis, Actionobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis i bakterija leptospire.

10.Postupak zaštite životinja protiv bolesti uzrokovane sa Mycoplasma hyopneumoniae, naznačen time, što uključuje stupanj davanja pomenutoj životinji kompozicije vakcine koja se sastoji od imunizirajuće količine bakterije Mycoplasma hyopneumoniae; smeše pomoćnih sredstava koju čine polimer akrilne kiseline i smeša metaboličnog ulja i polioksietilen-propilen blok kopolimera; i farmaceutski prihvatljivog nosača, gde kompozicija vakcine posle jednog davanja izaziva zaštitni imunitet od infekcije Mycoplasma hyopneumoniae.

11.Postupak prema zahtevu 10, naznačen time, što imunizirajuća količina pomenute bakterije je oko lxl08 do 3x10n MHDCE/ml.

12.Postupak prema zahtevu 11, naznačen time, što imunizirajuća količina pomenute bakterije je oko lxl09 do 3xl012 MHDCE/ml.

13.Postupak prema zahtevu 10, naznačen time, što način davanja pomenutog stupnja davanja je intramuskulami, subkutanozni, intraperitonealni, aerosolom, oralno ili intranazalno.

14.Postupak prema zahtevu 10, naznačen time, što smeša pomoćnih sredstava se sastoji od polimera akrilne kiseline i smeše metaboličnih ulja koju čine jedan ili više terpenskih ugljovodonika i polioksietilen- polipropilen blok kopolimer prisutan u krajnjoj koncentraciji od oko 1-25% v/v.

15. Postupak prema zahtevu 14, naznačen time, što polimer akrilne kiseline smeše pomoćnih sredstava je Carbopol.

16.Postupak prema zahtevu 14, naznačen time, što metabolično ulje smeše pomoćnih sredstava je terpenski ugljovodonik izabran iz grupe koju čine skvalen i skvalan.

17.Postupak prema bilo kom od zahteva 10-16, naznačen time, što dalje uključuje zajedničko davanje bar jedne dodatne bakterije izabrane iz grupe koju čine Haemonphilus parasuis, Pasteurella multiocida, Streptococcum suis, Actionobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis i bakterija leptospire.

18.Vakcina, naznačena time, što se sastoji od inaktivirane Mycoplasma hyopneumoniae, metaboličnog ulja, polioksietilen-polipropilen blok kopolimera i polimera akrilne kiseline u obliku emulzije ulja u vodi.