DE60127994T2

DE60127994T2 - VERBESSERTE i MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE /i BACTERIN VAKZINE

Info

Publication number: DE60127994T2
Application number: DE60127994T
Authority: DE
Inventors: Hsien-Jue CHU (Steve), Fort Dodge; Wumin Fort Dodge LI; Zhichang Fort Dodge XU
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2000-12-19
Filing date: 2001-12-11
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2021-12-12
Also published as: HU227431B1; CY1106669T1; ES2283452T3; WO2002049666A3; BRPI0116249B1; DK1343525T3; PL363220A1; MY129765A; TWI308872B; BR0116249A; BG66213B1; EP1343525A2; ME00570A; HUP0400687A3; AR033410A1; US20120213816A1; WO2002049666A2; EP1343525B1; US8187588B2; CN1489472A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich auf verbesserte Verfahren zur Induktion einer schützenden Immunität gegen Mycoplasma hyopneumoniae, insbesondere durch die Verwendung einer einzigen Dose eines inaktivierten Mycoplasma hyopneumoniae Bakterins in einer Menge, die wirksam ist, um ein Empfängertier gegen die Infektion durch Mycoplasma hyopneumoniae zu immunisieren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Mycoplasma hyopneumoniae ist das ätiologische Agens der Mykoplasmenpneumonie beim Schwein. Diese Krankheit ist eine wichtige Ursache für wirtschaftlichen Verlust in der Schweineindustrie auf Grund reduzierter Gewichtszunahme und schlechter Futtereffizienz. Die Krankheit verursacht chronischen Husten, glanzloses Fell, verzögertes Wachstum und ungesundes Aussehen während mehrerer Wochen. Charakteristische Läsionen von purpurfarbenen bis grauen Konsolidierungsflächen insbesondere in ventralen apikalen und kardialen Lappen werden bei infizierten Tieren beobachtet. Obwohl die Krankheit eine geringe Mortalität zur Folge hat, neigen befallene Schweine häufig zu sekundären Infektionen durch opportunistisch pathogene Erreger, die zum Tod oder zu Stress führen. Die wirtschaftlichen Verluste allein wurden auf zwischen 200 bis 250 Millionen Dollar jährlich geschätzt.
Mycoplasma hyopneumoniae ist ein langsam wachsendes, empfindliches Bakterium, dem eine Zellwand fehlt. Es ist oft schwierig aus dem respiratorischen Trakt zu isolieren wegen Mycoplasma hyorhinis, eines üblichen sekundären Agens, das auch im respiratorischen Trakt lokalisiert ist. Die Krankheit wird durch Aerosol, das durch Husten erzeugt wird, und direkten Kontakt eines befallenen oder konvaleszenten Trägerschweins verbreitet. Das Vermischen infizierter Tiere und nicht infizierter Tiere führt zu früher und häufiger Reinfektion. Die Infektion beginnt häufig mit einer Infektion der Ferkel durch die Trägersauen beim Werfen. Infolge der Herdhaltungstechniken ist es möglich, dass die Infektion erst im späteren Leben in Erscheinung tritt. Eine zusätzliche Infektion wird üblicherweise nach der Entwöhnung beobachtet, wenn die Schweine zusammengefasst werden. Der Krankheitsausbruch wird normalerweise bei sechs Wochen alten oder älteren Schweinen beobachtet. Die Wachstums- und Futterverwertungsraten sind deutlich reduziert bei kranken Tieren. Behandlungen mit Antibiotika sind kostspielig und erfordern längere Anwendung. Die Reinfektion ist ebenfalls ein Problem. Impfstoffe sind gegenwärtig die wirksamste Methode zur Vermeidung von Infektionen und deren Konsequenzen.
Die Fort Dodge Animal Health (FDAH) vermarktet in den USA das Mycoplasma hyopneumoniae Bakterin unter dem Namen Suvaxyn^® Respifend^® MH zur Verwendung als Impfstoff, um gesunde Schweine vor den durch Mycoplasma hyopneumoniae verursachten klinischen Zeichen zu schützen. Der Impfstoff enthält Carbopol als Adjuvans und wird als ZweifachImpfstoff für mindestens eine Woche alte Schweine empfohlen, wobei die zweite Dosis zwei bis drei Wochen nach der ersten Impfung verabreicht wird. Jedoch bringt ein Zweifach-Impfstoff den nahe liegenden Nachteil mit sich, dass die Tiere ein zweites Mal behandelt werden müssen, um den vollen Schutz gegen die Krankheit zu erreichen.
Ein Ziel dieser Erfindung besteht daher darin, einen wirksamen Impfstoff gegen Mycoplasma hyopneumoniae vorzuschlagen, der bei Verabreichung einer einzigen Dosis des Impfstoffs eine schützende Immunität auslöst und die durch diesen Organismus verursachte Krankheit verhütet.
Ein anderes Ziel dieser Erfindung besteht darin, eine Impfstoffzusammensetzung vorzuschlagen, die für die Verwendung beim Schwein gegen die durch Mycoplasma hyopneumoniae verursachte Infektion und Krankheit geeignet ist und in Kombination mit anderen Bakterins und/oder Toxoiden eingesetzt werden kann.
Noch ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht darin, ein Verfahren vorzuschlagen zur Verhütung oder Linderung der Krankheit, deren verursachender Organismus Mycoplasma hyopneumoniae ist, durch die Anwendung eines adjuvanten Präparats, das die Immunogenität des Bakterins erhöht, so dass eine schützende Immunität nach einer einzigen Dosis des Impfstoffs ausgelöst wird.
Andere Ziele und Merkmale dieser Erfindung ergeben sich aus nachstehend ausgeführter detaillierter Beschreibung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Impfstoffzusammensetzung zur Immunisierung eines Tiers gegen die Infektion durch Mycoplasma hyopneumoniae, die eine immunisierende Menge eines inaktivierten Mycoplasma hyopneumoniae Bakterins, eine adjuvante Mixtur, die durch Mischen eines Acrylsäurepolymers und einer Mixtur aus einem stoffwechselfähigen Öl und einem Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer gewonnen wird, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst, wobei diese Impfstoffzusammensetzung nach einmaliger Verabreichung eine schützende Immunität gegen Mycoplasma hyopneumoniae auslöst.
Bei einem anderen Aspekt schlägt diese Erfindung eine immunogene Zusammensetzung zur Immunisierung eines Tiers gegen die Infektion durch Mycoplasma hyopneumoniae vor, die ein inaktiviertes Mycoplasma hyopneumoniae Bakterin kombiniert mit der oben erwähnten Mixtur und einen pharmazeutisch annehmbaren Stabilisator, Träger oder Verdünner umfasst. Das Adjuvans liegt üblicherweise in dieser Impfstoffzusammensetzung in einer Endkonzentration von etwa 1 bis 25% (v/v) und bevorzugt etwa 5 bis 12% (v/v) vor. Die Zusammensetzung kann auch andere Impfstoffkomponenten umfassen, einschließlich inaktivierter Bakterine oder gereinigter Toxoide, aus einem oder mehreren Pathogenen, wie Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella cholerae-suis und Leptospira und kann auf intramuskulären, subkutanen, oralen, Aerosol- oder intranasalen Routen verabreicht werden.
Bei noch einem weiteren Aspekt schlägt diese Erfindung ein Verfahren vor zum Schutz eines Tiers gegen die durch Mycoplasma hyopneumoniae verursachte Krankheit durch Verabreichung einer einzigen Dosis des oben erwähnten Impfstoffs, der das inaktivierte Mycoplasma hyopneumoniae Bakterin und die adjuvante Mixtur umfasst.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie er hier verwendet wird, bedeutet der Begriff "Bakterin" ein geerntetes Bakterium, das inaktiviert wurde und in Kombination mit gewissen Adjuvantien eine schützende Immunität auslösen kann zum Schutz gegen Krankheit oder Infektion, wenn es Tieren verabreicht wird.
Ein „Adjuvans" ist eine Zusammensetzung, die aus einer oder mehreren Substanzen besteht, die die Immunogenität und Effizienz des Mycoplasma hyopneumoniae Bakterins in einer Impfstoffzusammensetzung steigern.
Wie er in der Spezifikation und den Ansprüchen verwendet wird, bezeichnet der Begriff MHDCE Mycoplasma hyopneumoniae DNA-Zellenäquivalente.
Der Begriff „immunisierende Menge" meint die Menge des Bakterins, die eine Immunität gegenüber Mycoplasma hyopneumoniae erzeugt. Die „immunisierende Menge" hängt von der Art, Gattung, dem Alter, der Größe, dem Gesundheitszustand und davon ab, ob das Tier vorher einen Impfstoff gegen denselben Organismus erhalten hat.
Vorliegende Erfindung schlägt einen Impfstoff gegen Mycoplasma pneumoniae vor, der für eine Immunisierung mit einer einmaligen Dosis geeignet ist. Der Impfstoff dieser Erfindung umfasst eine adjuvante Mischung, die die Immunogenität des Bakterins erhöht und damit ermöglicht, dass eine einmalige Verabreichung eine schützende Immunität bewirkt.
Der Impfstoff kann aus frisch geernteten Kulturen zubereitet werden durch Verfahren, die in der Technologie Standard sind (siehe zum Beispiel das U. S. Patent 5.338.543 oder U. S. Patent 5.565.205 , sowie Beispiel 2 unten). Das bedeutet, dass der Organismus in einem Kulturmedium wie dem kompletten Medium PPLO (Pleuropneumonia-ähnlicher Organismus) [Difco] Laborstories] propagiert wird. Das Wachstum des Organismus wird mittels Standardtechniken wie der Bestimmung der Farbänderungseinheiten (CCU) überwacht und geerntet, wenn ein ausreichend hoher Titer erreicht worden ist. Die Vorräte können ferner konzentriert oder lyophilisiert werden mittels herkömmlicher Methoden vor Einschluss in den Impfstoff für das Präparat. Andere Methoden, wie die von Thomas et al., Agri-Practice, Band 7 Nr. 5, S. 26–30, beschriebene, können zur Anwendung kommen.
Der erfindungsgemäße Impfstoff umfasst das inaktivierte Mycoplasma hyopneumoniae Bakterin kombiniert mit der adjuvanten Mixtur und einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder mehreren solcher Träger. Für die Verwendung geeignete Träger umfassen wässrige Medien, zum Beispiel Salzlösung, phosphatgepufferte Salzlösung, minimale essentielle Medien (MEM) oder MEM mit HEPES-Puffer.
Die adjuvante Mixtur zur Verwendung für die erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen erhöht die Immunantwort und umfasst eine Mixtur aus einem Polyacrylsäurepolymer mit einer Mixtur aus stoffwechselfähigem Öl, z. B. einem ungesättigten Terpenkohlenwasserstoff oder einem Hydrierungsprodukt davon, bevorzugt Squalan (2,3,10,15,19,23-Hexamethyltetracosan) oder Squalen, und einem Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer. Ein solches Acrylsäurepolymer kann ein Homopolymer oder ein Copolymer sein. Das Acrylsäurepolymer ist bevorzugt ein Carbomer. Carbomere sind unter dem Handelsnamen Carbopol im Handel erhältlich. Das Acrylsäurepolymer ist zum Beispiel in den U. S. Patenten 2.909.462 und 3.790.665 beschrieben. Die Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymere sind Tenside, vorzugsweise flüssige Tenside, die das Suspendieren der festen und flüssigen Komponenten unterstützen. Die Tenside sind im Handel als Polymere unter dem Handelsnamen Pluronic^® erhältlich. Das bevorzugte Tensid ist das Poloxamer 401, das im Handel unter dem Handelsnamen Pluronic^® L121 erhältlich ist.
Die immungenetisch stimulierende adjuvante Mixtur liegt typischerweise in der erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung in v/v Mengen von etwa 1% bis 25%, bevorzugt etwa 2% bis 15%, bevorzugter etwa 5% bis 12% v/v vor. Die Menge der Verwendung der adjuvanten Mixtur und das Verhältnis der beiden Komponenten des Adjuvans kann variieren je nach der Beifügung anderer Bakterine oder gereinigter Toxoide. Die adjuvante Mixtur umfasst im Allgemeinen ein stoffwechselfähiges Öl, ein Acrylsäurepolymer und ein Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer, die als Emulsion in einem wässrigen Medium zubereitet sind.
In dieser adjuvanten Mixtur können das stoffwechselfähige Öl und das Acrylsäurepolymer in Mengen vorliegen, die von etwa 10 bis 150 ml/l und etwa 0,5 bis 10 g/l jeweils reichen. Bei einer bevorzugten Ausführung der adjuvanten Mixtur ist die Mixtur des stoffwechselfähigen Öls und der Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymerkomponente eine Mixtur aus Squalan und Pluronic^® L121 (Poloxamer 401), die in einer Menge von etwa 50 bis 100 ml/l vorliegen kann, und das Carboxymethylenpolymer ist Carbopol 934P (Carbamer 934P), das in einer Menge von etwa 2 ml/l vorliegen kann. Typischerweise enthält die adjuvante Mixtur ein Verhältnis von etwa 1:25 bis 1:50 des Acrylsäurepolymers zur Mixtur aus stoffwechselfähigem Öl und Polyoxyethylen-Polypropylen-Blockcopolymer.
Bevorzugte Acrylsäurepolymere sind solche, die von B. F. Goodrich als Carbopol 934 P NF und 941 NF vermarktet werden, die Polymere der Acrylsäure sind, die mit Polyallylsaccharose kreuzverbunden sind und die chemische Formel (CH₂CHOOOH)_n besitzen. Diese Polymere bilden wässrige Gele, die sich mit wässrigen Trägern auf geeignete Weise zubereiten lassen. Bevorzugte Polyoxyethylen-Polypropylen-Blockcopolymere sind nichtionische Tenside, die von BASF als Pluronic^® L121, L61, L81 oder L101 vermarktet werden.
Der erfindungsgemäße Impfstoff kann auf intramuskulärem, subkutanem, intranasalem, intraperitonealem oder oralem Weg verabreicht werden, bevorzugt wird der intramuskuläre oder subkutane Weg.
Der erfindungsgemäße Impfstoff umfasst im Allgemeinen das inaktivierte Mycoplasma hyopneumoniae, ein stoffwechselfähiges Öl, ein Polyoxyethylen-Polypropylen-Blockcopolymer und ein Acrylsäurepolymer in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion. Der Impfstoff enthält bevorzugt das Acrylsäurepolymer in einer Konzentration im Bereich von 0,5 bis 10 g/l. Der Impfstoff enthält bevorzugt das stoffwechselfähige Öl in einer Konzentration im Bereich von 2 bis 6 ml/l. Der Impfstoff enthält bevorzugt das Polyoxyethylen-Propylen-Blockcopolymer in einer Konzentration im Bereich von 1 bis 3 ml/l.
Für die Einfachdosenverabreichung sollte der Impfstoff vorzugsweise eine Menge an Mycoplasma pneunomoniae Bakterin enthalten, die etwa 1 × 10⁸ bis 3 × 10¹¹ MHDCE/ml entspricht, bevorzugt etwa 1 × 10⁹ bis 3 × 10⁹ MHDCE/ml. Etwa ein bis fünf ml, vorzugsweise 2 ml, können pro Tier intramuskulär, subkutan oder intraperitoneal verabreicht werden. Ein bis zehn ml, vorzugsweise 2 bis 5 ml, können oral oder intranasal verabreicht werden.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern ohne Einschränkung ihres Geltungsumfangs.
BEISPIEL 1
MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE BAKTERIN ZUBEREITUNG DER IMPFSTOFFZUSAMMENSETZUNG
BESCHREIBUNG DER VIRALEN VORRATS.
Mycoplasma hyopneumoniae kann aus einer Anzahl fertig erhältlicher Quellen gewonnen werden. Bei einer Ausführung kann der Mycoplasma hyopneumoniae Stamm P-5722-3 verwendet werden. Die Kultur wurde von C. Armstrong, Purdue University, West Lafayette, Indiana, bezogen. Nach Erhalt der Mycoplasma hyopneumoniae Kultur wurde sie sieben Mal in einen Mycoplasma hyopneumoniae Ansatz gegeben, um die Master Seed herzustellen.
ZELLKULTUR.
Mycoplasma hyopneumoniae wurde in einem Medium gezüchtet, das Bacto PPLO Pulver, Hefeextrakt, Glucose, L-Cysteinhydrochlorid, Ampicillin, Thalliumacetat, Phenol rot, Antischaummittel, normales steriles Schweineserum und Wasser enthielt, während einer Dauer von 18 bis 144 Stunden. Zur Inaktivierung wird binäres Ethylenimin (BEI) auf die Produktionskultur innerhalb des Fermentierungsgefälles gerichtet zugefügt. Der pH-Wert wird auf 7,4 angepasst und dann wird nach herkömmlichen Verfahren geerntet, um das Mycoplasma hyopneumoniae Bakterin zu erhalten.
ZUBEREITUNG DER IMPFSTOFFZUSAMMENSETZUNG.
Zusammensetzung der Konservierungsstoffe und verwendete Proportionen.
Das geerntete Bakterin wird durch die Zugabe von Thimerosal und Ethylendiaminet-Tetraessigsäure, Tetra-Natriumsalz (EDTA) von höchstens 0,01% und 0,07%, jeweils, konserviert. Ampicillin U.S.P. ist im Wachstumsmedium in einer Menge von 0,250 g/l vorhanden. Die Konzentration des restlichen Ampicillins wird im Endprodukt je nach dem Volumen der geernteten Flüssigkeiten variieren, wobei die Konzentration des restlichen Ampicillins im fertig gestellten Produkt 30 ug/ml nicht übersteigt.
STANDARDISIERUNG DES PRODUKTS.
Das Mycoplasma Konzentrat wird durch einen DNA-Fluormetrie-Assay quantifiziert.
Eine Mixtur des stoffwechselfähigen Öls, das einen Terpenkohlenwasserstoff oder mehrere Terpenkohlenwasserstoffe und ein Polyoxyethylen-Polypropylen-Blockcopolymer, z. B. eine Squalan/Pluronic L121 Mixtur umfasst, wird durch Lösen von 10 g Natriumchlorid, 0,25 g Kaliumchlorid, 2,72 g dibasisches Natriumphosphat, 0,25 g monobasisches Kaliumphosphat, 20 ml Pluronic L121 (BASF Corporation), 40 ml Squalan (Kodak), 3,2 ml Tween 80 in 900 ml gereinigten Wassers ausreichender Menge bis 1000 ml zubereitet.
Nach dem Mischen können die Bestandteile autoklaviert werden. Die Mixtur wird dann homogenisiert, bis sich eine stabile Emulsion gebildet hat. Formalin kann bis zu einer Endkonzentration von 0,2% oder Thimerosal bis zu einer Endkonzentration von 1:10.000 hinzugegeben werden.
VEREINIGUNG DER EINHEITEN ZUR HERSTELLUNG EINER SERIE.

Befriedigende Mycoplasma hyopneumoniae Konzentrate werden aseptisch mit den Adjuvantien, Konservierungsstoffen und dem Verdünner in einem sterilen Behälter, der mit einem Rührer ausgestattet ist, vereinigt und mindestens 30 Minuten lang gemischt.

Mengen für 1.000.000 Dosierungen (zu je 2 ml):	% vol/vol
Mycoplasma Konzentrat (> 1,0 × 10¹⁰ MHDCE/ml)	400.000 ml	20,0
Squalan/Pluronic L121 Mixtur	100.000 ml	5,0
Carbopol (2% w/v in Wasser)	200.000 ml	10,0
Thimerosal Lösung 1% w/v in Wasser und EDTA (Tetranatriumsalz) 7 w/v%	18.000 ml	0,9
Sterile Salzlösung	1.282.000 ml	64,1

Der pH-Wert der Serie wird auf 7,0 ± 0,2 angepasst.
MHDCE = Mycoplasma hyopneumoniae DNA-Zellenäquivalente

METHODEN UND TECHNIKEN DES EINFÜLLENS IN ENDBEHÄLTER UND DEREN VERSIEGELUNG.
Das Produkt kann durch ein steriles 200–500 Micron Filterelement grob gefiltert und unter in 9 CFR 114.6 spezifizierten Bedingungen in sterile Endcontainer gefüllt werden in einem für Füllvorgänge bestimmten Raum. Die Glas- oder Kunststoffcontainer werden mit einem Gummistöpsel verschlossen und mit Aluminiumkapseln crimpversiegelt. Jede 2,0 ml Dosis enthält mindestens 2 × 10⁹ Mycoplasma hyopneumoniae DNA-Zellenäquivalente.
WIRKSAMKEITSTESTEN.
Lose oder Endcontainerproben des fertig gestellten Produkts können wie folgt auf ihre Wirksamkeit hin getestet werden:
Assayverfahren für das Wirksamkeitstesten: Sechs bis sieben Wochen alte weibliche ICR Mäuse aus einer Sendung von Harlan Sprague Dawley oder anderen annehmbaren Lieferanten werden verwendet. Mindestens 20 Mäuse sind für die Immunisierung mit jeweils dem unbekannten und dem Referenzbakterin erforderlich. Mindestens fünf Mäuse werden als nicht-inokulierte Kontrollen zurückgehalten. Test- und Referenzbakterine werden einzeln gut vermischt. Sterile Einwegspritzen, die mit 25-gauge Nadeln 5/8 ausgestattet sind, werden verwendet, um die Mäuse subkutan in der Leistengegend mit 1/10tel einer Wirtstierdosis (0,2 ml) zu inokulieren. Jede Mäusegruppe wird als einzelne Einheit untergebracht und erhält freien Zugang zu Futter und Wasser für 14 Tage. Dann wird jede Maus anästhetisiert. Die anästhetisierte Maus wird auf den Rücken gelegt. Mit der einen Hand wird der Kopf nach unten gehalten und ein Vorderbein vom Körper weggestreckt. Mittels eines Skalpells wird ein Hauteinschnitt etwa 1,3 mm lang zwischen dem ausgestreckten Vorderbein und dem Thorax durchgeführt, wobei die Oberarmarterie abgetrennt wird. Mittels einer 3,0 ml Spritze ohne Nadel wird das Blut, das sich im Einschnitt ansammelt, aufgenommen. Das Blut wird in ein beschriftetes Teströhrchen gegeben und man lässt es klumpen. Die Röhrchen mit dem geklumpten Inhalt werden bei 1.000 × g zentrifugiert, um das Serum vom Klumpen zu trennen. Die einzelnen Sera werden bei –20°C oder darunter bis zum Testen gelagert.
SEROLOGISCHES TESTEN:
Ein ELISA-Verfahren wird durchgeführt, um die Antikörperantwort der Mäuse auf die Referenz- und/oder unbekannten Bakterine zu messen. Das ELISA-Verfahren wird unter Verwendung von Immulon II Einweg-Flachboden-Mikrotiterplatten von Dynatech oder äquivalenten Platten und einem ELISA-Plattenlesegerät durchgeführt.
TESTREAGENZIEN:

Phosphatgepufferte Salzlösung-Tween (PEST) (pH-Wert auf 7,2 bis 7,4 mit 5N NaOH oder 5N HCl angepasst).

Menge pro Liter

Bestandteile Liter

NaCl 8,50 g

NaH₂PO₄ 0,22 g

Na₂HPO₄ 1,19 g

Tween-20 0,50 ml

Deionisiertes Wasser (in ausreichender Menge). 1.000,00 ml

Glycingepufferte Salzlösung (GBS) (pH-Wert auf 9,5 bis 9,7 mit 5N NaOH oder 5N HCl angepasst).

Bestandteile	Menge pro Liter
Glycin	0,.75 g
NaCl	8,50 g
Deionisiertes Wasser (in ausreichender Menge)	1.000,00 ml

Positives Kontrollserum: Das positive Kontrollserum ist ein Pool von Sera von Mäusen, die mit Mycoplasma hyopneumoniae Bakterin geimpft wurden.

Konjugat und Substrat:
Affinitäts-gereinigtes Anti-Maus-IgG-Peroxidase-markiertes Konjugat wird von Kirkegaard and Perry Laborstories, Inc. (Katalognr. 074-1802) bezogen. Das Verfahren zur Bestimmung der optimalen Verdünnung des Konjugats ist nachstehend im Detail erläutert. Die Peroxidasesubstratlösungen (ABTS) werden von Kirkegaard and Perry, Inc. bezogen.
Titrierung des Konjugats: eine Immulon II Flachbodenplatte wird mit 100 μl pro Well von 20 μg pro ml Mycoplasma hyopneumoniae Ganzzellen-Antigen in 10 mM GBS verdünnt überzogen. Die Platte wird mindestens eine Stunde lang bei 37°C + 2°C inkubiert und in 2 bis 7°C umgesetzt für mindestens 18 Stunden und längstens eine Woche. Vor ihrer Verwendung wird die Platte dreimal mit PEST gewaschen, mit einer einminütigen Wässerungszeit zwischen jedem Waschgang und trocken geklopft. Eine 1:40 Verdünnung in PEST des positiven Kontrollserums wird zubereitet und das verdünnte positive Serum (100 μl/Well) zu einer Hälfte der Wells in der Platte zugefügt. PEST wird zur anderen Hälfte der Wells zugefügt. Die Platte wird inkubiert für eine Stunde bei Raumtemperatur, wonach die Platte dreimal gewaschen wird. Das konjugierte Serum wird seriell mit PEST zweifach verdünnt, beginnend mit einer 1:100 Verdünnung und endend mit einer 1:10.240 Verdünnung. 100 μl jeder Konjugatverdünnung wird zu vier Wells des positiven Serums und vier der Wells des PEST zugefügt und man lässt dies für eine halbe Stunde bei Raumtemperatur reagieren. Die Platten werden viermal gewaschen und 100 μl der Peroxidasesubstratlösung (abts) werden pro Well hinzugefügt. Die Platte wird mit einer dualen Wellenlängeneinstellung von T λ = 450 gelesen. Eine Konjugatverdünnung wird gewählt, die einen gelesenen Wert von 0,850 bis 1,050 für das positive Kontrollserum ergibt, wenn der Wert der PEST Kontrolle vom Wert des positiven Kontrollserums abgezogen wird.
Testantigen:
Mycoplasma hyopneumoniae Antigen ist eine Ganzzellenzubereitung und wird von Fort Dodge Animal Health geliefert.
ELISA wird wie folgt durchgeführt: Dynatech Immulon II Flachboden-Mikrotiterplatten werden verwendet. Ein Glasfläschchen mit lyophilisiertem Mycoplasma hyopneumoniae Ganzzellenantigen wird mit glycingepufferter Salzlösung (GBS) zu zehn ml rekonstituiert. Die Konzentration des rekonstituierten Mycoplasma Proteins beträgt 20 μg/ml. 100 μl (2 μg) des verdünnten Antigens werden dann zu allen Wells der Platte zugefügt. Die Platte wird inkubiert bei 37°C ± 2°C für mindestens eine Stunde und dann in 2 bis 7°C umgesetzt für mindestens 18 Stunden und höchstens eine Woche. Die Platten werden dreimal mit PEST gewaschen, wobei eine Minute lang zwischen jedem Waschgang gewässert wird, und dann trocken geklopft. Die Sera werden zu 1:40 in PEST verdünnt. Das positive Kontrollserum wird vierfach auf jede Platte gegeben. Das Probenvolumen pro Well beträgt 100 μl. Die Serientestserumproben und Referenzserumproben werden zweifach auf derselben Platte getestet. Die Platten werden inkubiert für eine Stunde bei Raumtemperatur und dreimal mit PEST gewaschen. 100 μl des Anti-Maus IgG-Peroxidase-markierten Konjugats (Kirkegaard and Perry), verdünnt in PEST werden zu allen Wells hinzugefügt und die Wells für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten werden viermal mit PEST gewaschen. 100 μl einer Peroxidasesubstratlösung (ABTS) zu allen Wells hinzugefügt und die Platten inkubiert, bis die positive Serumkontrolle eine OD₄₀₅ (450) von 0,850 bis 1,050 erreicht, wenn die Maschine die PEST Kontroll-Wells abzieht. Die Platten werden gelesen und die PEST Wells abgezogen. Damit der Test gültig ist, müssen die mit dem Referenzbakterin inokulierten Mäusesera einen Mindestdurchschnittswert von 0,500 produzieren und die Sera der nicht geimpften Kontrollmäuse dürfen den maximalen Durchschnittswert von 0,100 nicht übersteigen. Oder der Unterschied zwischen dem Durchschnittswert der mit dem Referenzbakterin inokulierten Mäusesera und den Sera der nicht geimpften Kontrollmäuse muss größer als oder gleich 0,400 sein.
Die Mittelwerte für die Seriengeimpften, Referenzgeimpften und Kontrollen werden wie folgt errechnet und bewertet: Um als befriedigend zu gelten muss das Testbakterin einen durchschnittlichen mittleren optischen Dichtewert gleich oder größer als das Referenzbakterin beweisen. Oder bei Durchführung eines One-Tailed Student-T-Tests darf das Testbakterin nicht signifikant (p ≤ 0,05 Vertrauenskoeffizient) niedriger sein als das Referenzbakterin. Jeder errechnete T-Wert, der gleich oder größer als 1,686 ist, weist auf einen signifikanten Unterschied zwischen Referenz- und Testbakterin hin und führt dazu, dass das Testbakterin verworfen wird. Jeder errechnete T-Wert unter 1,686 weist auf eine befriedigende Serie hin. Jedes Testbakterin, das sich durch den Test, aus irgendeinem Grund, der nicht mit der Produkteffizienz in Zusammenhang steht, als unbefriedigend herausstellt, wird erneut getestet und der anfängliche Test als ungültig angesehen.
BEISPIEL 2
TESTIMPFSTOFF:
Der zum Testen bestimmte Impfstoff wurde nach den in Beispiel 1 detailliert beschriebenen Verfahren unter Verwendung von 5% einer Mixtur aus einem stoffwechselfähigen Öl, das einen Terpenkohlenwasserstoff oder mehrere Terpenkohlenwasserstoffe und ein Polyoxyethylen-Polypropylen-Blockcopolymer (Squalan/Pluronic L121 Mixtur) und 0,2% Acrylsäurepolymer (Carbopol) als Adjuvans und 2 × 10⁹ M. hyopneumoniae DNA-Zellenäquivalente (MHDCE) pro Dose umfasst, hergestellt.
BEISPIEL 3
Diese Studie war dazu bestimmt, eine vier Monate andauernde Immunität (DOI) bei Schweinen, die durch eine einmalige Verabreichung des Impfstoffs des Beispiels 2 in einem Alter von drei Wochen induziert wurde, nachzuweisen.
Zwei getrennte Tierversuche wurden für diese Studie durchgeführt. Alle Schweine in beiden Versuchen waren seronegativ (Antikörperfiter < 10) zum Zeitpunkt der Impfung, was darauf hinwies, dass die Tiere für Mycoplasma hyopneumoniae anfällig waren. Alle Schweine in den Kontrollgruppen blieben seronegativ vor der Infizierung. Dies weist darauf hin, dass die Immunantwort der geimpften Schweine auf den Impfstoff und nicht auf irgendeine andere Exposition im Umfeld zurückzuführen war.
Beim ersten Versuch wurde ein Impfstoff des Beispiels 2 zusammen mit einem kommerziell erhältlichen, von Boehringer Ingelheim (BI) hergestellten Produkt, Ingelvac M. hyo^®, ausgewertet durch Infizierung mit einem hohen Level eines virulenten M. hyopneumoniae (4 × 10⁶ Organismen). Zweiundzwanzig (22) Schweine im Alter von 18 bis 21 Tagen wurden mit dem Impfstoff des Beispiels 2 intramuskulär (IM) und acht (8) Schweine mit dem Ingelvac M. hyo^® [Serie 271 032] geimpft. Zweiundzwanzig (22) Schweine dienten als Infektionskontrollen und 10 Schweine als nicht infizierte Kontrollen.
Die Schweine in der geimpften und Infektionskontrollgruppe wurden mit virulentem M. hyopneumoniae vier Monate nach der Impfung infiziert. Die mit dem Impfstoff des Beispiels 2 geimpften Schweine wiesen durchschnittliche Lungenläsionen von 15,9% und die infizierten Kontrollschweine wiesen durchschnittliche Lungenläsionen von 19,6% auf. Die durchschnittlichen Lungenläsionen in der mit dem Impfstoff des Beispiels 2 geimpften Gruppe traten in geringerem Maße auf als bei den Kontrollen, sogar obwohl die Schweine mit einer höheren als der von Iowa State University (ISU) empfohlenen Dose infiziert wurden, der Unterschied war jedoch nicht signifikant (p = 0,19). Desgleichen wurde, wenn das Handelsprodukt, Ingelvac M. hyo^®, in derselben Gruppe von Tieren mit derselben Infektionsdosis ausgewertet wurde, ein ähnlicher Stand der Lungenläsionen ebenfalls beobachtet (14,6%). Es lag auch kein signifikanter Unterschied zwischen der mit Ingelvac M. hyo^® geimpften Gruppe und der Kontrollgruppe (p = 0,27) und zwischen der mit Ingelvac M. hyo^® geimpften Gruppe und der mit dem Impfstoff des Beispiels 2 geimpften Gruppe vor.
Beim zweiten Versuch wurde ein Impfstoff des Beispiels 2 ausgewertet durch eine Infektion mit dem virulenten M. hyopneumoniae in der von der ISU empfohlenen Dosis (1,0 × 10⁶ Organismen) vier Monate nach der Impfung. Dreiundzwanzig (23) Schweine wurden geimpft mit einer Dosis des Impfstoffs im Alter von 21 Tagen, 25 Schweine dienten als Infektionskontrolle und 7 Schweine als nicht infizierte Kontrollen. Die Schweine in der geimpften und Infektionskontrollgruppe wurden mit virulentem M. hyopneumoniae vier Monate nach der Impfung infiziert. Die Kontrollgruppe wies durchschnittliche Lungenläsionen von 10,4% auf und die geimpfte Gruppe durchschnittliche Lungenläsionen von 5,5%. Es lag ein signifikanter Unterschied vor zwischen der geimpften Gruppe und der Kontrollgruppe (p = 0,031). Dies weist darauf hin, dass der Impfstoff des Beispiels 2 eine schützende Immunität wirksam stimuliert, die mindestens vier Monate nach einer Einzeldosisimpfung bei Schweinen im Alter von drei Wochen anhalten kann.
Wurden die Daten bezüglich des Impfstoffs des Beispiels 2 in den beiden Versuchen kombiniert und analysiert, ergaben sich durchschnittliche Lungenläsionen der geimpften Gruppe, die signifikant niedriger waren als die der Kontrollgruppe.
Schlussfolgernd induziert der Impfstoff des Beispiels 2 eine schützende Immunität gegen eine Infektion durch das virulente M. hyopneumoniae vier Monate nach einer Einzeidosisimpfung bei Schweinen im Alter von drei Wochen.
EXPERIMENTELLE DATEN
Zwei getrennte Versuche wurden in dieser Studie durchgeführt. Beim ersten Versuch wurden siebenundsechzig (67) Schweine in vier Gruppen aufgeteilt unter Anwendung des Microsoft Excel Randomisierungsprogramms. Vierundzwanzig (24) Schweine wurden mit einer Dosis eines nach Beispiel 2 zubereiteten Impfstoffs intramuskulär (IM) im Alter von 18 bis 21 Tagen geimpft. Vierundzwanzig (24) Schweine dienten als Infektionskontrollen und 10 Schweine als nicht infizierte Kontrollen. Neun Schweine wurden mit dem kommerziellen Produkt, Ingelvac M. hyo^®, [Serie 271 032, hergestellt von Boehringer Ingelheim (BI)], nach der Herstellerinstruktion IM geimpft. Fünf Schweine (zwei mit dem Impfstoff des Beispiels 2 geimpfte Schweine, ein mit dem BI-Impfstoff geimpftes Schwein und zwei Kontrollen) starben während der Wirkungsdauer der Impfung aus Gründen, die nicht mit der Impfung zusammen hingen. Die verbliebenen Schweine in den geimpften Gruppen und der Infektionskontrollgruppe wurden mit 14 ml des virulenten M. hyopneumoniae (1,4 × 10⁶ Organismen) vier Monate nach der Impfung infiziert. Die Schweine in allen vier Gruppen wurden 30 Tage nach der Infizierung euthanasiert und die Lungenläsionen für jedes Schwein im Versuch gezählt.
Bei einem zweiten Versuch wurden fünfundzwanzig (25) Schweine mit einer Dosis eines nach Beispiel 2 zubereiteten Impfstoffs im Alter von 21 Tagen IM geimpft. Fünfundzwanzig (25) Schweine dienten als Infektionskontrollen und 10 Schweine als nicht infizierte Kontrollen. Zwei Schweine starben aus Gründen, die nicht mit der Impfung zusammenhingen, und ein Schwein wurde irrtümlich während der Wirkungsperiode der Impfung verkauft. Die verbliebenen Schweine in der geimpften und infizierten Kontrollgruppe wurden mit 10 ml des virulenten M. hyopneumoniae (1,0 × 10⁶ Organismen) vier Monate nach der Impfung infiziert. Zwei Schweine starben während der Postinfizierungsbeobachtungsperiode aus Gründen, die nicht mit der Impfung/Infizierung zusammenhingen. Die verbliebenen Schweine in allen drei Gruppen wurden 30 Tage nach der Infizierung euthanasiert und die Lungenläsionen für jedes Schwein im Versuch gezählt.
Impfung:
Jedes Schwein in den Impfungsgruppen erhielt eine 2 ml Dosis des Testimpfstoffs IM in die Seite des Nackens.
Infizierung und Autopsie:
Der Infizierungsvorrat des virulenten M. hyopneumoniae, ein gefrorenes (–70°C) Lungenhomogenat, wurde von Dr. Eileen Thacker der Iowa State University (ISU) zubereitet. Der Infizierungsvorrat wurde als rein bestätigt und enthielt etwa 10⁷ M. hyopneumoniae Organismen pro ml. Die empfohlene Infizierungsdosis beträgt 10 ml eines 1:100 verdünnten Vorrats (d.h. 1,0 × 10⁶ Organismen).
Die Schweine in den geimpften und Infizierungskontrollgruppen des ersten Versuchs wurden mit 14 ml des 1:100 verdünnten Vorrats infiziert (d.h. 1,4 × 10⁶ Organismen). Die Schweine des zweiten Versuchs wurden mit 10 ml des 1:100 verdünnten Vorrats (d.h. 1,0 × 10⁶ Organismen) wie empfohlen infiziert.
Am Tag der Infizierung wurde das Homogenat schnell unter warmem Wasser aufgetaut und nach den Empfehlungen der ISU verdünnt unter Verwendung eines sterilen M. hyopneumoniae Wachstumsmediums. Die Schweine wurden sediert mit einer Mixtur von Xylazin-Ketamin-Telazol^TM bestehend aus 50 mg/ml Xylazin, 50 mg/ml Ketamin und 100 mg/ml Telazol. Die Anästhesiemixtur wurde mit einer Dosis von 0,01–0,02 ml/lb Körpergewicht IM verabreicht. Jedes Schwein erhielt intratracheal eine Einzeldosis von 14 ml (erster Versuch) oder 10 ml (zweiter Versuch) des Infizierungsmaterials. Zur Sicherstellung, dass die Nadelplatzierung korrekt war, wurde Luft in die Spritze angesaugt vor Verabreichung der Infizierungsdosis. Die nicht geimpften, nicht infizierten Kontrollschweine wurden in getrennten Räumen gehalten und nicht infiziert.
30 Tage nach der Infizierung (DPC) wurde alle Schweine euthanasiert, die Lungen entfernt und die gesamten Lungenläsionen durch eine Person, die keine Kenntnis über die Testgruppen hatte, gezählt.
Probenentnahmen und Testen:
Blutproben wurden von allen Schweinen am Tag der Impfung (0 DPV), einen Monat nach der Impfung (1 MPV), 4 MPV/0 DPC und 30 DPC zur Untersuchung der Serumantikörper gegen M. hyopneumoniae entnommen, die durch einen kompetitiven ELISA-Satz (von DAKO Co. hergestellt) detektiert wurden. Die Serumproben wurden bei –20°C gelagert, bevor sie getestet wurden.
Datenanalyse:
Die Auszählungen der Lungenläsionen wurden zwischen geimpften und nicht geimpften Gruppen durch die Varianzanalyse (ANOVA) verglichen. Die Lungenergebnisse wurden Arcussinus-transformiert, um die Verteilung der Rückstände zu verbessern.
RESULTATE UND DISKUSSION
Serologie:
Alle Schweine in beiden Versuchen wurden auf Serumantikörper gegen M. hyopneumoniae durch eine kommerzielle Ausrüstung eines kompetitiven ELISA getestet, unter Verwendung von 1:10 Serumverdünnung für sämtliches Testen. Alle Schweine waren seronegativ (Antikörpertiter < 10) zum Zeitpunkt der Impfung, was anzeigte, dass die Tiere für das M. hyopneumoniae anfällig waren. Alle Schweine in den Kontrollgruppen blieben seronegativ vor der Infizierung. Dies wies darauf hin, dass die Immunantwort in den geimpften Schweinen auf den Impfstoff und nicht auf irgendeine Exposition im Umfeld zurückzuführen war. Alle Schweine in den geimpften Gruppen und die meisten der Schweine in den Infektionskontrollgruppen (18 von 22 Schweinen im ersten Versuch und 15 von 25 im zweiten Versuch) wiesen nach der Infizierung ein auf M. hyopneumoniae konvertiertes Serum auf, während alle nicht infizierten Tiere seronegativ blieben. Dies impliziert, dass die Infektion M. hyopneumoniae spezifisch war. Der serologische Status der Testtiere ist in Tabelle 1 zusammengefasst.
Immunogenitätstesten im ersten Versuch:
Der erste Versuch wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob der Impfstoff des Beispiels 2 eine starke Immunität, die gegen einen höheren Grad der Infizierung als den durch die ISU empfohlenen schützt, vier Monate nach der Impfung stimulieren konnte. Dieser Versuch verglich auch einen Impfstoff des Beispiels 2 mit dem kommerziell erhältlichen Ingelvac M. hyo^® auf seine Fähigkeit hin, eine schützende Immunität vier Monate nach der Impfung zu stimulieren.
Zweiundzwanzig mit FDAH Suvaxyn MH-One geimpfte Schweine und acht mit einem lizenzierten Produkt, Ingelvac M, hyo^®, Serie 271.032, geimpfte Schweine wurden mit 1,4 × 10⁶ Organismen pro Schwein des Infizierungsmaterials infiziert (1,0 × 10⁶ Organismen pro Schwein war von der ISU empfohlen, siehe Abschnitt 5.5). Zweiundzwanzig Schweine dienten als Infektionskontrollen und 10 Schweine als nicht infizierte Kontrollen. Die Prozentsätze der Lungenläsionen sind in Tabelle 2 zusammengestellt. Die mit dem Impfstoff des Beispiels 2 geimpften Schweine wiesen 15,9% durchschnittliche Lungenläsionen und die infizierten Kontrollschweine 19,6% durchschnittliche Lungenläsionen auf. Die Lungenläsionen in der mit dem Impfstoff des Beispiels 2 geimpften Gruppe waren geringer als in der Kontrolle, selbst wenn die Schweine mit einer höheren Dosis von M. hyopneumoniae infiziert wurden. Der Unterschied war jedoch nicht signifikant (p = 0,19). Desgleichen wurde, wenn ein kommerziell erhältliches Produkt, Ingelvac M. hyo^®, in derselben Gruppe von Tieren mit derselben Infizierungsdosis ausgewertet wurde, ein ähnlicher Grad an Lungenläsionen ebenfalls erreicht (14,6%). Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen der mit Ingelvac M. hyo^® geimpften Gruppe und der Kontrollgruppe (p = 0,27) und zwischen der mit Ingelvac M. hyo^® geimpften Gruppe und der mit dem Impfstoff des Beispiels 2 geimpften Gruppe (p = 0,88).
Obwohl eine nicht-signifikante numerische Reduzierung der Läsionen in der Gruppe, die den Impfstoff des Beispiels 2 erhielt, registriert wurde, lassen die in diesem Versuch gewonnenen Daten vermuten, dass die bei diesem Versuch angewandte höhere Infizierungsdosis (1,4 × 10⁶ Organismen) wahrscheinlich überwältigend war, selbst gegen die durch das kommerzielle Ingelvac Produkt stimulierte Immunität der Schweine. Dieser Infizierungslevel ist wahrscheinlich für die Auswertung der Impfungs-/Infizierungsstudie, die Gruppengrößen von 20–25 Tieren benutzt, nicht geeignet, wenngleich es mit umfangreicheren Gruppengrößen möglich ist, die Signifikanz zu beweisen.
Immunogenitätstesten im zweiten Versuch:
Die Schweine in der geimpften und infizierten Kontrollgruppe im zweiten Versuch wurden ausgewertet mit der von der ISU empfohlenen Infizierungsdosis (1,0 × 10⁶ Organismen) vier Monate nach der Impfung, um die Dauer der Immunität von vier Monaten (DOI) nachzuweisen. Die Prozentsätze der Lungenläsionen sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Die Kontrollgruppe wies einen Durchschnitt von 10,4% Lungenläsionen auf. Die geimpfte Gruppe wies einen Durchschnitt von 5,5% Lungenläsionen auf. Es bestand ein signifikanter Unterschied zwischen der geimpften und der Kontrollgruppe (p = 0,031). Dies weist darauf hin, dass der Impfstoff des Beispiels 2 eine schützende Immunität wirksam stimuliert, die mindestens vier Monate nach der Impfung mit einer einzigen Dosis von Schweinen im Alter von drei Wochen anhält.
Auswertung der kombinierten Resultate beider Versuche:
Waren zwei Versuche signifikant unterschiedlich, so war der Effekt auf die Gruppe doch nicht signifikant. Die Größenordnung des Gruppeneffekts war ähnlich bei beiden Versuchen. So konnte der Gruppeneffekt ohne Berücksichtigung des Versuchs bewertet werden. Da die Analyse des vollständigen Modells ergab, dass die Wechselwirkung zwischen Gruppe und Versuch nicht signifikant war, bekräftigt dies die Ansicht, dass der Gruppeneffekt in beiden Versuchen derselbe war und rechtfertigt die Verbindung der Daten aus beiden Versuchen zu einer einzigen Analyse.

Wurden die Daten bezüglich des Impfstoffs des Beispiels 2 aus beiden Versuchen vereinigt und die Arcussinus-transformierten Variablen für Lungenläsionen mit Gruppe und Versuch als unabhängige Variablen (reduziertes Modell) analysiert, ist die Gruppe an sich statistisch signifikant (p = 0,013). TABELLE 1: Zusammenfassung des serologischen Status gegenüber M. hyopneumoniae bei Kontroll- und geimpften Schweinen

Erster Versuch
	Positiv/negativ (1:10) etwa
Gruppe	Anzahl der Schweine	ODPV	–1DPC	30DPC
FDAH Impfstoff	22	0/22	0/22	22/22
BI Impfstoff	8	0/8	4/8	8/8
Infizierungskontrolle	22	0/22	0/22	18/22
Nicht infizierte Kontrolle	10	0/10	0/10	0/10

Zweiter Versuch
	Positiv/negativ (1:10) etwa
Gruppe	Anzahl der Schweine	ODPV	–3DPC	30DPC
FDAH Impfstoff	23	0/23	6/23	23/23
Kontrolle	25	0/25	0/25	14/25
Nicht infizierte Kontrolle	7	0/7	0/7	0/7

TABELLE 2: Zusammenfassunq der Prozentsätze der Lungenläsionen im ersten Versuch (Überdosis)*

Gruppe	Anzahl der Schweine	Durchschnittliche Prozentsätze der Lungenläsionen	P-Wert
FDAH Impfstoff	22	15,90%	0,19**
BI Impfstoff	8	14,60%	0,27***
Kontrolle	22	19,60%
Nicht infizierte Kontrolle	10	0%	0,88****

* Die Schweine wurden mit 1,4 × 10⁶ Organismen pro Schwein infiziert (von der ISU empfohlene Dosis 1,0 × 10⁶ Organismen pro Schwein)
** Vergleich zwischen FDAH Impfstoffgruppe und Kontrollgruppe
*** Vergleich zwischen BI Impfstoffgruppe und Kontrollgruppe
**** Vergleich zwischen BI Impfstoffgruppe und FDAH Impfstoffgruppe

Gruppe	Anzahl der Schweine	Durchschnittliche Prozentsätze der Lungenläsionen	P-Wert
FDAH Impfstoff	23	5,50%	0,031**
Kontrolle	25	10,40%
Nicht infizierte Kontrolle	7	0,77%

* Die Schweine wurden mit der von der ISU empfohlenen Dosis infiziert (1,0 × 10⁶ Organismen pro Schwein)
** Vergleich zwischen FDAH Impfstoffgruppe und Kontrollgruppe

Beispiel 4
Bewertung der langdauernden Immunität, die durch eine erfindungsgemäße Impfstoffzusammensetzung gegen eine virulente Infizierung sechs Monate nach Verabreichung einer einzigen Dosis induziert wurde

Unter Anwendung im Wesentlichen derselben wie in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Verfahren und unter Verwendung der nachstehend angegebenen Mengen wurde der Test-Impfstoff A zubereitet. Test-Impfstoff A

Mengen für 1.000.000 Dosierungen (zu je 2 ml):	% vol/vol
Mycoplasma Konzentrat (> 1,0 × 10¹⁰ MHDCE/ml)	1.200.000 ml	60,0
Squalan/Pluronic L121 Mixtur	200.000 ml	10,0
Carbopol (2% w/v in Wasser)	200.000 ml	10,0
Thimerosal Lösung 1% w/v in Wasser und EDTA (Tetranatriumsalz) 7 w/v%	18.000 ml	0,9
Sterile Salzlösung	382.000 ml	19,1

Der pH-Wert der Serie ist auf 7,0 ± 0,2 angepasst.
MHDCE = Mycoplasma hyopneumoniae DNA-Zellenäquivalente

ZUSAMMENFASSUNG
Dreiunddreißig 21 Tage alte Schweine wurden in diese Auswertung aufgenommen. Zwanzig Schweine wurden intramuskulär (IM) mit einer Dosis des Impfstoffs A im Alter von drei Wochen geimpft. Zehn Schweine dienten als nicht geimpfte Kontrollen und drei Schweine als nicht infizierte Umfeldkontrollen.
Alle Schweine waren seronegativ (Antikörpertiter < 10) zum Zeitpunkt der Impfung, was darauf hinwies, dass die Tiere für M. hyopneumoniae anfällig waren. Alle Schweine in den Kontrollgruppen blieben seronegativ vor der Infizierung. Dies weist darauf hin, dass die Immunantwort in den geimpften Schweinen auf den Impfstoff und nicht auf irgendeine Exposition im Umfeld zurückzuführen ist.
Sechs Monate nach der Impfung wurden 20 geimpfte Schweine und 10 nicht geimpfte Kontrollschweine mit virulentem M. hyopneumoniae (1,0 × 10⁶ Organismen pro Schwein) infiziert. Drei Schweine dienten als nicht infizierte Kontrollen. Die geimpften Schweine wiesen ein durchschnittliches Lungenläsionsergebnis von 3,6% und die infizierten Kontrollschweine wiesen ein durchschnittliches Lungenläsionsergebnis von 14,6% auf. Es gab in der geimpften Gruppe signifikant weniger Lungenläsionen als in den Kontrollen (p = 0,0215).
Die bei dieser Auswertung erzielten Daten beweisen, dass der Testimpfstoff A eine lang anhaltende schützende Immunität gegen die Infizierung durch das virulente M. hyopneumoniae sechs Monate nach Verabreichung einer Einzeldosis induzierte.
Versuchsanordnung
Dreiunddreißig 21 Tage alte Schweine wurden randomisiert in drei Gruppen aufgeteilt (geimpfte Gruppe, infizierte Kontrollgruppe und nicht infizierte Umfeldkontrollgruppe) unter Verwendung des Microsoft Excel Randomisierungsprogramms durch Streu. Zwanzig Schweine wurden mit einer Dosis des Testimpfstoffs A im Alter von drei Wochen intramuskulär geimpft. Zehn Schweine dienten als Infizierungskontrollen und drei Schweine als nicht infizierte Umfeldkontrollen. Die Schweine in der geimpften Gruppe und die Infizierungskontrollen wurden mit 10 ml einer virulenten M. hyopneumoniae Kultur (1,0 × 10⁸ Organismen) pro Schwein sechs Monate nach der Impfung infiziert. Drei nicht geimpfte Schweine wurden als nicht infizierte Kontrollen benutzt. Die infizierten Schweine und die nicht infizierten Kontrollen wurden 26 Tage nach der Infizierung euthanasiert und die Lungenläsionen für jedes Schwein gezählt.
Jedes Schwein in den Impfgruppen erhielt eine 2 ml Dosis des Testimpfstoffs IM in die Seite des Nackens.
Infizierung und Autopsie
Der virulente M. hyopneumoniae Infizierungsvorrat, ein gefrorenes (≤ –70°C) Lungenhomogenat, wurde von Dr. Eileen Thacker der Iowa State University (ISU) zubereitet. Der Infizierungsvorrat wurde als rein bestätigt und enthielt etwa 10⁷ M. hyopneumoniae Organismen pro ml.
Die Schweine wurden mit 10 ml einer 1:100 Verdünnung des Vorrats infiziert (d. h. etwa 1,0 × 10⁶ Organismen).
Am Tag der Infizierung wurde das Homogenat schnell unter warmem Wasser aufgetaut und nach den Empfehlungen der ISU unter Verwendung eines sterilen M. hyopneumoniae Wachstumsmediums verdünnt. Die Schweine wurden sediert mit einer Mixtur von Xylazin-Ketamin-Telazol^TM bestehend aus 50 mg/ml Xylazin, 50 mg/ml Ketamin und 100 mg/ml Telazol. Die Anästhesiemixtur wurde IM in einer Dosis von 0,01–0,02 ml/lb Körpergewicht verabreicht. Jedes Schwein erhielt intratracheal eine Einzeldosis von 10 ml des Infizierungsmaterials (1,0 × 10⁶ Organismen). Zur Sicherstellung, dass die Nadelplatzierung korrekt war, wurde Luft in die Spritze angesaugt vor Verabreichung der Infizierungsdosis. Die nicht geimpften, nicht infizierten Kontrollschweine wurden in getrennten Räumen gehalten und nicht infiziert.
26 Tage nach der Infizierung (DPC) wurden alle Schweine euthanasiert, die Lungen entfernt und die gesamten Lungenläsionen gezählt, wie in Beispiel 3 beschrieben.
Probenentnahme und Testen
Blutproben wurden von allen Schweinen am Tag der Impfung (0 DPV), 35 DPV, –1 DPC und 26 DPC zur Bestimmung der Serumantikörper gegen M. hyopneumoniae entnommen, die durch eine Ausrüstung eines kompetitiven ELISA (hergestellt von DAKO Co.) detektiert wurde. Die Serumproben wurden bei ≤ –20°C gelagert, bevor sie getestet wurden.
Datenanalyse
Die Lungenläsionsergebnisse wurden verglichen zwischen Geimpften und Kontrollen durch one-way ANOVA. Die Lungenläsionsergebnisse wurden Arcussinus-transformiert, um die Verteilung der Rückstände zu verbessern. Da die Normalitätsannahme für die Lungenläsionsergebnisse fragwürdig war, wurden sowohl die Lungenläsionsergebnisse als auch die Arcussinustransformierten Lungenläsionsergebnisse durch den Wilcoxon Rank Sum Test analysiert. Der Grad der Signifikanz wurde auf p < 0,05 eingestellt. Die Resultate aus dem nicht parametrischen Wilcoxon Rank Sum Test wurden zu Meldezwecke verwendet.
RESULTATE UND DISKUSSION
Serologie
Alle Schweine wurden auf Serumantikörper gegen M. hyopneumoniae getestet durch eine kommerzielle Ausrüstung eines kompetitiven ELISA unter Verwendung einer 1:10 Serumverdünnung für sämtliches Testen. Die Proben mit verdächtigem Testresultat nach den Anweisungen der Ausrüstung werden in der Datenanalyse als positiv behandelt. Alle Schweine waren seronegativ (Antikörpertiter < 10) zum Zeitpunkt der Impfung, was darauf hinwies, dass die Tiere für M. hyopneumoniae anfällig waren. Alle Schweine in den Kontrollgruppen blieben seronegativ vor der Infizierung. Nach der Impfung wurden fünfzehn von zwanzig geimpften Tieren (15/20) seropositiv bezüglich M. hyopneumoniae wenigstens einmal (Proben entnommen am 35 DPV and –1 DPC). Dies zeigt an, dass die Immunantwort der geimpften Schweine auf den Impfstoff und nicht auf eine Exposition im Umfeld zurückzuführen war. Alle geimpften Schweine und vier der zehn Schweine in der Infizierungskontrollgruppe wurden seropositiv bezüglich M. hyopneumoniae nach der Infizierung, während alle nicht infizierten Tiere seronegativ blieben. Der serologische Status der Testtiere ist in Tabelle 4 zusammengefasst.
Lungenläsionsergebnisse

Zwanzig mit dem Testimpfstoff A geimpfte Schweine und zehn nicht geimpfte Kontrollschweine wurden mit virulentem M. hyopneumoniae (1,0 × 10⁶ Organismen pro Schwein) sechs Monate nach der Impfung infiziert. Drei Schweine dienten als nicht infizierte Kontrollen. Acht von zwanzig geimpften Tieren (40%) entwickelten keine Lungenläsionen nach der Infizierung, während in der Kontrollgruppe nur ein Schwein von zehn Schweinen (10%) keine Lungenläsion aufwies. Die Prozentsätze der Lungenläsionen sind in Tabelle 5 zusammengefasst. Die geimpften Schweine hatten ein durchschnittliches Lungenläsionsergebnis von 3,6% und die infizierten Kontrollschweine ein durchschnittliches Lungenläsionsergebnis von 14,6%. Die Lungenläsionen in der geimpften Gruppe waren signifikant geringer als in den Kontrollen (p = 0,0215). TABELLE 4: Serologischer Status gegenüber M. hyopneumoniae der Schweine in der Studie*

			Anzahl der Positiven (1:10)/Gesamt
Gruppe	Behandlung	Anzahl der Schweine	0 DPV**	35 DPV	–1 DPC***	26 DPC
1	Impfstoff/Infizierung	20	0/20	9/20	12/20	20/20
2	Kontrolle/Infizierung	10	0/10	0/10	0/10	4/10
3	Kontrolle/keine Infizierung	3	0/3	0/3	0/3	0/3

* Die Serumproben wurden auf Serumantikörper gegen M. hyopneumoniae durch ELISA unter Verwendung einer kommerziellen Ausrüstung getestet. Alle Proben wurden mit einer Serumverdünnung von 1:10 getestet. Die Resultate wurden nach den Anweisungen der Ausrüstung interpretiert. Proben, die zu 1:10 verdächtig waren, wurden als positiv angesehen.
** DPV = Tag nach Impfung
*** DPC = Tag nach Infizierung

Gruppe	Behandlung	Anzahl der Schweine	Mittlere % der Lungen-Läsionsergebnisse	Standardabweichung	Unter 95% CL* für Mittelwert	Über 95% CL für Mittel	P-wert Wert**
1	Impfstoff/Infizierung	20	3,6	7,6	0,07	7,19	0,0215
2	Kontrolle/Infizierung	10	14,6	20,0	0,33	28,94
3	Kontrolle/keine Infizierung	3	1,8	1,8	–2,67	6,27

* CL = Vertrauenskoeffizient
** Der P-Wert ergab sich aus dem Vergleich der Gruppen 1 und 2.

Wie aus den in den Tabellen 4 und 5 dargestellten Daten entnommen werden kann, induziert der Testimpfstoff A eine schützende Immunität gegen eine virulente M. hyopneumonia Infizierung für sechs Monate nach Verabreichung einer Einzeldosis bei im Alter von drei Wochen geimpften Schweinen.

Claims

Impfstoffzusammensetzung zur Immunisierung eines Tieres gegen Infektion durch Mycoplasma hyopneumoniae, die eine immunisierende Menge des Mycoplasma hyopneumoniae Bakterin, ein adjuvantes System, das durch Mischen eines Acrylsäurepolymers und einer Mixtur aus einem stoffwechselfähigen Öl und einem Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer gewonnen werden kann, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst, wobei die Impfstoffzusammensetzung nach einmaliger Verabreichung eine schützende Immunität gegen Mycoplasma hyopneumoniae auslöst.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das adjuvante System aus einem Acrylsäurepolymer und einer Mixtur aus einem stoffwechselfähigen Öl, das einen Terpenkohlenwasserstoff oder mehrere Terpenkohlenwasserstoffe umfasst, und einem Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer in einem Verhältnis von etwa 1:25 bis 1:50 des Acrylsäurepolymers zur Mixtur aus stoffwechselfähigem Öl/Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer besteht.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das adjuvante System in einer Konzentration von etwa 1 bis 25% v/v der Impfstoffzusammensetzung vorliegt.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 3, wobei das Acrylsäurepolymer in einer Endkonzentration von etwa 1% v/v und die Mixtur Terpenkohlenwasserstoffe/Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer in einer Endkonzentration von etwa 5% bis 10% v/v vorliegen.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 3, wobei das adjuvante System in einer Konzentration von etwa 2%–15% v/v der Impfstoffzusammensetzung vorliegt.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das adjuvante System in einer Konzentration von etwa 5%–12% v/v der Impfstoffzusammensetzung vorliegt.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das stoffwechselfähige Öl Squalan oder Squalen ist.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, wobei das Acrylsäurepolymer ein Carbomer ist.
Impfstoffzusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, die ferner wenigstens ein Bakterin umfasst, das aus der aus Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella cholerae-suis and Leptospira Bakterien bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung des Mycoplasma hyopneumoniae Vakzins in Kombination mit einer ein Acrylsäurepolymer und eine Mixtur aus stoffwechselfähigem Öl und einem Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer umfassenden adjuvanten Mixtur und einem pharmazeutisch annehmbaren Träger für die Zubereitung einer Impfstoffzusammensetzung zum Schutz eines Tieres gegen durch Mycoplasma hyopneumoniae verursachte Krankheiten, wobei die Zusammensetzung nach Verabreichung einer einmaligen Dose eine schützende Immunität gegen eine Mycoplasma hyopneumoniae Infektion erzeugt.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die immunisierende Menge des Mycoplasma hyopneumoniae Bakterins etwa 1 × 10⁸ bis 3 × 10¹¹ MHDCE/ml beträgt, wobei MHDCE die Anzahl der Mycoplasma hyopneumoniae DNA Zelläquivalente bedeutet.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Immunisierungsmenge des Bakterins etwa 1 × 10⁹ bis 3 × 10⁹ MHDCE/ml beträgt.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Impfstoffzusammensetzung zur intramuskulären, subkutanen, intraperitonealen, Aerosol-, oralen oder intranasalen Verabreichung bestimmt ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das adjuvante System aus einem Acrylsäurepolymer und einer Mixtur aus stoffwechselfähigem Öl, das einen Terpenkohlenwasserstoff oder mehrere Terpenkohlenwasserstoffe enthält, und einem Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer besteht, das in einer Endkonzentration von etwa 1–25% v/v vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Acrylsäurepolymer der adjuvanten Mixtur ein Carbomer ist.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei das stoffwechselfähige Öl des adjuvanten Systems ein Terpenkohlenwasserstoff ist, der aus der aus Squalen und Squalan bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 10 bis 16, wobei die Impfstoffzusammensetzung ferner wenigstens ein zusätzliches Bakterin umfasst, das aus der aus Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella cholerae-suis und Leptospira Bakterien bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei das Acrylsäurepolymer in der Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion vorliegt.