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Verfahren zur Herstellung von Schweinecholeraserum Die Erfindung bezieht
sich auf ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Schweinecholeraserum.
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Seit mehr als fünfzig Jahren weiß man, daß Schweinecholera eine unabhängige,
durch ein Virus hervorgerufene Krankheit ist. Obwohl insbesondere in den letzten
fünfzehn bis zwanzig Jahren zahlreiche Forscher auf diesem Gebiet tätig waren, ist
diese Krankheit trotzdem weithin fast über die ganze Welt verbreitet und verursacht
immer noch außerordentlich hohe wirtschaftliche Verluste.
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Sowohl die Verwendung von Hyperimmun-Schweinecholeraserum in Serurn-Virus-Kombination
für die Impfung als auch die Verwendung des Hyperimmunserums für sich allein zur
Kontrolle von Schweinecholeraepidemien sind wohlbekannt. Obwohl somit das Hyperimmuserum
als wichtiges Veterinärwerkzeug auf diesem Gebiet erkannt worden ist, wird seine
Anwendung jedoch durch sein Gewinnungsverfahren begrenzt. Bisher hat man das Hyperimmunserum
beispielsweise nach folgender allgemeiner Verfahrensweise hergestellt: Zuerst wird
Schwein »tal« durch eine kombinierte Serum-Virus-Injektion immunisiert. Die Virämie
entwickelt sich für gewöhnlich innerhalb zweier Wochen nach der Impfung, und ihr
schließt sich kurz eine Befreiung des Bluts vom Virus an, sobald das Schwein infolge
der Bildung von Antikörpern Immunität entwickelt.
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Ein anderes Schwein »B« wird mit einer tödlichen Dosis virulenten
unmodifizierten Schweinecholeravirus geimpft. Bevor es stirbt, d. h. beispielsweise
während es im Sterben liegt, wird ihm Blut entnommen, und dieses an virulentem Virus
hochkonzentrierte Blut wird dem immunisierten Schwein »A« im Verhältnis von etwa
1.1 ccm Blut je Kilo Schweinegewicht intravenös injiziert. Wenn also beispielsweise
die bei diesem Verfahren benutzten »A «-Schweine etwa 135 kg wiegen, so verlangt
dies etwa 1500 ccm virushaltiges Blut je Schwein. Nachdem Schwein »A « infolge dieser
Injektion von virushaltigem Blut eine große Menge Antikörper entwickelt, wird ihm
Blut entnommen, und das so gewonnene, hyperimmunisierte Blut wird dann nach üblichen
Fachmethoden in Serum mit dem erwünschten hohen Titer umgewandelt.
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Dieses beschriebene Verfahren zur Gewinnung von hyperimmunem Serum
verlangt also die Immunisierung von Schwein »A« mit lebendem Virus und die Impfung
von Schwein »B« ebenfalls mit lebendem Virus. Da Schwein »B« verlorengeht, nämlich
stirbt, und nicht zur Nahrung verwendet werden kann, ist dieses Verfahren bei großbetrieblicher
Durchführung
offensichtlich aus wirtschaftlichen Gründen zu beanstanden. Dieses Verfahren ist
auch deshalb zu verurteilen, weil das kranke Schwein »B« eine ernstliche Infektionsquelle
für unbehandelte, nichtimmune Schweine darstellt. Ein weiterer Nachteil des bekannten
Verfahrens besteht fernerhin darin, daß dem immunisierten Schwein »A « vergleichsweise
große Mengen virushaltiges Blut injiziert werden müssen.
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Bei Forschungsarbeiten auf diesem Gebiet wurde bei der Suche nach
einem verbesserten Verfahren zur Gewinnung von hyperimmunem Schweinecholeraserum
die erfinderische Feststellung gemacht, daß man Blut, aus dem auf üblichem Wege
das erwünschte Hochtiter-Schweinecholeraserum hergestellt werden kann, dadurch leicht
in einem Schwein bilden kann, daß man das Schwein zuerst mit Virusdiarrhöevirus
impft und das so geimpfte Schwein danach mit Schweinechloreavirus impft. Im Gegensatz
zum Schweinecholeravirus ruft Virusdiarrhöevirus keine Temperaturerhöhung oder sonstige
Krankheitssymptome im Schwein hervor und wird, wie Versuche gezeigt haben, nicht
vom geimpften Schwein auf andere Schweine übertragen.
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Das bei dem erfindungsgemäßen, verbesserten Verfahren benutzte Virusdiarrhöevirus
kann ein unmodifiziertes Virus sein, wie es gemäß B aber, James A., York, Charles
J., Gillespie, James H. and
Mitchell, Grayson B., Am. J. Vet. Res.,
15, 525 bis 531 (1954) aus der Milz eines mit Virusdiarrhöevirus infizierten Kalbes
erhalten wird; es kann auch aus dem gemäß Lese, K. M. and Gillespie, J.H., Am. J.
Vet. Res., 18, 952/953 (1957) auf Gewebekultur vermehrten Virusdiarrhöevirus bestehen.
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Geeignet ist auch das modifizierte oder abgeschwächte Virusdiarrhöevirus,
das beispielsweise gemäß Baker, James A., Gillespie, James H., Sheffy, Ben E. and
Marshall, Vincent, The Cornell Veterinarian, 48, Nr. 2, 207 bis 213 (1958) mittels
Passagen durch Kaninchen gewonnen wird.
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Sämtliche Virusdiarrhöevirusstämme haben, wie beim Vergleich mittels
Neutralisationstest festgestellt wurde, antigenetische Beziehung und können daher
bei der Erfindung verwendet werden. Beispiele für solche erfindungsgemäß verwendbaren
Stämme einschließlich der zellpathogenen findet man in den weiter oben angegebenen
und in den nachstehenden Arbeiten im »Cornell Veterinarian«, und zwar von Gillespie,
James H. and Baker, James A., 49, 439 bis 442 (1959); Gillespie, James H., Baker,
James A. and McEntee, Kenneth, 50, 73 bis 79 (1960); Robson, Douglas S., Gillespie,
James H. and Baker, James A., 50, 503 bis 509 (1960); Gillespie, James H., Coggins,
Leroy, Thompson, Joan and Baker, James A., 51, 155 bis 159 (1961).
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Das bei dem erfindungsgemäßen, verbesserten Verfahren benutzte Schweinecholeravirus
kann ein unmodifiziertes Virus, das mittels Serienpassagen durch Schweine virulent
erhalten wird, oder ein abgeschwächtes, aber in den virulenten Zustand rückkehrendes
Virus gemäß B aker, James A. and Sheffy, Ben E., Proc, Soc. Exp. Biol. and Med.,
105, 675 bis 678 (1960) sein. Geeignet ist noch ein gemäß G i llespie, James H.,
Sheffy, Ben E. and Baker, James A., Proc, Soc. Exp. Biol. and Med., 105, 679 bis
681 (1960) in Gewebekultur vermehrtes Virus und fernerhin auch ein Virus, das gemäß
USA.-Patentschrift 2 518 978 mittels Passagen durch andere Tiere, wie beispielsweise
Kaninchen, abgeschwächt ist.
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Die nachstehenden Beispiele sollen zur Erläuterung der Erfindung
dienen.
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Beispiel 1 Ein etwa 82 kg schweres Schwein wird zunächst intramuskulär
mit 1 ccm einer 10prozentigen Emulsion der Milz eines mit New York-l-Virusdiarrhöevirus
infizierten Kalb es geimpft. Diese Impfung rief weder Temperaturerhöhung noch sonstige
Krankheitserscheinungen im Schwein hervor. 2 Wochen später wurde dann das Schwein
intramuskulär mit 1 ccm einer 10prozentigen Milzemulsion von virulentem Stamm A-Schweinechloeravirus
geimpft. Diese zweite Impfung rief nach etwa 2 bis 4 Tagen eine leichte Temperaturerhöhung
von etwa 0,50 C hervor, die etwa 1 bis 2 Tage anhielt, worauf die Temperatur wieder
normal wurde und blieb. 7 Tage nach dieser Impfung mit Schweinecholeravirus ließen
sich Schweinecholera-Antikörper als vorhanden feststellen, und nach 21 Tagen lag
der Titer im Mittel bei 515. Gleichzeitig erhöhte sich nach der Impfung mit dem
Schweinecholeravirus der Titer gegen Virusdiarrhöevirus von 27 auf etwa 729 und
lief damit mit der Entwicklung des Titers gegen Schweinecholeravirus parallel. Zu
diesem Zeitpunkt wurde
dem Schwein Blut entnommen und dieses Blut nach den Standardverfahren
in das gewünschte Hyperimmunserum umgewandelt.
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Beispiel ll Dieses Beispiel folgt der allgemeinen Verfahrensweise
gemäß Beispiel I, jedoch wird das Schwein zuerst mit einer 10prozentigen Milzemulsion
geimpft, die aus einem mit Oregon C 24V-Virusdiarrhöevirus infizierten Kalb gewonnen
worden ist, und nach etwa 10 bis 14 Tagen schließt sich eine Impfung einer Gewebekultur
eines virulenten Stamm A-Schweinechloleravirus. Dem so hyperimmunisiertem Schwein
wird an oder nach dem 14. Tag der Impfung mit dem Schweinecholeravirus Blut entnommen.
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Beispiel III Hierbei wird ebenso wie im Beispiel II verfahren, das
Schwein jedoch mit einer Gewebekultur des New York-l -Virusdiarrhöevirus geimpft.
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Beispiel IV Dieses Beispiel entspricht dem Beispiel I, jedoch wird
für die erste Impfung nichtvirulentes. modifiziertes Virusdiarrhöevirus und für
die zweite Impfung nichtvirulentes, abgeschwächtes Schweinecholeravirus verwendet.
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Warum das Impfen von Schweinen mit Virusdiarrhöevirus Widerstandsfähigkeit
gegen das immunologisch völlig beziehungslose Schweinecholeravirus hervorruft, ist
nicht voll verständlich. Es liegt keine direkte immunologische Grundlage vor. Dies
ist aus der Tatsache ersichtlich, daß die mit Virusdiarrhöevirus geimpften Schweine
zwar einen Antikörpertiter gegen Virusdiarrhöevirus, aber keinen meßbaren Titer
gegen Schweinecholeravirus entwickelten, bevor sie nicht mit dem Schweinecholeravirus
geimpft waren. Andererseits ergaben Untersuchungen, daß die induzierte Widerstandsfähigkeit
oder veränderte Aufnahmefähigkeit wahrscheinlich darauf beruht, daß die zunächst
mit Virusdiarrhöevirus und danach mit Schweinecholeravirus geimpften Schweine dadurch
Schutz schaffen, daß sie sehr schnell, beispielsweise innerhalb von 7 Tagen, nach
der Impfung mit Schweinecholeravirus Antikörper entwickeln. Andererseits entwickelten
sich bei den Kontrollschweinen, die keine Virusdiarrhöevirus-Impfung erhielten und
innerhalb von 8 bis 15 Tagen nach Empfang einer tödlichen Schweinecholeraimpfung
starben, keine Antikörper gegen Schweinecholeravirus. Das Unvermögen des Virusdiarrhöevirus
und des Schweinecholeravirus, einen gemeinsamen, neutralisierenden Antikörper zu
besitzen, zeigt ebenfalls an, daß ein neuartiger Mechanismus wirksam sein muß. Eine
mögliche Erklärung mag darin bestehen, daß sich das Virusdiarrhöevirus als Antigen
verhält, indem es ein sekundäres Ansprechen im Schwein hervorruft. Ohne Rücksicht
auf die genaue Arbeitsweise haben die Untersuchungen jedenfalls gezeigt, daß das
Virusdiarrhöevirus Schweine gegen tödliche Dosen von Schweinecholeravirus schützt
und Schweine, die zuerst mit dem Virusdiarrhöevirus und danach mit dem Schweinecholeravirus
geimpft werden, viel früher und in weit höherer Konzentration Antikörper gegen Schweinecholeravirus
entwickeln, als dies bei dem üblichen Antikörperansprechen auf Schweinecholeravirus
angetroffen wird. Während die Erfindung somit ein Mittel zur Entwicklung eines hohen
Titers an
Schweinecholeraantikörpern im Blut eines Schweines schafft,
sorgt sie im Zusammenhang damit auch für Immunisierung des Schweins gegen Schweinecholeravirus.
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Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens, das nur eine Impfung
von lebendem Schweinecholeravirus je Schwein verlangt und den Zwang aufhebt, mit
virushaltigem Blut aus einem mit einer tödlichen Dosis Schweinecholeravirus geimpften
Schwein arbeiten zu müssen, liegen für den Fachmann auf der Hand. Diese Vorteile
kann man erzielen, indem man native, unmodifizierte oder nahezu native, lebende
virulente Viren, wie etwa solche gemäß Beispiel I, verwendet oder modifiziertes
Virusdiarrhöevirus mit nativem Schweinecholeravirus oder umgekehrt natives Virusdiarrhöevirus
mit modifiziertem Schweinecholeravirus kombiniert oder in den Fällen, wo die Verwendung
von lebendem, virulentem Virus, nicht erlaubt ist, etwa gemäß Beispiel IV mit nichtvirulentem,
modifizierten Virus arbeitet. In allen Fällen soll zwecks Erzielung bester Gesamtergebnisse
die Schweinecholeraimpfung nicht früher als 7 Tage und vorzugsweise etwa 2 Wochen
nach der Impfung mit dem Virusdiarrhöevirus vorgenommen werden.
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Die optimalen Zeitabstände kann man jedoch für jede spezielle Viruskombination
leicht an Hand von Vorversuchen feststellen.
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Die Erfindung schafft fernerhin ein Verfahren zur Gewinnung eines
abgeschwächten, nichtvirulenten Stammes von Virusdiarrhöevirus aus einem nativen,
virulenten Virusdiarrhöevirus, der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Gewinnung
von Schweinecholeraserum verwendet werden kann, und die Verwendung dieses abgeschwächten
Stammes bei der Herstellung eines standardisierten, wirkungsvollen und sicheren
Virusdiarrhöevirus-Impfstoffes.
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Die Virusdiarrhöe von Vieh stellt eine klinische Einheit dar, die
durch ein spezifisches Virus verursacht wird.
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Bei den Versuchen, Virusdiarrhöevirus für die Verwendung in einem
Impfstoff abzuschwächen, wurde New York Stamm-1-Virusdiarrhöevirus durch Kaninchen
passiert. Bis zu dreißigmal durchgeführte Passagen gaben wenig, wenn nicht gar keine
Abschwächung, indem mit dem aus den Kaninchen stammenden Material geimpfte Kälber
Temperaturerhöhung, Leukozytenvermehrung und sonstige Krankheitsanzeichen zeigten,
die den durch obere tragung nativen Materials hervorgerufenen ähnelten.
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Dagegen verursachte die Impfung anfälliger Kälber mit Material, das
fünfundsiebzigmal durch Kaninchen passiert worden war, festgestelltermaßen eine
leichte Leukozytenminderung und eine nur eintägige Temperaturerhöhung. Der nach
der fünfundsiebzigsten Passage durch Kaninchen erhaltene abgeschwächte Virus immunisierte
zwar, wie festgestellt werden konnte, Kälber gegen virulentes Virusdiarrhöevirus,
jedoch erwies sich die Herstellung eines handelsfähigen Impfstoffes aus einem New
York-l-Stamm nach diesem Verfahren wegen der Schwierigkeit beim Passieren durch
Tiere und vor allem wegen der großen Zahl von Tierpassagen, die erforderlich sind,
um das Virus zur möglichen Verwendung in einem Impfstoff ausreichend abzuschwächen,
als zu kostspielig und war auch aus anderen Gründen zu beanstanden. Außerdem rief,
wie bereits erwähnt, das Virus selbst' nach fünfundsiebzig Tierpassagen noch Krankheitssymptome
bei
mit Impfstoff aus solchem Material geimpften Kälbern hervor.
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Im Hinblick auf diese Nachteile, die der Tierverwendung bei der Abschwächung
von virulentem Virus innewohnen, wurde die Vermehrung von New York Stamm-1-Virusdiarrhöevirus
in Gewebekultur untersucht. Bei dieser Untersuchung wurde diese Virussorte über
zwanzig aufeinanderfolgende Passagen hinweg in Rinderembryohautmuskelgewebe und
über weitere fünfzehn Passagen hinweg in Rinderembryonierenzellen gehalten. Bei
diesen insgesamt füufunddreißig Serienübertragungen wurden keine zellpathogenen
Wirkungen in Zellen beobachtet, und das Virus blieb offensichtlich in voller Virulenz
erhalten. Kälber, die mit dem elften, zwanzigsten, fünfundzwanzigsten, dreißigsten
und fünfunddreißigsten in Gewebekultur gezüchteten Virus geimpft wurden, zeigten
sämtlich, und zwar in 10->facher Verdünnung nach der letzten Passage bei jeder
Sorte Gewebekultursystem Krankheitssymptome.
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Bei weiter fortgeführten Untersuchungen wurde Indiana Stamm-46-Virusdiarrhöevirus
über sechsundzwanzig Serienübertragungen in Gewebekultur-Rinderembryonierenzellen
hinweg gehalten. Es wurden keine zellpathogenen Wirkungen beobachtet und auch keine
Abschwächung festgestellt. So erkrankten beispielsweise Kälber, die mit 1 ccm unverdünnter
Flüssigkeit einerseits aus der fünften und andererseits aus der sechsundzwanzigsten
Überttagung geimpft wurden, und zeigten die üblichen Krankheitssymptome, wie zweiphasige
Temperatur, Leukozytenverminderung usw., die man bei anfälligen, mit virulentem,
nativem Virusdiarrhöevirus geimpften Kälbern beobachtet. Durch Kaninchen hindurchpassierter
Indiana Stamm-46-Virusdiarrhöevirus blieb ebenfalls Kälbern gegenüber infektiös.
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Bei noch anderen Untersuchungen wurde beschlossen, - eine Abschwächung
des Virusdiarrhöevirus unter Verwendung eines anderen Stammes, und zwar speziell
des Oregon C 24 V-Stammes, zu versuchen. Dieser als zellpathogen angegebene Stamm
befindet sich beim New York State, Veterinary Virus Research Institute, Cornell
University, Ithaca, New York, auf Lager und kann dort bezogen werden. Die Vermehrung
dieses Oregon C 24V-Virus wurde in Gewebekultur-Rinderernbryonierenzellen gemäß
B ak er, James A. et al., Proc. U.S. Livestock Sanit.
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Assoc., 63, 143, 147, 148 (1959) durchgeführt, obwohl Gillespie, Bake
r and McEntee, The Cornell Veterinarian, 50, 73 bis 79 (1960) berichteten, daß der
in diesem System vermehrte Oregon C 24 V-Stamm Krankheitssymptome hervorruft, die
den vom New York Stamm-1-Virusdiarrhöevirus erzeugten ähneln. Die Passagen in der
Rinderembryonierenzellenkultur wurden jedoch in jeder Zellenkultur so lange fortgesetzt,
bis beispielsweise nach 2 bis 8 Tagen zellpathogene Wirkungen beobachtet wurden,
und das Ausmaß einer wenn überhaupt vorhandenen Abschwächung wurde periodisch durch
Impfen eines anfälligen Kalbes bestimmt. Bei dieser Untersuchung wurde festgestellt,
daß nach zweiunddreißigmaliger Übertragung geimpfte Kälber keine Krankheitsanzeichen
zeigten. Dies war zwar der erste »Durchbruch«, jedoch blieben sowohl Wirkungsgrad
als auch Gesamtsicherheit eines aus diesem Material hergestellten Impfstoffes unbestimmt.
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Bei dem Anfangstest wurden zehn etwa 4 Monate alte anfällige Kälber
in zwei gleich große Gruppen
unterteilt. Gruppe I wurde intramuskulär
mit 1 ccm der nach zweiunddreißig Übertragungen erhaltenen überstehenden Flüssigkeit
geimpft, während die Gruppe 2 zur Kontrolle ungeimpft blieb. Aus je einem Kalb jeder
Gruppe gebildete Paare wurden in Isoliereinheiten in Kontakt gebracht.
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Einen Monat nach der Impfung wurde allen Kälbern Blut entnommen und
dann zwecks Immunitätsbestimmung virulentes Virusdiarrhöevirus gegeben.
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Die fünf geimpften Kälber sprachen an, indem sie ohne Krankheitssymptome
neutralisierende Antikörper entwickelten, und zeigten sich sämtlich bei Darreichung
des virulenten Virus immun. Die fünf nicht geimpften Kontrollkälber waren anfangs
anfällig und blieben es auch nach Imonatigem Kontakt mit den geimpften Kälbern,
ohne Antikörper zu entwickeln.
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Damit war angezeigt, daß der Impfstoffvirus nicht übertragen wurde.
Nach Erregung mit dem virulenten Virus zeigten alle fünf Kontrollkälber klinische
Krankheitsanzeichen.
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Mit diesen positiven Ergebnissen wurden nun die Untersuchungen auf
Feldversuche unter Verwendung von zweihundertvierundzwanzig Tieren aus dreizehn
Molkereiherden ausgedehnt, in denen die Altersabstufung der Tiere zwischen 1. Monat
und 7 Jahren lag. Die eine Hälfte, nämlich hundertachtzehn Tiere, wurden, wie beim
Ausgangsversuch, mit dem abgeschwächten Oregon C 24V-Virus geimpft, während die
übrigen zur Kontrolle dienten. Diejenigen Tiere, die vor Beginn der Feldversuche
nachweisbare Antikörper zeigten, wurden als unbrauchbare Testtiere ausgelassen.
Auch unter Feldbedingungen erwies sich der Impfstoff weiter als sicher bezüglich
Nichthervorrufung von Krankheitssymptomen, und der als ein Immunitätsanzeiger wirkende
Neutralisierungstest zeigte einen Wirkungsgrad von etwa 95 o. Der Folgeregel für
die Feststellung von Sicherheit als auch von Wirkungsgrad wurde mehr als angemessen
Genüge geleistet.
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Die Abschwächung des Oregon C 24V-Stammes von Virusdiarrhöevirus
in Zellkulturen, wie beispielsweise Gewebekultur-Rinderembryonierenzellen ohne Anzeichen
von zellpathogenen Wirkungen stellt auf dem vorliegenden Testgebiet einen ausgesprochenen
Fortschritt dar. Die zu beobachtende Zelldegenerierung in solchen Kulturen beispielsweise
zeigt nicht nur die Anwesenheit von lebendem Virus, sondern erlaubt auch die Messung
relativer Mengen von im Kulturfeld vorhandenem Virus. Diese unter üblichen Virustitrationen
benutzende Maßnahme liefert ein Mittel zur Standardisierung des Impfstoffes.
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Die Erfindung schafft fernerhin ein Verfahren zur Gewinnung eines
abgeschächten, nichtvirulenten Schweinecholeravirusstammes, der zur Herstellung
des Schweinecholeraserumimpfstoffes benutzt werden kann. Die Erfindung liefert ein
praktisches Verfahren zur Umwandlung eines hochvirulenten, beständigen Schweinecholeravirusstammes
in einen abgeschwächten, nichtvirulenten Stamm.
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Bei den Untersuchungen auf diesem Gebiet zur Auffindung eines zellpathogenen
Schweinecholeravirusstammes insbesondere solcher Art, der sich abschwächen und in
einem stabilen, nichtvirulenten und für die Gewinnung von Schweinecholeraserum und
-impfstoff brauchbaren Stamm umwandeln läßt, wurden viele Versuche und Teste durchgeführt.
Bei diesen Untersuchungen führten epidemiologische Studien an Schweinecholera zur
Entdeckung eines bestän-
digen virulenten Stammes, s. Baker, James A. and Sheffy,
Ben E., Proc. Soc. Exp. Biol. and Med., 105, 679 bis 681 (1960). Gemäß diesem Bericht
trat bei der Impfung von fünfundzwanzig nichtimmunen, 6 Wochen alten Jungschweinen
mit Schweinecholeravirus, und zwar gemäß Baker, James A., Proc. Soc. Exp. Biol.
and Med. 63, 183 (1946) durch Kaninchenpassage modifizierten, virulenten Stamm A,
bei den meisten Jungschweinen nicht die erwartete Klärung des Blutes vom Virus auf.
Statt dessen verblieben vielmehr riesige Mengen an beständigem virulentem Virus
bis zu dem in verschiedensten Zeiträumen zwischen 6 und 17 Wochen nach Impfung eintretenden
Tod im Blut zurück.
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Außerdem blieben diese Jungschweine im Gegensatz zu den immunen und
den 3 Monate alten Schweinen, die auch bei dieser Untersuchung benutzt wurden, verkümmert,
obwohl sie bis einige Tage vor ihrem Tode fraßen und normale Aktivität zeigten.
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Dieser beständige Virusstamm erwies sich als einzigartig. So zeigten
beispielsweise Schweine, die mit dem aus der Leber der verkümmerten Schweine gewonnenen
beständigen Virus geimpft waren, eine kürzere Inkubationsperiode und starben in
kürzerer Zeit, als Schweine, die mit durch Serienpassage in Schweinen festgehaltenem,
virulentem Stamm A-Virus geimpft worden waren. Fernerhin infizierten Milzsuspensionen
von zehn verkümmerten Schweinen anfällige Schweine noch bei Verdünnungen von 10-7,
10 s und 10-9, während im Gegensatz dazu Milzsuspensionen von fünf im Eingehen befindlichen
Schweinen, die mit dem virulenten StammA-Virus geimpft worden waren, anfällige Schweine
bei Verdünnungen von 10-4 und 10-5, nicht aber mehr bei Verdünnungen von l0-s infizierten.
Diese Zahlenwerte zeigen, daß der ursprüngliche modifizierte Stamm A-Virus in den
verkümmerten Jungschweinen seinen Charakter von modifiziert auf virulent geändert
hatte, und daß der veränderte Virus, offensichtlich ein Mutant, eine stärkere Virulenz
als die seines Vorgängerstamms A besaß.
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Dieser beschriebene beständige Virusstamm erhielt die BezeichnungPAV-1.
Er befindet sich bei dem New York State, Veterinary Virus Research Institute, Cornell
University, Ithaca, New York, auf Lager und kann von dort bezogen werden.
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Bei den weiteren Untersuchungen zwecks Auffindung eines zellpathogenen
Schweinecholeravirusstammes wurden der vorerwähnte beständige PAV-1-Stamm und außerdem
der durch Übertragung in Schweinen soll virulent erhaltene virulente A-Stamm, ein
durch siebzehnfache Serienpassage in Kaninchen in seiner Virulenz modifizierter
A-Stamm, sowie viele andere von der Purdue University und der Pennsylvania State
University erhaltene virulente Schweinecholeravirusstämme Gewebekultur vermehrt.
Bei Verwendung von Schweinenierenzellen von noch nicht oder gerade geborenen Schweinen
als Kulturmedium sowie von normalen Viruskulturmedien, wie etwa dem Karzon-Medium,
Science, 130, 1078 (1959), dem im Handel erhältlichen Parker 199-Medium od. dgl.
in Verbindung mit Lammserum oder seinem Äquivalent erwies sich von der vorstehend
angegebenen Gruppe von Schweinecholeraviren allein der weiter oben beschriebene,
beständige PAV-1-Stamm als zellpathogen. Über die Auffindung des ersten zellpathogenen
Schweinecholeravirusstammes wurde von G i 11 e s p i e, James H.,
Sheffy,
Ben E. and Baker, James A., in Proc.
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Soc. Exp. Biol. and Med., 105, 679 bis 681 (1960) berichtet. Die praktische
Bedeutung dieses »Durchbruchs« blieb jedoch seinerzeit unbestimmt und sogar fragwürdig,
weil gemäß Bericht von G rille s p i e, Sheffy and Baker, l.c. aus acht und sechzehn
und sogar zweiunddreißig Reihenübertragungen in Gewebekulturen gewonnenes PAV-1-Virus
bei damit geimpften Schweinen die für Schweinecholera typischen Krankheitssymptome
und Schädigungen einschließlich Temperaturerhöhung und anschließendes Absterben
hervorriefen.
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Die Untersuchungen wurden jedoch fortgesetzt, indem das PAV-1-Virus
weiteren Serienpassagen durch zusätzliche Gewebekulturen der von G i l -lespie,
Sheffy and Baker, l.c. beschriebenen Art unterworfen wurden. Für die Teste wurde
ungefähr 6 Wochen alten, anfälligen Schweinen 1 ccm unverdünnte Gewebekulturflüssigkeit
intramuskulär eingespritzt. Teste mit dem PAV-1-Virus, das vierzig Serienpassagen
durch Gewebekultur hinter sich hatte, zeigten, daß das Virus, obwohl einige Tage
lang etwas Temperaturerhöhung auftrat, doch so weit modifiziert war, daß es nicht
mehr tötete.
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Weitere Serienpassagen durch Gewebekulturen zeigten, daß das PAV-l.-Virus
nach zweiundfünfzig Passagen immer noch etwas Temperaturerhöhung verursachte und
von den geimpften Schweinen auf anfällige oder nichtimmune Kontrollschweine überging.
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Bei weiterer Fortsetzung der Serienpassagen durch die Gewebekultur
wurde dann gefunden, daß nach zweiundsiebzig Passagen eine Impfung anfälliger Schweine
mit dem PAV-1-Virus eine nur noch eintägige Temperaturerhöhung von nur etwa 0,50
C ohne sonstige Krankheitsanzeichen ergab. Außerdem wurde festgestellt, daß das
Virus nicht mehr von geimpften Schweinen auf andere Schweine überging oder übertragen
wurde. Als äußerst wichtige Tatsache wurde fernerhin gefunden, daß nach zweiundsiebzig
Passagen durch Gewebekultur Impfungen mit dem anfangs hochvirulenten, beständigen
Schweinecholeravirus PAV-1 zur Erzeugung einer hohen Konzentration von schützenden
Antikörpern, d. h. einer Schweineimmunisierung der erstrebten Art, führten.
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Die Untersuchungen zeigten, daß das erfindungsgemäße PAV-1-Virus
auf üblichen Virusgewebekulturen gezüchtet werden kann und so weit abgeschwächt
ist, daß das Einimpfen von 1 com Gewebekulturflüssigkeit in nichtimmune Schweine
zu einer nur eintägigen Temperaturerhöhung von etwa 0,50 C führt. Im allgemeinen
wird zwecks leichterer Kontrolle das Virus in Zellkulturen abgeschwächt, die zellpathogene
Wirkungen zeigen. Auf jeden Fall und unabhängig von der Art der zur Abschwächung
benutzten Zellkulturen müssen jedoch zwecks Standardisierung die letzten Kulturen
des abgeschwächten Virus, aus denen der Impfstoff nach üblichen Verfahren zubereitet
wird, solche mit zellpathogenen Wirkungen sein. Die beobachtbare Zelldegeneration
in solchen Kulturen zeigt nicht nur die Anwesenheit von lebendem Virus an, sondern
ihr relatives Ausmaß dient auch als Maß, wieviel Virus in der Kulturflüssigkeit
relativ enthalten ist. Diese letzterwähnte Eigenschaft liefert unter Verwendung
genormter oder üblicher Virustitrationen das Mittel, um den Impfstoff zu standardisieren.
Eine solche Standardisierung ist aber, wie schon weiter oben erwähnt wurde, von
Bedeutung, um den Wirkungsgrad, die Immunisie-
rungspotenz und die Sicherheit des
Impfstoffes zu kontrollieren.
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Die Vorteile, die durch die Standardisierung des Impfstoffes ohne
Schweineteste nach Virusabschwächung erreicht werden, liegen für den Fachmann auf
der Hand. Da außerdem Schweineteste nur etwas über Wirksamkeit oder Unwirksamkeit
des Impfstoffes aussagen, selbst jedoch keine Impfstoffstandardisierung schaffen,
sind die dem erfindungsgemäßen standardisierten Impfstoff innewohnenden Vorteile
für diejenigen klar erkennbar, die mit der Ausrottung der Schweinecholera beschäftigt
sind.