PL211174B1

PL211174B1 - Kompozycja szczepionki przeciwko Mycoplasma hyopneumoniae, szczepionka i zastosowanie

Info

Publication number: PL211174B1
Application number: PL363220A
Authority: PL
Inventors: Hsien-Jue CHU (Steve); Wumin Li; Zhichang Xu
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2000-12-19
Filing date: 2001-12-11
Publication date: 2012-04-30
Also published as: TWI308872B; WO2002049666A3; PL363220A1; CN1489472A; ATE359813T1; CZ20031721A3; YU49303A; CN1296095C; HUP0400687A3; HU227431B1; EP1343525A2; HRP20030585B1; HRP20030585A2; US20070020296A1; WO2002049666A2; HUP0400687A2; BG107898A; US8187588B2; KR100874119B1; BRPI0116249B1

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 211174 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 363220 (51) Int.Cl.

(22) Data zgłoszenia: 11.12.2001 A61K 39/02 (2006.01)

A61K 39/116 (2006.01) (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

11.12.2001, PCT/US01/047865 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

27.06.2002, WO02/49666

Kompozycja szczepionki przeciwko Mycoplasma hyopneumoniae, szczepionka i zastosowanie

	(73) Uprawniony z patentu:
(30) Pierwszeństwo:	WYETH, Madison, US
19.12.2000, US, 60/256,637	(72) Twórca(y) wynalazku:
(43) Zgłoszenie ogłoszono:	HSIEN-JUE (STEVE) CHU, Fort Dodge, US
15.11.2004 BUP 23/04	WUMIN LI, Fort Dodge, US ZHICHANG XU, Fort Dodge, US
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
30.04.2012 WUP 04/12	(74) Pełnomocnik:
	rzecz. pat. Magdalena Tagowska

PL 211 174 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja szczepionki przeciwko Mycoplasma hyopneumoniae, szczepionka i zastosowanie. Wynalazek niniejszy dotyczy ulepszonych sposobów indukowania odporności ochronnej przeciwko Mycoplasma hyopneumoniae, specyficznie wykorzystujących inaktywowaną szczepionkę bakteryjną przeciwko Mycoplasma hyopneumoniae w ilości skutecznej w pojedynczej dawce do immunizacji otrzymującego ją zwierzę cia przeciwko zakażeniu Mycoplasma hyopneumoniae.

Mycoplasma hyopneumoniae jest etiologicznym czynnikiem mikoplazmatycznego zapalenia płuc u świń. Choroba ta jest ważną przyczyną strat ekonomicznych w hodowli trzody chlewnej na skalę przemysłową ze względu na to, że obniża przyrost wagi i powoduje małą wydajność paszy. Choroba wywołuje, trwające przez kilka tygodni, chroniczny kaszel, matowe pokrycie sierści, opóźniony wzrost i wygląd, jak przy nieprawidłowym rozwoju. Charakterystycznymi organicznymi zmianami chorobowymi obserwowanymi u zakażonych zwierząt są fioletowe do szarych powierzchnie zagęszczeń tkanki, szczególnie w brzusznych szczytowych i sercowych płatach. Pomimo, że choroba powoduje niewielką śmiertelność, dotknięte świnie są często podatne na zakażenia wtórne patogenami oportunistycznymi, prowadzące do stresu lub śmierci. Same straty ekonomiczne oszacowano na 200 do 250 milionów dolarów rocznie.

Mycoplasma hyopneumoniae jest rosnącą powoli, wymagającą bakterią, która nie ma ściany komórkowej. Często jest ona trudna do wyizolowania z dróg oddechowych ze względu na Mycoplasma hyorhinis, powszechny czynnik wtórny również zlokalizowany w drogach oddechowych. Choroba rozprzestrzenia się przez aerozol, wytwarzany przy kaszlu i przez bezpośredni kontakt z zarażoną lub świnią po rekonwalescencji będącą nosicielem. Mieszanie się zakażonych i niezakażonych zwierząt powodowało wczesne i częste ponowne zakażenie. Zakażenie często zaczyna się od zakażenia prosiąt podczas prosienia przez maciorę będącą nosicielem. Ze względu na techniki zarządzenia stadem, zakażenie może nie stać się widoczne aż do starszego wieku prosiąt. Dodatkowe zakażenie zwykle jest obserwowane po odstawieniu od maciory, gdy świnie są grupowane. Jawna postać choroby jest normalnie obserwowana u świń w szóstym tygodniu życia lub później. U zakażonych zwierząt szybkość przyrostów i szybkość przetwarzania pokarmu są znacząco zredukowane. Leczenie z użyciem antybiotyków jest drogie i wymaga przedłużonego stosowania. Ponowne zakażenie również stanowi problem. Szczepionki są obecnie najskuteczniejszym sposobem unikania zakażeń i ich konsekwencji.

Fort Dodge Animal Health (FDAH) dostarcza na rynek szczepionkę bakteryjną z Mycoplasma hyopneumoniae pod nazwą Suvaxyn® Respifend® MH do zastosowania, jako szczepionkę do ochrony zdrowych świń przeciwko klinicznym objawom powodowanym przez Mycoplasma hyopneumoniae. Szczepionka zawiera Carbopol, jako adiuwant i jest rekomendowana jako dwudawkowa szczepionka dla świń w wieku przynajmniej jednego tygodnia, przy czym drugą dawkę podaje się dwa do trzech tygodni po pierwszym szczepieniu. Jednakże, dwudawkowa szczepionka ma tę oczywistą niekorzyść, że wymaga powtórnego zajmowania się zwierzętami w celu dostarczenia pełnej ochrony przeciwko chorobie.

Dlatego twórcy niniejszego wynalazku postawili sobie za cel dostarczenie skutecznej szczepionki przeciwko Mycoplasma hyopneumoniae, która wywołuje odporność ochronną i zapobiega chorobie powodowanej przez ten organizm, przy podawaniu pojedynczej dawki szczepionki.

Innym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie kompozycji szczepionki odpowiedniej do zastosowania u świń przeciwko zakażeniu i chorobie powodowanej przez Mycoplasma hyopneumoniae, która może być stosowana w połączeniu z innymi szczepionkami bakteryjnymi i/lub anatoksynami.

Ponadto również celem obecnego wynalazku jest dostarczenie sposobu zapobiegania lub osłabiania choroby, w której organizmem będącym przyczyną choroby jest Mycoplasma hyopneumoniae, poprzez zastosowanie preparatu adiuwantowego, który wzmacnia immunogenność szczepionki bakteryjnej, tak aby wywołać odporność ochronną po pojedynczej dawce szczepionki.

Inne przedmioty i właściwości wynalazku będą zrozumiałe na podstawie szczegółowego opisu przedstawionego poniżej.

Obecny wynalazek dotyczy kompozycji szczepionki do szczepienia zwierzęcia przeciwko zakażeniu Mycoplasma hyopneumoniae zawierającej immunizującą ilość szczepionki bakteryjnej przeciwko Mycoplasma hyopneumoniae; mieszaninę adiuwantową zawierającą polimer kwasu akrylowego i mieszaninę ulegają cego metabolizmowi oleju i blokowego kopolimeru tlenku etylenu i propylenu;

PL 211 174 B1 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, która to kompozycja szczepionki, po pojedynczym podaniu, wywołuje odporność ochronną przeciwko Mycoplasma hyopneumoniae.

Korzystnie mieszanina adiuwanta w kompozycji według wynalazku składa się z polimeru kwasu akrylowego oraz mieszaniny ulegającego metabolizmowi oleju, który obejmuje jeden lub więcej węglowodorów terpenowowych, i blokowego kopolimeru tlenku etylenu i tlenku propylenu, w stosunku polimeru kwasu akrylowego do mieszaniny olej ulegający metabolizmowi/blokowy kopolimer tlenku etylenu i tlenku propylenu od około 1:25 do 1:50.

Również korzystnie mieszanina adiuwanta w kompozycji według wynalazku jest zwykle obecna w stężeniu koń cowym okoł o 1-25% (obj./obj.), korzystniej okoł o 2-15% (obj./obj.), a najkorzystniej 5-12% (obj./obj.).

W korzystnym aspekcie wykonania kompozycja szczepionki wedł ug wynalazku charakteryzuje się tym, że polimer kwasu akrylowego jest obecny w stężeniu końcowym około 1% obj./obj. i mieszanina węglowodory terpenowe/ blokowy kopolimer tlenku etylenu i tlenku propylenu jest obecna w stężeniu koń cowym od około 5% do 10% obj./obj.

Korzystnie olejem ulegającym metabolizmowi stosowanym w kompozycji według wynalazku jest skwalan lub skwalen, a polimerem kwasu akrylowego jest karbomer (Carbopol).

Kompozycja może korzystnie zawierać inne składniki szczepionki, w szczególności inaktywowane bakteryjne szczepionki lub oczyszczone anatoksyny, z jednego lub więcej patogenów, takich jak Haemonphilus parasuis, Pasteurella multiocida, Streptococcum suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis i leptospira.

Wynalazek dotyczy również zastosowania Mycoplasma hyopneumoniae w kombinacji z mieszaniną adiuwanta zawierającą polimer kwasu akrylowego oraz mieszaninę ulegającego metabolizmowi oleju i blokowego kopolimeru tlenku etylenu i tlenku propylenu; oraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, do wytwarzania kompozycji szczepionki do ochrony zwierzęcia przed chorobą wywoływaną przez Mycoplasma hyopneumonia, przy czym kompozycja szczepionki po pojedynczym podaniu wywołuje odporność ochronną przeciwko Mycoplasma hyopneumoniae.

Korzystnie immunizująca ilość bakterii zgodnie z zastosowaniem według wynalazku wynosi około 1x10⁸ do 3x10¹¹ MHDCE/ml, a korzystniej około 1x10⁹ do 3x10⁹ MHDCE/ml.

Ponadto korzystnie kompozycja szczepionki otrzymywana zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczona do podawania domięśniowego, podskórnego, dootrzewnowego, w postaci aerozolu, doustnie lub donosowo.

Korzystnie mieszanina adiuwanta w kompozycji otrzymywanej zgodnie z zastosowaniem według wynalazku składa się z polimeru kwasu akrylowego i mieszaniny ulegającego metabolizmowi oleju, która zawiera jeden lub więcej węglowodór terpenowy i blokowy kopolimer tlenku etylenu i tlenku propylenu obecnych w stężeniu końcowym około 1-25% obj./obj.

W korzystnej postaci zastosowania według wynalazku polimerem kwasu akrylowego w mieszaninie adiuwanta jest karbomer (Carbopol), a olejem ulegającym metabolizmowi w mieszaninie adiuwanta jest węglowodór terpenowy wybrany z grupy składającej się ze skwalenu i skwalanu.

W korzystnym aspekcie wykonania kompozycja szczepionki otrzymywana zgodnie z zastosowaniem według obejmuje ponadto przynajmniej jedną dodatkową szczepionkę bakteryjną wybraną z grupy skł adają cej się z bakterii Haemophilus parasuis; Pasteurella multiocida; Streptococcum suis; Actinobacillus pleuropneumoniae; Bordetella bronchiseptica; Salmonella choleraesuis; oraz leptospira.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto szczepionka zawierająca inaktywowany Mycoplasma hyopneumoniae, ulegający metabolizmowi olej, blokowy kopolimer tlenku etylenu i tlenku propylenu oraz polimer kwasu akrylowego w postaci emulsji olej w wodzie.

Szczegółowy opis wynalazku

Jak stosuje się w niniejszym opisie, „szczepionka bakteryjna (bakteryna) oznacza zebraną hodowlę bakterii, które zostały inaktywowane i które, w połączeniu z pewnymi adiuwantami, po podaniu zwierzętom mogą wywołać odporność ochronną, w celu zabezpieczenia przeciwko chorobie lub zakażeniu.

„Adiuwant oznacza kompozycję zawierającą przynajmniej jedną substancję, która wzmacnia immunogenność i skuteczność szczepionki bakteryjnej przeciwko Mycoplasma hyopneumoniae w kompozycji szczepionki.

Zgodnie z opisem i zastrzeżeniami patentowymi, MHDCE (ang. Mycoplasma hyopneumoniae DNA cell equvalents) oznacza ekwiwalenty komórkowe DNA Mycoplasma hyopneumoniae.

PL 211 174 B1 „Immunizująca ilość oznacza ilość szczepionki bakteryjnej, która zapewni odporność względem

Mycoplasma hyopneumoniae. „Immunizująca ilość będzie zależeć od gatunku, hodowli, wieku, wielkości, stanu zdrowia oraz tego czy zwierzę było uprzednio szczepione przeciwko temu samemu organizmowi.

Obecny wynalazek dostarcza szczepionkę przeciwko Mycoplasma pneumoniae, która jest odpowiednia do szczepienia w pojedynczej dawce. Szczepionka według obecnego wynalazku obejmuje mieszaninę adiuwanta, który wzmacnia immunogenność szczepionki bakteryjnej, a zatem zapewnia, że pojedyncze podanie będzie wywołać odporność ochronną.

Szczepionka może być otrzymana ze świeżo zebranych hodowli sposobami, które są standardowo stosowane w dziedzinie (patrz, na przykład, opis patentowy US 5338543 lub opis patentowy US 5565205, jak i przykład 2 poniżej). To jest, organizm może być reprodukowany w pożywce hodowlanej takiej jak pełna pożywka PPLO (dla organizmów typu Pleuropneumonia) [Difco Laboratories]. Wzrost organizmu jest monitorowany standardowymi technikami, takimi jak wyznaczanie jednostek zmiany koloru (CCU, ang. color changing units) i komórki są zbierane gdy zostanie uzyskane dostatecznie wysokie miano. Buliony wyjściowe mogą być również zatężone lub liofilizowane konwencjonalnymi sposobami przed wprowadzeniem szczepionki do preparatu. Inne sposoby, takie jak te opisane w pracy Thomas i in., Agri-Practice, tom 7 Nr 5, str. 26-30, mogą być stosowane.

Szczepionka według obecnego wynalazku obejmuje inaktywowaną szczepionkę bakteryjną przeciwko Mycoplasma hyopneumoniae w kombinacji z mieszaniną adiuwanta i jednym lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Nośniki odpowiednie do zastosowania obejmują ośrodki wodne, na przykład, roztwór soli, roztwór soli buforowany fosforanem, minimalną pożywkę podstawową (MEM), lub MEM z buforem HEPES.

Mieszanina adiuwanta do zastosowania w kompozycjach szczepionki według obecnego wynalazku wzmacnia odpowiedź immunologiczną i obejmuje mieszaninę polimeru kwasu akrylowego z mieszaniną oleju ulegają cego metabolizmowi, np. nienasyconego węglowodoru terpenowego lub jego produktu uwodornienia, korzystnie skwalanu (2,3,10,15,19,23-heksametylotetrakozan) lub skwalenu, i blokowy kopolimer tlenku etylenu i propylenu. Taki polimer kwasu akrylowego może być homopolimerem lub kopolimerem. Polimerem kwasu akrylowego jest korzystnie karbomer. Karbomery są dostępne na rynku pod nazwą handlową Carbopol. Polimery kwasu akrylowego są opisane, na przykład, w opisach patentowych US 2909462 i 3790665. Blokowe kopolimery tlenku etylenu i propylenu są środkami powierzchniowo czynnymi, korzystnie ciekłymi środkami powierzchniowo czynnymi, które wspomagają zawieszanie stałych i płynnych składników. Środki powierzchniowo czynne są dostępne na rynku jako polimery pod nazwą handlową Pluronic®. Korzystnej środkiem powierzchniowo czynnym jest poloksamer 401 który jest dostępny na rynku pod nazwą handlową Pluronic® L121.

Immunogennie stymulująca mieszanina adiuwanta jest zazwyczaj obecna w kompozycji szczepionki według wynalazku w ilości obj./obj. około 1% do 25%, korzystnie około 2% do 15%), korzystniej około 5% do 12% obj./obj. Ilości mieszaniny adiuwanta zastosowane i stosunek dwóch składników adiuwanta mogą się zmieniać w zależności od dodatku innych szczepionek bakteryjnych lub oczyszczonych anatoksyn. Mieszanina adiuwanta ogólnie obejmuje ulegający metabolizmowi olej, polimer kwasu akrylowego i blokowy kopolimer tlenku etylenu i tlenku propylenu przygotowane w postaci emulsji w ośrodku wodnym.

W tej mieszaninie adiuwanta, ulegaj ą cy metabolizmowi olej i polimer kwasu akrylowego mo ż e być obecny w ilości w zakresie odpowiednio od około 10 do 150 ml/l oraz od około 0,5 do 10 g/l. W korzystnej postaci wykonania mieszaniny adiuwanta, skł adnikiem mieszaniny oleju ulegają cego metabolizmowi i blokowego kopolimeru tlenku etylenu i tlenku propylenu jest mieszanina skwalanu i Pluronic® L121 (poloksamer 401), która moż e być obecna w iloś ci okoł o od 50 do 100 ml/l, a polimerem karboksymetylowym jest Carbopol 934P (Carbamer 934P), który może być obecny w ilości około 2 ml/l. Zazwyczaj, stosunek polimeru kwasu akrylowego do mieszaniny oleju ulegającego metabolizmowi/blokowego kopolimeru tlenku etylenu i propylenu w mieszaninie adiuwanta wynosi około 1:25 do 1:50.

Korzystnej polimery kwasu akrylowego są polimerami sprzedawanymi przez B. F Goodrich jako Carbopol 934 P NF i 941 NF, które są polimerami kwasu akrylowego usieciowanego poliallilosacharozą i które mają wzór chemiczny (CH2CHOOOH)n. Polimery te tworzą wodne żele, które ulegają odpowiedniemu spreparowaniu z wodnymi nośnikami. Korzystnymi blokowymi kopolimerami tlenku etylenu i tlenku propylenu są niejonowe środki powierzchniowo czynne dostarczane przez BASF jako Pluronic® L121, L61,L,81 lub L101.

Szczepionka według wynalazku może być podawana drogą domięśniową, podskórnie, donosowo, dootrzewnowo lub doustnie, korzystnie domięśniowo lub podskórnie.

PL 211 174 B1

Szczepionka według wynalazku ogólnie obejmująca inaktywowane Mycoplasma hyopneumoniae, olej ulegający metabolizmowi, blokowy kopolimer tlenku etylenu i tlenku propylenu, polimer kwasu akrylowego jest w postaci emulsji olej w wodzie. Szczepionka korzystnie zawiera polimer kwasu akrylowego w stężeniu w zakresie od 0,5 do 10 g/l. Szczepionka korzystnie zawiera ulegający metabolizmowi olej w stężeniu w zakresie od 2 do 6 ml/l. Szczepionka korzystnie zawiera blokowy kopolimer tlenku etylenu i tlenku propylenu w stężeniu w zakresie od 1 do 3 ml/l.

Przy jednodawkowym podawaniu, szczepionka powinna korzystnie zawierać ilość szczepionki bakteryjnej przeciwko Mycoplasma pneunomoniae odpowiadającej około 1x10⁹ do 3x10⁹ MHDCE/ml, korzystnie około 1x10⁸ do 3x10¹¹ MHDCE/ml. Około jeden do pięciu ml, korzystnie 2 ml, może być podawane na zwierzę, domięśniowo, podskórnie, lub dootrzewnowo. Jeden do dziesięciu ml, korzystnie 2 do 5 ml, może być podawane doustnie lub donosowo.

Następujące przykłady mają na celu dalsze zilustrowanie wynalazku nie ograniczając jego zakresu.

P r z y k ł a d 1

Szczepionka bakteryjna przeciwko Mycoplasma hyopneumoniae

Wytwarzanie kompozycji szczepionki

Opis bulionów wyjściowych. Mycoplasma hyopneumoniae może być otrzymana z dowolnej liczby łatwo dostępnych źródeł. W jednym wykonaniu może być stosowany szczep P-5722-3 Mycoplasma hyopneumoniae. Hodowlę otrzymano od C. Armstrong, z Purdue University, West Lafayette, Indiana, USA. Zgodnie z zaleceniem hodowlę Mycoplasma hyopneumoniae, pasażowano w bulionie dla Mycoplasma hyopneumoniae siedem razy, aby ustalić hodowlę macierzystą.

Hodowla komórkowa. Mycoplasma hyopneumoniae hodowano w pożywce zawierającej Bacto PPLO, ekstrakt drożdżowy, glukozę, chlorowodorek L-cysteiny, ampicylinę, octan talu, czerwień fenolową, środek przeciwpieniący, normalną sterylną surowicę świń i wodę, w czasie 18-144 godzin. W celu inaktywacji dodano podwójną etyloenoiminę (BEI) bezpośrednio do prowadzonej hodowli w naczyniu fermentacyjnym. pH doprowadzono do 7,4, a nastę pnie zebrano komórki wedł ug tradycyjnych procedur, aby dostarczyć szczepionkę bakteryjną przeciwko Mycoplasma hyopneumoniae.

Wytwarzanie kompozycji szczepionki

Kompozycja konserwantów i zastosowane proporcje. Zebrana szczepionka bakteryjna jest zabezpieczana przez dodatek tiomersalu i soli tetra-sodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w ilości nie większej niż odpowiednio 0,01% i 0,07%. Ampicylina USP jest obecna w pożywce wzrostowej w stężeniu 0,250 gram/litr. Stężenie resztkowe ampicyliny będzie różne w końcowym produkcie w zależności od objętości zebranych płynów, przy resztkowym stężeniu ampicyliny w końcowym produkcie nieprzekraczającym 30 μg/ml.

Standarydyzacja produktu. Koncentrat mikoplazmy jest określany ilościowo oznaczeniem fluorymetrycznym DNA.

Mieszaninę oleju ulegającego metabolizmowi, która obejmuje jeden lub więcej węglowodór terpenowy i blokowy kopolimer tlenku etylenu i tlenku propylenu, np. mieszaninę Skwalan/Pluronic L121, otrzymano przez rozpuszczenie 10 g chlorku sodu, 0,25 g chlorku potasu, 2,72 dwuzasadowego fosforanu sodu, 0,25 jednozasadowego fosforanu potasu, 20 ml Pluronic L121 (BASF Corporation), 40 ml Skwalanu (Kodak), 3,2 ml Tween 80 w 900 ml oczyszczonej wody, uzupełnionej do 1000 ml. Po zmieszaniu, składniki mogą być autoklawowane. Mieszaninę następnie homogenizowano do momentu utworzenia stabilnej emulsji. Formalina może być dodana do stężenia końcowego 0,2% lub tiomersal może być dodany do stężenia końcowego 1:10,000.

Składanie jednostek, aby utworzyć serię. Satysfakcjonujące koncentraty Mycoplasma hyopneumoniae aseptycznie połączono z adiuwantami, konserwantem i rozpuszczalnikiem w sterylnym pojemniku wyposażonym w mieszadło i mieszano przez nie krócej niż 30 minut.

Ilości dla 1000000 dawek (każda 2 ml):

% obj./obj.
Koncentrat mikoplazmy (>1,0x10¹⁰ MHDCE/ml)	400000 ml	20,0
mieszanina Skwalan/Pluronic L121	100000 ml	5,0
Carbopol (2% stęż. masa/obj.)	200000 ml	10,0
Stężenie tiomersalu 1% stęż. stęż. masa/obj. w wodzie i EDTA (sól tetrasodowa) 7% stęż. masa/obj.	18000 ml	0,9
Sterylny roztwór soli	1282000 ml	64,1

PL 211 174 B1 pH serii jest doprowadzona do 7,0 ± 0,2.

MHDCE = ekwiwalenty komórkowe DNA Mycoplasma hyopneumoniae

Sposób i technika wypełniania i uszczelniania ostatecznych pojemników. Produkt może być ogólnie przefiltrowany przez sterylny 200-500 mikronów filtrujący element i umieszczony w warunkach wyszczególnionych w 9 CFR 114.6 w sterylnych pojemnikach w pomieszczeniu przeznaczonym do operacji napełniania. Pojemniki szklane lub z tworzywa zamykano gumowym korkiem i obciskano uszczelniając aluminiowymi zamknięciami. Każda 2,0 ml dawka zawiera nie mniej niż 2x10⁹ ekwiwalenty komórkowe DNA Mycoplasma hyopneumoniae.

Badanie skuteczności.

Próbki produktu z objętości całkowitej i z ostatecznego pojemnika mogą być następująco badane pod kątem skuteczności:

Sposób badania skuteczności: zastosowano samice myszy ICR, w szóstym do siódmego tygodnia życia, z jednej przesyłki, od Harlan Sprague Dawley lub od innego zaakceptowanego odbiorcy. Minimum 20 myszy jest koniecznych do immunizacji każdą nieznaną i bakteryjną szczepionką odniesienia. Minimum pięć myszy pozostawiono jako nieszczepione kontrole. Testowane szczepionki i szczepionki bakteryjne odniesienia dokł adnie mieszano. Sterylne, jednorazowe strzykawki wyposażone w igły o wielkości 25 i długości 5/8 cala, stosowano do szczepienia myszy podskórnie w regionie pachwin stosując 1/10 dawki dla zwierzęcia docelowego (0,2 ml). Każdą grupę myszy umieszczono jako oddzielną jednostkę i pozostawiono wolny dostęp do pokarmu i wody przez 14 dni. Każdą mysz następnie usypiano. Uśpioną mysz umieszczano na grzbiecie. Trzymając jedną ręką, głowę utrzymywano skierowaną do dołu i przednią jedną łapę wyciągano przed resztę ciała. Stosując skalpel, nacinano skórę w przybliżeniu na długość ½ cala pomiędzy przodem wyciągniętej łapy a klatką piersiową, odcinając tętnicę ramienną. Stosując 3,0 ml strzykawkę, bez igły, zebrano krew, która wyciekała przez nacięcie. Krew umieszczano w znakowanej probówce i pozostawiano do utworzenia skrzepu. Probówki ze skrzepem wirowano przy 1000 x g, aby oddzielić surowicę od skrzepu. Poszczególne surowice przechowywano w temp. -20°C lub niższej do momentu użycia do zbadania.

Badanie serologiczne: Procedurę ELISA stosowano do pomiaru odpowiedzi przeciwciała myszy na szczepionki bakteryjne odniesienia i/lub nieznane. Procedurę ELISA przeprowadzono stosując jednorazowe płytki mikrotitracyjne Immulon II o płaskim dnie z Dynatech lub równoważne i czytnik płytek ELISA.

Odczynniki do testu:

Roztwór soli buforowy fosforanem - Tween (PBST) (pH doprowadzono do 7,2 -7,4 roztworem 5N NaOH lub 5N HCl).

Ilość na litr

Składniki	Litr
NaCl	8,50 grama
NaH2PO4	0,22 grama
Na2HPO4	1,19 grama
Tween-20	0,50 ml
Dejonizowana woda uzupełniona do	1000,00 ml

Roztwór soli buforowy glicyną (GBS) (pH doprowadzono do 9,5 do 9,7 roztworem 5N NaOH lub 5N HCl).

Składniki	Ilość na litr
Glicyna	0,75 grama
NaCl	8,50 grama
Dejonizowana woda uzupełniona do	1000,00 ml

Surowica do kontroli pozytywnej: Surowica do kontroli pozytywnej jest zebraną surowicą od myszy szczepionych szczepionką bakteryjną Mycoplasma hyopneumoniae.

Koniugat i substrat:

Oczyszczony przez powinowactwo koniugat ze znakowaną peroksydazą anty-mysią lgG otrzymano z Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc. (nr katalogowy 074-1802). Procedurę do określenia

PL 211 174 B1 optymalnego rozcieńczenia koniugatu przedstawiono szczegółowo poniżej. Roztwory substratu peroksydazy (ABTS) otrzymano z Kirkegaard and Perry, Inc.

Oznaczanie miana koniugatu: płytkę mikrotitracyjną Immulon II o płaskim dnie powlekano 100 μΐ na studzienkę 20 μg na ml komórkowego antygenu Mycoplasma hyopneumoniae rozcieńczonego w 10 mM GBS. Płytkę inkubowano przez nie krócej niż jedną godzinę przy temp. 37°C±2°C i przeniesiono do 2-7°C, w której to temperaturze prowadzono inkubację przez nie krócej niż 18 godzin, ale nie dłużej niż jeden tydzień. Przed zastosowaniem płytkę przemywano trzy razy PBST, stosując jednominutowe namaczanie pomiędzy każdym przemyciem i owinięto taśmą gdy wyschła. Przygotowano rozcieńczenie surowicy do kontroli pozytywnej 1:40 w PBST i rozcieńczoną surowicę do kontroli pozytywnej (100 μΐ/na studzienkę) dodano do jednej połowy studzienek na szalce. PBST dodano do drugiej połowy studzienek. Płytkę inkubowano przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, po czym przemywano trzy razy. Skoniugowaną surowicę rozcieńczono stopniowo w PBST dwukrotnie, wychodząc z rozcieńczenia 1: 100 i kończąc na rozcieńczeniu 1:10 240. 100 μl każdego rozcieńczenia koniugatu dodano do czterech studzienek surowicy pozytywnej i czterech studzienek PBST, i pozostawiono, aby zaszła reakcja przez pół godziny w temperaturze pokojowej. Płytki przemywano cztery razy i dodano 100 μl roztworu substratu peroksydazy (abts) na studzienkę. Płytkę sczytywano przy ustawieniu podwójnej długości fal T λ, = 450. Rozcieńczenie koniugatu wybrano tak, aby uzyskać odczyt 0,850 do 1,050 dla surowicy do kontroli pozytywnej, gdy wartość kontroli PBST odjęto od wartości dla surowicy do kontroli pozytywnej.

Badany antygen:

Antygen Mycoplasma hyopneumoniae stanowi preparat zawierający całe komórki i jest dostarczany przez Fort Dodge Animal Health.

Oznaczenie ELISA wykonuje się następująco: stosuje się płytki mikrotitracyjne o płaskim dnie Immulon II z Dynatech. Jedną fiolkę liofilizowanego antygenu z całej komórki Mycoplasma hyopneumoniae odtworzono w dziesięciu ml roztworu soli buforowanego glicyną (GBS). Stężenie odtworzonego białka mikoplazmy wynosiło 20 μg/ml. Następnie 100 μl (2 pg) rozcieńczonego antygenu dodano do studzienek płytki. Płytę inkubowano w temp. 37°C ± 2°C przez nie krócej niż jedną godzinę, a następnie przeniesiono i inkubowano w 2-7°C przez minimalnie 18 godzin a maksymalnie jeden tydzień. Płytki przemywano trzy razy PBST, namaczano jedną minutę pomiędzy każdym przemyciem, a następnie zamknięto taśmą na sucho. Surowice rozcieńczono 1:40 w PBST. Surowica do kontroli pozytywnej będzie włączona w czterech powtórzeniach na każdej płytce. Objętość próbki na studzienkę wynosi 100 pl. Badane próbek surowicy testowanej seryjnie i próbek surowicy odniesienia będą testowane w dwóch powtórzeniach na tej samej płytce. Płytki inkubowano przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej i przemywano trzy razy PBST. 100 pl koniugatu anty-mysia IgG znakowana peroksydazą (Kirkegaard and Perry), rozcieńczonego w PBST dodano do wszystkich studzienek i studzienki inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Płytki przemywano cztery razy PBST. 100 pl roztworu substratu peroksydazy (ABTS) dodano do wszystkich studzienek i płytki inkubowano aż kontrola pozytywna surowicy osiągnie OD405 (450) 0,850 do 1,050, gdy urządzenie jest kalibrowane względem kontrolnych studzienek PBST. Płytki sczytywano i porównywano ze ślepą próbą studzienek PBST. Aby test był ważny, surowice myszy szczepionych szczepionką bakteryjną odniesienia muszą osiągać minimalną średnią wartość 0,500, a surowice nieszczepionych kontrolnych myszy nie mogą przekraczać maksymalnej średniej wartości 0,100. Ale różnica pomiędzy średnią wartością dla surowicy myszy szczepionych szczepionką bakteryjną odniesienia i surowicy nieszczepionych kontrolnych myszy musi być większa niż lub równa 0,400.

Średnie wartości szczepionek seryjnych, szczepionek odniesienia i kontroli, obliczono i oszacowano następująco: aby były uważane za satysfakcjonujące, badane szczepionki bakteryjne muszą wykazywać przeciętnie średnią wartość gęstości optycznej równą lub większą niż odnośnik. Albo, stosując test-T Studenta jednego końca, testowana szczepionka bakteryjna nie może być znacząco (poziom ufności p < 0,05) niższa niż szczepionka bakteryjna odniesienia. Dowolna obliczona wartość T równa, lub wyższa niż, 1,686 będzie wskazywać znaczącą różnicę pomiędzy szczepionką odniesienia i badaną szczepionką bakteryjną, i będzie powodować, że badana szczepionka bakteryjna będzie odrzucona. Dowolna obliczona wartość T mniejsza niż 1,686 będzie wskazywać serię satysfakcjonującą. Dowolna badana szczepionka bakteryjna określona testem jako niesatysfakcjonująca z dowolnego powodu, niezwiązanego ze skutecznością produktu jest odrzucana i wstępne badanie jest uważane za nieważne.

PL 211 174 B1

P r z y k ł a d 2

Testowana szczepionka:

Szczepionkę do testowania przygotowano według procedur szczegółowo opisanych w przykładzie 1 stosując 5% mieszaniny oleju ulegającego metabolizmowi, która obejmuje jeden lub więcej węglowodór terpenowy i blokowy kopolimer tlenku etylenu i propylenu (mieszanina Skwalan/Pluronic L121) i 0,2% polimeru kwasu akrylowego (Carbopol) jako adiuwantu, i 2x10⁹ ekwiwalentów komórkowych DNA M. hyopneumoniae (MHDCE) na dawkę.

P r z y k ł a d 3

Badanie to było zaprojektowane tak, aby wykazać czteromiesięczny czas trwania odporności (DOI) indukowanej u świń w trzecim tygodniu życia w jednodawkowym szczepieniu szczepionkami z przykł adu 2.

W tym celu przeprowadzono dwie oddzielne próby na zwierzętach. Wszystkie świnie w obu próbach były surowiczo-ujemne (miano przeciwciał < 10) w czasie szczepienia wskazując, że zwierzęta były podatne na zakażenie Mycoplasma hyopneumoniae. Wszystkie świnie w grupach kontrolnych pozostawały surowiczo-ujemne przed testem prowokacji. Wskazuje to, że odpowiedź immunologiczna u szczepionych świń wystąpiła na skutek szczepionki, a nie ze względu na ekspozycję na działanie środowiska.

W pierwszej próbie, szczepionkę z przykł adu 2 sprawdzano razem z dostę pnym na rynku produktem, Ingelvac M. hyo® wytwarzanym przez Boehringer Ingelheim (BI), w teście prowokacji wysokim poziomem zjadliwego M. hyopneumoniae (0,4 x 10⁶ organizmów). Dwadzieścia dwie (22) świnie w wieku 18-21 dni szczepiono domięśniowo szczepionką z przykładu 2 (IM) i osiem (8) świń szczepiono Ingelvac M. hyo® [seria 271 032]. Dwadzieścia dwie (22) świnie stanowiły kontrolę testu prowokacji i 10 ś wiń stanowiło kontrole niepoddane testowi prowokacji. Ś winie w szczepionych i poddanych testowi prowokacji grupach kontrolnych były prowokowane zjadliwym M. hyopneumoniae w cztery miesiące po szczepieniu. Świnie szczepione szczepionką z przykładu 2 miały średnie uszkodzenia płuc 15,9%, a prowokowane kontrolne świnie miały średnie uszkodzenia płuc 19,6%. Średnie zmiany patologiczne w płucach w grupie szczepionej szczepionką z przykładu 2 były mniejsze niż w kontrolach pomimo, że świnie prowokowano wyższą dawką niż zalecana przez Iowa State University (ISU), jednakże, różnica nie była znacząca (p=0,19). Podobnie, gdy dostępny w handlu, Ingelvac M. hyo® oszacowano na tej samej grupie zwierząt przy tej samej dawce prowokacji, również obserwowano podobny poziom zmian patologicznych w płucach (14,6%). Nie było również znaczącej różnicy pomiędzy grupą szczepioną Ingelvac M. hyo® i grupą kontrolą (p=0,27), i pomiędzy grupą szczepioną Ingelvac M. hyo® i grupą szczepioną szczepionką z przykładu 2.

W drugiej próbie, szczepionkę z przykładu 2 testowano prowokując zjadliwym M. hyopneumoniae na poziomie sugerowanym przez ISU (1,0 x 10⁶ organizmów) w cztery miesiące po szczepieniu. Dwadzieścia trzy (23) świnie w wieku 21 dni szczepiono jedną dawką szczepionki, 25 świń jako kontrole testu prowokacji i 7 świń jako kontrole nieprowokowane. Świnie w szczepionych i prowokowanych grupach kontrolnych prowokowano zjadliwym M. hyopneumoniae w cztery miesiące po szczepieniu. Kontrolna grupa miała średnie uszkodzenia płuc 10,4%) i szczepiona grupa miała średnie uszkodzenia płuc 5,5%. Występowała znacząca różnica pomiędzy grupą szczepioną a grupą kontrolą (p=0,031). Wskazuje to, że szczepionka z przykładu 2 skutecznie stymuluje odporność ochronną, która może trwać przynajmniej cztery miesiące po pojedynczej dawce szczepienia świń w wieku trzech tygodni.

Gdy dane związane ze szczepionką z przykładu 2 w dwóch próbach połączono i zanalizowano, średnie uszkodzenia płuc w szczepionej grupie były znaczącego niższe niż w grupie kontrolnej.

Podsumowując, szczepionka z przykładu 2 indukuje odporność ochronną przeciwko prowokacji zjadliwym M. hyopneumoniae w czwartym miesiącu po jednodawkowym szczepieniu świń w wieku trzech tygodni.

Dane doświadczalne

W tym badaniu przeprowadzono dwie oddzielne próby. W próbie pierwszej, sześćdziesiąt siedem (67) świń przydzielono do czterech grup stosując program randomizacji Microsoft Excel. Dwadzieścia cztery (24) świnie w wieku 18-21 dni szczepiono domięśniowo (IM) jedną dawką szczepionki z przykł adu 2. Dwadzieś cia cztery (24) ś winie słu ż ył y jako prowokowane kontrole i 10 świń jako kontrole nieprowokowane. Dziewięć świń szczepiono IM komercyjnym produktem, Ingelvac M. hyo®, [seria 271 032, wytwarzanym przez Boehringer Ingelheim (BI)], zgodnie z załączoną instrukcją. Pięć świń (dwie świnie szczepione szczepionką z przykładu 2, jedna szczepionką BI i dwie kontrolne) padło w czasie okresu ochronnego szczepienia ze względu na przyczyny niezwiązane ze szczepieniem. Pozostałe świnie w szczepionych grupach i prowokowanej grupie kontrolnej prowokowano 14 ml zjaPL 211 174 B1 dliwego M. hyopneumoniae (1,4 x 10⁶ organizmów) w cztery miesiące po szczepieniu. Świnie we wszystkich czterech grupach uśmiercono 30 dni po prowokowaniu i zmiany patologiczne w płucach określano u każdej świni w próbie.

W drugiej próbie, dwadzieścia pięć (25) świń w wieku 21 dni szczepiono IM jedną dawką szczepionki z przykładu 2. Dwadzieścia pięć (25) świń służyło jako prowokowane kontrole i 10 świń jako kontrole nieprowokowane. Dwie świnie padły ze względu na przyczyny niezwiązane ze szczepieniem i jedną świnię przez przypadek sprzedano w czasie utrzymywania szczepienia. Pozostałe świnie w szczepionych i prowokowanych w grupach kontrolnych prowokowano 10 ml zjadliwego M. hyopneumoniae (1,0 x 10⁶ organizmów) w cztery miesiące po szczepieniu. Dwie świnie padły w czasie obserwacji po prowokowaniu ze względu na powody niezwiązane ze szczepieniem/prowokowaniem. Pozostałe świnie we wszystkich trzech grupach uśmiercano 30 dni po prowokowaniu i zmiany patologiczne w płucach określano u każdej świni w próbie.

Szczepienie:

Każda świnia w grupach szczepionych otrzymała jedną 2 ml dawkę testowanej szczepionki IM w bok szyi.

Prowokowanie i sekcja:

Wyjściowy zjadliwy M. hyopneumoniae do prowokowania, mrożony (-70°C) homogenat płuc został otrzymany przez Dr Eileen Thacker z Iowa State University (ISU). Potwierdzono, że wyjściowa zawiesina do prowokowania jest czysta i zawiera w przybliżeniu 10⁷ organizmów M. hyopneumoniae na ml. Zalecana do prowokowania dawka wynosi 10 ml rozcieńczonej 1:100 zawiesiny wyjściowej (to jest, 1,0 x 10⁶ organizmów).

Świnie w szczepionych i prowokowanych w grupach kontrolnych w pierwszej próbie prowokowano 14 ml rozcieńczonej 1:100 zawiesiny wyjściowej (to jest, 1,4 x 10⁶ organizmów). Świnie w drugiej próbie prowokowano 10 ml rozcieńczonej 1: 100 zawiesiny wyjściowej (to jest, 1,0 x 10⁶ organizmów) zgodnie z zaleceniem.

W dniu prowokacji, homogenat rozmroż ono szybko pod ciepłą wodą i rozcień czono wedł ug zaleceń ISU stosując sterylną pożywkę wzrostową M. hyopneumoniae. Świnie uspokojono mieszaniną Xylazine-Ketamine-Telazol™ składającą się z 50 mg/ml ksylazyny, 50 mg/ml ketaminy, i 100 mg/ml telazolu. Mieszaninę usypiającą podano IM w ilości 0,022-0,044 ml/kg (0,01-0,02 ml/lb) masy ciała. Każdej świni podano dotchawiczo pojedynczą 14 ml (próba pierwsza) lub 10 ml dawkę (próba druga) prowokującego materiału. Aby zapewnić prawidłowe umieszczenie igły, do strzykawki wprowadzono powietrze przed podawaniem prowokującej dawki. Nieszczepione nieprowokowane kontrolne świnie trzymano w oddzielnych pomieszczeniach i nieprowokowano.

dni po prowokowaniu (DPC, ang. days post challenge), wszystkie świnie uśmiercano. Płuca usuwano i ogólne zmiany patologiczne w płucach były określane liczbowo przez osobę nie znającą wyników grup testowanych.

Zbieranie i badanie próbek:

Próbki krwi pobierano od wszystkich świń w dniu szczepienia (0 DPV), jeden miesiąc po szczepieniu (1 MPV), 4 miesiące po szczepieniu/0 dni po prowokowaniu (MPV/0 DPC) i 30 dni po prowokowaniu (DPC) w celu zbadania przeciwciał przeciwko M. hyopneumoniae w surowicy jak wykrywano kompetycyjnym zestawem ELISA (wykonany przez DAKO Co.). Próbki surowicy przechowywano przy -20°C przed badaniem.

Analiza danych:

Punktową ocenę zmian patologicznych w płucach porównywano pomiędzy szczepionymi i nieszczepionymi grupami stosując analizę wariancji (ANOVA). Wartości punktowej oceny zmian patologicznych w płucach przekształcono funkcją arcsin, aby poprawić rozmieszczenie reszt.

Wyniki i omówienie

Serologia: Wszystkie świnie w obu próbach badano pod kątem przeciwciał przeciwko M. hyopneumoniae w surowicy stosując dostępny w handlu zestaw do oznaczeń ELISA, stosując rozcieńczenie surowicy 1:10 we wszystkich testach. Wszystkie świnie w czasie szczepienia były surowiczoujemne (miano przeciwciał <10) co wskazywało, że zwierzęta były podatne na zakażenie M. hyopneumoniae. Wszystkie świnie w grupach kontrolnych pozostawały surowiczo-ujemne przed prowokowaniem. Wskazuje to, że odpowiedź immunologiczna u szczepionych świń wystąpiła w wyniku podania szczepionki, a nie w wyniku ekspozycji na czynniki środowiskowe. Wszystkie świnie w szczepionych grupach i większość świń w prowokowanych w grupach kontrolnych (18 z 22 świń w próbie pierwszej i 15 z 25 w próbie drugiej) przeszły po prowokowaniu serokonwersję wobec M. hyopneumoniae, podczas gdy wszystkie nieprowokowane zwierzęta pozostawały surowiczo-ujemne. Sugeruje to,

PL 211 174 B1 że prowokowanie było specyficzne względem M. hyopneumoniae. Stan serologiczny zwierząt testowanych podsumowano w tabeli 1.

Badanie immunogenności w próbie pierwszej:

Próbę pierwszą przeprowadzono w celu określenia czy szczepionka z przykładu 2 mogłaby stymulować silną odporność, która w cztery miesiące po szczepieniu mogłaby zabezpieczać przeciwko wyższym poziomom prowokowania niż zalecane przez ISU. W próbie tej porównano również szczepionkę z przykładu 2 z dostępną na rynku, Ingelvac M. hyo®, pod kątem zdolności do stymulacji odporności ochronnej w cztery miesiące po szczepieniu.

Dwadzieścia dwie świnie szczepione FDAH Suvaxyn MH-One i osiem świń licencjonowanym produktem, Ingelvac M. hypo® seria 271 032, prowokowano materiałem 1,4 x 10⁶ organizmów na świnię (1,0 x 10⁶ organizmów na świnię było zalecane przez ISU, patrz rozdział 5.5). Dwadzieścia dwie świnie służyły jako kontrole prowokowania i 10 świń jako kontrole nieprowokowane. Procentowości zmian patologicznych w płucach podsumowano w tabeli 2. Świnie szczepione szczepionką z przykładu 2, miały średnie uszkodzenia płuc 15,9% i prowokowane kontrolne świnie miały średnie uszkodzenia płuc 19,6%. Zmiany patologiczne w płucach w grupie szczepionej szczepionką z przykładu 2 były mniejsze niż w kontroli nawet gdy świnie prowokowano wyższą dawką M. hyopneumoniae. Jednakże różnica nie była znacząca (p=0,19). Podobnie, gdy dostępny w handlu produkt, Ingelvac M. hyo® oszacowywano w tej samej grupie zwierząt przy tej samej dawce prowokującej, również otrzymano podobny poziom zmian patologicznych w płucach (14,6%)). Nie było znaczących różnic pomiędzy szczepioną grupą Ingelvac M. hypo® i grupą kontrolną (p=0,27), i pomiędzy szczepioną grupą Ingelvac M. hyo® i grupą szczepioną szczepionką z przykładu 2 (p=0,88).

Pomimo, że w grupie otrzymującej szczepionkę z przykładu 2 zostało zarejestrowane nieznaczące liczbowo obniżenie zmian patologicznych, dane otrzymane w tej próbie sugerują, że wyższe dawki prowokowania (1,4 x 10⁶ organizmów) stosowane w tej próbie były prawdopodobnie zbyt wysokie, nawet przy odporności świń stymulowanej przez komercyjny produkt Ingelvac. Ten poziom prowokowania nie jest prawdopodobnie odpowiedni do oszacowania badań szczepienia/prowokowania stosując wielkości grup 2025 zwierząt, jednak przy liczniejszych grupach jest możliwe, aby udowodnić takie znaczenie.

Badanie immunogenności w drugiej próbie:

Świnie w grupach szczepionych i kontrolnych prowokowanych w grupach w próbie drugiej badano przy prowokującej dawce (1,0 x 10⁶ organizmów) jak zaleca ISU w cztery miesiące po szczepieniu, aby wykazać czteromiesięczny czas trwania ochrony (DOI). Procent zmian patologicznych w płucach podsumowano w tabeli 3. Grupy kontrolne miały średnią zmian patologicznych w płucach 10,4%. Szczepione grupy miały średnią zmian patologicznych w płucach 5,5%. Występuje znacząca różnica pomiędzy szczepionymi a kontrolnymi grupami (p=0,031). Wskazuje to, że szczepionka z przykładu 2 jest skuteczna w stymulowaniu odporności ochronnej, która może trwać przynajmniej cztery miesiące po pojedynczej dawce szczepienia świń w wieku trzech tygodni.

Ocena połączonych wyników obu prób:

Podczas gdy dwie próby były znacząco różne, wpływ próby na grupę nie był znaczący. Wielkość wpływu grupy był podobny w obu próbach. Zatem, wpływ grupy mógł być oszacowany bez uwzględnienia próby. Ponieważ analiza pełnego modelu wykazała, że oddziaływania pomiędzy grupami i próbą nie były znaczące, to wspiera to stwierdzenie, że wpływ grupy był taki sam w obu próbach i uzasadnia połączenie danych z obu prób w jednej analizie. Zatem gdy dane związane ze szczepionką z przykładu 2 z dwóch prób połączono i zmienną przekształconą w arcsin dla zmian patologicznych w płucach analizowano, traktując grupę i próbę jako niezależne zmienne (model zredukowany). Grupa jest statystycznie znacząca (p=0,013).

Tabela 1: Podsumowanie stanu serologicznego względem M. hyopneumoniae kontrolnych i szczepionych świń

Próba pierwsza

Dodatni/ujemny( 1:10) w

Grupa	Liczba świń	ODPV	-1 DPC	30DPC
szczepionka FDAH	22	0/22	0/22	22/22
Szczepionka BI	8	0/8	4/8	8/8
Prowokowana kontrola	22	0/22	0/22	18/22
Nieprowokowana kontrola	10	0/10	0/10	0/10

PL 211 174 B1

Próba druga

Dodatni/u	emny (1:10) w
Grupa	Liczba świń	ODPV	-3DPC	30DPC
szczepionka FDAH	23	0/23	6/23	23/23
Kontrola	25	0/25	0/25	14/25
Nieprowokowana kontrola	7	0/7	0/7	0/7

Tabela 2: Podsumowanie procentowości zmian patologicznych w płucach w próbie pierwszej (wyższa dawka) *

Grupa	Liczba świń	Średnia procentowość zmian patologicznych w płucach	wartość P
Szczepionka FDAH	22	15,90%	0,19**
Szczepionka BI	8	14,60%	0 27***
Kontrola	22	19,60%
Nieprowokowana kontrola	10	0%	0 88****

*Świnie prowokowano 1,4x10⁶ organizmów na świnię (zalecana przez ISU dawka 1,0x10⁶ organizmów na świnię) ** porównanie pomiędzy grupą szczepioną FDAH a grupą kontrolną *** porównanie pomiędzy grupą szczepioną BI a grupą kontrolną * porównanie pomiędzy grupą szczepioną BI a grupą szczepioną FDAH

Tabela 3 : Podsumowanie procentowości zmian patologicznych w płucach w próbie drugiej (zalecana dawka)

Grupa	Liczba świń	Średnia procentowość zmian patologicznych w płucach	wartość P
Szczepionka FDAH	23	5,50%	0,031 **
Kontrola	25	10,40%
Nieprowokowana kontrola	7	0,77%

* Świnie prowokowano dawcą zalecaną przez ISU (1,0x10⁶ organizmów na świnię) ** porównanie pomiędzy grupą szczepioną FDAH a grupą kontrolną

P r z y k ł a d 4

Ocena długoterminowej odporności indukowanej przez kompozycję szczepionki według wynalazku przeciwko zjadliwej prowokacji sześć miesięcy po jednodawkowym podaniu

Stosując zasadniczo takie same procedury jak opisane w przykładach 1 i 2 oraz wykorzystując ilości przedstawione poniżej, wytworzono testową szczepionkę A.

Testowa szczepionka A

Ilości na 1 000 000 dawek (każda 2ml):% obj./obj.

Koncentrat mikoplazmy( > 1,0 x 10¹⁰ MHDCE/ml)	1200 000 ml	60,0
mieszanina Skwalan/Pluronic L121	200 000 ml	10,0
Karbopol (2% masa/obj. w wodzie)	200 000 ml	10,0
Stężenie tiomersalu 1% masa/obj. w wodzie i EDTA (sól tetrasodowa) 7 masa/obj.%	18 000 ml	0,9
Sterylny roztwór soli	382 000 ml	19,1

pH serii doprowadzono do 7,0 ± 0,2.

MHDCE = ekwiwalenty komórkowe DNA Mycoplasma hyopneumoniae

Podsumowanie

Trzydzieści-trzy 21-dniowe świnie wykorzystano w tej ocenie. Dwadzieścia świń w wieku trzech tygodni szczepiono jedną dawką szczepionki A domięśniowo (IM). Dziesięć świń służyło jako nieszczepione kontrole i trzy świnie jako nieprowokowane środowiskowe kontrole.

Wszystkie świnie były w czasie szczepienia surowiczo-ujemne (miano przeciwciał <10), wskazując że zwierzęta były podatne na zakażenie M. hyopneumoniae. Wszystkie świnie przed prowokowaniem

PL 211 174 B1 w grupach kontrolnych pozostawały surowiczoujemne. Wskazuje to, że odpowiedź immunologiczna u szczepionych świń była wynikiem szczepionki, a wynikiem ekspozycji na czynniki środowiskowe.

Sześć miesięcy po szczepieniu, 20 szczepionych świń i 10 nieszczepionych kontrolnych świń prowokowano zjadliwym M. hyopneumoniae (1,0 x 10⁶ organizmów na świnię). Trzy świnie służyły jako nieprowokowane kontrole. Szczepione świnie miały średnią liczbową zmian patologicznych w płucach 3,6%, a prowokowane kontrolne świnie miał y średnią liczbową zmian patologicznych w płucach 14,6%). Zmiany patologiczne w płucach w szczepionych grupach były znaczącego mniejsze niż w kontrolach (p=0,0215).

Dane otrzymane w tej ocenie wykazują, że testowa szczepionka A indukowała długoterminową odporność ochronną przeciwko prowokacji zjadliwym M. hyopneumoniae sześć miesięcy po szczepieniu w pojedynczej dawce.

Projekt doświadczalny

Trzydzieści trzy 21 dniowe świnie losowo przypisano do trzech grup (szczepiona grupa, prowokowana grupa kontrolna i nieprowokowana środowiskowa grupa kontrolna) stosując program Microsoft Excel do randomizacji w miocie. Dwadzieścia świń w wieku trzech tygodni szczepiono domięśniowo jedną dawką testowej szczepionki A. Dziesięć świń służyło jako prowokowane kontrole i trzy świnie jako nieprowokowane środowiskowe kontrole. Świnie w szczepionej grupie i prowokowane kontrole prowokowano 10 ml na świnię kolonii zjadliwego M. hyopneumoniae (1,0 x 10⁶organizmów) w szóstym miesiącu po szczepieniu. Trzy nieszczepione świnie stosowano jako kontrole nieprowokowane. Świnie z grup prowokowanej i nieprowokowanej kontroli uśmiercano 26 dni po prowokowaniu i określano zmiany patologiczne w płucach u każdej świni.

Każda świnia w grupach szczepionych otrzymała jedną 2 ml dawkę testowej szczepionki IM w bok szyi.

Prowokowanie i sekcja

Wyjściowa zawiesina zjadliwego M. hyopneumoniae do prowokowania, mrożony (< -70°C) homogenat płuc, został otrzymany przez Dr Eileen Thacker z Iowa State University (ISU). Potwierdzono, że zawiesina wyjściowa do prowokowania jest czysta i zawiera w przybliżeniu 10⁷ organizmów M. hyopneumoniae na ml.

Świnie prowokowano 10 ml rozcieńczonej 1: 100 zawiesiny wyjściowej (to jest, w przybliżeniu 1,0 x 10⁶ organizmów).

W dniu prowokacji, homogenat rozmrożono szybko pod ciepłą wodą i rozcieńczono według zaleceń ISU stosując sterylną pożywkę wzrostową M. hyopneumoniae. Świnie uspokojono mieszaniną XylazineKetamine-Telazol™ składającą się z 50 mg/ml ksylazyny, 50 mg/ml ketaminy, i 100 mg/ml telazolu. Mieszaninę usypiającą podano IM w ilości 0,022-0,044 ml/kg (0,01-0,02 ml/lb) masy ciała. Każdej świni podano pojedynczą 10 ml dawkę materiału prowokującego (1,0x10⁶ organizmów), dotchawiczo. Aby zapewnić prawidłowe umieszczenie igły, do strzykawki wprowadzono powietrze przed podawaniem prowokującej dawki. Nieszczepione, nieprowokowane kontrolne świnie trzymano w oddzielnych pomieszczeniach i nieprowokowano.

dni po prowokowaniu (DPC), wszystkie świnie uśmiercano. Płuca usuwano i ogólne zmiany patologiczne w płucach określano jak opisano w przykładzie 3.

Zbieranie i badanie próbek:

Próbki krwi pobierano od wszystkich świń w dniu szczepienia (0 DPV), 35 dni po szczepieniu (35 DPV), - 1 DPC (jeden dzień przed prowokowaniem) i 26 DPC (dni po prowokowaniu) w celu zbadania przeciwciał przeciwko M. hyopneumoniae w surowicy wykrywanych kompetycyjnym zestawem ELISA (wykonany przez DAKO Co.). Próbki surowicy przed zbadaniem przechowywano przy -20°C.

Analiza danych

Ocenę punktową zmian patologicznych w płucach porównywano pomiędzy szczepionymi i kontrolnymi grupami stosując jednokierunkową analizę (ANOVA). Ocenę punktową zmian patologicznych w płucach przekształcono funkcją arcsin, aby poprawić rozmieszczenie reszt. Ponieważ założenie normalności dla oceny zmian patologicznych w płucach było wątpliwe, zarówno ocena zmian patologicznych w płucach jak i przekształcony arcsin oceny zmian patologicznych w płucach analizowano testem sumy rzędów Wilcoxona. Poziom istotności ustalono na p<0,05. Wyniki z nieparametrycznego testu sumy rzędów Wilcoxona stosowano w celach sprawozdawczych.

Wyniki i omówienie

Serologia:

Wszystkie świnie badano pod kątem przeciwciał przeciwko M. hyopneumoniae w surowicy, stosując dostępny w handlu zestaw do oznaczeń ELISA, stosując rozcieńczenie 1:10 surowicy we wszystkich testach. Próbki o niepewnych wynikach testu były traktowane jako dodatnie w analizie danych. Wszystkie świnie w czasie szczepienia były surowiczo-ujemne (miano przeciwciał <10) wskazując, że zwierzęta były podatne na zakażenie M. hyopneumoniae. Wszystkie świnie w grupach kontrolnych pozostawały surowiPL 211 174 B1 czo-ujemne przed prowokowaniem. Po szczepieniu piętnaście z dwudziestu (15/20) szczepionych zwierząt stało się surowiczo-dodatnimi względem M. hyopneumoniae przynajmniej raz (próbki zebrano w 35DPV i 1 DPC). Sugeruje to, że odpowiedź immunologiczna u szczepionych świń była spowodowana szczepionką, a nie ekspozycją na warunki środowiskowe. Wszystkie szczepione świnie i cztery z dziesięciu świń w prowokowanej grupie kontrolnej stały się surowiczo-dodatnie względem M. hyopneumoniae po prowokowaniu, podczas gdy wszystkie nieprowokowane zwierzęta pozostawały surowiczo-ujemne. Stan serologiczny zwierząt testowanych podsumowano w tabeli 4.

Ocena punktowa zmian patologicznych w płucach

Dwadzieścia świń szczepionych testową szczepionką A i dziesięć nieszczepionych kontrolnych świń prowokowano zjadliwym M. hyopneumoniae (1,0 x 10⁶ organizmów na świnię) w szóstym miesiącu po szczepieniu. Trzy świnie służyły jako nieprowokowane kontrole. Osiem z dwudziestu szczepionych zwierząt (40%) nie rozwinęło zmian patologicznych w płucach po prowokowaniu, podczas gdy w grupie kontrolnej jedynie jedna z 10 świń (10%) nie wykazywała zmian patologicznych w płucach. Procentowość zmian patologicznych w płucach podsumowano w tabeli 5. Szczepione świnie miały średnią zmian patologicznych w płucach 3,6%, a świnie z prowokowanej kontroli miały średnią zmian patologicznych w płucach 14,6%). Zmiany patologiczne w płucach w szczepionych grupach były znaczącego mniejsze niż w kontrolach (p=0,0215).

T a b e l a 4: Stan serologiczny względem M. hyopneumoniae świń w badaniu*

			Liczba pozytywnych (1:10)/wszystkie
Grupa	Traktowanie	Liczba świń	0 DPV**	35 DPV	-1 DPC***	26 DPC
1	Szczepionka/prowokowanie	20	0/20	9/20	12/20	20/20
2	Kontrola/prowokowanie	10	0/10	0/10	0/10	4/10
3	Kontrola/bez prowokowania	3	0/3	0/3	0/3	0/3

* próbki surowicy badano pod kątem przeciwciał przeciwko M. hyopneumoniae w surowicy stosując dostępny w handlu zestaw do oznaczeń ELISA.

Wszystkie próbki badano przy rozcieńczeniu surowicy 1:10. Wyniki interpretowano według instrukcji załączonej do zestawu.

Próbki podejrzane przy 1:10 były uważane za dodatnie.

** DPV = dzień po szczepieniu *** DPC = dzień po prowokowaniu

T a b e l a 5: Podsumowanie wyników oceny zmian patologicznych w płucach (%) u świń prowokowanych M. hyopneumoniae i u nieprowokowanych kontroli

Grupa	Leczenie	Liczba świń	Średnia % ocena uszkodzenia płuc	Odchylenie standardowe	Poniżej 95% CL* średniej	Powyżej 95% CL* średniej	Wartość P**
1	Szczepionka/ prowokowanie	20	3,6	7,6	0,07	7,19	0,0215
2	Kontrola/ prowokowanie	10	14,6	20,0	0,33	28,94
3	Kontrola/ bez prowokowania	3	1,8	1,8	-2,67	6,27

* CL = poziom ufnoś ci ** Wartość P otrzymano z porównania grup 1 i 2.

Jak można stwierdzić na podstawie danych przedstawionych w tabelach 4 i 5, testowana szczepionka A indukuje odporność ochronną przeciwko prowokacji zjadliwym M. hyopneumoniae przez sześć miesięcy po pojedynczej dawce szczepionki podawanej świniom w wieku trzech tygodni.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompozycja szczepionki do szczepienia zwierzęcia przeciwko zakażeniu Mycoplasma hyopneumoniae, znamienna tym, że zawiera immunizującą ilość szczepionki bakteryjnej przeciwko

PL 211 174 B1

Mycoplasma hyopneumoniae; mieszaninę adiuwanta zawierającą polimer kwasu akrylowego oraz mieszaninę ulegającego metabolizmowi oleju i blokowego kopolimeru tlenku etylenu i tlenku propylenu; oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, przy czym kompozycja szczepionki po pojedynczym podaniu wywołuje odporność ochronną przeciwko Mycoplasma hyopneumoniae.
2. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znamienna tym, że mieszanina adiuwanta składa się z polimeru kwasu akrylowego oraz mieszaniny ulegającego metabolizmowi oleju, który obejmuje jeden lub więcej węglowodorów terpenowowych, i blokowego kopolimeru tlenku etylenu i tlenku propylenu, w stosunku polimeru kwasu akrylowego do mieszaniny olej ulegający metabolizmowi/blokowy kopolimer tlenku etylenu i tlenku propylenu od około 1:25 do 1:50.
3. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znamienna tym, że mieszanina adiuwanta obejmuje około 1-25% obj./obj. kompozycji szczepionki.
4. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3, znamienna tym, że polimer kwasu akrylowego jest obecny w stężeniu końcowym około 1% obj./obj. i mieszanina węglowodory terpenowe/ blokowy kopolimer tlenku etylenu i tlenku propylenu jest obecna w stężeniu końcowym od około 5% do 10% obj./obj.
5. Kompozycja szczepionki według zastrz. 3, znamienna tym, że mieszanina adiuwanta obejmuje około 2%-15% obj./obj. kompozycji szczepionki.
6. Kompozycja szczepionki według zastrz. 5, znamienna tym, że mieszanina adiuwanta obejmuje około 5%-12% obj./obj. kompozycji szczepionki.
7. Kompozycja szczepionki według zastrz. 1, znamienna tym, że olejem ulegającym metabolizmowi jest skwalan lub skwalen.
8. Kompozycja szczepionki według zastrz. 6 albo 7, znamienna tym, że polimerem kwasu akrylowego jest karbomer.
9. Kompozycja szczepionki według jednego z zastrz. 1-8, znamienna tym, że zawiera ponadto przynajmniej jedną szczepionkę bakteryjną wybraną z grupy składającej się z bakterii Haemophilus parasuis, Pasteurella multiocida, Streptococcum suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis i leptospira.
10. Zastosowanie Mycoplasma hyopneumoniae w kombinacji z mieszania adiuwanta zawierającą polimer kwasu akrylowego oraz mieszaninę ulegającego metabolizmowi oleju i blokowego kopolimeru tlenku etylenu i tlenku propylenu; oraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, do wytwarzania kompozycji szczepionki do ochrony zwierzęcia przed chorobą wywoływaną przez Mycoplasma hyopneumonia, przy czym kompozycja szczepionki po pojedynczym podaniu wywołuje odporność ochronną przeciwko Mycoplasma hyopneumoniae.
11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że immunizującą ilość bakterii wynosi około 1x10⁸ do 3x10¹¹ MHDCE/ml.
12. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że immunizującą ilość bakterii wynosi około 1x10⁹ do 3x10⁹ MHDCE/ml.
13. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że kompozycja szczepionki jest przeznaczona do podawania domięśniowego, podskórnego, dootrzewnowego, w postaci aerozolu, doustnie lub donosowo.
14. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że mieszanina adiuwanta składa się z polimeru kwasu akrylowego i mieszaniny ulegającego metabolizmowi oleju, która zawiera jeden lub więcej węglowodór terpenowy i blokowy kopolimer tlenku etylenu i tlenku propylenu obecnych w stężeniu końcowym około 1-25% obj./obj.
15. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że polimerem kwasu akrylowego w mieszaninie adiutanta jest karbomer.
16. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że olejem ulegającym metabolizmowi w mieszaninie adiuwanta jest węglowodór terpenowy wybrany z grupy składającej się ze skwalenu i skwalanu.
17. Zastosowanie według jednego z zastrz. 10-16, znamienne tym, że kompozycja szczepionki obejmuje ponadto przynajmniej jedną dodatkową szczepionkę bakteryjną wybraną z grupy składającej się z bakterii Haemophilus parasuis; Pasteurella multiocida; Streptococcum suis; Actinobacillus pleuropneumoniae; Bordetella bronchiseptica; Salmonella choleraesuis; oraz leptospira.
18. Szczepionka, znamienna tym, że zawiera inaktywowany Mycoplasma hyopneumoniae, ulegający metabolizmowi olej, blokowy kopolimer tlenku etylenu i tlenku propylenu oraz polimer kwasu akrylowego w postaci emulsji olej w wodzie.