WO1998018907A1 - Verfahren zur herstellung von tumoriziden t-lymphozyten - Google Patents

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WO1998018907A1
WO1998018907A1 PCT/EP1997/005957 EP9705957W WO9818907A1 WO 1998018907 A1 WO1998018907 A1 WO 1998018907A1 EP 9705957 W EP9705957 W EP 9705957W WO 9818907 A1 WO9818907 A1 WO 9818907A1
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lymphocytes
cells
tumoricidal
tumor
antibody
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PCT/EP1997/005957
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Herbert Jungfer
Heinrich Barchet
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Roche Diagnostics Gmbh
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    • C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere

Definitions

  • the invention relates to a process for the activation, production and multiplication of tumorous T lymphocytes and a composition which is suitable as a medium for the production, activation and multiplication of tumorous T lymphocytes.
  • the cellular immune defense plays an important role in the elimination of pathologically altered body cells such as virus-infected cells or tumor cells.
  • cytotoxic T-lymphocytes recognize the changed body's own cells based on surface antigens.
  • surface antigens are usually protein fragments that are formed by the cells and are present on the cell surface bound to surface receptors of the so-called major histocompatibility complex (MHC) (Zinkernagel et al., Nature 248 (1974), 701-702 and Babbit et al., 1985, Nature 317: 359-361).
  • MHC major histocompatibility complex
  • LAK cells lymphokine-activated killer cells
  • the lymphocytes to be activated were also cultivated in the presence of autologous tumor cells (mixed lymphocyte tumor cultures, G. Fossati et al., International Journal of Cancer 42 (1988), 239-245; G. Degiovanni et al., Eur. J. Immunol. 18 (1988), 671-676; Wölfel et al., J. Exp. Med. 170 (1989), 797-810; Darrow et al., J. Immunol. 142 ( 1989), 3329-3335 and Notter et al., Int. J. Cancer 45 (1990), 834-841).
  • autologous tumor cells mixed lymphocyte tumor cultures, G. Fossati et al., International Journal of Cancer 42 (1988), 239-245; G. Degiovanni et al., Eur. J. Immunol. 18 (1988), 671-676; Wölfel et al., J. Exp. Med. 170 (1989), 797-810; Darrow
  • TLL tumor infiltrating lymphocytes
  • WO 94/23014 describes tumoricidal T lymphocytes and a process for their preparation. Thereafter, tumor tidal lymphocytes are produced by co-cultivating lymphocytes with a mammalian cell line of certain properties.
  • the object of the invention was to provide an improved and simplified method for the specific production of specifically tumoricidal T-lymphocytes, the Stimulation and proliferation of other T lymphocytes, and in particular of NK cells, is avoided
  • tumoricidal T-lymphocytes which cells of a chronic myelogenic leukemia cell line (K-562, ATCC CCL 243) do not destroy cytotoxically, but only inhibit their growth for a limited period of time, by cultivating lymphocytes which are lysosomotrophic be pretreated with anti-CD43 antibodies and isolation of the tumoricidal T lymphocytes.
  • lymphocytes white blood cells
  • sucker cell line a sucker cell line
  • Tumor lymphocytes in the sense of the invention, are T cells, as described in WO94 / 23014 and which recognize tumor cells in an antigen-unspecific manner and are killed by apoptosis induction and / or cytolysis. T tumor lymphocytes are characterized in that
  • no interleukin-2 is detectable in the culture supernatant of these tumorous T lymphocytes during the proliferation of these cells in the presence of the HB 654 or HB 617 cell line at a detection limit of 0.5 IU / ml
  • Tumor-killer T cells are not natural killer (NK) lymphocytes. Compared to tumor-infiltrating lymphocytes, they are better suited for therapeutic use due to their broader tumoricidal activity.
  • the tumoricidal cells T produced according to the method of the invention are T -Cells
  • Another distinguishing criterion between NK cells and tumoricidal T cells is that NK cells recognize the tumor cell line K-562 and destroy it cytotoxically, whereas tumoricidal T cells only inhibit the cell line K-562 for a limited time during growth
  • a time-limited inhibition in the sense of the invention is to be understood that the cells of the cell culture are not killed, but only inhibited in their proliferation, preferably completely inhibited in their proliferation. The inhibition of proliferation is reversible and can be reversed by separating the tumoricidal T cells and the cells of the cell line K-562.
  • a tumoricidal effect is not only to be understood as the killing (in particular lysis) of the tumor cell lines examined, but also an anti-proliferation effect.
  • This tumoricidal effect can e.g. are recognized by the cytotoxicity tests familiar to the person skilled in the art, e.g. the fact that the tumor cell lines, which are morphologically distinguishable from the tumor t-lymphocytes, disappear from the culture or at least remain in growth after prolonged cultivation with the tumor t-lymphocytes.
  • the tumoricidal T lymphocytes are preferably CD3 + and / or CD4 +.
  • Lymphocytes in the sense of the invention, are to be understood as preparations of white blood cells which can be obtained from whole blood, for example. Such methods are known to the person skilled in the art. For example, after a gradient centrifugation (Ficoll gradient), the fraction of mononuclear cells (PBMNC) containing the blood lymphocytes can be obtained.
  • PBMNCs obtained in this way have to be pretreated so that specifically tumoricidal T lymphocytes are formed.
  • the cells are pretreated using a lysosomotrophic substance, such as L-leucyl-leucine methyl ester or an analogous ester. Such substances are for example from PL.
  • the lysosomotrophic pretreatment maintains the fraction of surviving lymphocytes in which the progenitor cells are enriched with tumoricidal T-lymphocytes.
  • An anti-CD43 antibody is an antibody against the cell surface molecule CD43 (DeSmet, W. et al., In: Schlossman, SF, et al. [Eds.] Leukocyte Typing V, pp. 1706-1707, Oxford, United Kingdom: Oxford University Press, 1995).
  • CD43 is a sialoglycoprotein that is formed on cells of the hematopoietic system and - with the exception of dendritic cells and a subpopulation of B lymphocytes - is expressed on all cells of the immune system (Fukuda, M., Glycobiology 1 [1991], 347-356 ).
  • Such an antibody is preferably directed against the part of the CD43 molecule which is involved in the binding of CD43 to MHC class I molecules.
  • the antibody can be monoclonal or polyclonal and by immunization, synthesis or recombinant methods be made. Complete antibodies or antibody derivatives which mediate a characteristic binding can be used. However, an antibody or antibody derivative is preferably used which is capable of crosslinking CD43 molecules on cell surfaces in an analogous manner to an intact CD43 antibody.
  • one or more anti-CD2 antibodies are added to improve the yield of tumoricidal T lymphocytes, preferably a T cell stimulating pair (directed against two different epitopes of CD2) of anti-CD2 antibodies ( Schwarz, M., et al., J. Immunol. 154 (1995), 5813-5820; Moingeon, P., et al., Immunol. Rev. 111 (1989), 111-140).
  • the lymphocytes are cultured with the anti-CD43 antibody expediently in conventional culture media over several days (preferably 5-30 days).
  • the culture medium is preferably serum-free.
  • An autologous serum is very particularly preferably used for the cultivation if autologous tumoricidal T-lymphocytes are to be prepared.
  • the tumor tidal lymphocytes obtained in this way can, if necessary after cleaning, be administered to the patient as a therapeutic agent.
  • tumoral T-lymphocytes with a wide tumor activity can be obtained without HLA restriction.
  • a tumoricidal activity is understood to mean both a killing, in particular apoptosis-inducing and / or lysing, effect on the corresponding tumor cells and also a proliferation-inhibiting effect on these tumor cells.
  • Blood lymphocytes are preferably used as lymphocytes. However, it is also possible to use tumor infiltrating lymphocytes (TLL) as well as lymphocytes from spleen or lymph nodes. It is preferred to clean the lymphocyte preparation before use. When using blood lymphocytes, it is advisable to deplete the erythrocytes.
  • the fraction of the progenitor cells from tumoricidal T lymphocytes is enriched with the anti-CD43 antibody before cultivation.
  • monocytes, macrophages, NK cells, suppressor T cells and allogen-reactive, cytotoxic T cells and their precursor cells are eliminated lysosomotrophically, preferably according to Thiele and Lipsky (The Journal of Immunology, Vol. 136, No. 3 (1986) , Pp. 1038-1048), incubated with L-leucyl-L-leucine methyl ester.
  • lymphocytes preferably from the blood or from tumors of a donor.
  • lymphocytes according to known methods, e.g. isolated using a Ficoll density gradient centrifugation.
  • the lymphocytes left over after lysosomotrophic treatment are then cultured in a customary lymphocyte culture medium together with an anti-CD43 antibody.
  • the antibody concentration is between 1 ng / ml - 100 ⁇ g / ml, preferably 10 ⁇ g / ml culture medium.
  • Cultivation continues until the activation of tumoricidal T cells becomes apparent. This usually requires cultivation for around 8 days.
  • the cultivation according to the invention enables activation of tumoricidal T lymphocytes without growth or differentiation factors, such as e.g. Lymphokines, especially interleukin-2, must be added. This is of particular advantage for the therapeutic use of the tumoral T lymphocytes obtained, since such factors can trigger side effects in the therapeutic application.
  • human tumoricidal T-lymphocytes can be obtained without differentiation or growth factors, such as lymphokines, in particular interleukin-2, having to be added, which can lead to side effects during therapy.
  • Another object of the invention is therefore the use of the method according to the invention for the production of a therapeutic agent which is used in tumor therapy.
  • the tumoricidal T-lymphocytes produced according to the invention are washed according to methods familiar to the person skilled in the art (e.g. by centrifugation and resuspension of the pellet in physiological saline solution with repeated, e.g. triple repetition), if appropriate isolated and in a for suitable medium (e.g.
  • lymphocytes can also be activated in vivo by application of an anti-CD43 antibody to form tumoricidal T lymphocytes.
  • the antibody is taken up and applied in a medium suitable for the application, such as, for example, physiological saline.
  • the tumoricidal T lymphocytes can also be used for the elimination of tumor cells in a cell preparation ex vivo. It can preferably be used to isolate tumor cells from stem cell isolates (eg bone marrow stem cells) by culturing with tumoricidal T lymphocytes (purging). The stem cells cleaned in this way can be re-implanted in the patient after radiation or chemotherapy (autologous bone marrow transplantation).
  • stem cell isolates eg bone marrow stem cells
  • the stem cells cleaned in this way can be re-implanted in the patient after radiation or chemotherapy (autologous bone marrow transplantation).
  • Antibodies against the human CD43 molecule are described by DeSmet, W., et al. (In: Schlossman, S.F., et al. [Eds.] Leukocyte Typing V, pp. 1706-1707, Oxford, United Kingdom: Oxford University Press, 1995).
  • the anti-CD43 antibody designated as "6F5" is suitable.
  • an increase in the T-lymphocytes thus obtained is carried out.
  • the propagation is preferably carried out according to the method described in the international application PCT / EP97 / 01924.
  • the cell line HB 654 was deposited on March 24, 1993 with the German Collection for Cell Cultures and Microorganisms GmbH, Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig under the number DSM ACC 2122.
  • the cell line HB 617 was deposited on March 1st, 1994 with the German Collection for Cell Cultures and Microorganisms GmbH, Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig under the number DSM ACC 2166.
  • Mononuclear cells from the peripheral blood (PBMNC) of human donors are separated from the erythrocytes by gradient centrifugation (lymphocyte separation medium, Boehringer Manheim GmbH (BM)), washed twice with phosphate-buffered saline (Boehringer Mannheim GmbH (BM)) and at a density of approx 5 x 10 ⁇ cells / ml RPMI-1640 medium (Boehringer Mannheim GmbH (BM)) according to Thiele and Lipsky (The Journal of Immunology, Vol. 136, No. 3 (1986), pp. 1038-1048) at 250 ⁇ M leucyl-leucine methyl ester (Boehringer Mannheim GmbH (BM)) incubated for 20 minutes at room temperature.
  • BM peripheral blood
  • the surviving cells After washing twice with RPMI-1640 medium, the surviving cells at a density of approx. 2 x 10 ⁇ cells / ml in X-Vivo-20 medium (Bio-Whittacker), which the anti-CD43 antibody 6F5 in a Concentration of 10 ⁇ g / ml has been added, cultured at 37 ° C. in an 8% CO 2 atmosphere. On day 5 after the beginning of the culture, half of the medium is renewed and fresh anti-CD43 antibody 6F5 is added to a final concentration of 10 ⁇ g / ml. On day 10, after the culture has been set up, the cells are used for example 3.
  • the phenotyping of the cells on day 10 of the culture shows that> 95% of the cells are CD3 +. Cells with the CD 14 or CD 16 markers are not found.
  • lymphocytes are prepared from the blood of a human donor by gradient centrifugation and treatment with leucyl-leucine methyl ester.
  • the lymphocytes are suspended in Isove's modified DMEM (Gibco), to which 10% heat-inactivated (56 ° C / 30 minutes), autologous serum has been added, at a density of 1 x 10 ⁇ cells / ml and the anti-CD43 antibody 6F5 and the anti-CD2 antibodies TS2 / 18 and VIT13 (Schwarz, M., et al., J. Immunol. 154 (1995), 5813-5820) were added in a concentration of 10 ⁇ g / ml each. On day 5, half of the culture medium with the antibodies contained in it is renewed. The cell count on day 10 after the start of the culture showed that the lymphocytes had increased 2.2-fold.
  • the tumoricidal T-lymphocytes obtained according to Example 1 are added to cultures of human tumor lines (see Tables I and II). The tumoricidal effect on these tumor cells is monitored under the microscope. These different tumor cell lines are killed or their growth is inhibited with the tumoricidal T-lymphocytes according to the invention.
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Abstract

Ein Verfahren, bei dem Lymphozyten lysosomotroph vorbehandelt werden und eine Inkubation mit Anti-CD43-Antikörpern erfolgt, ist dazu geeignet, spezifisch tumorizide T-Lymphozyten herzustellen.

Description

Verfahren zur Herstellung von tumoriziden T-Lymphozyten
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Aktivierung, Herstellung und Vermehrung von tumoriziden T-Lymphozyten sowie eine Zusammensetzung, welche sich als Medium zur Herstellung, Aktivierung und Vermehrung von tumoriziden T-Lymphozyten eignet.
Für die Eliminierung von krankhaft veränderten körpereigenen Zellen wie z.B. virusinfizierten Zellen oder Tumorzellen spielt die zelluläre Immunabwehr eine bedeutende Rolle. Dabei erkennen zytotoxisch wirkende T-Lymphozyten die veränderten körpereigenen Zellen anhand von Oberflächenantigenen. Diese Oberflächenantigene sind in der Regel Proteinfragmente, die von den Zellen gebildet werden und an der Zelloberfläche gebunden an Oberflächenrezeptoren des sogenannten Major-Histocompatibility-Komplex (MHC) vorliegen (Zinkernagel et al., Nature 248 (1974), 701 - 702 und Babbit et al., Nature 317 (1985), 359 - 361). Wenn sich diese Oberflächenantigene der Tumorzellen jedoch nur sehr geringfügig von den entsprechenden Antigenen gesunder Zellen unterscheiden, bildet das Immunsystem unter Umständen keine zytotoxisch wirkenden T-Lymphozyten, welche die Tumorzellen eliminieren könnten, aus. Es wurden daher bereits Versuche unternommen, auch gegen solche Tumorzellen eine zelluläre Immunabwehr zu induzieren. Dazu wurde zunächst versucht, eine aktive Immunisierung mit unspezifischen Immunostimulantien wie dem Bacillus Calmette-Guerin (BCG), Corynebacterium parvum oder Vakzinen aus Tumorzellextrakten zu erreichen (Terry und Rosenberg eds., Immunotherapy of Human Cancer (1982), Elsevier North Holland). Bessere Ergebnisse wurden mit dem Konzept der sogenannten adoptiven Immuntherapie erreicht. Hierbei werden Lymphozyten des Patienten in vitro aktiviert und dann reimplantiert. In den meisten Fällen erfolgt die in vitro Aktivierung zu solchen "promiscous killer cells" (D. Thiele et al., Immunology Today 10 (1989), 375 - 381) durch Zugabe von Interleukin-2. Die erhaltenen zytotoxischen Lymphozyten werden dann als Lymphokin-aktivierte Killer-Zellen (LAK- Zellen) bezeichnet (Rosenberg, Immunology Today 9 (1988), 58 - 62). Im Gegensatz zu zytotoxischen T-Lymphozyten sind LAK-Zellen für ihre Wirkung gegen Tumorzellen nicht auf eine korrekte Expression der MHC-Gene zur Erkennung der Tumorantigene angewiesen, und im Gegensatz zu den Natural Killer Zellen des Immunsystems sind LAK-Zellen auch gegen frische Tumorzellen wirksam. Mit LAK-Zellen konnten auch bereits erste klinische Erfolge erzielt werden. Ein Nachteil dieser Form der adoptiven Immuntherapie sind jedoch Nebenwirkungen des über einen längeren Zeitraum in relativ hohen Dosierungen erforderli- chen Interleukins-2. Dadurch kommt es vor allem zu einer Erhöhung der Permeabilität der Kapillaren und einer dadurch bedingten Organdysfünktion (Rosenberg, Immunology Today 9 (1988), 58 - 62, Rosenstein et al., Journal Immunology 137 (1986), 1735 - 1742 und Etting- hausen et al., Surg. Forum 37 (1987), 388 - 389). Zudem werden bei der Stimulierung mit Interleukin-2 auch solche LAK-Zellen erhalten, welche gegen gesunde körpereigene Zellen gerichtet sind (B. Chen et al., Cell. Immunol. 118 (1989), 458 - 469).
Auf der Suche nach effektiveren Verfahren zur adoptiven Immuntherapie wurden die zu aktivierenden Lymphozyten auch in Gegenwart von autologen Tumorzellen kultiviert (mixed lymphocyte tumor cultures, G. Fossati et al., International Journal of Cancer 42 (1988), 239 - 245; G. Degiovanni et al., Eur. J. Immunol. 18 (1988), 671 - 676; Wölfel et al., J. Exp. Med. 170 (1989), 797 - 810; Darrow et al., J. Immunol. 142 (1989), 3329 - 3335 und Notter et al., Int. J. Cancer 45 (1990), 834 - 841). Daneben wurde auch ein Verfahren zur Vermehrung von tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TLL) in vitro beschrieben (Yron et al., J. Immunol. 125 (1980), 238 - 245). Im Gegensatz zu LAK-Zellen, die aus peripheren Blutzellen gewonnen werden können, muß zur Gewinnung von Tumor-infiltrierenden Lymphozyten dem Patienten Tumorgewebe entnommen werden. Dies grenzt ihre therapeutische Anwendbarkeit deutlich ein.
In der WO 94/23014 sind tumorizide T-Lymphozyten sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung beschrieben. Danach werden tumorizideT-Lymphozyten durch Co-Kultivierung von Lymphozyten mit einer Säugerzellinie bestimmter Eigenschaften hergestellt.
Aus Mentzer et al., J. Exp. Medicine 165 (1987) 1383 - 1392 ist bekannt, daß ein Sialoglyco- protein an der Zelloberfläche (später als CD43 bezeichnet) bei der Proliferation von T-Lymphozyten eine Rolle spielt. Der von Mentzer beschriebene Antikörper stimuliert T-Lymphozyten jedoch nur in Gegenwart von Monozyten.
Vargas-Cortes et al., beschreibt in Scand. J. Immunol. 27 (1988) 661 - 671 die Stimulierung von peripheren Blutlymphozyten (PBL) mit Anti-CD43 -Antikörpern. Bei dem beschriebenen Verfahren wird eine spontane Cytotoxizität von humanen PBLs potenziert, wobei der Effekt im wesentlichen auf die NK-Zellen gerichtet ist und die Cytotoxizität der Zellen gegenüber der Tumorzellinie K562 erhöht wird.
Aufgabe der Erfindung war es, ein verbessertes und vereinfachtes Verfahren zur spezifischen Herstellung von spezifisch tumoriziden T-Lymphozyten zur Verfügung zu stellen, wobei die Stimulierung und Proliferation von anderen T-Lymphozyten, und insbesondere von NK- Zellen, vermieden wird
Diese Aufgabe wird gelost durch ein Verfahren zur spezifischen Herstellung von tumoriziden T-Lymphozyten, welche Zellen einer chronischen myelogenen Leukamiezellinie (K-562, ATCC CCL 243) nicht cytotoxisch zerstören, sondern lediglich im Wachstum zeitlich begrenzt inhibieren, durch Kultivierung von Lymphozyten, welche lysosomotroph vorbehandelt werden, mit Anti-CD43 -Antikörpern und Isolierung der tumoriziden T-Lymphozyten.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß es nicht, wie in der WO 94/23014 beschrieben, erforderlich ist, weiße Blutzellen (Lymphozyten) mit einer Saugerzellinie zu co-kultivieren, sondern daß es überraschenderweise gelingt, spezifisch tumorizide T-Lymphozyten zu erhalten, wenn lysosomotroph vorbehandelte Lymphozyten mit einem Anti-CD43 -Antikörper kultiviert und inkubiert werden
Tumorizide T-Lymphozyten, im Sinne der Erfindung, sind T-Zellen, wie sie in der WO94/23014 beschrieben sind und welche auf antigenunspezifische Weise Tumorzellen erkennen und über Apoptose-Induktion und/oder Zytolyse abtoten Tumorizide T-Lymphozyten sind dadurch gekennzeichnet, daß
a) sie auf die Tumorzellinien MOLT-4, Jurkat, THP-1, HL-60, Heia, K-562, Malme- 3M und/oder Y79 eine tumorizide Wirkung ausüben und
b) im Kulturuberstand dieser tumoriziden T-Lymphozyten wahrend der Proliferation dieser Zellen in Gegenwart der Zellinie HB 654 oder HB 617 bei einer Nachweisgrenze von 0,5 IU/ml kein Interleukin-2 nachweisbar ist
Tumorizide Killer-T-Zellen sind keine Natural Killer (NK)-Lymphozyten Gegenüber tumorinfiltrierenden Lymphozyten sind sie auf Grund ihrer breiteren tumoriziden Aktivität besser für einen therapeutischen Einsatz geeignet Im Gegensatz zu Natural Killer-Zellen, sind die nach dem erfindungsgemaßen Verfahren hergestellten tumoriziden Zellen T-Zellen Ein weiteres Unterscheidungskriterium zwischen NK-Zellen und tumoriziden T-Zellen ist, daß NK-Zellen die Tumorzellinie K-562 erkennen und cytotoxisch zerstören, wahrend tumorizide T-Zellen die Zellinie K-562 lediglich im Wachstum zeitlich begrenzt inhibieren Unter einer zeitlich begrenzten Inhibition im Sinne der Erfindung ist zu verstehen, daß die Zellen der Zellkultur nicht abgetötet werden sondern lediglich in ihrer Proliferation gehemmt, vorzugsweise vollständig in ihrer Proliferation inhibiert werden. Die Proliferationshemmung ist reversibel und kann durch Trennung der tumoriziden T-Zellen und der Zellen der Zellinie K- 562 wieder aufgehoben werden.
Unter einer tumoriziden Wirkung ist dabei nicht nur die Abtötung (insbesondere Lyse) der untersuchten Tumorzellinien zu verstehen, sondern auch eine proliferationshemmende Wirkung. Diese tumorizide Wirkung kann z.B. über die dem Fachmann geläufigen Zytotoxizi- tätstests erkannt werden, z.B. daran, daß die morphologisch von den tumoriziden T-Lymphozyten unterscheidbaren Tumorzellinien aus der Kultur verschwinden oder zumindest bei längerer Kultivierung mit den tumoriziden T-Lymphozyten im Wachstum zurück bleiben. Die tumoriziden T-Lymphozyten sind vorzugsweise CD3+ und/oder CD4+.
Unter Lymphozyten, im Sinne der Erfindung, sind Präparationen von weißen Blutzellen zu verstehen, welche beispielsweise aus Vollblut erhalten werden können. Derartige Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise kann nach einer Gradientenzentrifugation (Ficoll- Gradient) die Fraktion von mononukleären Zellen (PBMNC) erhalten werden, in der die Blut-Lymphozyten enthalten sind. Die so erhaltenen PBMNC müssen vorbehandelt werden, damit spezifisch tumorizide T-Lymphozyten entstehen. Die Vorbehandlung der Zellen erfolgt durch eine lysosomotrophe Substanz, wie L-Leucyl-Leucinmethylester oder einem analogen Ester. Solche Substanzen sind beispielsweise von PL. Triozzi et al., Immunopharmacology 28 (1994) 39 - 45; C.S. Rosenfeld, Stemcells, Dayt 12 (1994) 198 - 204; N. Seo, Cancer Immunol. Immunother. 38 (1994) 277 - 280 beschrieben. Durch die lysosomotrophe Vorbehandlung wird die Fraktion der überlebenden Lymphozyten erhalten, in der die Vorläuferzellen von tumoriziden T-Lymphozyten angereichert sind.
Unter einem Anti-CD43 -Antikörper ist ein Antikörper gegen das Zelloberflächenmolekül CD43 zu verstehen (DeSmet, W. et al., In: Schlossman, S.F., et al. [Eds.] Leukocyte Typing V, pp. 1706 - 1707, Oxford, United Kingdom: Oxford University Press, 1995). CD43 ist ein Sialoglycoprotein, das auf Zellen des hämatopoetischen Systems ausgebildet wird und - mit Ausnahme von dendritischen Zellen und einer Subpopulation von B-Lymphozyten - auf allen Zellen des Immunsystems exprimiert wird (Fukuda, M., Glycobiology 1[1991], 347 - 356). Ein solcher Antikörper ist vorzugsweise gegen den Teil des CD43 -Moleküls gerichtet, der an der Bindung von CD43 an MHC-Klasse-I-Moleküle beteiligt ist. Der Antikörper kann mono- klonal oder polyklonal sein und durch Immunisierung, Synthese oder rekombinante Methoden hergestellt sein. Es können vollständige Antikörper oder Antikörperderivate, welche eine charakteristische Bindung vermitteln, verwendet werden. Vorzugsweise wird jedoch ein Antikörper oder Antikörperderivat verwendet, welches in analoger Weise wie ein intakter CD43- Antikörper in der Lage ist, CD43 -Moleküle auf Zeil Oberflächen zu vernetzen.
Es hat sich gezeigt, daß an der Differenzierung von Vorläuferzellen (CD3 -positive, Leucyl- Leucinmethylester-resistente Lymphozyten) zu tumoriziden T-Lymphozyten eine Co- Stimulierung über die Oberflächenmarker CD43 (Bindung an MHC-I auf der Stimulator- zelle) und CD2 (Bindung an CD58 auf der Stimulatorzelle) beteiligt ist. Es hat sich gezeigt, daß die in der WO94/23014 beschriebene Säugerzellinie, welche bei einer Co-Kultivierung mit Lymphozyten zur Herstellung von tumoriziden T-Lymphozyten führt, offensichtlich über die genannten Oberflächenmarker eine Differenzierung der Vorläuferzellen bewirkt. Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß ein Anti-CD43 -Antikörper allein in der Lage ist, einen analogen Effekt zu erreichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden zur Verbesserung der Ausbeute an tumoriziden T-Lymphozyten ein oder mehrere Anti-CD2-Antikörper zugesetzt, und zwar vorzugsweise ein T-Zell-stimulierendes Paar (gegen zwei verschiedene Epitope von CD2 gerichtete) von Anti- CD2-Antikörpern (Schwarz, M., et al., J. Immunol. 154 (1995), 5813 - 5820; Moingeon, P., et al., Immunol. Rev. 111 (1989), 111 - 140).
Die Kultivierung der Lymphozyten mit dem Anti-CD43 -Antikörper erfolgt zweckmäßig in üblichen Kulturmedien über mehrere Tage (vorzugsweise 5 - 30 Tage). Das Kulturmedium ist vorzugsweise serumfrei. Ganz besonders bevorzugt wird ein autologes Serum zur Kultivierung verwendet, wenn autologe tumorizide T-Lymphozyten präpariert werden sollen.
Die so erhaltenen tumoriziden T-Lymphozyten können, ggf. nach Reinigung, dem Patienten als Therapeutikum appliziert werden.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß durch Kultivierung mit Anti-CD43 -Antikörpern aus Lymphozyten spezifisch tumorizide T-Lymphozyten mit einer breiten tumoriziden Aktivität ohne HLA-Restriktion gewonnen werden können. Unter einer tumoriziden Aktivität ist dabei sowohl eine abtötende, insbesondere Apoptose-induzierende und/oder lysierende Wirkung auf die entsprechenden Tumorzellen sowie auch eine proliferationshemmende Wirkung auf diese Tumorzellen zu verstehen. Als Lymphozyten werden vorzugsweise Blutlymphozyten verwendet. Es ist jedoch auch möglich, tumorinfiltrierende Lymphozyten (TLL) sowie Lymphozyten aus Milz oder Lymphknoten zu verwenden. Dabei ist es bevorzugt, die Lyphozytenpräparation vor Anwendung zu reinigen. Bei Verwendung von Blutlymphozyten ist es zweckmäßig, die Erythrozyten abzurei- chern. Die Fraktion der Vorläuferzellen von tumoriziden T-Lymphozyten wird vor Kultivierung mit dem Anti-CD43 -Antikörper angereichert. Dazu werden Monozyten, Makrophagen, NK-Zellen, Suppressor-T-Zellen und allogenreaktive, zytotoxische T-Zellen sowie deren Vorläuferzellen lysosomotroph eliminiert, vorzugsweise wird gemäß Thiele und Lipsky (The Journal of Immunology, Vol. 136, Nr. 3 (1986), S. 1038 - 1048), mit L-Leucyl- L-Leucinmethylester inkubiert.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden zunächst, vorzugsweise aus dem Blut oder aus Tumoren eines Spenders, Lymphozyten nach bekannten Verfahren, z.B. über eine Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation, isoliert. Anschließend werden die nach lysosomotropher Behandlung übrig behaltenen Lymphozyten in üblichem Lymphozytenkul- turmedium zusammen mit einem Anti-CD43 -Antikörper kultiviert. Die Antikörper-Konzentration beträgt zwischen 1 ng/ml - 100 μg/ml, vorzugsweise 10 μg/ml Kulturmedium. Die Kultivierung wird fortgesetzt, bis die Aktivierung von tumoriziden T-Zellen erkennbar wird. Hierfür ist in der Regel eine Kultivierung für etwa 8 Tage erforderlich. Durch die erfindungsgemäße Kultivierung wird eine Aktivierung von tumoriziden T-Lymphozyten erreicht, ohne daß Wachstums- oder Differenzierungsfaktoren, wie z.B. Lymphokine, insbesondere Inter- leukin-2, zugegeben werden müssen. Dies ist für eine therapeutische Verwendung der erhaltenen tumoriziden T-Lymphozyten von besonderem Vorteil, da derartige Faktoren Nebenwirkungen bei der therapeutischen Anwendung auslösen können.
Wie bereits ausgeführt, sind unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens humane tumorizide T-Lymphozyten erhältlich, ohne daß Differenzierungs- oder Wachstumsfaktoren, wie z.B. Lymphokine, insbesondere Interleukin-2, zugesetzt werden müssen, die bei einer Therapie zu Nebenwirkungen führen können. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung eines Therapeutikums, das Anwendung in der Tumortherapie findet. Für eine solche therapeutische Verwendung werden die erfindungsgemäß hergestellten tumoriziden T-Lymphozyten gemäß dem Fachmann geläufigen Verfahren gewaschen (z. B. durch Zentrifugation und Resuspension des Pellets in physiologischer Kochsalzlösung bei mehrfacher, z. B. dreifacher Wiederholung), gegebenenfalls isoliert und in ein für die Applikation geeignetes Medium (z.B. physiologische Kochsalzlösung) aufgenommen. Neben dieser ex vivo-Aktivierung von Lymphozyten zu tumoriziden T-Lymphozyten können Lymphozyten auch in vivo durch Applikation eines Anti-CD43 -Antikörpers zu tumoriziden T- Lymphozyten aktiviert werden. Für eine solche therapeutische Verwendung wird der Antikörper in einem für die Applikation geeigneten Medium wie z.B. physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen und appliziert.
Die tumoriziden T-Lymphozyten können ebenfalls zur Elimination von Tumorzellen in einer Zellpräparation ex vivo eingesetzt werden. Vorzugsweise können damit aus Stammzell- isola- ten (z. B. Knochenmarkstammzellen) Tumorzellen durch Kultivierung mit tumoriziden T- Lymphozyten eliminiert werden (purging). Die so gereinigten Stammzellen können beispielsweise nach einer Strahlen- oder Chemotherapie dem Patienten wieder implantiert werden (autologe Knochen- markstransplantation).
Antikörper gegen das humane CD43 -Molekül sind von DeSmet, W., et al. (In: Schlossman, S.F., et al. [Eds.] Leukocyte Typing V, pp. 1706 - 1707,, Oxford, United Kingdom: Oxford University Press, 1995) beschrieben. Für das erfindungsgemäße Verfahren ist z.B. der als "6F5" bezeichnete Anti-CD43- Antikörper geeignet.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird nach der Kultivierung der Lymphozyten mit dem Anti-CD43 -Antikörper eine Vermehrung der so erhaltenen tumoriziden T-Lymphozyten durchgeführt. Die Vermehrung erfolgt vorzugsweise nach dem Verfahren, das in der internationalen Anmeldung PCT/EP97/01924 beschrieben ist.
Die Zellinie HB 654 wurde am 24.03.1993 bei der Deutschen Sammlung für Zellkulturen und Mikroorganismen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig unter der Nummer DSM ACC 2122 hinterlegt.
Die Zellinie HB 617 wurde am 01.03.94 bei der Deutschen Sammlung für Zellkulturen und Mikroorganismen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig unter der Nummer DSM ACC 2166 hinterlegt.
Die folgenden Beispiele, Publikationen und die Tabellen erläutern die Erfindung, deren Schutzumfang sich aus den Patentansprüchen ergibt, weiter. Die beschriebenen Verfahren sind als Beispiele zu verstehen, die auch noch nach Modifikationen den Gegenstand der Erfindung beschreiben. Die in den Beispielen genannten Antikörper sind in den internationalen Leucocyte Typing Workshops charakterisiert worden. Anstelle der genannten Antikörper können Antikörper mit analoger Bindungsspezifität verwendet werden.
Beispiel 1
Kultivierung von Lymphozyten mit Anti-CD43- Antikörper
Mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut (PBMNC) menschlicher Spender werden mittels Gradientenzentrifugation (Lymphozytentrennmedium, Boehringer Manheim GmbH (BM)) von den Erythrozyten abgetrennt, zweimal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (Boehringer Mannheim GmbH (BM)) gewaschen und in einer Dichte von ca. 5 x 10^ Zellen/ml RPMI- 1640-Medium (Boehringer Mannheim GmbH (BM)) nach Thiele und Lipsky (The Journal of Immunology, Vol. 136, Nr. 3 (1986), S. 1038 - 1048) mit 250 μM Leucyl-Leucinmethylester (Boehringer Mannheim GmbH (BM)) über 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit RPMI-1640-Medium werden die überlebenden Zellen in einer Dichte von ca. 2 x 10^ Zellen/ml in X-Vivo-20-Medium (Bio-Whittacker), dem der Anti- CD43-Antikörper 6F5 in einer Konzentration von 10 μg/ml zugesetzt worden ist, bei 37°C in 8 % CO^-Atmosphäre kultiviert. Am Tag 5 nach Beginn der Kultur wird die Hälfte des Mediums erneuert und frischer Anti-CD43 -Antikörper 6F5 bis zu einer Endkonzentration von 10 μg/ml zugesetzt. Am Tag 10, nach Anlage der Kultur, werden die Zellen für das Beispiel 3 verwendet.
Die Phänotypisierung der Zellen am Tag 10 der Kultur ergibt, daß >95 % der Zellen CD3+ sind. Zellen mit den Markern CD 14 oder CD 16 werden nicht gefunden.
Beispiel 2
Kultivierung von Lymphozyten mit Anti-CD43- und Anti-CD2-Antikörpern
Wie in Beispiel 1 beschrieben, werden Lymphozyten aus dem Blut eines menschlichen Spenders durch Gradientenzentrifugation und Behandlung mit Leucyl-Leucinmethylester präpariert. Die Lymphozyten werden in Iscoves modifiziertem DMEM (Gibco), dem 10 % hitzeinaktiviertes (56°C/30 Minuten), autologes Serum zugesetzt wurde, in einer Dichte von 1 x 10^ Zellen/ml suspendiert und der Anti-CD43 -Antikörper 6F5 sowie die Anti-CD2- Antikörper TS2/18 und VIT13 (Schwarz, M., et al., J. Immunol. 154 (1995), 5813 - 5820) in einer Konzentration von jeweils 10 μg/ml zugesetzt. Am Tag 5 wird die Hälfte des Kulturmediums mit den darin enthaltenen Antikörpern erneuert. Die Zellzählung am Tag 10 nach Beginn der Kultur ergab, daß sich die Lymphozyten um das 2,2-fache vermehrt haben.
Beispiel 3
Wirkung tumorizider T-Lymphozyten
Die gemäß Beispiel 1 erhaltenen tumoriziden T-Lymphozyten werden zu Kulturen von humanen Tumorlinien (s. Tabellen I und II) gegeben. Die tumorizide Wirkung auf diese Tumorzellen wird unter dem Mikroskop verfolgt. Mit den erfindungsgemäßen tumoriziden T-Lymphozyten werden diese verschiedenen Tumorzellinien abgetötet oder in ihrem Wachstum gehemmt.
Tabelle I
Figure imgf000011_0001
1) Effektor-/Tumorzell- Verhältnis
2) Mikroskopische Auswertung nach 48 Stunden
3) nach 14-tägiger Kultur
4) Wachstums-Inhibition
5) ca. 4 Kolonien pro 5 x 104 THP-1 Zellen
6) ca. 15 Kolonien pro 5 x 104 HL-60 Zellen
7) 6 Kolonien pro 2.5 x 104 HELA-Zellen
8) Aufhebung der Wachstums-Inhibitoren nach 3 Tagen Tabelle II
Figure imgf000012_0001
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ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
FÜR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN
INTERNATIONALES FORMBLATT
Boehringer Mannheim GmbH Sandhofer Strasse 116 D-6800 Mannheim
EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG, ausgestellt gemäß Regel 7 1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
I KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER
HB 654 DSM ACC2122
II WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG
Mit dem unter I bezeichneten Mikroorganismus wurde
( ) eine wissenschaftliche Beschreibung
( ) eine vorgeschlagene taxonoπusche Bezeichnung eingereicht (Zutreffendes ankreuzen)
III EINGANG UND ANNAHME
Diese internationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter I bezeichneten Mikroorganismus an, der bei ihr am 1993 - 03 — 24 (Datum der Ersthinterlegung) eingegangen ist
IV EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG
Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Internationalen Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Enthinterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Enthinterlegung in eine Hinterlegung gemäß
Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung)
V INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name DSM-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterachnft(en) der zur Vertretung der internationalen
MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH Hinterlegungsstelle befugten Perβon(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten
Adresse Mascheroder Weg 1 B D-3300 Braunschweig
Datum 1993-04-13
Falls Regel 6 4 Buchstabe d zutrifft, ist dies der Zeitpunkt, zu dem der Status einer internationalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist Formblatt DSM-BP/4 (einzige Seite) 0291 BUDAPESTER VERTRAG OBER DIE INTERNATIO; ,E
AB ERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
FÜR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN
INTERNATIONALES FORMBLATT
Boehringer Mannheim GmbH
Sandhof er Str. 116 68305 Mannheim
EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG, ausgestellt gemäß Regel 7.1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
I. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen: Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER: HB617
DSM ACC2166
II. WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG
Mit dem unter I. bezeichneten Mikroorganismus wurde
( ) eine wissenschaftliche Beschreibung
( ) eine vorgeschlagene taxonomische Bezeichnung eingereicht. (Zutreffendes ankreuzen).
III. EINGANG UND ANNAHME
Diese internationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter I bezeichneten Mikroorganismus an, der bei ihr am 1994 - 03 — 01 (Datum der Enthinterlegung) 1 eingegangen ist.
IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG
Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Internationalen Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Enthinterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Enthinterlegung in eine Hinterlegung gemäß Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung).
V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name: DSM-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Untenchrift(en) der zur Vertretung der internationalen MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH Hinterlegungsstelle befugten Penon(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten:
Anschrift: Mascheroder Weg lb
D-38124 Braunschweig
^ Datum: 1994-03-11
Falls Regel 6.4 Buchstabe d zutrifft, ist dies der Zeitpunkt, zu dem der Status einer internationalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist. Formblatt DSM-BP/4 (einzige Seite) 12/93

Claims

Patentansprüche
Verfahren zur spezifischen Herstellung von tumoriziden T-Lymphozyten, welche Zellen einer chronischen myelogenen Leukamiezelle K562, (ATCC CCL 243) nicht cytotoxisch zerstören, sondern lediglich im Wachstum zeitlich begrenzt inhibieren, durch Kultivierung von Lymphozyten, welche lysosomotroph vorbehandelt werden, mit Anti-CD43- Antikorpern und Isolierung der tumoriziden T-Lymphozyten
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere Anti-CD2- Antikorper zugesetzt werden
Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Kultivierung ein autologes Serum zugesetzt wird
Verfahren nach den Ansprüchen 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, daß die lysosomotrophe Vorbehandlung mit L-Leucyl-Leucinmethylester erfolgt
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