DE60033955T2

DE60033955T2 - Melanoma-impfstoff und seine herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE60033955T2
Application number: DE60033955T
Authority: DE
Inventors: Marc K. New York WALLACK; Muthukumaran S. Ozone Park SIVANANDHAM
Original assignee: St Vincent's Hospital and Medical Center of New York
Current assignee: St Vincent's Hospital and Medical Center of New York
Priority date: 1999-10-18
Filing date: 2000-10-18
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2020-10-19
Also published as: JP2003512335A; CA2387855A1; ATE356632T1; IL149184A0; AU1214001A; HK1049114A1; EP1227838A2; EP1227838B1; AU779325B2; DE60033955D1; IL189615A0

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung– betrifft allgemein ein verbessertes therapeutisches Vakzin, das zur Behandlung und Vorbeugung eines Krebses verwendbar ist. Offenbart ist ein Krebsvakzin und Verfahren zur Herstellung und Verwendung eines solches Vakzins in einem mit einem Krebs diagnostizierten Wirt. Das erfindungsgemäß verwendete Vakzin umfasst ein neues Verabreichungsschema und Inhaltsstoffe wie z.B. rekombinantes IL-2, das für das Vaccinia-Virus kodiert, sowie autologe dendritische/Monozyten-Zellen, die mit Melanom-Antigenen, die von krebsartigen Melanomzelllinien abstammen, die wenigstens zwei HLA-Klasse 1-Antigene exprimieren, gepulst wurden.
Hintergrund der Erfindung
Das Vorkommen von malignem Melanom nahm während der letzten Jahrzehnte in alarmierender Weise zu, und es gibt Anzeichen, dass das Vorkommen dieser tödlichen Krankheit in der Zukunft weiter ansteigen wird. Da ein Melanom dafür bekannt ist, gegenüber einer konventionellen Chemotherapie oder Strahlentherapie unempfänglich zu sein, wurden mehrere alternative Behandlungsansätze zur Behandlung dieser Vielzahl von Hautkrebs verwendet. Eine Immuntherapie wird im Wesentlichen als nützlich für ein Melanom angesehen, da ein Melanom bestimmte immunologische Eigenschaften aufweist, wie z.B. eine spontane Regression, Infiltration von Lymphozyten innerhalb der Tumormasse, eine In-vitro-Demonstration von Antimelanomspezifischen zellulären Antworten und das Auftreten einer Reaktivität gegenüber Immunmodulatoren wie Interleukin und Interferone (Mukherij B. und Chakraborty NG., Immunobiology and immunotherapy of melanoma. Curr. Opin. Oncol. 7:175-184, 1995). Beispielsweise könnte die Immunisierung eines Patienten mit einem Melanom mit dessen eigenen Melanom-Antigenen, die als ein Vakzin hergestellt wurden, eine Antitumor-Immunreaktion induzieren und könnte einen solchen Patienten von der Krankheit heilen.
Die Beschreibung eines solchen Vakzins kann in dem U.S.-Patent Nr. 4,108,983 von Wallack entnommen werden. Dieses Patent beschreibt Melanom-Vakzin der ersten Generation, Vaccinia Melanoma Oncolysate (VMO), das von Melanomzellen abstammt, die von einem Vaccinia-Virus lysiert worden sind (US-Patent Nr. 4,108,983). Dieses Vakzin und modifizierte Versionen davon wurden in mehreren klinischen Studien getestet. Obwohl eine klinische Verbesserung in mehreren Patientengruppen beobachtet wurde, insbesondere bei jungen männlichen Patienten mit einem Stadium III (AJCC)-Melanom, erzeugte das Vakzin keinen signifikanten Vorteil für Melanom-Patienten bei Tests gegenüber einer operativen Adjuvanztherapie in kürzlich beendeten klinischen Phase-III-Studien (Wallack MK, Sivanandham M, et al., Favorable clinical responses in subsets of patients from a randomized, multiinstitutional melanoma vaccine trial, Ann. Surg. Oncol. 3(2):1-8, 1996: Wallack MK, multiinstitutional trial of vaccinia melanoma oncolysate-active specific immunotherapy for patients with stage II melanoma. Cancer 75:34-42, 1995).
US-Patent Nrn. 5,635,188 und 5,030,621, beide von Bystryn, offenbaren ein Vakzin, das aus Zelloberflächen-Antigenen von Melanomzellen hergestellt wurde, die in dem Kulturmedium gezogen und dann als Antimelanom-Vakzin verwendet wurden.
In gleicher Weise offenbart US-Patent-Nr. 5,484,596 von Hanna, Jr. et al. ein Verfahren zur Krebstherapie, bestehend aus der Herstellung bestrahlter Tumorzellen und der Injektion derselben als Vakzin in einen menschlichen Patienten.
Obwohl solche immuntherapeutischen Studien mit diesen Vakzinen ermutigende Ergebnisse in einigen Patienten zeigen konnten, z.B. eine partielle Regression des Melanoms, eine Verzögerung beim Auftreten eines rückläufigen Melanoms und einen Anstieg des Gesamt-Überlebens im Vergleich zur Standardtherapie oder Operation, war keines dieser Verfahren bis jetzt insgesamt zufriedenstellend.
Während der letzten beiden Jahrzehnte wurden mehrere neue immunmodulatorische Zytokine entdeckt, und diese Zytokine wurden hinsichtlich ihrer therapeutischen Vorteile in Patienten mit Krebs intensiv untersucht. Das am besten untersuchte Zytokin ist Interleukin-2 (IL-2), das einen Vorteil bei der Verstärkung der Immunität gegen Melanom gezeigt hat. Der Vorteil einer IL-2-Therapie besteht vermutlich in der Stimulation von T-Zellen, von denen einige für Tumorzellen toxisch werden können.
Im Allgemeinen werden immunmodulatorische Zytokine, wie IL-2, entweder als Bolus-Injektion oder als kontinuierliche Niedrigdosis-Infusion verabreicht (Lotze MT et al., High dose recombinant interleukin-2 in the treatment of patients with disseminated cancers, JAMA 256(22):3117-3124, 1986; West WH et al., Constant infusion of recombinant IL-2 in adoptive immunotherapy of advanced cancers, New Engl. J. Med 316(15):898-905, 1987). Im Allgemeinen erzeugt jedoch eine Bolus-Injektion mit einer hohen Dosis von Zytokinen eine beträchtliche Toxizität, während eine kontinuierliche Niedrigdosis-Infusion unangenehm ist. Ein konstanterer, ähnlich dem durch eine kontinuierliche Infusion von Zytokin erzeugten Spiegel von Zytokin in vivo, kann erreicht werden, indem rekombinante Viren oder Bakterien verwendet werden, die darauf ausgelegt sind, Zytokine in vivo zu produzieren.
Die Verwendung von rekombinanten Vektoren zur Einleitung der Herstellung von Zytokinen in vivo fällt unter die Definition einer Gentherapie. Einige ermutigende Ergebnisse wurden unter Verwendung solcher Vektoren beobachtet. Zum Beispiel erschien die Verwendung des IL-2-Gens in einem rekombinanten Vaccinia-Virus (rVV) die Tumorbelastung in einem Maus-Melanom-Modell zu verringern (Sivanandham M, Scoggin SD, Sperry RG, Wallack MK, Prospects for gene therapy and lymphokine therapy for metastatic melanoma. Ann. Plast. Surg. 28(I):114-118,1992). Im Gegensatz dazu haben spätere Studien nahe gelegt, dass rekombinantes Vaccinia mit IL-2 keine Wirkung zeigte. Zum Beispiel beschreiben Quin et al. ein Vakzin, das eine Wirkung mit GM-CSF-exprimierendem rVV haben soll, jedoch nicht mit IL-2 exprimierendem rVV (Qin H, Chatterjee SK. Cancer gene therapy using tumor cells infected with recombinant vaccinia virus expressing GM-CSF, Hum. Gene Ther. 7(15):1853-60, 1996). Ähnlich enttäuschende Ergebnisse mit rVV, das für IL-2 kodiert, wurden von Shrayer et al. in ihrem Melanom-Modell beobachtet (Shrayer DP, Bogaars H, Hearing VJ, Wanebo HJ, Immunization of mice with irradiated melanoma tumor cells transfected to secrete lymphokines and couples with IL-2 or GM-CSF therapy, J. Exp. Ther. Oncol., 1(2):126-33, 1996).
Daher ist der Erfolg von rekombinantem IL-2 in Gentherapie-Strategien unvorhersehbar. Anfängliche Berichte haben objektive Antwortraten mit einer Einzelagenzl-rIL-2-Therapie im Bereich von 15% bis 20% gezeigt; jedoch waren die Gesamt-Antwortraten in der Klinik viel geringer als ursprünglich erwartet. Ferner scheint es, dass die gleichzeitige Verabreichung von Lymphokin-aktivierten Killer (LAK)-Zellen, welche ex vivo mit rIL-2 erzeugt wurden, keine Erhöhung der mit rIL-2 alleine erreichten Antwortraten bewirkt.
Zum Beispiel offenbaren US-Patent-Nrn. 4,863,727 und 5,425,940, beide von Zimmerman et al., eine Verstärkung der Anti-Melonam-Aktivität in Säugetieren durch Verabreichung einer wirksamen Menge von IL-2- und Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), oder TNF und Interferon (IFN)-Beta, oder IL-2, TNF, und IFN-Beta-Kombinationen. Diese Zusammensetzungen wurden auch zur Behandlung von anderen Krebsarten wie Leukämie, Lymphom, Mastozytom, Brustdrüsen-Adenokarzinom und pharyngeales Plattenepithelzellkarzinom als nützlich erachtet.
US-Patent-Nr. 5,066,489 von Paradise et al. offenbart die Behandlung eines malignen Melanoms durch Kombinieren von IL-2 mit chemotherapeutischen Agenzien.
Rosenberg et al. beschreiben eine Kombination von IL-2 mit Tumor-infiltrierenden Lymphozyten als Mittel zur Anwendung einer Immuntherapie an Patienten mit einem metastatischen Melanom (Rosenberg et al., Use of tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin-2 in the immunotherapy of patients with metastatic melanoma, New Engl. J. Med. 319:1676-1680.1988).
In gleicher Weise beschrieben Dutcher et al. die Kombination von IL-2 mit IL-2-aktivierten Killerzellen als Behandlungsoption für metastatisches Melanom (Dutcher et al., A Phase II study of high-dose continuous infusion interleukin-2 with lymphokine-activated killer cells in patients with metastatic melanoma, J. Clin. Oncol. 9(4):641-648, 1991).
Aufgrund der breiten Aktivierungsnatur von T-Zellen ist die durch IL-2 erzeugte Antitumorantwort nicht sehr spezifisch. Aus diesem Grund hat sich eine auf IL-2 basierende Therapie als nicht sehr wirksam herausgestellt. Ferner scheinen die für diese IL-2-Behandlungsverfahren erforderlichen IL-2-Dosen für die behandelten Patienten toxisch zu sein (Siegel et al., Interleukin-2 toxicity, J. Clin. Oncology, 9:694-704, 1991). Basierend auf diesen Beobachtungen wird angenommen, dass eine spezifischere Immunantwort durch Kombination von IL-2 mit tumorspezifischen Antigenen erreicht werden kann.
US-Patent Nr. 5,290,551 von Berd offenbart die Behandlung eines Melanoms mit einem Vakzin, das bestrahlte autologe Melanom-Tumorzellen umfasst, die an ein Hapten konjugiert sind, sowie Kombinationen des Vakzins mit IL-2.
US-Patent Nr. 5,478,556 von Elliott et al. offenbart die Impfung von Krebspatienten unter Verwendung von Tumor-assoziierten Antigenen, die mit IL-2 und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) gemischt wurden.
Die Wichtigkeit von Antigen-präsentierenden (APC) oder Helferzellen bei der Induktion einer spezifischen zellulären Immunantwort wurde lange Zeit postuliert. Unter vielen Arten von Helferzellen befinden sich dendritische Zellen (DC), die von verschiedenen Zelllinien abstammen, wie z.B. Knochenmarkzelllinien, Makrophagen und Lymphozyten. Die DC stimulieren zytotoxische und Helfer-T-Zellen durch Expression von hohen Spiegeln an HLA-Klasse 1- und Klasse 2- Antigenen und die co-stimulatorischen T-Zell-Faktoren CD80, CD86, ICAM-1 und LFA-3. DC sekretieren auch Zytokine wie IL-12, IL-15 und IFN-Gamma, von denen auch gezeigt wurde, dass sie für die Ausbreitung von stimulierten T-Zellen nützlich sind. DC-basierende Immuntherapien wurden auch in Patienten mit Krebs und viralen Krankheiten untersucht.
Um eine Antitumor-Immunantwort auszulösen, wurden verschiedene Zelltypen als zelluläre Adjuvanzien mit Tumor-Antigenen eingesetzt, und kürzlich hatten mehrere Gruppen gezeigt, dass dendritische Zellen (DC), die mit Tumorzelllysaten, synthetischen Tumor-Antigenen oder Peptiden, die von Tumorzellen gereinigt wurden, kultiviert wurden, eine relativ signifikante Antitumorimmunität in vivo induzierten. In sämtlichen Ansätzen wurden die DC mit einer exogenen Antigen-Quelle gepulst. Es wurden auch alternative Verfahren vorgeschlagen, die aus genetisch veränderten DC bestehen, um Tumor-Antigene zu exprimieren. Die Expression von Tumor-Antigenen durch DC ist ein wirksames Verfahren zur Induktion von Tumor-Antigen-spezifischen Antworten in vivo (siehe Pardoll DM, Cancer vaccines. Nat. Med. 4(5 Suppl): 525-31, 1998). Mehrere Melanom-spezifische Antigene wurden kürzlich identifiziert, z.B. MART-1/Melan A, gp100, Tyrosinase, MAGE-1, MAGE-3, u.a. Sie wurden dementsprechend verwendet, um eine Antitumor-Immunreaktion durch eine Präsentation über DC auszulösen. Einige Studien verwendeten nicht nur Peptide, sondern auch nicht fraktionierte Tumorzelllysate (Abdel-Wahab Z, DeMatos P., Hester D.Dong XD, and Seigler HF, Human dendritic celles, pulsed with either melanoma tumor cell lysates or the gp100 peptide (280-288), induce paris of T-cell cultures with similar Phänotype and lytic activity, Cell. Immunol. 186(1):63-74, 1998).
Daher war trotz der Tatsache, dass eine Impfung mit autologen DC sich als sicher herausgestellt hat, die Wirksamkeit solcher Vakzine nicht viel besser als mit konventionellen Melanom-Vakzinen. Beispielsweise waren die objektiven Antworten lediglich in 5 von 16 Patienten mit metastatischem Melanom evident (Nestle FO, Alijagic S, Gilliet M, Sun Y, Grabbe S, Dummer R, Burg G, Schadendorf D, Vacciniation of melanoma patients with peptide- or tumor lysate pulsed dendritic cells, Nat. Med. 4(3):328-332, 1998). Diese und andere ähnliche Ansätze scheiterten daran, DC-basierte Vakzine zu verbessern oder die Überlebenschancen von Melanompatienten zu erhöhen. Trotz vieler Studien, die auf die Entwicklung von Melanomvakzinen ausgerichtet waren, wurde bis jetzt nur ein geringer tatsächlicher Fortschritt erzielt. Es besteht eindeutig ein Bedarf an einem wirksamen Melanomvakzin, das nützlich ist, um den Verlauf, wenn nicht sogar die Heilung eines Melanoms in einem höheren Anteil von Patienten zu verlangsamen, als es mit früher beschriebenen Vakzinen der Fall war.
US-Patent-Nr. 5,788,963 von Murphy et al. offenbart Verfahren und Zusammensetzungen zur Verwendung humaner DC, um T-Zellen für immuntherapeutische Antworten gegen einen primären und metastatischen Prostatakrebs zu aktivieren. Andere DC-basierte Ansätze wurden auch beschrieben, z.B. Hsu et al. (Vaccination of patients with B-cell lymphoma using autologous antigenpulsed dendritic cells, Nat. Med. 2(1):52-58, 1996).
Somit besteht das Problem weiterhin, obwohl mehrere Ansätze gegen Melanom (und Krebs allgemein) während der letzen 20 Jahre verfolgt und auch mancher Fortschritt erreicht wurde. Das Melanom nimmt weiter zu und ist für verfügbare Therapien unempfänglich (Villikka K, Pyrhonen S. Cytokine therapy of malignant melanoma. Ann. Med. 28(3):227-233, 1996).
Daher stellt die Erfindung ein verbesserte Melanom-Vakzin zur Verfügung, das eine höhere Erfolgsrate erzielt als die auf dem Gebiet bestehenden Melanomtherapien.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine therapeutische Zusammensetzung, die aus Antigenpräsentierenden Zellen besteht, die mit einer aufgebrochenen Zellpräparation gepulst worden ist. Die aufgebrochene Zellpräparation umfasst entkerntes Zytosol und Zellmembranen von Krebszellen, die mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus infiziert worden sind, das für wenigstens ein immunstimulierendes Molekül kodiert. In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein therapeutisches Vakzin bereit, bei dem autologe dendritische/Monozyten-Zellen (DC/M) ein Gemisch von Antigenen darstellen (vorliegend in einer Präparation von entkerntem Zytosol und Zellmembranen), die von Zellen aus Krebszelllinien stammen, die mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus infiziert worden sind, das für IL-2 kodiert. In einer anderen Ausführungsform stammen das entkernte Zytosol und die Zellmembranen aus Krebszellen, die von einem Patienten mit einem Krebs geerntet worden sind. In einer weiteren Ausführungsform sind die Antigen-präsentierenden Zellen HLA-angepasste dendritische/Monozyten-Zellen für den Wirt, der das Vakzin empfängt. Gemäß der Erfindung ist das entkernte Zytosol im Wesentlichen frei von Zellkernen. Zusätzlich enthalten die erfindungsgemäßen Krebszellmembranen wenigstens zwei, vorzugsweise mehr als zwei HLA-Klasse 1 A-Antigene.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein immuntherapeutisches Vakzin mit zwei Teilen bereit. Der erste Teil des Vakzins betrifft die Verabreichung eines rekombinanten Vaccinia-Virus, das für wenigstens IL-2 kodiert. Der zweite Teil des Vakzins stellt Antigen präsentierende Zellen bereit, die mit einer Präparation von Antigenen aus Krebszellen gepulst worden sind, die mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus, das für wenigstens IL-2 kodiert, infiziert wurden. In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert das rekombinante Vaccinia-Virus des ersten Teils des Vakzins für IL-2, und der zweite Teil des Vakzins umfasst autologe DC/M, die mit entkerntem Zytosol und Zellmembranen aus Krebszellen von Krebszelllinien gepulst wurden, die mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus infiziert worden sind, das für IL-2 kodiert.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines immuntherapeutischen Vakzins bereit, das zur Erzeugung einer Antikrebs-Immunantwort oder zur Behandlung von Krebs in einem Wirt verwendbar ist. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte: (i) In-Kontakt-Bringen von Krebszellen mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus, das für IL-2 kodiert; (ii) Aufbrechen der Vaccinia-Virus-infizierten Krebszellen zum Erhalten einer Präparation, die entkerntes Zytosol und Zellmembranen von den Krebszellen umfasst, und (iii) Pulsieren von Antigen-präsentierenden Zellen mit der Präparation für wenigstens sechs Stunden.
Von der Erfindung ebenfalls umfasst ist ein Verfahren zum Auslösen einer Antikrebs-Immunantwort mit einer Testperson durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die Antigen-präsentierende Zellen einschließt, die mit einer Präparation gepulst worden sind, welche entkerntes Zytosol und Zellmembranen von Krebszellen einschließt, die mit einem Vaccinia-Virus infiziert wurden, das für wenigstens IL-2 kodiert.
Ferner stellt die Erfindung ein Verfahren zum Auslösen einer Antikrebs-Immunantwort in einer Testperson bereit durch: (i) Verabreichen eines rekombinanten Vaccinia-Virus, das für wenigstens IL-2 kodiert; und (ii) Verabreichen einer Zusammensetzung, in der Antigen-präsentierende Zellen vorliegen, die mit einer Präparation gepulst werden, welche entkerntes Zytosol und Zellmembranen von Krebszellen einschließt, die mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus infiziert wurden, das für wenigstens IL-2 kodiert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der erste Teil des Vakzins ungefähr dreißig (30) Minuten vor dem zweiten Teil und im Wesentlichen am selben Ort am Patienten verabreicht.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Behandlung einer Testperson mit Krebs bereit durch: (i) Verabreichen eines rekombinanten Vaccinia-Virus, das für wenigstens IL-2 kodiert; und (ii) Verabreichen einer Zusammensetzung, die Antigen-präsentierende Zellen umfasst, die mit einer Präparation gepulst wurden, die entkerntes Zytosol und Zellmembranen von Krebszellen einschließt, die mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus infiziert wurden, das für wenigstens IL-2 kodiert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der erste Teil des Vakzins ungefähr dreißig (30) Minuten vor dem zweiten Teil und im Wesentlichen an demselben Ort am Patienten verabreicht.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Flussdiagramm, das die Schritte zur Herstellung von CVACII-Vakzin zeigt.
2 zeigt die relative Wirksamkeit von verschiedenen Vakzin-Präparationen beim Schutz gegen die Entwicklung eines Tumors.
3 zeigt den Überlebensprozentsatz von Mäusen, die mit sieben unterschiedlichen Vakzin-Präparationen und mit einem Nichtbehandlungsprotokoll behandelt wurden.
4 zeigt, dass ein Vakzinschutz mit der Induktion von CD8-positiven zytolytischen Zellen korreliert.
5 zeigt Zytotoxizitätstests, die auf eine Behandlung mit CVACII-Vakzin und einer Kontroll-Vakzinpräparation zurückgehen, die aus DC/M besteht, die nur mit dem TumorSonifikat gepulst wurden.
6 zeigt eine HLA-beschränkte Proliferation von PBL- und CD8-Zellen von einem repräsentativen Patienten nach Aussetzen gegenüber verschiedenen Melanom-Antigenen (MART-1, Mel-9, Mel-2 und eigene Tumorzellen) wie zuvor und nach der Impfung getestet.
7 zeigt ein HLA-beschränktes Zytotoxizitätsprofil eines Patienten, getestet in Vorimpfungs- und Nachimpfungszeiträumen (in zweiwöchigen Intervallen).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes immuntherapeutisches Vakzin, das zur Behandlung eines Wirtes verwendbar ist, der mit Krebs diagnostiziert wurde, z.B. Melanom, sowie Verfahren zur Herstellung und Verwendung des Vakzins und verschiedener Bestandteile davon.
Der Ausdruck "HLA" bezeichnet ein humanes Leukozyten-Antigen und entspricht dem Ausdruck "Haupthistokompatibilitätskomplex" (MHC)-Molekül. Im Allgemeinen sind Klasse 1-Moleküle MHC-kodierte Peptide, die mit β2-Mikroglobulin assoziiert sind, während Klasse 2-Moleküle zwei nicht-kovalent assoziierte MHC-kodierte Peptide aufweisen. Klasse 1 (HLA-A, B, C)- und 2 (HLA-D oder DR, DQ, DP)-Moleküle sind zur Präsentation von "Antigenen"- oder "Immunogenen"-Molekülen, die eine Immunantwort ausschließen, in der Lage, wenn sie sich auf der Zelloberfläche befinden. Der Ausdruck "Immunantwort" wird im Allgemeinen mit der Aktivierung von Immunzellen in Verbindung gebracht. Jedoch kann auch das Gegenteil zutreffen, wenn ein Immunogen eine Immuntoleranz oder Anergie auslöst. Der Ausdruck "HLA-angepasst" bezeichnet solche HLA-Antigene von einem Individuum, die im Wesentlichen ähnlich den HLA-Antigenen aus einem anderen Individuum sind.
Der Ausdruck "autologe Zellen" bezeichnet, dass es sich bei den Zellen um die eigenen Zellen eines Individuums handelt. Dendritische Zellen (DC) gehören zu einer Untergruppe von "Antigen-präsentierenden Zellen" (APC), die zur Auslösung einer Immunantwort oder -reaktion fähig sind, die teilweise durch "zytotoxische T-Lymphozyten" (CTL) vermittelt wird. CTL sind Zellen, die zum Abtöten oder Unterdrücken des Wachstums von Zellen mit reaktionsauslösenden Antigenen in der Lage sind. Der Ausdruck "CTL" bezeichnet im Allgemeinen CD8+-T-Zellen, obwohl CD4+-T-Zellen und "natürliche Killer" (NK)-Zellen auch eine zytolytische Aktivität besitzen können. Wenn CTL mit Lymphokinen wie IL-2 aktiviert oder ausgelöst wurden, werden sie auch als Lymphokin-aktivierte Killer-Zellen oder "LAK"-Zellen bezeichnet. Der Ausdruck CD, z.B. CD8 oder CD4, steht für ein Differenzierungsmuster und bezeichnet im Allgemeinen einen Immunmarker, der zur Unterscheidung unterschiedlicher Zelltypen verwendet wird. Der Ausdruck "Antigen-präsentierende Zellen" bezeichnet gewöhnlicherweise spezialisierte Lymphoid-Zellen, wie z.B. dendritische Zellen, B-Zellen und Monozyten-Zellen, die zur Induktion einer T-Zell-Aktivierung in der Lage sind. Der Ausdruck "Monozyten" bezeichnet Zellen, die mit "Makrophagen" verwandt sind, und sie stellen eine andere Art von APC dar, die hauptsächlich zuvor sensibilisierte CTL reaktivieren. DC wiederum erscheinen jedoch funktionell native oder nicht ausgelöste T-Zellen zu aktivieren. Sowohl DC als auch Monozyten werden benötigt, um Immunzellantworten zu aktivieren und aufrecht zu erhalten. Neben den Unterschieden bei dem Immunphänotyp unterscheiden sich diese beiden Arten von APC morphologisch, wobei DC einen eher "haarigen" oder "dendritischen" Phänotyp besitzen. Jedoch ist im Gegensatz zu Monozyten der exakte Ursprung von DC noch immer unklar, da sie von einer Vielzahl von Geweben gewonnen werden, z.B. aus dem peripheren Blut, der Milz, dem Thymus, dem Knochenmark, den Lymphknoten oder der Haut. Monozyten können im Wesentlichen von denselben Quellen erhalten werden. Einige DC sind auch als "verschleierte" Zellen bekannt, die im Blut oder als "Langerhansche Zellen" gewöhnlicherweise in der Epidermis vorgefunden werden.
Der Ausdruck "immunstimulatorisches Molekül" bezeichnet Zytokine, hämatopoetische Wachstumsfaktoren und Melanom-Immunogene. Der Ausdruck "Zytokin" bezeichnet biaktive Moleküle, die von Zellen abgeleitet sind und die zur Beeinflussung des Zellverhaltens fähig sind, z.B. dem Wachstum, der Migration, der Abtötungsfähigkeit, der Differenzierung, der Sekretion etc. Der Ausdruck "Lymphokin" bezeichnet im Wesentlichen das selbe wie Zytokin, betrifft jedoch gewöhnlicherweise bioaktive Moleküle, die von Lymphozyten abstammen und die hauptsächlich das Verhalten von Lymphozyten beeinflussen.
Der Ausdruck "immuntherapeutisches Vakzin" bezeichnet im Gegensatz zu dem Ausdruck "prophylaktisches Vakzin" ein Vakzin, das zur Behandlung und/oder Vorbeugung des Fortschreitens der Krankheit in einem Wirt, der bereits mit der Krankheit diagnostiziert ist, verabreicht wird. Der Ausdruck "Verabreichen" bezeichnet ein beliebiges Verfahren, um einem bedürftigen Wirt ein Vakzin bereitzustellen, einschließlich oraler, intranasaler, topischer, transdermaler, parenteraler, z.B. intravenöser, subkutaner, intradermaler, intramuskulärer Verabreichungen und anderer Verabreichungsmittel, die auf dem Gebiet bekannt sind.
Der Ausdruck "Melanom" bezeichnet einen malignen Hautkrebs oder Tumor mit unterschiedlichem Schweregrad und mit der Tendenz, sich in fortgeschrittenen Stadien der Krankheit auszubreiten oder zu "metastatisieren". Der Ausdruck "Krebs" oder "Neoplasmus" bezeichnet im Allgemeinen eine maligne Krankheit und wird durch ein unkontrolliertes Wachstum von "Tumor"- oder "Krebs"-Zellen charakterisiert. Tumore können sich als primäre Tumormasse lokal oder in weiter entfernte Körperteile ausbreiten, d.h. metastatisieren.
Der Ausdruck "entkerntes Zytosol" bezeichnet die zytoplasmatischen Bestandteile einer Zelle, aus der der Zellkern möglichst intakt entfernt worden ist. Daher ist ein entkerntes Zytosol im Wesentlichen frei von Zellkernen. Wie hier verwendet, bezeichnet "Pulsieren" das Ausstatten einer Antigen-präsentierenden Zelle mit einem Antigen oder einem Immunogen oder einer Präparation, die Antigene oder Immunogene enthält, z.B. eine Präparation von Tumor-Antigenen, die von einem Tumor abgeleitet sind. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Antigene, Immunogene oder eine Präparation an die APC gebunden oder von dieser aufgenommen, um zu Peptiden verarbeitet zu werden, welche an die Plasmamembran als ein Peptid-MHC- oder Peptid-HLA-Komplex abgegeben werden. Wenn dieser Komplex durch eine Immunzelle kontaktiert wird, z.B. einer CTL, wird er diese Zellen dazu bringen, Tumorzellen, die ein ähnliches Antigen oder Immunogen tragen, zu erkennen und abzutöten. Durch das Pulsieren von APC mit Tumorantigenen wird die Immunogenität dieser Antigene verbessert.
Der Ausdruck "CVACII-Vakzin" umfasst zwei Bestandteile: der erste ist ein lebendes rekombinantes Vaccinia-Virus, das für ein Zytokin kodiert, z.B. humanes IL-2 (rIL-2VV), das vorzugsweise als erstes injiziert wird, und der zweite Bestandteil umfasst dendritische und/oder Monozytenzellen (DC/M), die mit Krebs- und/oder Melanom-Antigenen gepulst wurden, die von Krebs- und/oder Melanom-Zellen abgeleitet sind oder von Zelllinien, die einem Vaccinia-Virus ausgesetzt waren, das für ein Zytogen kodiert, z.B. rIL-2VV. Der zweite Bestandteil wird vorzugsweise ungefähr 30 Minuten nach rIL-2VV verabreicht. Der Ausdruck "VV" steht für Vaccinia-Virus, und der Ausdruck "rVV" steht für rekombinantes Vaccinia-Virus, das für ein externes Gen kodiert, das für dieses Virus fremd ist.
Der Ausdruck "Vakzin" wie hier verwendet umfasst ein therapeutisches oder immuntherapeutisches Vakzin. In einer Ausführungsform der Erfindung wird das Vakzin in einem Wirt verwendet, bei dem bereits Krebs diagnostiziert wurde, und kann verabreicht werden, um eine Immunantwort gegen einen schwach immunogenen Tumor zu stimulieren. Die Immunantwort kann zu einem vermindertem Tumorwachstum und -ausbreitung, einer Elimination von Tumorzellen durch zelluläre und humorale Immunantworten und/oder der Vorbeugung oder Verzögerung des Tumorauftretens nach einer teilweisen oder vollständigen Entfernung des Krebses führen.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft eine therapeutische Zusammensetzung von Antigenpräsentierenden Zellen, die mit einer Präparation von Tumorantigenen gepulst worden sind, welche in einem entkernten Zytosol und Zellmembranen von Krebszellen, z.B. Melanomzelllinien, die nicht zytolytisch mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus, das für IL-2 kodiert, infiziert wurden, vorliegen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die APC die wirtseigenen oder HLA-angepasste Antigen-präsentierende Zellen, z.B. dendritische und/oder Monozyten-Zellen. Die Zusammensetzung kann Krebszellmembranen enthalten, die wenigstens zwei und vorzugsweise mehr als zwei HLA-Klasse 1 A-Antigene enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Melanomzellen, wie Mel-2, Mel-3-, Mel-4-, Mel 6- und Mel-9-Melanomzelllinien verwendet. HLA-angepasste dendritische und/oder Monozyten-Zellen, die von einem Spender bereitgestellt werden, sind auch als verwendbare Bestandteile dieses Vakzins eingeschlossen.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verabreichung von RVV, das für wenigstens IL-2 kodiert.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von rekombinantem Vaccinia-Virus, das für Melanom-Immunogene kodiert, wie MAGE-1-, MAGE-3-, BAGE-, GAGE-, PRAME- und NY-ESO-1-Antigene; Melanozyten-Differenzierungs-Antigene wie Tyrosinase, Melan-A/MART-1, gp100, TRP-1 und TRP-2; mutierte oder aberrant exprimierte Antigene wie MUM-1, CDK-4, Beta-Catein, gp 100-in 4, p.15 und N-Acetylglukosaminyltransferase; und andere geeignete Antigene wie B7-1, TA-90, Lysosom-assoziiertes Membranprotein (LAMP), Melanozyten-stimulierender Hormonrezeptor (MCIR), p90-Kalnexin und andere Antigene, die auf dem Gebiet bekannt sind. Diese Immunogene oder Antigene können für die vorliegende Zusammensetzung von weiterem Vorteil sein durch Auftreten einer weiteren Veränderung(en) zu einer Immunantwort eines Wirtes.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird als CVACII bezeichnet. Bei dieser Ausführungsform ist das verwendete Vaccinia-Virus (VV) ein rekombinantes Virus, das ein Gen enthält, das für humanes IL-2 kodiert. Zusätzlich sind die APC in der CVACII-Ausführungsform vorzugsweise mit Präparationen von einer beliebigen der fünf humanen Melanomzelllinien oder Zelllinien, die für mehr als ein HLA-Klasse 1 A-Antigen exprimieren, gepulst. Schließlich können die eigenen dendritischen Zellen des Patienten sowie Monozyten als APC in CVACII verwendet werden.
Obwohl die hier veranschaulichte Ausführugsform eine Melanomtherapie umfasst, wird der Fachmann erkennen, dass die hier offenbarten Prinzipien in gleicher Weise auf eine Vielzahl anderer maligner Tumore anwendbar sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Plattenepithelkarzinom, Lungenkrebse, Brustkrebse, Kopf- und Nackenkarzinome, Schilddrüsenkarzinome, Weichgewebesarkome, Knochensarkome, Hodenkrebse, Prostatakrebse, Eileiterkrebse, Blasenkrebse, andere Arten von Hautkrebsen, Gehirnkrebsen, Angiosarkome, Mastzellentumore, primäre häpatische Krebse, Pankreas-Krebse, gastrointestinale Krebse, renale Zellkarzinome, Lymphome und hämatopoetische Neoplasien.
Obwohl bevorzugte Zellen zur Verwendung als humane Melanomvakzine von der Mel-Serie stammen (z.B. Mel-2, Mel-3, Mel-4, Mel-6, Mel-9), können auch andere Melanomzelllinien verwendet werden. Solche Zelllinien können de novo von Tumorbiopsien von Melanompatienten etabliert oder können von bereits bestehenden Quellen ausgewählt werden. Z.B. wurden Zelllinien, die als FM3, FM6, FM9, FM28, FM37, FM45, FM55p, FM55M1 und FM55M2 bezeichnet sind, von Kirkin et al. von acht metastatischen Tumoren und einem Primärtumor von sieben unterschiedlichen Patienten etabliert (Kirkin, A.F., Petersen, T.R., Olsen, A.C., Li, L., thor Straten, P., Zeuthen, J. Generation of human-melanoma-specific T lymphocyte clones defining novel cytolytic targets with panels of newly established melanoma cell lines, Cancer Immunol. Immunother. 41(2):71-81, 1995). Verfahren zum Etablieren von Melanomlinien stellen Routine dar und sind für den Fachmann bekannt. Es ist zu würdigen, dass ähnliche Verfahren zur Auswahl oder Etablierung von transformierten Zelllinien, die Tumoren oder Krebszellen anderer Zelltypen entsprechen, anwendbar sind. Es ist auch zu würdigen, dass dort, wo übliche Tumor-Antigene beteiligt sind, Vakzine von Zelllinien entwickelt werden können, die von einem anderen Ursprung als von dem zu behandelnden Krebs stammen.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung stellen die ausgewählten Melanomzelllinien wenigstens zwei HLA-Klasse 1-Antigene, vorzugsweise HLA-A2 und/oder -A1 bereit. Im Allgemeinen findet die HLA-A2-Expression hauptsächlich in Melanompatienten statt und spielt eine kritische Rolle bei der HLA-Klasse 1-beschränkten CTL-Abtötung von Melanomen. Jedoch können einige Patienten andere HLA-Allele exprimieren. Daher sollten Melanomzelllinien vorzugsweise mehr als zwei HLA-Antigene exprimieren. Mehr bevorzugt sollten sie ein drittes HLA-A-Antigen exprimieren, und vorzugsweise ist dieses Antigen ein A3-Antigen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die DC in Kombination mit anderen Arten von Antigen-präsentierenden Zellen, wie Monozyten (M), verwendet. Es ist bevorzugt, dass DC/M-Zellen frisch verwendet werden, obwohl man sie nach bekannten Verfahren einfrieren und weiter verwenden kann, wann immer es notwendig ist (z.B. US-Patent Nr. 5,788,963). Entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform werden DC/M-Zellen vom eigenen Blut eines Patienten erhalten. Entsprechend einer anderen Ausführungsform werden DC/M-Zellen von einem HLA-angepassten Spender erhalten. Neben einer Melanomtherapie stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von metastatischem Menalom bereit, insbesondere solche, die Lunge, Leber, Gehirn beeinträchtigen und entweder kutan oder subkutan sind. Die vorliegende Erfindung ist auch auf andere Krebsarten anwendbar. In einer bevorzugten Ausführungsform können diese Krebsarten Fibrosarkom, Myxosarkom, Liposarkom, Chondrosarkom, osteogenes Sarkom, Chordom, Angiosarkom, Endotheliosarkom, Lymphangiosarkom, Lymphangioendotheliosarkom, Synoviom, Mesotheliom, Ewing's Tumor, Leiomyosarkom, Rhabdomyosarkom, Rhabdosarkom, kolorektales Karzinom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Brustkrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs, Plattenepithelkarzinom, Basalzellenkarzinom, Adenokarzinom, Schweißdrüsenkarzinom, Talgdrüsenkarzinom, papilläres Karzinom, papilläres Adenokarzinom, Zystadenokarzinom, medulläres Karzinom, bronchogenes Karzinom, Nierenkarzinom, Lebertumor, Gallengangskarzinom, Chorionkarzinom, Seminom, Embryonalkarzinom, Wilm's Tumor, Gebärmutterhalskrebs, Hodentumor, Lungenkarzinom, kleinzelliges Lungenkarzinom, Blasenkrebs, Epithelkarzinom, Gliom, Astrozytom, Kaposi's Sarkom, Medulloblastom, Kraniopharyngiom, Ependymom, Pinealom, Hemangioblastom, akustisches Neurom, Oligodendrogliom, Meningiom, Neuroblastom, Retinoblastom, Myelom, Lymphom oder Leukämie umfassen. Daher können DC/M-Zellen von Patienten hergestellt werden, die an den oben genannten Krebsarten leiden und mit entsprechenden Tumorgenen gepulst wurden, die von einem eigenen Tumor des Patienten erhalten wurden, oder von etablierten Zelllinien derselben Art wie der therapiebedürftige Tumor.
In Ausführungsformen der Erfindung werden Extrakte zur Verwendung bei der Pulsierung von DC/M-Zellen von transformierten Zelllinien hergestellt, die mit rekombinantem Vaccinia-Virus infiziert worden sind. Bevorzugte Extrakte sind solche, von denen das nukleäre Material entfernt worden ist, so dass die Präparationen entkerntes Zytosol und Zellmembranen von mit rekombinanten oder Vaccinia-Virus infizierten Zellen umfassen. Z.B. wird eine Zellsuspension von Melanomzellen einer rIL-2VV-Präparation bei einem Verhältnis von ungefähr 10 Zellen bis ungefähr 1 PFU des rIL-2VV ausgesetzt. Gemäß der Erfindung kann das Verhältnis von Krebszellen zum Virus variieren und kann sich irgendwo zwischen ungefähr 1000 bis 0,001 Zellen bis ungefähr 1 PFU Virus befinden. Nach einer kurzen Inkubationsperiode zur Vermeidung einer Virus-induzierten Zelllyse, vorzugsweise für 4 bis 36 Stunden, bevorzugter 18 bis 30 Stunden und mehr bevorzugt 24 Stunden in einem CO₂-Inkubator werden die Melanomzellen von dem Kulturüberstand aufgetrennt. Dies kann beispielsweise durchgeführt werden durch Zentrifugation bei ungefähr 1200 Upm für 10 Minuten in einer gekühlten Zentrifuge. Andere Mittel zum Auftrennen von Zellen und Kulturmedium sind auf dem Gebiet bekannt und können eingesetzt werden. Die aufgetrennten Melanomzellen werden gesammelt und durch mechanische, chemische oder physikalische Mittel aufgebrochen. Eine Vielzahl von Verfahren sind bekannt und können eingesetzt werden. Diese können wiederholtes Einfrieren und Auftauen, Hochdruck (French press), Dounce Homogenisation, Mikrowellen- oder Ultrawellenbestrahlung, verschiedene Detergenzien oder andere auf dem Gebiet bekannte Verfahren umfassen. Das bevorzugte Verfahren ist ein Hochfrequenzvibrations- oder Sonifikations-Verfahren unter Verwendung eines Sondensonifikators. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden die Zellen aufgebrochen, jedoch bleiben die Zellkerne intakt. Der Zustand der aufgebrochenen Zellen wird beispielsweise mit einem Mikroskop verfolgt. Die aufgebrochenen Zellen werden dann behandelt, um Zellkerne zu entfernen, beispielsweise durch Zentrifugation bei 800 Upm für 10 Minuten. Das verbleibende zelluläre Material umfasst Vaccinia-Virus-Partikel, entkerntes Zytosol und Zellmembranen und wird zur Pulsierung von DC/M verwendet. In einer Ausführungsform, bei der eine Sonifikation zum Aufbrechen von Zellen eingesetzt wird, ist das zelluläre Material das Melanom-Sonifikat (MS). In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird der von dem Kulturüberstand gesammelte Virus zurück in das zelluläre Material vor der Pulsierung mit der DC/M gegeben. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Kombination von MS und rekombinantem Virus aus dem Überstand als rIL-2VV-MS bezeichnet. Vor der Pulsierung der DC/M kann die MS oder rIL-2VV-MS weiter behandelt werden, um Viruspartikel zu inaktivieren, beispielsweise durch Aussetzen gegenüber ultraviolettem Licht.
Das Pulsieren von DC/M beinhaltet das In-Kontakt-Bringen von DC/M mit dem zellulären Material, das von den aufgebrochenen Zellen gewonnen wurde. In einer bevorzugten Ausführungsform findet die Kontaktierung für einen Zeitraum statt, der für die Verarbeitung und Präsentation von Tumor- und Vaccinia-Virus-Antigenen durch die DC/M ausreicht. Verfahren zur Pulsierung von Immunsystemzellen für die Antigen-Präsentation sind für den Fachmann bekannt.
Vorzugsweise werden Antigen-präsentierende Zellen von dem Patienten gewonnen. Die Verwendung von eigenen oder autologen APC und vorzugsweise DC des Patienten stellt eine Möglichkeit dar, einen individualisierten therapeutischen Ansatz auszuwählen (Celluzzi, C.M., Falo, L.D. Jr. Physical interaction between dendritic cells and tumor cells results in an immunogen that induces protective and therapeutic tumor rejection. J. Immunol. 160(7):3081-3085, 1998).
Ein Verfahren zur Herstellung der vorliegenden Zusammensetzung ist auch offenbart. In einem bevorzugten Verfahren wird die Zusammensetzung hergestellt durch Wachstum von Tumorzellen oder Tumorzelllinien als Quelle für entkerntes Zytosol und Zellmembranen; In-Kontakt-Bringen der Zellen mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus, das für IL-2 kodiert, in einem serumfreien Medium; Sonifizieren oder Aufbrechen von im Wesentlichen intakten Vaccinia-infizierten Zellen, um einen Aufbruch der Zellen zu bewirken (Zell-Sonifikat); Zentrifugieren von Zelltrümmern zur Auftrennung von Zellkernen; Einsammeln des Sonifikats, das entkerntes Zytosol, Vaccinia-Virus und Zellmembranen enthält; Inaktivieren, z.B. das Bestrahlen des Sonifikats mit ultraviolettem Licht; Vereinigen von mehr oder weniger gleichen Volumina der Sonifikate von verschiedenen Tumorzellen; Anpassen des Volumens des Sonifikats an ungefähr zehn Millionen ursprünglicher Zellen pro ml; Überführen von jeweils 1 ml Volumen des gemischten Sonifikats in sterile Glasbegefäße; Einfrieren und Lagerung dieser Behälter bei –70° C; Zurückgewinnen von dendritischen und/oder Monozytenzellen von einem HLA-angepassten Spender oder von einem Wirt, der mit einem Krebs diagnostiziert wurde und Wachsen- Lassen der genannten Zellen in Kultur (ex vivo); Vermischen oder Pulsieren von dendritischen und/oder Monozyten-Zellen mit aufgetautem Überstand von Krebszellen in einem serumfreien Medium; und Einsammeln von gepulsten dendritischen und/oder Monozyten-Zellen.
Es ist bevorzugt, dass die DC/M von frisch präparierten Zellen verabreicht werden. Jedoch kann man die Zellen entsprechend auf dem Gebiet bekannter Verfahren einfrieren (US-Patent Nr. 5,788,963) und die DC/M unmittelbar verwenden, wenn sie gebraucht werden.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Auslösen einer Anti-Krebs-Immunantwort bereit, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge eines lebenden rekombinanten Vaccinia-Virus, das für IL-2 kodiert, und einer wirksamen Menge von Antigen präsentierenden Zellen an einen mit einem Krebs diagnostizierten Wirt. Vor der Verabreichung werden die Antigen-präsentierenden Zellen mit entkerntem Zytosol und Zellmembranen von Krebszellen gepulst, die mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus infiziert worden sind, das für dasselbe Molekül kodiert.
Auch umfasst von der Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung eines menschlichen Wirtes, der mit einem Krebs diagnostiziert ist, z.B. einem Melanom, durch Verabreichung, vorzugsweise subkutan (s.c.), eines lebenden rekombinanten Vaccinia-Virus, das für IL-2 kodiert, und Injektion, vorzugsweise an nahezu derselben Stelle, einer therapeutischen Zusammensetzung, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die wirksame Menge eines lebenden rekombinanten Vaccinia-Virus, das für IL-2 kodiert, eine Menge im Bereich von 10⁴ bis 10⁹ Plaque-bildender Einheiten (PFU) pro Injektion. Vorzugsweise befinden sich wirksame Mengen zwischen ungefähr 10⁵ und 10⁸ PFU und mehr bevorzugt ungefähr 10⁷ PFU. Im Allgemeinen umfasst die wirksame Menge einer therapeutischen Zusammensetzung eine Menge in einem Bereich von ungefähr 10⁵ bis 10⁹ ursprüngliche Krebszellen pro Injektion. Vorzugsweise ist die wirksame Menge zwischen ungefähr 10⁸ und 10⁸ Zellen und bevorzugter ungefähr 10⁷ Krebszellen. Die bevorzugte Anzahl von Antigen-präsentierenden Zellen (APC) in einer Dosis eines Vakzins beträgt ungefähr 1 bis 5 Millionen Zellen. Das Verhältnis zwischen Krebszellen und Plaque-bildenden Einheiten (PFU) des rekombinanten Vaccinia-Virus ist ausgewählt aus dem Bereich von ungefähr 1.000 bis 1 Krebszellen bis ungefähr 0,001 bis 1 PFU. Vorzugsweise ist das Verhältnis zwischen Krebszellen und PFU des rekombinanten Vaccinia-Virus ungefähr 10 bis ungefähr 1. Das Verhältnis zwischen Krebszellen und Antigen-präsentierenden Zellen wiederum ist ausgewählt aus dem Bereich von ungefähr 1.000 bis 1 Krebszellen bis ungefähr 10 bis 1 Antigen-präsentierenden Zellen. Das bevorzugte Verhältnis zwischen Krebszellen und Antigen-präsentierenden Zellen beträgt ungefähr 10 Krebszellen bis 1 bis 5 APC.
Es ist bevorzugt, dass das vorliegende immuntherapeutische Vakzin subkutan oder intradermal für einen Zeitraum und in einer Menge verabreicht wird, die erforderlich sind, um die therapeutische Wirkung zu erzielen. Daher befinden sich bevorzugte Injektionsstellen an den vorderen Oberschenkeln, den vorderen Oberarmen oder dem vorderen Brustkorb. Die Mindestdauer der Vakzintherapie beträgt mindestens einen Tag, vorzugsweise wenigstens drei Monate, bevorzugter wenigstens ein Jahr oder länger und mehr bevorzugt bis zur Krankheitsremission oder zum Krankheitsrückfall. Die Therapie kann auch nach einem Krankheitsrückfall weiterlaufen, wenn es für den Wirt als vorteilhaft angesehen wird. In diesem Fall kann ein Wechsel von Tumorantigenen wünschenswert sein und wird in Erwägung gezogen.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung können DC/M-rIL-2VV-CS intradermal oder subkutan an Stellen in der Nähe der regionalen Lymphknotengruppen injiziert werden. Jede Injektion kann gleich aufgeteilt werden unter wenigstens 4 bis 6 Injektionsstellen – wenigstens 2 bis 4 oberhalb des Bauches und wenigstens 2 unterhalb des Bauches in der Nähe der Leistenknoten. In einer bevorzugten Ausführungsform wird rIL-2VV zuerst injiziert, und dann werden DC/M-MS ungefähr 30 Minuten später an ungefähr denselben Stellen injiziert. Andere Verabreichungsrouten sind vorstellbar und können eine kontinuierliche (wie z.B. ein intravenöser Tropf), intramuskuläre, transdermale (die eine penetrationsverstärkendes Mittel einschließen kann) Erhaltungsfreisetzung durch Verkapselung in Freisetzungsvehikel wie Liposomen umfassen.
Vorzugsweise wird eine Immunisierung mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung unter Verwendung von mehreren Injektionen durchgeführt, die über einen Zeitverlauf verabreicht werden, der so ausgewählt ist, dass die Immunantwort maximiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform empfangen Melanom-Patienten sechs zweiwöchige Injektionen für zwölf Wochen, dann alle drei Monate für zwei Jahre oder bis zum Krebsrückfall. Jedoch kann jedes geeignete Immunisierungsschema verwendet werden. Der Fachmann kann die Verabreichungsverfahren innerhalb der Offenbarung dieser Beschreibung modifizieren, um zahlreiche Routen bereitzustellen, ohne die erfindungsgemäße Zusammensetzung unbrauchbar zu machen oder deren therapeutischen Wert zu mindern.
Die erhaltenen DC/M werden in einer DC/M-MS-Präparation und auch für in vitro-Studien verwendet, um Immunitätsaktivierungszeichen zu bestimmen.
Biopsien können zur Bestimmung der IL-2-Produktion durch bekannte Verfahren entnommen werden.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der Erfindung.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Herstellung und Test eines Prototyp-CVACII-Vakzins in einem Maus-Modell.
Zelllinien
Die murine Darmkrebszelllinie CC-36, humane Fibroblastenzelllinie MRC5, Affenvirenzelllinie VERO, NK-sensitive Zelllinie YAC-1, murine Anti-CD4-Antikörper-sekretierende Zelllinie GK1.5, murine Anti-CD8-sekretierende Zelllinie TIB210-2.43, IL-2-abhängige Zelllinie CTLL, Thymidin-Kinase-negative Zelllinie 143B wurden von ATCC erhalten und entweder in EMEM- oder RPMI-Medien mit geeigneten Nährstoffen gehalten.
Mäuse
Bulb/C-Mäuse mit einem Alter von vier bis sechs Wochen wurden in allen therapeutischen Krebsvakzin-Experimenten und zur Isolierung von dendritischen Zellen sowie für die Herstellung von monoklonalen Anti-CD4- oder Anti-CD8-Antikörper-enthaltenden Ascites verwendet.
Vaccinia-Virus (VV)
Ein rekombinantes Vaccinia-Virus (rVV) wurde hergestellt mit einem vollständigen Escherichia coli β-Gelactosidasegen (lacZ) und einem anderei rVV mit dem humanen IL-2-Gen (rIL-2VV), das in denselben Lokus wie das lacZ-Gen von rVV eingefügt worden ist. Diese Viren wurden entweder in MRC5- oder Vero-Zellen gezüchtet und durch einen Plaque-bildenden Assay unter Verwendung von VERO-Zellen quantifiziert. Das Präparationsverfahren von rIL-2VV ist von Flexner et al. beschrieben (Flexner C. Hugin A., Moss B. Prevention of vaccinia virus infection in immunodeficient mice by vector-directed IL-2 expression, Nature 330:259-262, 1987).
Vaccinia-Kolon-Sonifikat (rIL-2VV-CS)-Präparation
Das Vaccinia-Kolon-Sonifikat unter Verwendung von rIL-2VV wird hergestellt durch ein modifiziertes Verfahren wie beschrieben (Sivanandham, et al., Cancer Immunol. Immunother. 38:259-264, 1994). Kurz zusammengefasst, wurden CC-36-Zellen für 24 Stunden mit rIL-2VV mit einem Verhältnis von einer Zelle bis einer PFU Virus co-kultiviert. Die Vaccinia-Virus-infizierten CC-36-Zellen wurden dann gesammelt, durch Zentrifugation aufgetrennt und durch Sonifizierung aufgebrochen. Die Zellkerne wurden von dem Sonifikat durch Zentrifugation mit 800 Upm für 10 Minuten entfernt. Das Vaccinia-Virus und die Tumorzelltrümmer wurden Zell-/Virus-Co-Kultur-Überstand durch Zentrifugation mit 100.000 × g für eine Stunde isoliert und mit dem Zellsonifikat gemischt. Die entstandene Suspension wurde einer Kurzwellen-UV für 1 Stunde ausgesetzt, um das Virus zu inaktivieren und dann aliquotiert und bei –70° C bis zur Verwendung gelagert. Die Aliquote enthielten ungefähr 10⁶ Zelläquivalente in 0,2 ml Salzlösung (0,9% Natriumchlorid).
Analyse der Herstellung von IL-2 von rIL-2VV
IL-2 wurde in den Zellüberständen von rIL-2VV-infizierten CC-26-Zellen und in Serien von Mäusen, die mit rIL-2VV injiziert waren, unter Verwendung von kommerziellen ELISA-Kits und durch einen geeigneten Bio-Assay gemessen. Die Kinetiken der Herstellung von IL-2 wurden sowohl durch in vitro- als auch in vivo-Prozeduren getestet.
Präparationen von Milz-abgeleiteten dendritischen/Monozyten-Zellen
Dendritische und Monozyten (DC/M)-Zellen wurden von Milzen desselben Mausstammes isoliert. Die Milze wurden auf einem Drahtgeflecht zerhackt, und alle dissoziierten Zellen wurden in einer balancierten Hank's Salzlösung (HBSS) gesammelt. Diese Zellen wurden auf Ficoll-Hypaque überlagert und mit 400 g für 30 Minuten zentrifugiert, von der Ficoll-Hypaque-Zwischenphase geerntet, zweimal in HBSS gewaschen, in Trypanblau gezählt und dann in vollständigem RPMI-Medium resuspendiert. Den Zellen wurde es ermöglicht, an die Plastikoberfläche einer Gewebekulturschale für 1 bis 2 Stunden anzuhaften. Nicht-adherente Zellen wurden durch vier Waschungen mit Medium entfernt. Die adherenten Zellen enthielten hauptsächlich Makrophagen-/Monozyten- und dendritische Zellen. Die Zellen wurden über Nacht in vollständigem RPMI 1640-Medium gehalten. Am folgenden Tag wurden die schwimmenden Zellen entfernt, mit HBSS gewaschen und in vollständigem RPMI-Medium gehalten, das 2000 Einheiten murines GM-CSF und 1000 Einheiten murines IL-4 enthält. Diese Zytonkine begünstigen hauptsächlich das Wachstum von DC. Jedoch wurden auch einige Monozyten-Zellen in der Kultur vorgefunden. Nach einer Kultivierung für fünf Tage wurden DC/M-Zellen geerntet, zweimal mit PBS gewaschen und dann mit rIL-2VV-CS wie folgt pulsiert. Eine Million DC/M wurden in 5 ml FBS-freiem RPMI-Medium mit den Bestandteilen von einem Gefäß (ungefähr 10⁶ Zelläquivalente) rIL-2VV-CS inkubiert. Das anschließende Pulsieren erfolge mit einem Gemisch, das ungefähr eine DC/M-Zelle auf ein Zelläquivalent rIL-2VV-CS enthielt. Das Gemisch wurde über Nacht bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Am nächsten Tag wurden die pulsierten DC/M-Zellen herunterzentrifugiert und zweimal mit HBSS gewaschen.
Experimentelles Design
Fest-Tumore wurden in Mäusen durch Injektion von 10⁴CC-36-Zellen in 100–200 μl HBSS an der rechten Wangenregion injiziert, und die Wirksamkeit der rIL-2VV+DC/M-rIL-2VV-CS-Kombinationstherapie wurde untersucht. Acht Gruppen der 10 Mäuse wurden in diesem Experiment verwendet. Gruppe 1 wurde mit rIL-2VV + DC/M-IL-2VV-CS (CVACII) behandelt; Gruppe II wurde mit einer Kontrolle VV+DC/M-VV-CS behandelt; Gruppe III wurde mit DC/M-rIL-2VV-CS behandelt; Gruppe IV wurde mit DC/M-VV-CS behandelt; Gruppe V wurde mit DC/M-CC-36-Lysat behandelt (d.h. Rohzell-Lysat, wie in den Verfahren des Standes der Technik verwendet); Gruppe VI wurde mit rIL-2VV behandelt; Gruppe VII wurde mit einer nicht rekombinanten VV-Kontrolle behandelt, und Gruppe VIII wurde nicht behandelt. Diese Gruppen sind, wie mit entsprechenden Vakzinen behandelt, in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1: Verabreichte Behandlungen
In den ersten und zweiten Gruppen wurde die Verabreichung in zwei Schritten durchgeführt. Als erstes wurden eine Million PFU lebensfähiger rIL-2VV oder der Kontrolle "Wildtyp"-VV in 100 μl subkutan in der linken Wangenregion injiziert. Dreißig Minuten später wurden DC/M-rIL-2VV-CS oder DC/M-VV-CS in 200 μl an derselben Stelle injiziert. Die Mäuse erhielten Injektionen am Tag 4, 10 und 17 nach der Tumortransplantation.
Um die Wirksamkeit der Vakzinpräparationen zu bestimmen, wurden die Mäuse auf das Tumorvorkommen beobachtet. Das Tumorvorkommen und der Durchmesser wurden in einem Zeitintervall von 2 bis 3 Tagen gemessen, um das Tumorwachstum zu bestimmen. Die Wirkung der Behandlungen auf das Überleben wurde ebenfalls bestimmt.
Analyse der Induktion der tumorspezifischen Immunität
Seren und Lymphozyten von Mäusen von unterschiedlichen Behandlungsgruppen wurden gesammelt und in der geeigneten in vitro-Analyse verwendet, um die Induktion von Anti-CC-36-Immunantworten zu demonstrieren. Es wurden zelluläre Tests unter Verwendung von peripheren Blutlymphozyten (PBL) oder Milzlymphozyten von Mäusen aus den unterschiedlichen Gruppen durchgeführt. Die Lymphozyten wurden von peripherem Blut oder von der Milz durch Standardverfahren hergestellt.
Zytolytische Assays
Eine CC-36-spezifische zytolytische Aktivität von PBL oder Milzlymphozyten wurde unter Verwendung eines standardgemäßen Chromfreisetzungs-Assay gemessen. Frisch hergestellte Lymphozyten wurden mit bestrahltem rIL-2-VV-CS pulsierten DC/M für 5 Tage bis 2 Wochen in RPMI-Medium co-kultiviert, das 10 Einheiten Interleukin-2 enthielt. CC-36 oder YAC-1-Zielzellen wurden geerntet, gewaschen und mit 100 μCi Natriumchromat/10⁶ Zellen (⁵¹Cr, Amersham) in 0,5 ml Volumen für 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach viermaligem Waschen mit RPMI 1640 wurden die radioaktiv markierten Zielzellen mit 10⁴/ml in 100 μl Volumen zu konischen Mikrotiterplatten zugegeben (Costar). Die Verhältnisse von Effektor-Lymphozyt zu Ziel-Tumorzelle (E:T) waren in einem Bereich von 100:1 bis 10:1. E:T wurden in vierfachen Vertiefungen verwendet. Die Platten wurden bei 250 g für 5 Minuten zentrifugiert und bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator, der 5% CO₂ enthielt, inkubiert. Nach vier Stunden wurden die Überstände von den Vertiefungen auf Faserfilter geerntet, indem ein Skatron Sammelsystem eingesetzt wurde, und für eine Minute auf einem Gammazähler gezählt. Um die maximale ⁵¹Cr-Freisetzung zu bestimmen, wurden 0,1 ml 1%-iger Natrium-Dodecyl-Sulfatlösung zu den jeweiligen Vertiefungen zugegeben. Die Zähler pro Minute (cpm) wurden verwendet, um die prozentuale Freisetzung (% R) entsprechend der Formel zu berechnen:
CTL-Vorläufer-Häufigkeit (CTLp)-Assay
Frische Lymphozyten wurden von Mäusen von den oben genannten Behandlungsgruppen isoliert. 2–10 × 10⁴ Lymphozyten in 50 μl Medium, das 50 Einheiten/ml rekombinantes IL-2 enthielt, wurden zu jeder Vertiefung mit 10³ CC-36 Sonifikat-gepulsten DC/M zugegeben. Wenigstens 50 Replikate wurden in diesem Test verwendet. Die Co-Kulturen wurden für 21 Tage in einem befeuchteten CO₂-Inkubator gehalten. An Tag 6, 12 und 18 wurden 50 μl frisches Medium zu jeder Vertiefung zugegeben. Am Tag 21 wurden ungefähr 10³ YAC-1-Zellen gefolgt von 10³ ⁵¹CR-markierten CC-36-Zellen zugegeben. Nach vier Stunden wurden die Überstände geerntet und unter Verwendung eines Gammazählers gezählt. Positive Vertiefungen waren solche, die eine Zytotoxizität von mehr als 10% im Vergleich zu den Kontrollvertiefungen zeigten.
ELISA-Messung der Induktion des Antikörpers gegen CC-36-Tumor
ELISA-Platten wurden mit 10 μg/Vertiefung CC-36-Tumorzellensonifikat in Bikarbonat-Puffer (pH 9,4) beschichtet. Ungebundene Stellen, die zur nicht-spezifischen Bindung fähig waren, wurden mit 1% humanem Serumalbumin blockiert und über Nacht bei 4°C inkubiert. 100 μl des gelösten Serums von immunisierten Mäusen wurden pro Vertiefung zugegeben und bei 4°C über Nacht inkubiert. Die Tests schlossen eine Negativkontrolle ein, unter Verwendung von normalem Mausserum. Die Platten wurden dreimal mit PBS gewaschen. 100 μl einer 1:1000 Verdünnung eines zweiten biotinylierten Antimaus-Antikörpers der Ziege (Sigma, St. Louis, MO) wurde zu jeder Vertiefung zugegeben. Nach Inkubation bei 37°C für eine Stunde wurden die Platten dreimal mit PBS gewaschen und mit 100 μl Avidin-Alkaline-Phosphatase-Konjugat (Sigma, St. Louis, MO) (1 1000 Verdünnung) für 30 Minuten inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit PBS gewaschen, und es wurden 100 μl P-Nitrophenylphosphat-Substrat (PNPP; Sigma, St. Louis, MO) zugegeben. Nach 30 Minuten wurde die Reaktion durch Zusatz von 50 μl 3 M-Natirumhydroxid pro Vertiefung abgestoppt. Die von dem ELISA-Test erhaltenen OC₄₀₆-Werte zeigten den Titer der Antitumor-Antikörper an.
Statistische Analyse
Es wurde eine statistische Vorhersage verwendet, um die Gesamtanzahl von Tieren (10), die pro Behandlungsgruppe erforderlich sind, herauszufinden, so dass ein Unterschied von 30–40% beim Behandlungsarm gegenüber der neuen Krebsvakzinbehandlung mit einem 85%-Konfidenz-Intervall erzeugt wurde. Der Student's-T-Test und die Wilcoxon-Überlebensanalyse oder die Log-Rank-Überlebensanalyse wurden verwendet, um den Unterschied zwischen den Vakzingruppen zu bestimmen.
Ergebnisse
Es wurden vier getrennte Experimente in dieser murinen Modelluntersuchung durchgeführt. 2 zeigt die Wirksamkeit der verschiedenen Vakzinpräparationen auf das Tumoraufkommen mit 5 ± 2 mm Durchschnittsdurchmesser während der 30 Tage nach der Tumorimplantation. Lediglich eine Maus in der CVACII-Vakzin-Gruppe (Gruppe I) entwickelte einen Tumor (10%). In anderen Gruppen war das beobachtete Tumoraufkommen während des 30-Tage-Zeitraums 50–100%. Somit war das Tumoraufkommen in Gruppe I im Vergleich zu anderen Gruppen signifikant reduziert (p < 0,05). Gruppe V stellt Mäuse dar, die mit einem typischen DC-basierten Vakzin behandelt wurden. Zusätzlich wurde ein Überlebensexperiment unter Verwendung derselben Behandlungsgruppen und desselben Tumorinduktionsprotokolls durchgeführt. Es wurde eine Autopsie an jeder Maus durchgeführt, um die Todesursache herauszufinden. Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt. Bei dieser Überlebensuntersuchung überlebten 90% der Mäuse, die eine rIL-2VV + DC/M-rIL-2VV-CS (CVACII)-Behandlung erhielten, für mehr als 100 Tage nach der Tumortransplantation. Die Überlebensrate für Mäuse in anderen Gruppen betrug 0–60%. Somit erzeugte die rIL-2VV + DC/M-rIL-2VV-CS-Behandlung eine signifikant bessere Überlebensrate im Vergleich zu anderen Behandlungen (p < 0,05). Die in 2 und 3 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass eine rIL-2VV + DC/M-rIL-2VV-CS-Therapie eine signifikante und andauernde Antitumor-Antwort induziert.
Der Induktionsmechanismus der Antitumor-Antwort durch eine rIL-2VV + DC/M-rIL-2VV-CS-Therapie wurde in vivo unter Verwendung von Mäusen bestimmt, die entweder in CD4^–-Helfer-T-Zellen oder CD8^–-zytolytischen T-Zellen depletiert waren (4) und in vitro unter Verwendung von PBL von Mäusen, die mit rIL-2VV + DC/M-rIL-2VV-CS behandelt waren (5). Am zweiten Tag nach der Tumorinduktion wurden die Mäuse der Gruppe II mit 0,5 ml Anti-CD4-Antikörper enthaltenden Ascites injiziert, und Mäuse in der Gruppe III wurden mit 0,5 ml Anti-CD8-Antikörper enthaltenden Ascites injiziert. Mäuse in der Gruppe I, II und III wurden dann mit rIL-2VV + DC/M-rIL-2VV-CS an Tag 4, 11 und 18 behandelt. Mäuse der Gruppe IV erhielten keine Behandlung nach der Tumorinduktion. Das Tumoraufkommen in jeder Gruppe wurde alle 2 bis 3 Tage überprüft und aufgezeichnet. Gruppen I und II zeigten einen ähnlichen Schutz gegen die Tumorentwicklung. Dieser Schutz ist signifikant höher als der Tumorschutz in den Gruppen III und IV. Mäuse, bei denen CD4⁺-Helfer-T-Zellen depletiert waren, zeigten einen Schutzgrad gegen einen Tumor ähnlich dem von CD4⁺/CD8⁺-Mäusen, die mit rIL-2VV + rIL-2VV-CS behandelt wurden. Jedoch zeigten Mäuse, bei denen zytolytische CD8⁺-T-Zellen depletiert waren, keinen Schutz gegen eine Tumorentwicklung als Antwort auf die IL-2VV + DC/M-rIL-2VV-CS-Therapie (4). Diese Ergebnisse zeigen, dass die durch das rIL-2VV + DC/M-rIL-2VV-CS induzierte Antitumor-Antwort aufgrund der Induktion von zytolytische CD8⁺-T-Zellen zurückzuführen ist.
Die Analyse von PBL aus Mäusen, die mit einer rIL-2VV + DC/M-rIL-2VV-CS-Therapie behandelt wurden, zeigte eine signifikant höhere Zytotoxizität gegen einen CC-36-Tumor (5). Mäuse (n = 20 pro Gruppe) wurden entweder mit CVACII oder DC/M-CS (Standardtyp DC-Vakzin; Kontrolle) an Tag 1, 7 und 14 behandelt. PBL wurden gesammelt und mit CVACII oder einer Kontrolle für 5 Tage in vollständigem RPMI-Medium, das 10 Einheiten rIL-2 enthielt, gesammelt und stimuliert. Die PBL wurden dann auf Zytotoxizität in einem ⁵¹Cr-Freisetzungsassay unter Verwendung von CC-36-Zellen (5, obere Hälfte) und YAC-1-Zellen (untere Hälfte) als Ziele von verschiedenen Effektor-zu-Zielverhältnissen getestet. PBLs von Mäusen, die mit CVACII immunisiert waren, zeigten eine höhere Zytotoxizität gegenüber CC-36-Zellen im Vergleich zu PBLs von Mäusen, die mit dem Kontrollvakzin immunisiert waren. Diese Ergebnisse und die in vivo – Experimente weisen auf die Beteiligung von positiven zytolytischen CD8^–-T-Zellen in der durch die CVACII-Therapie induzierte Antitumor-Antwort hin.
BEISPIEL 2
Präparation und klinischer Test des CVACII-Melanom-Vakzins in Menschen
Herstellung und Verabreichung von CVACII
Die Herstellung und Verabreichung von CVACII an Krebspatienten umfasst die folgenden Schritte: Herstellung eines rekombinanten Vaccinia-Virus mit klinischem Grad, das für humanes Interleukin-2 (rIL-2VV) kodiert; Herstellung von Melanomzelllinien mit klinischem Grad, die von Menschen mit einem metastatischen Melanom stammen; Inkubation von rIL-2VV mit Melanomzellen für einen ausreichenden Zeitraum; Aufbrechen der Melanomzellen durch Sonifizierung und Isolierung des Vaccinia-Virus, des entkernten Zytosols und der Zellmembranen; Bestrahlung des Melanom-Sonifikats (MS) durch UV, um das Virus zu inaktivieren; Herstellung von dendritischen/Monozyten-Zellen (DC/M) vorzugsweise vom eigenen Blut des Patienten; Pulsieren der DC/M mit einem Melanom-Sonifikat, um eine DC/M-MS-Präparation zu erhalten; Impfung eines Patienten, als erstes mit rIL-2VV und dann mit der DC/M-MS-Präparation, vorzugsweise subkutan und vorzugsweise an den Stellen in der Nähe der regionalen Lymphknoten.
Verabreichungsverfahren
In dem ersten Schritt des zweistufigen Verfahrens wurde vitales rIL-2VV (10⁷ PFU) subkutan oder intradermal in wenigstens 4 bis 6 Stellen in der Nähe der regionalen Lmyphknotengruppen injiziert. Diese Stellen befanden sich am vorderen Oberschenkel, dem Oberarm oder dem vorderen Brustkorb. Ungefähr dreißig Minuten wurden die DC/M-MS an im Wesentlichen denselben Stellen injiziert wie die anfängliche rIL-2VV-Injektion. Das Vakzin wurde einmal alle zwei Wochen für drei Monate und danach alle drei Monate für ein oder zwei Jahre oder bis zum erneuten Auftreten oder Fortschreiten der Krankheit verabreicht.
Herstellung von IL-2-kodierendem rekombinantem Vaccinia-Virus
Rekombinantes II-2-kodierendes Vaccinia-Virus (rVV-IL-2) wurde unter Verwendung eines Wyeth-Stamm Vaccinia-Virus mit klinischem Grad hergestellt (einem Virusstamm ähnlich dem, der bei dem VMO-Vakzin der ersten Generation verwendet wurde) sowie unter Verwendung des rekombinanten humanen IL-2-Gens (pTCGF-11, Nr. 39673, ATCC, Manassas, VA) durch ein im Stand der Technik etabliertes molekulares Verfahren. Das Verfahren zur Konstruktion eines rVV ist im Detail an anderer Stelle beschrieben (Sivanandham, M., Scoggin, D.S., Tanaka, N., Levi, M., Wallack, M.K., Therapeutic effect of a vaccinia colon oncolysate prepared with interleukin-2-gene encoded vaccinia virus studied in a syngeneic CC-36 murine colon hepatic metastasis model, Cancer Immunol. Immunother. 38:259-264, 1994; Lee, S.S., Eisenlohr, L.C., McCue, P.A., Mastrangelo, M.J., Lattime, E.C., Vaccinia virus vector mediated cytokine gene transfer for in vivo tumor immunotherapy, Proc. Am. Assoc. Can. Res. 1035:514, 1994). Kurz gesagt, wurde ein humaner, für das IL-2-Gen spezfiischer cDNA-Klon von einer für IL-2 kodierenden Plasmid-DNA unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme isoliert. Dieses IL-2-Gen wurde unter Verwendung einer Füllreaktion mit Blunt-Enden versehen und in die Smal-Restriktionsstelle in dem tK-Gen-Segment des Plasmids pSC65 ligiert.
Das das IL-2-Gen enthaltende pSC65-Plasmid und das Wyeth-Stamm-Vaccinia-Vakzin-Virus (das auch das tK-Gen in der nicht essentiellen Region enthält) wurden einer homologen Rekombination in CV-1-Zellen wie folgt unterworfen. Als erstes wurde eine CV-1-Zell-Monoschicht mit dem Vaccinia-Vakzin-Virus (eine Zelle bis ein PFU Virus) für zwei Stunden infiziert. Die für IL-2 kodierende Plasmid-DNA wurde dann in diese Zellen unter Verwendung eines Kalzium-Chlorid-Verfahrens transduziert. Fünf (5) ml Kulturmedium wurde zu der CV-1-Zellkultur gefolgt von einer Inkubation für drei Stunden zugegeben. Das Medium wurde entfernt, und es wurden 5 ml frisches Medium zugegeben. Die Zellkultur wurde für 48 Stunden in einem CO₂-Inkubator inkubiert. CV-1-Zellen von der Kultur wurden abgekratzt und mit dem Medium gesammelt. Das Virus wurde von den Zellen durch 3 Auftau- und Gefrier-Zyklen, gefolgt von einer Sonifikation für 1 Minute, in einem Bad-Sonifikator freigesetzt. Die rekombinanten viralen Klone wurden für Wachstum auf tK-143B-Zellen in der Gegenwart von 5-Brom-Desoxyuridin (BUDr) und 5-Brom-Chlor-3-Inodyl-Beta-D-Galaktosid (X-gal) ausgewählt. Es wurden blaue Plaques gewählt und für wenigstens 3 weitere Zyklen einer Plaque-Isolation aufgereinigt. Das so erhaltene rIL-2VV wurde in Mäusen auf dessen Zytotoxizität getestet sowie in vitro auf das Fehlen von Bakterien, Pilzen und Mykroplasmen. Das Vorliegen des Vaccinia-Virus in der rIL-2VV-Präparation wurde durch einen Antikörper-Neutralisations-Assay unter Verwendung eines polyklonalen Anti-Vaccinia-Antikörpers bestätigt. Es wurden auch Tests durchgeführt, um eine Kontamination mit humanen infektiösen Viren wie HIV, HPV und HBV auszuschließen. Es wurde eine Saatcharge mit 10⁹ Plaque-bildenden Einheiten von rIL-2VV angelegt.
Melanom-Zelllinien
Melanomzellen stammten von fünf etablierten Melanom-Zelllinien Mel-2, Mel-3, Mel-4, Mel-6 und Mel-9 ab. Diese Zellen stammten ursprünglich von Patienten mit einem metastatischen Melanom. Diese Zellen exprimieren wenigstens zwei HLA Klasse 1-A-Antigene. Diese Zellen exprimieren auch eine Vielzahl von Melanom-Antigenen. Die Melanom-Zelllinien wurden hinsichtlich der Expression von Melanom-Antigenen charakterisiert, die Melanom-spezifische Antikörper und zytolytische T-Zellen induzieren. Die Zellen enthielten charakteristische zelluläre Melanom-Bestandteile wie Melanosome und Prä-Melanosome, die mikroskopisch detektiert werden konnten. Die Zellen waren frei von Kontaminanten wie Bakterien, Mykroplasmen, Viren und anderen gefährlichen biologischen Agenzien. Eine Samencharge wurde für jede Melanom-Zelllinie etabliert. Ein Gefäß mit dieser Samencharge wurde für die Herstellung eines Vakzin-Batches verwendet.
Herstellung von Melanom-Sonifikat (MS), das rekombinantes Vaccinia-Virus enthält (rIL-2VV-MS)
Eine Einzelzellsuspension von Melanomzellen wurde gegenüber einer rIL-2VV-Präparation mit einem Verhältnis von ungefähr 10 Zellen bis ungefähr 1 PFU des rIL-2VV ausgesetzt. Das Verhältnis kann variieren und kann sich irgendwo zwischen ungefähr 1000 bis 0,001 Zellen bis ungefähr 1 PFU Virus befinden. Nach der Inkubation für 24 Stunden (virale Replikation ist noch nicht wesentlich zytolytisch, und im Wesentlichen sind alle Zellen intakt) in einem CO₂-Inkubator wurden die Melanom-Zellen durch Zentrifugation bei ungefähr 1200 Upm für 10 Minuten in einer gekühlten Zentrifuge aufgetrennt. Der Überstand (S1) wurde entnommen, und das Zellpellet (P1) wurde in PBS aufgelöst. Die Zellen wurden durch Sonifikation unter Verwendung eines Sonifikators (1500 Watt, Heat System XL Serie) für ungefähr 1 Minute aufgebrochen. Die Sonifikation wurde ungefähr dreimal wiederholt, oder bis alle Zellen aufgebrochen waren, jedoch waren die Zellkerne noch intakt (was unter dem Mikroskop festgestellt wurde). Das Gemisch der aufgebrochenen Zellen wurde dann bei ungefähr 800 Upm for 10 Minuten abzentrifugiert, und das entstehende Melanomsonifikat (MS), das die Vaccinia-Virus-Partikel, das entkernte Zytosol und die Zellmembranen enthielt, wurde entnommen (das Pellet, das hauptsächlich Zellkerne enthielt, wurde verworfen). Der Überstand S1 wurde bei ungefähr 100.000 g für 30 Minuten unter Verwendung einer Ultrazentrifuge abzentrifugiert, um das Virus von dem Überstand zu pelletieren. Das Pellet wurde mit dem Zellkernfreien Melanom-Zell-Sonifikat (MS) kombiniert, um die rIL-2VV-MS-Präparation herzustellen. Jede Melanom-Zelllinie wurde auf dieselbe Weise getrennt verarbeitet. Das rIL-2VV-MS von jeder Melanom-Zelllinie wurde dann in eine Petrischale gegebenen, ungefähr 10 cm von einer keimtötenden UV-Lampe entfernt (Kurzwellen-UV, 256 nm, 1,5–1,75 Mikrowatt/cm²) für ungefähr 1 Stunde, um das Vaccinia-Virus zu inaktivieren. Melanom-Sonifikate von allen fünf Melanom-Zelllinien wurden in einem gleichen Zell-Anzahl-Verhältnis gemischt. Eine Einheit rIL-2VV-MS enthielt die äquivalente Menge von ungefähr 10⁷ ursprünglichen Melanomzellen und 10⁶ PFU rIL-2VV. Die rIL-2VV-MS-Präparationen wurden in 1 ml -Gefäßen mit Kochsalzlösung (0,9% Natrium-Chlorid-Lösung) gelöst und bei –70°C bis zum Gebrauch gelagert.
100 ml peripheres Blut wurde von dem Patienten gesammelt, und 50 ml wurden für eine HLA-Analyse zurückgestellt. Dendritische Zellen wurden von den verbleibenden 50 ml wie folgt isoliert. Periphere Blutlymphozyten (PBL) wurden vom Blut unter Verwendung eines Lymphozyten-Auftrennmediums isoliert (Ficoll-Hypaque oder Lymphozyten-Auftrennmedium (LSM), Litton). Das Blut wurde in sterilen heparinisierten Gefäßen gesammelt, in balancierter Hank's Salzlösung (HBSS) verdünnt, auf eine Ficoll-Hypaque überlagert und bei 400 g für 30 Minuten zentrifugiert. Zellen an der LSM-wässrigen Zwischenphase wurden dann geerntet, zweimal in HBSS gewaschen und in Trypanblau gezählt, um die Lebensfähigkeit zu bestimmen. Die PBL wurden bei 10⁶ Zellen/ml in vollständigem RPMI-1640-Medium mit 10% FBS und 1 mM Glutamin gelöst, in ein T75-Gewebe-Kultur-Gefäß überführt und für 2 Stunden bei 37°C in einem CO₂-Inkubator inkubiert. Das Gefäß wurde dann mindestens viermal mit vollständigem RPMI-Medium gewaschen, um nicht adherente Zellen zu entfernen. Nach der letzten Waschung wurden 35 ml vollständiges RPMI-1640-Medium zu dem Gefäß zugegeben, gefolgt von einer Inkubation über Nacht (ungefähr 18 Stunden). Am nächsten Tag wurden die schwimmenden, nicht adherenten Zellen (dendritische Monozytenzellen) mit Medium gewaschen und in ein neues Gefäß überführt mit vollständigem RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 2.000 Einheiten/ml IL-4 und 2.000 Einheiten/ml GM-CSF und für 18 bis 24 Stunden in einem CO₂-Inkubator inkubiert (eine erhöhte DC-Ausbeute kann durch Zusatz von FLT-3-Ligand erhalten werden, welcher ein dendritischer Zellwachstumsfaktor in vivo ist). Die Ausbeute von DC/M wurde gemessen, und die Zellen wurden weiter für ungefähr 5 Tage in einem CO₂-Inkubator kultiviert. Im Allgemeinen wurden 1–5 × 10⁶ lebende DC/M-Zellen nach 5 Kulturtagen erhalten (die Kulturzeitdauer kann länger sein, um eine größere Anzahl von Zellen zu erhalten). Am Tag vor der Verabreichung von DC/M-MS wurden kultivierte DC/M von dem Gefäß geerntet, einmal mit PBS gewaschen und mit 1 ml Einheit rIL-2VV-MS in 5 ml AIM V-(serumfreien) Medium, enthaltend 2.000 Einheiten/ml IL-4 und 2.000 Einheiten/ml GM-CSF. Die Passage durch das serumfreie Medium war beabsichtigt, um die assoziierten toxischen Wirkungen durch die Verabreichung einer bovines Serum enthaltenden Präparation an eine Testperson zu eliminieren. Das Gemisch wurde in einem Glasgefäß bei 37°C über Nacht inkubiert (ungefähr 18 Stunden), um Zeit zur Verarbeitung und Präsentation von Tumor- und Vaccinia-Virus-Antigenen zu schaffen. Die Mindestzeit für eine Antigen-Präsentation beträgt ungefähr 6 Stunden. Am nächsten Tag wurden die entstehenden DC/M-MS herunterzentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen (ein Aliquot wird für einen Endotoxintest gesichert). Die DC/M-MS wurde in 1 ml rIL-2VV-MS rekonstituiert und in 5 bis 6 Allquoten zur Verabreichung an die Testperson aufgeteilt.
Beobachtung der Induktion von Immunantworten
Indikationen der Induktion einer Anti-Melanom-Immunität in Patienten, die mit dem Melanom-Vakzin behandelt wurden, sind zur Bestimmung der Wirksamkeit des Vakzins nützlich. Diese Indikationen sind insbesondere im frühen Stadium der Vakzintherapie wertvoll, wenn klinische Endpunkt-Ergebnisse noch nicht verfügbar sind. Die Induktion einer Anti-Melanom-Immunität wurde durch Bestimmung der Spättyp-Hypersensitivität (DTH)-Antwort gegenüber Melanom-Antigenen vor und drei Monate nach der Melanom-Vakzin-Behandlung analysiert. Zusätzlich wurden Serum- und periphere Blutlymphozyten vor der Vakzin-Injektion und einen Monat nach der Vakzin-Injektion erhalten, um die Induktion der Anti-Melanom-Immunität durch einen Zytotoxizitätsassay, CTL-Vorläufer-Häufigkeit (CTLp)-Assay und Phänotypische Analyse von Lymphozyten zu testen.
Spättyp-Hypersensitiväts (DTH)-Test
Dieser Test wurde durchgeführt, um die Immunantwort gegen Melanom-Antigene zu bestimmen. Wenn ein Patient positiv auf HLA A1 war, dann wurden Melanom-Peptid-Antigen-MAGE-1-beladene DC/M verwendet. Wenn ein Patient positiv auf HLA A2 war, dann wurden MAGE-3-, MART-1- oder gp100-Melanom-Antigen-beladene DC/M verwendet. Das MAGE-1-Peptid hat eine Aminosäuresequenz NH₂-EADPTGHSY-COOH, das MAGE-3-Peptid hat eine Aminosäuresequenz NH₂-EVDPIGHLY-COOH, und das MART-1- Peptid hat eine Aminosäuresequenz NH₂-AAGIGILTV-COOH. Die Peptide stammen von einer kommerziellen Quelle. Die Reinheit dieses Peptids betrug > 90% und zeigte einen einzelnen Peak bei der Massenspektrumanalyse. Diese Peptide wurden in reinem Wasser mit 1 mg/ml rekonstituiert und durch Filtration durch einen 0,2 μm Sterilfilter sterilisiert. Die rekonstituierten Peptide wurden mit 1 ml pro Gefäß aliquotiert und bei –70°C eingefroren. Zehn Millionen DC/M in 1 ml Medium, das 50 bis 200 μg Peptid enthielt, wurden bei 37°C für 4 Stunden inkubiert. Die Peptid-beladenen DC/M wurden zweimal mit Medium gewaschen und dann in 100 μl PBS zur Injektion gehalten, um eine DTH-Antwort, einen in vitro Zytotoxizitäts-Assay, eine Proliferation und einen ELISPOT-Assay durchzuführen.
Beim DTH-Test wurden die Melanom-Peptid-Antigen-pulsierten autologen DC/M (10^5-6) subkutan in der Deltamuskelregion injiziert. Nach 48 Stunden wurde die Abhärtung gemessen und fotografiert. Der Patient erhielt auch reine DC/M als Kontrolle in den anderen Arm. Wenn eine DTH-Stelle eine Antwort zeigte, wurde an der Stelle eine Biopsie durchgeführt und auf das Vorliegen von CTLp durch einen CTLp-Häufigkeitsassay sowie auf das Vorliegen von zytotoxischen Lymphozyten durch den ⁵¹Cr-Freisetzungsassay analysiert. Zusätzlich wurde eine Immunhistologie durchgeführt, um den Phänotyp von Tumor-infiltrierenden Lymphozyten zu analysieren. Der DTH-Test wurde vor der Einleitung der CVACII-Therapie und einen Monat nach der Einleitung der Therapie durchgeführt.
Lymphozyten vom Blut (PBL) und Lymphozyten von DTH-Stellen
Es wurden zelluläre Assays wie CTL-Assay und CTLp-Assay unter Verwendung von peripheren Blutlymphozyten (PBL) des Patienten als Wirkzellen durchgeführt. Die PBL wurden vom Blut wie oben beschrieben geerntet. Infiltrieren der Lymphozyten an den DTH-Stellen wurden von Biopsien isoliert, die an den Peptid-pulsierten DC/M-injizierten Stellen entnommen wurden. Die Biopsien wurden auch an den Kontroll-DC/M-injizierten Stellen entnommen. Die Isolierung von Lymphozyten aus dem Biopsiegewebe wurde durch eine Kollagenase-Behandlung durchgeführt. Das Gewebe wurde zerkleinert und in 10 ml RPMI-Medium, das Kollagenase-DNase enthielt (1,4 mg Kollagenase Typ IV und 1,0 mg DNase pro ml) für 3 bis 4 Stunden bei 37°C gehalten. Die Zellen wurden dreimal mit Medium gewaschen und über Nacht in einem CO₂-Inkubator inkubiert. Am nächsten Tag wurden nicht-adherierende Lymphozyten von den adherierenden Fibroblastenzellen aufgetrennt und in Anwesenheit von IL-2 enthaltendem Medium und Peptid-pulsierten DC/M für 1 bis 2 Monate kultiviert. Diese Lymphozyten wurden Phänotypisch bestimmt und auf Peptid-spezifische CTL und CTLp getestet.
Zytolytischer Assay
MAGE-1, MAGE-3, MART-1/Melan A oder eine gp100-peptidspezifische zytolytische Aktivität von PBL wurde unter Verwendung eines standardgemäßen Chromfreisetzungs-Assays gemessen. Frisch hergestellte PBL oder gefrorene PBL von mehreren Zeitintervallen wurden in demselben Assay getestet. Melanom-Zelllinien, die sowohl auf HLA-A1 als auch MAGE-1 (wenn der Patient A1-positiv ist) oder sowohl auf HLA-A2 und MAGE-3, MART-1/Melan A oder gp100 (wenn der Patient A2-positiv ist) positiv waren, sowie autologe DC/M-pulsierte Zellen mit den oben genannten Peptid-Antigenen wurden als Stimulatoren in diesem Assay verwendet. PBL von Patienten, die mit Melanom-Antigen stimuliert waren, wurden in IL-2-RPMI-Medium für wenigstens 3 Wochen kultiviert und in diesem Assay verwendet. Zielzellen in dem Assay enthielten routinemäßig zwie Melanom-Zelllinien, normale Hautfibroblasten, die mit dem jeweiligen Peptid pulsiert waren, und Ertythroleukämie-Linie K-562. Für den Assay wurden die Zielzellen geerntet, gewaschen und mit 100 μCi Natriumchromat/10⁶ Zellen in 0,5 ml Volumen für 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach viermaligem Waschen mit RPMI 1640 wurden die radioaktiv markierten Zielzellen bei 10⁴/ml in 100 μl Volumen zu konförmigen Mikrotiterplatten (Costar) zugegeben. Das Verhältnis von Effektor zum Ziel (E:T) 40:1 bis 5:1 wurde in Vierfach-Vertiefungen verwendet. Die Platten wurden bei 250 g für 5 Minuten zentrifugiert und bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO₂ inkubiert. Um die maximale Freisetzung zu bestimmen, wurden 0,1 ml 1% Natrium-Dodekyl-Sulfat-Lösung zu den jeweiligen Vertiefungen zugegeben. Am Ende der 4 Stunden wurden die Überstände von den Vertiefungen auf Faserfiltern geerntet und dann für eine Minute auf einem Gammazähler gezählt. Die Zähler pro Minute (cpm) wurden verwendet, um die prozentuale Freisetzung (%R) entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Formel zu berechnen.
Der ELISPOT-Assay kann verwendet werden, um die CTLp, die für ein Melanom-Peptid-Antigen spezifisch sind, zu quantifizieren. Dieser Assay kann entsprechend einem veröffentlichten Verfahren durchgeführt werden, jedoch mit einer leichten Modifikation (Miyahira, Y. et al., Quantification of antigen specific CD8+T cells using an ELISPOT assay, J. Immunol. Meth. 181:45-54, 1995). Vertiefungen in einer Platte mit 96 Vertiefungen werden mit 10 μg/ml anti-humanen IFN-γ-der Maus in 75 μl PBS beschichtet und über Nacht bei Raumtemperatur unter einer laminaren Abzugshaube inkubiert. Die Platte wird dreimal mit Kulturmedium gewaschen (vollständiges RPMI-1640). Die letzte Waschung wird mit Medium durchgeführt. PBL in den Mengen 10⁴, 5 × 10⁴, 10⁵ oder 5 × 10⁶ PBL (10⁶ für frisches PBL) in 50 μl Medium wurden zu jeder Vertiefung zugegeben. Wenigstens 25 Replikate werden für jede Verdünnung gehalten. Peptid-pulsierte DC/M bei einem Verhältnis zu PBL von 1:1 werden zu jeder Vertiefung zugegeben und für 24 bis 48 Stunden in einem CO₂-Inkubator inkubiert. Die Vertiefungen werden mit PBS, enthaltend 0,05% Tween 20, gewaschen. Fünfzig (50) μl (5 μg/ml) biotinyliertes Maus-Anti-Interferon-Gamma (mit unterschiedlichem Klon) werden zu jeder Vertiefung zugegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Am nächsten Tag werden die Vertiefungen dreimal mit PBS-Tween 20 gewaschen, und es werden 50 μl Avidin-Peroxidase zugegeben (entsprechend den Empfehlungen des Herstellers). Die Platte bei 37°C für 1 Stunde inkubiert und zweimal mit PBS-Tween und einmal mit PBS (ohne Tween-PBS) gewaschen. Fünfzig (50) μl Tris-HCl (50 mM und pH 7,5), enthaltend 3,3 Diaminobenzidin-Tetra-Hydrochloryd-Dehydrat (DAM) (1 mg/ml) und 5 μl/ml 30% Wasserstoffperoxyd wird zugegeben und ermöglicht, eine Färbung zu entwickeln. Schwarz-grüne Punkte in jeder Vertiefung werden unter Verwendung eines einfachen Mikroskops gezählt. Die Anzahl der Punkte für jede Verdünnung wird berechnet und verglichen.
Immunphänotypisierung
Periphere Blutlymphozyten und DTH-infiltrierende Lymphozyten werden auf CD4, CD8, CD16 und CD25 unter Verwendung direkter oder indirekter Immunfluoreszenz- oder immunhistologischer Verfahren phänotypisiert. Geeignete monoklonale Antikörper für CD4, CD8, CD16 und CD25 werden von kommerziell verfügbaren Quellen bezogen. DC/M wurden auf die Expression von CD80, CD85, CD11b und 1a-Antigene phänotypisiert.
Expression von IL-2 an der Vakzin-Injektionsstelle
Es wurden Stech-Biopsien von den Vakzin-injizierten und Kontroll-Vakzin-injizierten Stellen entnommen. Wenigstens eine Vakzin-Biopsie und eine Kontroll-Vakzin-Biopsie wurde zu jedem Zeitpunkt in dem Injektionsplan entnommen und auf das Vorliegen von IL-2 getestet. Für die Immunhistologie wurde gefrorenes Biopsiegewebe zur Herstellung von 6 μm Gewebesektionen auf behandelten Glasobjektträgern verwendet, die dann für 30 Minuten bei Raumtemperatur luftgetrocknet wurden. Das Gewebe wurde mit Situfix (Kreatech Diagnostics) fixiert und dann mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS) zweimal gewaschen. Ein Tropfen des grob verdünnten Biotinyl-Antikörpers gegen humanes IL-2 (Konzentration 5 μg/ml) wurde zugegeben und in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur für 30 Minuten bis 1 Stunde inkubiert. Der Objektträger wurde dreimal mit PBS gewaschen und dann mit einer in geeigneter Form verdünnten Avidin-Peroxidase für 30 Minuten inkubiert. Der Objektträger wurde zweimal mit PBS gewaschen und dann mit einem Tropfen Dioaminobenzindin (1,3 mM DAB in PBS, enthaltend 0,02% Wasserstoffperoxyd) für 20 bis 30 Minuten behandelt. Der Objektträger wurde mit PBS gewaschen und mit Alkohol und Xylen dehydriert und mit DPX gerahmt. Eine bräune Färbung deutet auf das Vorliegen von IL-2 hin.
Statistische Analyse
Alle immunologischen Tests verglichen die Induktion der Immunität in prä- und post-behandelten Proben. In diesen Analysen wurde ein ANOVA-statistisches Verfahren verwendet, um Veränderungen aufgrund der Vakzin-Therapie festzustellen.
Ergebnisse
Der Patient erhielt sechs zweiwöchentlich verabreichte subkutane Injektionen von CVACII über drei Monate (Induktionsphase). Klinisch gesehen wurden keine schweren Nebenwirkungen festgestellt, außer leichtem Fieber, Kopfschmerzen sowie eine Entzündung und ein Anschwellen der Impfstellen. Nach der Impfung enthielten die peripheren mononuklearen Zellen eine erhöhte Anzahl von proliferativen Tumor-reaktiven und zytolytischen Zellen. Im Allgemeinen hatte der Patient keine DTH-Antwort vor der Melanom-Vakzin-Therapie. Jedoch trat eine DTH-Antwort auf, wenn sie nach Beendigung der Induktionsphase getestet wurde.
Die Immunitätsfähigkeit gegenüber üblichen Antigenen wurde unter Verwendung des Multitests CMI (Pasteur-Merieux Connaught Laboratories, Swiftwater, PA) vor der Vakzinbehandlung und zwei Wochen nach der Einleitung der Vakzinbehandlung getestet. Der Patient zeigte eine Reaktion auf wenigstens eines der acht Antigene in dem Multitest vor der Behandlung, und eine Reaktion auf wenigstens einen der acht Test-Antigene. Weiter zeigte der Patient eine Vitiligo (Verfärbung der Haut) in der Nähe der Vakzin-injizierten Stellen, was auf Induktion der Antimelanozyten-Immunantwort hinweist.
Mehrere in vitro-Assays wurden ebenfalls unter Verwendung von Prä- und Post-Impfblut durchgeführt. Post-Immun-PBL zeigten eine verstärkte Proliferation gegenüber Melanom-Antigenen sowie eine erhöhte Anti-Melanom-Zytotoxizität (6 bzw. 7). 6 zeigt eine Proliferation von Prä-Immun-PBL und Post-Immun-PBL oder fraktionierter CD8⁺-T-Zellen gegen autologe dendritische/Monozyten-Zellen, die mit gereinigtem Melanom-Peptid-Antigen (MART-1 ), dem HLA-angepassten Allogen-Melanom-Zelllysat des Patienten (Mel-9), von Melanomzellen abgeleitetem Zelllysat, die nicht an den HLA des Patienten angepasst sind (Mel-2), oder Zelllysaten von eigenen Tumorzellen des Patienten gepulst wurden. Im Vergleich zu Prä-Immun-PBL zeigten Post-Immun-PBL oder CD8-T-Zellen eine erhöhte proliferative Antwort auf alle Melanom-Antigen-Quellen. 7 zeigt die Zytotoxizität von Prä- und Post-Immun-PBL eines Patienten, der mit der CVACII immunisiert war. PBL wurden von dem Blut isoliert und mit Melanom-Antigen-pulsierten DC/M für 1 bis 3 Wochen in vollständigem RPMI-Medium, enthaltend 10 Einheiten/ml IL-2, stimuliert. Im Vergleich zu Prä-Immun-PBL zeigten Post-Immun-PBL eine erhöhte Lyse gegenüber den HLA-angepassten Melanom-Zellen des Patienten (Mel-9). Obwohl die Post-Immun-PBL eine erhöhte Lyse von Melanom-Zellen zeigten, welche nicht die HLA des Patienten teilen (Mel-2), war dieser Anstieg lediglich moderat. Post-Immun-PBL zeigten auch eine erhöhte Zytotoxizität gegenüber dem NK-Ziel K562. Die Immunreaktion war spezifisch, da die Antwort des Patienten ausgeprägter war, wenn der HLA-Typ passte. Mehrere andere Assays wie ELISA wurden durchgeführt, um die Herstellung von Antikörpern gegen Melanom-Antigene zu zeigen; eine Immunphänotypisierung der Zellen, welche die DTH-Stelle infiltrierten, und das Testen der Vakzin-injizierten Stellen auf eine IL-2-Produktion wurde ebenfalls durchgeführt. Zusätzlich zeigte die Induktion einer Anti-Melanom-Immunität eine Immunantwort gegenüber synthetischen Melanom-Peptid-Antigenen und den eigenen Tumorzell-Antigen-pulsierten dendritischen Zellen des Patienten. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass eine CVACII-Impfung positive immunologische Veränderungen im Krankheitsendstadium des Patienten zeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Immunisierung mit CVACII eine zelluläre Immunität verleiht und das Tumorwachstum verzögert, wodurch somit das Überleben der Patienten, die an dem Melanom leiden, verlängert wird.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf den Umfang der beispielhaften Ausführungsformen beschränkt, die lediglich der Veranschaulichung von einzelnen Aspekten der Erfindung dienen sollen. Verschiedene Modifikationen der Erfindung neben den hier gezeigten und beschriebenen werden für den Fachmann aufgrund der Beschreibung und den nachfolgenden Zeichnungen ersichtlich. Solche Modifikationen sollen in den Umfang der folgenden Ansprüche fallen. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Immuntherapeutisches Vakzin, umfassend: (a) einen ersten Bestandteil, der ein erstes rekombinates Vacciniavirus umfasst, das wenigstens für IL-2 kodiert, und (b) einen zweiten Bestandteil, der Antigen-präsentierende Zellen umfasst, die mit einer Präparation gepulst sind, die entkerntes Cytosol und Zellmembranen von Krebszellen umfasst, die mit einem rekombinanten Vacciniavirus infiziert sind, das wenigstens für IL-2 kodiert.
Vakzin nach Anspruch 1, wobei das entkernte Cytosol frei von Zellkernen ist.
Vakzin nach Anspruch 1, wobei die Zellmembranen wenigstens zwei HLA-Klasse-I-A-Antigene umfassen.
Vakzin nach Anspruch 1, wobei das erste rekombinante Vacciniavirus ein Lebendvirus ist.
Vakzin nach Anspruch 1, wobei das zweite rekombinante Vacciniavirus entweder lebend oder inaktiviert ist.
Vakzin nach Anspruch 1, wobei die Antigen-präsentierenden Zellen dendritische Zellen und/oder Monozyten sind.
Vakzin nach Anspruch 1, wobei die Antigen-präsentierenden Zellen autologe Zellen sind.
Vakzin nach Anspruch 1, wobei die Krebszellen Melanomzellen sind.
Vakzin nach Anspruch 1, wobei die Antigen-präsentierenden Zellen an einen zu behandelnden Patienten HLA-angepasst sind.
Vakzin nach Anspruch 8, wobei die Melanomzellen eine oder mehrere Zellen aus der Gruppe bestehend aus Mel-2, Mel-3, Mel-4, Mel-6 und Mel-9 umfassen.
Vakzin nach Anspruch 1, wobei die Krebszellen etablierte Krebszelllinien sind.
Vakzin nach Anspruch 1, wobei die Krebszellen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Zellen von Fibrosarkom, Myxosarkom, Liposarkom, Chondrosarkom, Osteosarkom, Chordom, Angiosarkom, Kaposi-Sarkom, Endothelio-Sarkom, Lymphangiosarkom, Lymphangioendothelio-Sarkom, Synoviom, Mesotheliom, Ewing's-Tumor, Leiomyosarkom, Rhabdomyosarkom, Rhabdosarkom, colorektales Karzinom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Brustkrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs, Plattenepithelkarzinom, Basalzellenkarzinom, Adenokarzinom, Schweißdrüsenkarzinom, Talgdrüsenkarzinom, papilläres Karzinom, papilläres Adenokarzinom, Zystadenkarzinom, medulläres Karzinom, Bronchialkrebs, Nierenzellenkarzinom, Hepatom, Gallengangkarzinom, Chorionkarzinom, Seminom, embryonales Karzinom, Wilm's-Tumor, Gebärmutterhalskrebs, Hodentumor, Lungenkarzinom, kleinzelliges Lungenkarzinom, Blasenkarzinom, Epithelkarzinom, Glioma, Astrozytom, Medulloblastom, Kraniopharyngiom, Ependymom, Pinealom, Hämangioblastom, akustisches Neurom, Oligodendrogliom, Meningiom, Neuroblastom, Retinoblastom, Myelom, Lymphom und Leukämie.
Vakzin nach Anspruch 11, wobei die Krebszelllinien ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Zellen von Fibrosarkom, Myxosarkom, Liposarkom, Chondrosarkom, Osteosarkom, Chordom, Angiosarkom, Kaposi-Sarkom, Endothelio-Sarkom, Lymphangiosarkom, Lymphangioendothelio-Sarkom, Synoviom, Mesotheliom, Ewing's-Tumor, Leiomyosarkom, Rhabdomyosarkom, Rhabdosarkom, colorektales Karzinom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Brustkrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs, Plattenepithelkarzinom, Basalzellenkarzinom, Adenokarzinom, Schweißdrüsenkarzinom, Talgdrüsenkarzinom, papilläres Karzinom, papilläres Adenokarzinom, Zystadenkarzinom, medulläres Karzinom, Bronchialkrebs, Nierenzellenkarzinom, Hepatom, Gallengangkarzinom, Chorionkarzinom, Seminom, embryonales Karzinom, Wilm's-Tumor, Gebärmutterhalskrebs, Hodentumor, Lungenkarzinom, kleinzelliges Lungenkarzinom, Blasenkarzinom, Epithelkarzinom, Glioma, Astrozytom, Medulloblastom, Kraniopharyngiom, Ependymom, Pinealom, Hämangioblastom, akustisches Neurom, Oligodendrogliom, Meningiom, Neuroblastom, Retinoblastom, Myelom, Lymphom und Leukämie.
Vakzin nach Anspruch 1, wobei die Krebszellen zu dem mit dem Vakzin zu behandelnden Patienten autolog sind.
Ex-vivo-Verfahren zur Herstellung eines immuntherapeutischen Vakzins, umfassend: (a) In-Kontakt-Bringen von Krebszellen mit einem rekombinanten Vacciniavirus, das für ein immunstimulatorisches Molekül kodiert, wobei das immunstimulatorische Molekül IL-2 ist; (b) Aufbrechen der Vacciniavirus-kontaktierten Krebszellen zum Erhalten einer Präparation, die entkerntes Cytosol und die Zellmembranen von den Krebszellen umfasst, und (c) Pulsieren von Antigen-präsentierenden Zellen mit der Präparation.
Ex-vivo-Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Kontaktierungsschritt gestoppt wird, bevor die Krebszellen durch das Vacciniavirus lysiert werden.
Ex-vivo-Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Kontaktierungsschritt zwischen ungefähr vier Stunden und ungefähr 36 Stunden, vorzugsweise ungefähr 24 Stunden dauert.
Ex-vivo-Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Präparation frei von Krebszellkernen ist.
Ex-vivo-Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Aufbrechungsschritt durch physikalische oder chemische Mittel oder mittels Sonifikation durchgeführt wird.
Ex-vivo-Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Antigen-präsentierenden Zellen periphere Blut-, Milz-, Haut-, Thymus-, Lymphknoten- oder Knochenmarkzellen sind.
Ex-vivo-Verfahren nach Anspruch 20, wobei Antigen-präsentierende Zellen an den zu behandelnden Patienten HLA-angepasst sind.
Ex-vivo-Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Pulsierungsschritt für wenigstens sechs Stunden durchgeführt wird.
Ex-vivo-Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Verhältnis zwischen den Krebszellen und den Plaque-bildenden Einheiten (PFU) des rekombinanten Vacciniavirus von ungefähr 1 Million: 1 bis ungefähr 1:1, vorzugsweise ungefähr 10:1 beträgt.
Ex-vivo-Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Verhältnis zwischen den Krebszellen und den Antigen-präsentierenden Zellen ungefähr 1000:1 bis ungefähr 1:10, vorzugsweise ungefähr 10:1 bis ungefähr 2:1 beträgt.
Verwendung von: (a) einem ersten rekombinanten Vacciniavirus, das für wenigstens IL-2 kodiert; und (b) einer Zusammensetzung, die Antigen-präsentierende Zellen umfasst, die mit einer Präparation gepulst wurden, die entkerntes Cytosol und Zellmembranen von Krebszellen umfasst, die mit einem zweiten rekombinanten Vacciniavirus infiziert wurden, das für wenigstens IL-2 kodiert, zur Herstellung eines Arzneimittels oder Arzneimitteln zur Auslösung einer Antikrebs-Immunantwort in einem Patienten.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Menge des ersten rekombinanten Vacciniavirus von ungefähr 10⁴ bis ungefähr 10⁸ PFU, vorzugsweise ungefähr 10⁷ PFU beträgt.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Anzahl von Antigen-präsentierenden Zellen von ungefähr 10⁵ bis ungefähr 10⁷ PFU, vorzugsweise ungefähr 10⁶ bis ungefähr 5 × 10⁶ Zellen beträgt.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei das Arzneimittel weiter das zusätzliche, in einem der Ansprüche 2 bis 21 definierte Merkmal umfasst.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Krebszellen für den Patienten autolog sind.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei das Arzneimittel eine wirksame Menge einer wie in Anspruch 25 (b) definierten Zusammensetzung umfasst und das erste rekombinante Vacciniavirus ein lebendes rekombinantes Vacciniavirus ist und wobei der Krebs über die genannte Antikrebs-Immunantwort behandelt wird.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei das erste lebende rekombinante Vacciniavirus für IL-2 kodiert.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei ungefähr 10⁵ bis 10⁷ PFU des ersten lebenden rekombinanten Vacciniavirus bereitgestellt wird.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei entkerntes Cytosol und Zellmembranen entsprechend ungefähr 10⁶ bis ungefähr 10⁷ Krebszellen bereitgestellt werden.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei der Krebs ein Melanom ist.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei die Krebszellen Melanomzellen sind.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei der Krebs ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zellen von Fibrosarkom, Myxosarkom, Liposarkom, Chondrosarkom, Osteosarkom, Chordom, Angiosarkom, Kaposi-Sarkom, Endothelio-Sarkom, Lymphangiosarkom, Lymphangioendothelio-Sarkom, Synoviom, Mesotheliom, Ewing's-Tumor, Leiomyosarkom, Rhabdomyosarkom, Rhabdosarkom, colorektales Karzinom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Brustkrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs, Plattenepithelkarzinom, Basalzellenkarzinom, Adenokarzinom, Schweißdrüsenkarzinom, Talgdrüsenkarzinom, papilläres Karzinom, papilläres Adenokarzinom, Zystadenkarzinom, medulläres Karzinom, Bronchialkrebs, Nierenzellenkarzinom, Hepatom, Gallengangkarzinom, Chorionkarzinom, Seminom, embryonales Karzinom, Wilm's-Tumor, Gebärmutterhalskrebs, Hodentumor, Lungenkarzinom, kleinzelliges Lungenkarzinom, Blasenkarzinom, Epithelkarzinom, Glioma, Astrozytom, Medulloblastom, Kraniopharyngiom, Ependymom, Pinealom, Hämangioblastom, akustisches Neurom, Oligodendrogliom, Meningiom, Neuroblastom, Retinoblastom, Myelom, Lymphom und Leukämie.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei die Krebszellen von Krebsarten stammen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Zellen von Fibrosarkom, Myxosarkom, Liposarkom, Chondrosarkom, Osteosarkom, Chordom, Angiosarkom, Kaposi-Sarkom, Endothelio-Sarkom, Lymphangiosarkom, Lymphangioendothelio-Sarkom, Synoviom, Mesotheliom, Ewing's-Tumor, Leiomyosarkom, Rhabdomyosarkom, Rhabdosarkom, colorektales Karzinom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Brustkrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs, Plattenepithelkarzinom, Basalzellenkarzinom, Adenokarzinom, Schweißdrüsenkarzinom, Talgdrüsenkarzinom, papilläres Karzinom, papilläres Adenokarzinom, Zystadenkarzinom, medulläres Karzinom, Bronchialkrebs, Nierenzellenkarzinom, Hepatom, Gallengangkarzinom, Chorionkarzinom, Seminom, embryonales Karzinom, Wilm's-Tumor, Gebärmutterhalskrebs, Hodentumor, Lungenkarzinom, kleinzelliges Lungenkarzinom, Blasenkarzinom, Epithelkarzinom, Glioma, Astrozytom, Medulloblastom, Kraniopharyngiom, Ependymom, Pinealom, Hämangioblastom, akustisches Neurom, Oligodendrogliom, Meningiom, Neuroblastom, Retinoblastom, Myelom, Lymphom und Leukämie.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei das Arzneimittel weiter die zusätzlichen, in einem der Ansprüche 2 bis 21 aufgeführten Merkmale umfasst.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei die Antigen-präsentierenden Zellen für den Patienten autolog sind.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei die Antigen-präsentierenden Zellen an den Patienten HLA-angepasst sind.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei die Krebszellen zu dem Patienten autolog sind.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei der Patient ein Mensch ist.