JPH0486557A - 抗体価測定試薬およびこれを用いた免疫分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗体価測定試薬、更に詳細には補体依存性リポ
ソーム損傷反応を利用した、簡単な自動操作によって抗
体価を測定することができ、大量生産可能な抗体価測定
試薬に関する。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕一般に
、輸血や血清中の抗体価を測定することは、成人下細胞
白血病（ＡＴＬ）等のウィルス感染に起因する様々な疾
患を診断し、予防する上で極めて重要なことである。

従来、抗体価の測定法としては、間接蛍光抗体法、ＥＩ
Ａ法、凝集法、Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ法等が採用さ
れているが、上述のような臨床上の重要性に鑑み、測定
化の自動化が望まれている。しかしながら、間接蛍光抗
体法やＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ法は操作が煩雑である
ため自動化は困難であり、ＥＩＡ法は洗浄操作か必要で
あるため、自動化のためには洗浄機構を必要とするとい
う問題かあった。また、凝集法は操作は比較的簡単では
あるものの、判定が目視であるために測定結果に個人差
を生じるという問題かあった。

そこで、本発明者は鋭意検討した結果、補体依存性リポ
ソーム損傷反応を利用すれば抗体価測定の自動化が可能
であることを見出し先に特許出願した（特開平２−４２
３６０号）。しかしながら、この方法はリン脂質、コレ
ステロール及び架橋剤導入リン脂質から調製したリポソ
ームに、架橋剤を介して抗原を共有結合させて用いてい
るが、ここで使用される抗原は精製度の高いものである
ことが必要であり、該抗原を大量に入手することは困難
であるという問題があった。

〔課題を解決するための手段〕

斯かる実情において、本発明者は上記課題を解決せんと
鋭意研究を行った結果、安価で大量入手の容易な特異抗
体を介して抗原をリポソーム上に結合させれば、入手困
難な精製度の高い抗原を用いなくとも補体依存性リポソ
ーム損傷反応を利用した抗体価測定試薬が得られること
を見出し本発明を完成した。

すなわち、本発明はリン脂質及びコレステロールを主要
構成成分とするリポソームの表面に架橋剤を用いて特異
抗体を結合させ、この特異抗体を介して特異抗原を固定
化し、かつ該リポソーム内に親水性標識物質を封入した
ことを特徴とする抗体価測定試薬を提供するものである
。

本発明において、リポソームはリン脂質及びコレステロ
ールを主要構成成分とするものであれば、従来使用され
ている何れのものでもよいが、リン脂質とコレステロー
ルの比が１＝１前後であるとき、安定なリポソームか得
られ易い。また、リン脂質中の脂肪酸残基は、炭素原子
数が１２〜１８であることが好ましく、更には偶数であ
ることが好ましい。

リポソーム内に封入される標識物質は、親水性であって
、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物質でなけ
ればならない。斯かる物質としては、例えば、高濃度で
は自己消光により蛍光は示さないが、低能度（１０−３
Ｍ以下）で非常に強い蛍光を発するカルボキシルフルオ
レセインのような蛍光性化合物；リポソーム外で酸化反
応により発光するルミノールやルシフェリンのような発
光性化合物；可視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯を
有する吸光性化合物（水溶性色素等）；酸化酵素の作用
により分解された酸素消費あるいは過酸化水素生成をも
たらすグルコース及びシュークロースナトの糖類；テト
ラペンチルアンモニウムの様な比較的大きなイオン性化
合物；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ
）のような補酵素類；メチルビオロゲンを初めとするラ
ジカル化合物などが望ましい。

また、本発明において用いられる架橋剤としては、例え
ばＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プ
ロピオネート（ＳＰＤＰ）　、Ｎ−スクシンイミジル４
−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）
　、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニ
ル）アセテート（ＳＭＰＡ）、Ｎ−スクシンイミジル４
−（ｐ−マレイミドフェニル）プロピオネート（ＳＭＰ
Ｐ）　、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシ
ンイミド（ＧＭＢＳ）及びＮ−（ε−マレイミドカプロ
イルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）等か挙げられ
る。

また、リポソームに感作させる特異抗体としては、用い
る抗原の反応部位の一部に特異的な抗体であって補体の
活性化を起こさないもの又はＦ　（ａｂ　’　）　ｘ化
したものを使用することが好ましい。

更に、本発明において抗原としては、抗体価を測定しよ
うとする抗体に対する抗原が用いられる。

斯かる抗原は、リポソームへの固相化に際しては、免疫
反応を利用するために何の修飾をする必要がなく、また
固定化される抗原は特異抗体に特異的なタンパクのみで
あるため、用いる抗原の精製度はなんら制限を受けるも
のではない。また、従来の方法により抗原を直接リポソ
ームに固相化するには大量の抗原が必要とされていたが
、本発明の抗体価測定試薬は使用される抗原量が従来の
１／ｌｏｏ〜１／１０００と非常に少量においても、同
等の測定感度が得られる。

本発明の抗体価測定試薬は例えば次の方法で製造される
。

まず、リン脂質とコレステロールをフラスコに入れ溶媒
を留去し、吸引乾燥する。しがる後、壁面に薄膜が形成
されたフラスコ内に所定の標識物質の溶液を加え、密栓
をして振とうし、標識物質封入リポソームを得る。

一方、特異抗体と架橋剤とを緩衝液中で反応させて架橋
基を導入し、しがる後必要であれば、該架橋基を還元す
る試薬（例えばジチオスレイトール：　ＤＴＴ）と更に
反応させて、修飾抗体を得る。

その後、標識物質封入リポソームと修飾抗体とを緩衝液
中で反応せしめることにより抗体感作リポソームを調製
する。次いで、所定量の抗原と該抗体感作リポソームを
緩衝液中で反応せしめることにより抗原固相化リポソー
ムが得られる。斯かる抗体価測定試薬は、通常、標識物
質を内包し、表面に固定化された抗原を担持したマイク
ロカプセルとして得られる。

斯くして調製された本発明の抗体価測定試薬を用いて、
被検体中の抗体価を測定するには、まず被検体中に該試
薬及び補体を加え、抗原−抗体と補体との結合反応を引
き起こさせる。すると、斯かる反応量に比例して、リポ
ソーム内から標識物質が放出されてくる。次いで、この
標識物質に応じた分析方法（例えば、標識物質が蛍光物
質であれば、蛍光分析法）により定量を行い、例えば予
め作成しておいた検量線により、試料中の抗体の量を測
定すればよい。

この測定操作において使用する補体は、特に限定されな
いが、通常、モルモット血清が用いられる。また、ウサ
ギ、マウス、ヒト等の血清を使用することもできる。

〔発明の効果〕

本発明の抗体価測定試薬は、抗原をリポソームに結合さ
せるのに安価に大量入手の容易な特異抗体を使用してい
るため、入手困難な精製度の高い抗原を用いずに補体依
存性リポソーム損傷反応を利用した抗体価の測定を行う
ことができる。また、抗原の使用量も従来の１／１００
〜１　／１０００と非常に少量であるため、非常に経済
的であると共に大量生産が可能である。

更に、本発明の抗体価測定試薬を使用すれば、簡単な操
作で正確に被検体中の抗体価を測定することができ、し
かもその自動化が可能である。

〔実施例〕

以下に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明
はこれによって何ら限定されるものではない。

実施例１ １）リポソームの調製ニ ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）１μ
ｍｏｌ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）　　１　μｍｏｌ
及びジチオピリジル化ジパルミトイルホスファチジルエ
タノールアミン（ＤＴＰ−ＤＰＰＥ）　０．０５μｍｏ
ｌをナシ型フラスコにとり、脂質を溶解していたクロロ
ホルムをエバポレーターで留去した。更に、１時間真空
デシケータ−で乾燥し、次いで、ナシ型フラスコに０．
２Ｍカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）１００μＱを入
れ、激しく攪拌し、ナシ型フラスコのガラス壁上の脂質
薄膜を剥がしてＣＦ封入リポソームを調製した。未封入
のＣＦは０．ＯＩＭ　Ｈｅｐｅｓ緩衝液（０，１５Ｍ　
Ｎａｌ含有、　ｐＨ７，５）で遠心洗浄３回を行って分
離した。

２）抗ＨＢｓモノクローナル抗体のリポソームへの感作
： 二種類の異なった抗ＨＢｓモノクローナル抗体（ａｄ　
、　ａｙ）溶液（１ｍｇ／ｍ１２）を７５０μＱずつ等
しく混合したちの１．５ｍ１２に、３０ｍＭ　５ＰＤＰ
工タノール溶液５μｇを添加し、室温で３０分間反応さ
せた。引き続き、過剰の５ＰＤＰを除去するために、０
．１Ｍ酢酸緩衝液（０，１５Ｍ　ＮａＣｆ１含有、　ｐ
Ｈ４，５）で平衡化したセファデックスＧ−２５でゲル
濾過した。

ゲル濾過で得られたタンパク分画にＤＴＴを５０ｍＭと
なるように添加し、室温で３０分間反応させた後、０、
ＯＩＭ　Ｈｅｐｅｓ緩衝液（０，１５Ｍ　ＮａＣｌ２含
有、　ｐＨ７，５）で平衡化したセファデックスＧ−２
５でゲル濾過し、過剰のＤＴＴとタンパクを分離した。

斯くして得られたタンパク分画１ｍ１ｌに１）で調製し
たＣＦ封入リポソームを加え、６〜１０℃で１８〜２４
時間ゆっくり攪拌しながら反応させた。その後、リポソ
ーム懸濁液を遠心洗浄し、未反応のタンパクを分離し、
ゲラチンベロナール（ＧＶＢ）緩衝液（０，１５Ｍ　Ｎ
ａＣｆｆ含有、　ｐＨ７，５）　１ｍｆｌに再懸濁した
。

３）ＨＢｓ抗原のリポソームへの固相化：ＨＢｓ抗原産
生細胞から得られた硫安塩析粗分画ＨＢｓ抗原（比活性
１０６２２）　１．１ｍｇ、及び）ＩＰＬＣによる精製
度９７．５％以上の精製ＨＢｓ抗原（比活性３２０００
０）２９μｇを２）で調製したリポソーム溶液１５０μ
ｇにそれぞれ添加し、ＧＶＢ緩衝液（０，１５Ｍ　Ｎａ
ＣＱ含有。

ｐＨ７，５）を加え、それぞれ５００μｌとして室温で
１８〜２４時間反応させた。その後、リポソーム懸濁液
を遠心洗浄し、未反応の抗原を分離し、ＧＶＢ緩衝液（
０，１５Ｍ　ＮａＣｎ含有、　ｐＨ７，５）　３ｍ１ｌ
にそれぞれ懸濁し、ＨＢｓ抗原固相化リポソームを得た
。

４）ＨＢｓ抗原固相化リポソームを用いたＨＢｓ抗体価
の測定： ９６穴マイクロプレート（注文ベークライト社製）を用
いて測定を行った。ここで希釈にはすべて０．５ｍＭ　
ＭｇＣＬと０．１５Ｍ　ＣａＣ１１ｚを含むＧＶＢ緩衝
液を用いた。３）で調製したリポソームを２５倍希釈し
た溶液２５μｌｉｉ：、ＩｇＧ化したウサギ抗ＨＢｓ抗
体を１００００ＩＵ／１から倍々希釈したものを５０μ
ｇ加え、３７℃で２時間反応させた。その後、適当に希
釈したモルモット補体２５μａを加え、更に３７℃で２
時間反応させた。反応は１０ｍＭ　ＥＤＴＡ含有ＧＶＢ
緩衝液（０，１５Ｍ　ＮａＣ１含有、　ｐＨ７，５）　
１００μｍ１を加え停止させた。

ＨＢｓ抗体量に依存したＣＦ量はマイクロプレート用蛍
光光度計ＭＴＰ−３２（コロナ社製）を用いて励起光４
９０ｎｍ、蛍光５３０ｎｍで測定した。その結果を第１
図に示す。

第１図から明らかなように本発明の抗体価測定試薬を用
いれば、粗ＨＢｓ抗原を用いた場合においても精製ＨＢ
ｓ抗原を用いた場合と同様な遊出曲線が得られ、抗原の
精製程度によって測定精度の差が生じないことがわかる
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１において本発明の抗体価測定試薬を
用いて、被検体中のＨＢｓ抗原を測定したときの遊出曲
線を示す図面である。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、リン脂質及びコレステロールを主要構成成分とする
   リポソームの表面に架橋剤を用いて特異抗体を結合させ
   、この特異抗体を介して特異抗原を固定化し、かつ該リ
   ポソーム内に親水性標識物質を封入したことを特徴とす
   る抗体価測定試薬。 ２、請求項１記載の抗体価測定試薬を用いる免疫分析法
   。