JPH01229971A - 免疫分析用試薬及びそれを用いた免疫分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、試料中の抗原または抗体量を側室するのに好
適な免疫分析用試薬およびそれを用いた免疫分析方法に
関する。

〔従来の技術〕

従来のリポソームあるいは小胞体を用いた免疫分析方法
の一例として、たとえば、特開昭５６−１３２５６４号
記載のものが存在する。この従来例では、小胞体内に、
標識物質である酵素を担持し、小胞体表面には試料中の
抗原または抗体と反応する抗体または抗原が結合されて
いる。この小胞体に試料を加えると、小胞体表面と試料
との間に生じた抗原抗体反応により、小胞体表面が破壊
され、小胞体内部の酵素が小胞体外部へ遊離する。

一方、これに基質を加えると、基質と酵素との間で酵素
反応が生じ、この酵素反応の結果から、試料中の抗原ま
たは抗体を定量的に分析することができるとしている。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記従来の免疫分析用試薬では、定量に関与する標識物
質としての酵素量を多くするために、すボソームを多層
にして、その内部に酵素を包含するようにしている。

しかしながら、抗原−抗体反応の結果、定量分析に関与
する酵素は、リポソームの最外層と第２の層との間にあ
る量に限定され、その他の層内に包含されている酵素は
、反応に関与しないことになる。それでは１反応効率が
悪くなり、試料中の目的物を高感度に分析することがで
きないという課題があった。

本発明は、係る課題を解決するために、反応に関与する
標識物質量が多くできる免疫分析用試薬及び定量分析の
際の反応効率が高く、かつ目的物を高感度に分析できる
免疫分析方法を提供することをその目的としている。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、上記目的を達成するために、多層からなり、
内部には標識化合物が包含されてなるリポソームであっ
て、最外層表面には、試料中の抗体または抗原と反応す
る抗原または抗体が結合されてなり、内層表面には、前
記抗体または抗原と異なる第２の抗原または抗体が結合
されたリポソームと、前記第２の抗原または抗体と反応
する第３の抗体または抗原と、を備えてなる免疫分析用
試薬である。

さらに本発明に係る免疫分析方法は、上記免疫分析用試
薬含有液と試料溶液とを反応させることを特徴とするも
のである。

上記本発明において、目的物質である、試料中の抗体ま
たは抗Ｉｌｌの定量をおこなうのに必要な標識物質とし
ては、例えば酵素、キレート剤、ラジオアイソ＋−−プ
がある。抗原−抗体反応の結果、リポソームから放出さ
れた標識物質量を求めることにより、試料中の抗体また
は抗原を定量することができる０例えば、標識物質と反
応して発色するための発色用試薬を加えることができる
。さらに、抗原−抗体反応の結果、リポソームの膜の破
壊を促進するために補体を加えることもできる。

〔作用〕

試料中の抗原または抗体と反応する抗体または抗原を表
面上にもった外側のリポソームは、試料中の抗原または
抗体と反応し、補体作用により膜の溶解反応が起こる。

この外側リポソーム膜の溶解反応は、外側リポソームに
含まれていた内側の小さいリポソームの流出を引き起こ
す。この小さいリポソームは、膜表面上に第２の抗原ま
たは抗体をもち、試料中に含まれる、この第２の抗〃Ｋ
または抗体と反応する第３の抗体または抗原と反応し、
補体活性の作用により小さいリポソーム膜の溶解を起こ
す。このことにより、リポソーム内のすべての標識物質
がリポソーム外に流出し１分析可能となる。内包されて
いたリポソームが溶解反応を起こすことにより、今まで
分析に関与していなかった標識化合物が効率よく反応に
関与するため、定量分析における反応効率が高くなり、
かつより高感度の免疫分析が可能となる。

〔実施例〕

次に本発明に係る免疫分析用試薬を添付図面に従い詳説
する。

その一実施例に係る免疫分析用試薬は、第１図に示すよ
うに２重のリポソームから構成されている。すなわち、
外側リポソーム１内部には内側リポソーム２が内包され
ている。この外側リポソーム１及び内側リポソーム２内
には標識物質５が存在する。外側リポソーム１表面には
試料中の抗体と反応する第１の抗原３が結合されている
。また、内側リポソーム２表面には試料中の抗体とは異
なる第２の抗体４が結合されている。第１図イに示すよ
うに、このリポソームに試料中の抗体７及び補体８が作
用すると、第１図口に示すように第１の抗原３に試料中
の抗体７が結合する。すなわち、外側リポソーム１表面
には、測定対象物の抗原が表現されており、試料中の１
１１ｇ定対象物である抗体７との反応あるいは競合反応
が可能となる。この抗原抗体反応の結果、補体活性によ
り、外側リポソーム１膜が破壊される。この破壊の結果
、内側リポソーム２の流出を生じる。このような状態で
さらに本発明のごとく前記第１の抗原３とは異なる第２
の抗原６を作用させると、第１図ハのごとく第２の抗体
４と第２の抗原６との間で抗原抗体反応が生ずる。この
結果、第１図二に示すように、補体活性により内側リポ
ソーム２の膜の破壊が生じ、内側リポソーム内に存在し
た標識物質が測定系に導き出される。

なお上記本実施例で第１の抗原３の代わりに抗体を用い
ることもできる。この場合、試料中の測定対象物質は所
定の抗原となる。また、第２の抗体４の代わりに抗原を
用いることもできる。この場合、第１図口で加えられる
第２の抗Ｊｍ　６の代わりに第２の抗体が加えられるこ
とになる。

このような本実施例に対して従来のリポソームは、第２
図イに示すごとく内側リポソーム２及び外側リポソーム
１の中には標識物質が存在するが（この点は上記本実施
例と同一であるが）、外側リポソーム１表面及び内側リ
ポソーム２表面には、同一の第１の抗Ｍ３が結合しであ
る。これに第２図イに示すごとく試料中の抗体７及び補
体８を加えると、第２図口に示すごとく、外側リポソー
ム１表面の抗原３に抗体７が結合する。この結果により
、外側リポソーム膜が破壊され内側リポソーム２の流出
を引き起こす。しかし、試料中の抗体７の大部分が、外
側リポソーム１表面に結合した抗原３と結合すると、内
側リポソーム表面に結合した抗原と結合できなくなる結
果、内側リポソーム２の膜の破壊が起こりにくくなる。

この結果、従来の免疫分析用試薬では、内側リポソーム
内に存在する標識化合物９が定量分析の反応に参加でき
なくなり、この全反応効率及び感度とも低下する。従来
内側リポソーム内標識物質の量としては、全標識物質に
対して約３０％程度と考えられる。

これに対して上記第１図で示した本実施例では約１００
％の標識化合物質が定量分析に参加できるので、反応効
率及び測定感度とも向上することになる。

上記本実施例に係るリポソームは、Ｈｉｓａらの方法に
従い調整する（　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｈｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙＶｏｌ　７４，１５２頁、１９８１年）。

すなわち、内側リポソーム２をこの方法により調整し、
外側のリポソームを次の通りに作成する。

このように作成された内側リポソーム２とＨｉｓａらの
方法と同じ脂質を加え、超音波処理をおこなうことによ
り内側リポソーム回りに外側リポソームを形成すること
ができる。このリポソーム表面に抗体または抗ＪＸを結
合させる場合は、内側リポソームまたは外側リポソーム
に、架橋剤である５ＰＤＰ及び抗原または抗体を存在さ
せ、５ＰＤＰを用いて感作をおこなうことにより、リポ
ソーム表面上に抗体または抗原を結合させる。

このような本実施例に係るリポソームの製造に際して、
内側リポソーム表面に結合させるべき抗原または抗体が
外側リポソーム表面に結合する場合がある。また、これ
とは逆に外側リポソーム表面に結合させるべき抗原また
は抗体が内側リポソーム表面に結合する場合がある。こ
のような場合は、カラムに抗原または抗体と反応する抗
体または抗原を結合したセファロースを充填し、得られ
たリポソームをカラムに導入することにより、リポソー
ム表面に結合されるべき抗体または抗原種をコントロー
ルすることができる。

また、リポソーム製造の際に、内側リポソーム表面に外
側リポソームを形成できない場合があるが、この場合に
は内包されなかった小さいリポソームは、ゲル濾過によ
り内側リポソームが内包されたリポソームと分離するこ
とができる。

次に具体的な実施例について説明する。

（実施例１） 前述のようにして調整したリポソームを用いて測定をお
こなう抗体感作は、外側リポソームに抗Ｔ４抗体を５Ｐ
ＤＰを用いて結合させた。内包リポソームの膜表面上に
は、反応系で後から添加する試薬中に含まれている抗α
−ＦＰ抗体と反応する抗原α−ＦＰが５ＰＤＰを用いて
感作されている。

標識物質としてＴＡＭＳＭＢをリポソーム内にトラップ
させ、ＴＡＭＳＭＢと反応させる金属はＣｕ　（ＴＩ）
　、　Ｇｏ　（ｍ）　、　Ｎｉ　（ＩＩ）　Ｆａ　（■
）。

Ｐｄ（■）Ｍｎ（ｍ）が挙げられるが、ここではＣｏ　
（ＩＩＩ）を試薬系に含ませ、リポソーム内から流出し
てきたＴＡＭＳＭＢとＣｏ（ｍ）を反応させ発色させる
。

上記のようにして得られたリポソーム１ｍｌと、補体１
ｍｌを、０　、１５　ｍｏｌｅ／　ｌのＮ　ａ　Ｃｌ溶
液で１００ｍ１とする。この試薬を第一試薬とする。次
に。

内包リポソームの膜表面上の抗原と反応する抗α−ＦＰ
抗体１ｍｌとＣｏ　（ｍ）　　１０ｍ　ｍｏｌｅ／１１
０ｍ１を０　、１５　ｍｏｌｅ／　１のＮａＣ１溶液で
１００ｍ１とし第二試薬とする。

Ｔ、１０．０μｇ／ｄｌ含む試料１０μｍと第一試薬２
００μｍ加え３７℃で２０分間反応させる。

抗原抗体反応をさせた後、第二試薬を２００μｌ加えて
２回目の抗原抗体反応と、発色反応を３７℃で２０分間
、インキュベイジョンをおこない、６５０ｎｍでの吸光
度を測光し１分析をおこなった。

反応とは別に、１試料当りのリポソーム液を、界面活性
剤で完全に膜を溶解させた。リポソーム膜を完全に溶解
後Ｇｏ（ｍ）イオンを加えて６５０ｎｍでの吸光度を測
定した。

また従来通りにリポソームを調整し、Ｔ４抗体のみを感
作させたリポソーム１ｍｌと、補体１ｍｌを０　、１５
１１１ｏｌｅ／　ｌのＮａ１ｌ溶液で１００ｍ１とし第
一試薬とする１次にＧ　ｏ　（ｍ）　１０ｍ　ｍｏｌｅ
／ｌ　１０ｍ１を０　、１５１１１ｏｌｅ／　ｌのＮ　
ａ　Ｃｌ溶液で１００ｍ１とし第二試薬とする。′第一
試薬、第二試薬をそれぞれ２００μｍずつ前述同様に、
Ｔ、１０．０μｇ／ｄｌ含む試料１０μｍと反応させ、
６５０ｎｍでの吸光度を測定した６さらに、１試料当り
の従来リポソーム液を界面活性剤で完全に溶解させ、Ｇ
ｏ（ＩＩＩ）イオンを加えて６５０ｎ＋＊での吸光度を
４１μ定した。

本実施例のリポソームとＴ４を反応させた値をＡ９本本
実側のリポソームを界面活性剤で膜溶解させ発色させた
場合の値をＢ、従来通りに調整したリポソームを用いて
Ｔ４を反応させた値をＣ９従来リポソームを界面活性剤
で溶解させた値をＤとした。各々ｎ＝１０とし１表１に
その結果を示しす。

この結果、従来法より７倍多くの標識化合物が反応に使
用されており、（Ａ、Ｃ）リポソーム内に封入されてい
る量は１．５倍（Ｂ、Ｃ）、反応効率（％）＝反応吸光
度／トラップ吸光度は５倍（Ａ／Ｂ、Ｃ／Ｄ）と、増加
している。また吸光度の増加に伴い再現性もよくなって
おり、精度の向上もみられる。

これより、高感度の分析が可能であり、微量の抗原また
は抗体でも正確に測定できる。

（実施例２） 前記実施例１と同様にしてリポソームを調整し、第一試
薬と第二試薬を調整した。試料はＴ４を０゜０μｇ／ｄ
ｉ、５．０μｇ／ｄｉ、１０μｇ／ｄｌ、２０μｇ／ｄ
ｌ、４０μｇ／ｄｌを含む標準物質を用いて検地線を作
成した。これを第３図に示す。

また、従来法のリポソームも第一試薬、第二試薬を調整
し、上記のＴ４濃度の試料を用いて検量線を作成した。

これを第４図に示す。

第３図と第４図を比較すると明らかに本発明の感度が向
上しているのが判る。

〔発明の効果〕

以上説明したように本発明に係る免疫分析用試薬によれ
ば、分析反応に関与する標識物質量を多くすることがで
きる。

また１本発明に係る免疫分析方法によれば１分析反応に
関与する標識物質量が多くなる結果、試料中の測定目的
物である抗体又は抗原を高感度に分析できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に係る免疫分析用試薬及び免疫分析方
法の一実施例の作用を示す説明図、第２図は従来の免疫
分析用試薬及び免疫分析方法の一実施例の作用を示す説
明図、第３図は１本発明に係る免疫分析方法の検ｈ（線
、第４図は、従来法の検に線である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、多層からなり、内部には標識物質が包含されてなる
   リポソームであって、最外層表面には、試料中の抗体ま
   たは、抗原と反応する抗原または抗体が結合されてなり
   、内層表面には、前記抗体または抗原と異なる第２の抗
   原または抗体が結合されたリポソームと、 前記第２の抗原または抗体と反応する第３の抗体または
   抗原と、 を備えてなる免疫分析用試薬。 ２、補体が加えられてなる請求項１記載の免疫用分析試
   薬。 ３、請求項１または２記載の免疫測定用試薬含有液と試
   料溶液とを反応させることを特徴とする免疫分析方法。