JPH06509177A - イムノアッセイ用改良洗浄方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般的にイムノアッセイに関し、特にイムノアッセイのための改良され た洗浄方法に関する。

発明の背景 イムノアッセイは抗体及び抗原の定性的又は定量的検定のためのよく知られた技 術である。全てのイムノアッセイ技術のための基礎は、特定の抗体が特定の抗原 を認識しそして特定の抗原に結合する特定の免疫学的現象である。

イムノアッセイは乾式分析要素上で行われる。このような要素には、典型的には 、その中に固定化された、薬剤（Ｄ）及び化学標識（又はラベル）（Ｌ）のよう な目的とするアナライトのための吸着部位として作用する抗体を含む多孔質展開 層が含まれる。実際に、薬剤りを含む試料はこの展開層にスポットとして適用さ れる。試料は急速に展開層の孔に浸透し、同時に、展開層の表面に予め塗布し、 乾燥したか又は別の溶液として適用した化学標識りを再構成（溶解）する。また 、化学標識を試料に添加し、混合物を要素に適用することができる。理想的には 、標識りはそれがどのようにして適用されたかに拘わらず、液体試料中に均一に 分配されるようになる。即ち、試料適用工程が終わった場合に、展開層はＤ及び Ｌの均一な溶液で飽和されている。固定化抗体は展開層の全体に存在しているの で、Ｄ及びＬはこれらの吸着部位に結合し始める。試料中のＤのレベルを検出す るために、層中の限られた数の抗体吸着部位のためにＤとＬとの間の競合が無く てはならない（競合アッセイ）。即ち、Ｄの量は、展開層中の利用可能な吸着部 位のためにＬに対して競合するその相対的能力から決定される。

普通サンドイッチアッセイと呼ばれる免疫学的アッセイの別の形式に於いては、 抗体をアナライト（Ｄ）を含む試料と接触させ、アナライトを抗体に結合させる 。次いでこの錯体を、結合したアナライトと反応する標識化した抗体の溶液と接 触させる。このようにして結合した標識化抗体の量は結合したアナライトの量に 直接比例している。

抗体部位に対する競合で勝ったＤを測定するために、抗体に結合したしの量を測 定する。吸着したＤの量は単純な差から得ることができる。残念ながら、Ｌが抗 体又はリガンド（サンドイッチアッセイ）に結合する場合には、勿論、それが溶 液と共に移動することができない場合を除いて、それはそれ自体を結合していな いＬから区別する独特の特性を発現しない。従って、固定化抗体に結合したしの 量を測定するために、溶液中のしを、Ｌの存在を感知する検出装置により読み取 る領域から洗い去らなくてはならない。洗浄工程には一般に結合していない標識 の除去を容易にするアッセイ手順が含まれている。典型的には、この洗浄工程は 、従来のイムノアッセイに於いては試料をスポット付けした領域の中心に約３０ −１００μＬの洗浄液を適用することによって行われている。洗浄液が展開層中 に流れた場合には、洗浄液は溶解したＬを含む試料液体を外に追い出す（押し出 す）。理想的には、吸着したしに固定化抗体から解離する機会を与えること無し に、溶液中に存在するしのみを拭い去るために十分速く洗浄液を添加する。次い でこの洗浄した領域中のＬの量は吸着したしの量に等しくなり、そうして試料中 の元々のＤの量に比例する。かくして、結合した標識化リガンド（抗体又は抗原 ）の量は、生物学的液体中のアナライトの濃度に関連づけることができる。

残念ながら、展開層中への洗浄液の流れは上記の理想化した形式に従わない。そ の代わりに、洗浄液は接触線に沿って入り、結合していないＬは、層の頂面に洗 浄液により作られる液体メニスカス（レンズ）の接触線の丁度真下の展開層の環 状領域に主として洗い出される。結局、このフロープロセスは結合していないＬ の大部分をスポットの中心に残すようにする。時には「標的化（ｔａｒｇｅｔｉ ｎｇ）」と言われるこの非能率的な洗浄プロセスは、洗浄液を層の上表面に展開 層による吸収速度よりも非常に速い速度で適用した場合に、一層悪くなる。この 場合に、洗浄液は実質的な体積のレンズを作り、接触線は中心領域から更に外に 移動し、それにより中心に更に大きな未洗浄領域が残る。

不拘−又は不完全洗浄のために湿潤領域の中心部分に残った結合していないＬは 、検出機構が結合した標識と結合していない「自由なＪ標識との間を区別するこ とができないので、分析方法に於いて有害な影響を有する。予測したよりも多い Ｌが存在するので、より強い信号が中心で得られる。これはアッセイの感度を低 下させるのみならず、測定を光学的走査の間の装置内のスライドの位置に対し、 及び洗浄液の計量チップとの相互作用に対し敏感にする。

洗浄の間のスポットの中心からの結合していない標識の洗出を最大にするための 一つのアプローチは、洗浄液を非常にゆっくり添加して、有意なサイズのレンズ が洗浄液によって形成されないようにすることである。しかしながら、洗浄液を ゆっくり添加すると、多数の小さい体積増分として展開層の上に滴る。各回の洗 浄液は展開層の頂部に触れ、装置（計量チップ）から離れ、付随する表面応力は 展開層の物理的一体性を崩壊させる。展開層の中心に対するこれらの多数の体積 増分により受けた蓄積した損傷は、アッセイの感度を一層弱める。

結合していない標識の洗出を最大にするための他のアプローチは、洗浄液（即ち 、３０〜６０μＬ）を試料により濡れた領域の周囲の外側の位置に適用する特開 昭６１−１２６４７０号公報に開示されている。特開昭６１−６２８６５号公報 には、比較的多量（５０−１００μＬ）の洗浄液を、試料を適用した領域の中心 部の間の距離の２／３から中心部と周囲部との間の距離の２倍までの地点で滴下 する洗浄方法が開示されている。

上記公開公報により示唆されている範囲内に洗浄液を適用することは幾らか不正 確性を生じる。試料により濡れた領域の周囲の外側の位置により洗浄液を適用す ると、濡れた領域の周囲の結合していない標識が中心の方に洗い戻される。これ は前記のようにアッセイの感度を低下させる。また、洗浄液はこの周囲から要素 の展開層の乾燥領域内に急速に流れ去るので、かなりの体積の洗浄液が必要であ る。しかしながら、このような多量の洗浄液を乾式多層イムノアッセイ要素で使 用することはできない。最近の要素は３０μＬの最大体積容量を有している。そ れで、上記の問題点を解決する洗浄方法についての必要性が存在している。

発明の要約 本発明は、液体試料のイムノアッセイ用の新規で改良された洗浄方法を提供し、 この方法に於いて、結合していない標識は検出領域から存効に追い出され、それ によってイムノアッセイの感度レベルか増大する。

本発明の改良された洗浄方法は、洗浄液を試料スポットの中心と試料により濡れ た領域の内側周囲との間の位置に適用することからなる。この方法で洗浄液を適 用した場合には、最初の試料スポットの中心部分では結合していない標識が適当 に洗い出され、一方周囲の過剰の標識は中心の方に戻って再分布することはない であろう。

更に、洗浄液を適用した直ぐ下の停滞域により生じたどのような任意的な人工島 （ａｒｔｉｆａｃｔ）も光学的読み取りにより見られない。

好ましい態様に於いては、被検物を含む液体試料を、少なくとも１個の多孔質帯 域を有する梨の分析要素に適用し、該要素が被検物と反応し得る固定化された結 合剤を含み、試料が要素上に濡れた領域を形成し、濡れた領域が試料の適用点に 一致するその中心で試料スポットにより定義され、及びリングがその周辺で試料 スポットにより定義され、 要素に標識を付与し、 ８〜３０μＬの洗浄液の流れを、該試料スポットの中心と、該スポットの中心と 該リングの内側周辺との間の５０％以下の距離との間の位置で要素に適用し、該 洗浄液が結合していない標識を該スポットの中心領域から有効に追い出し、そし て結合した標識がスポット領域内に存在する広さを測定することからなる、未知 のレベルの被検物を含む液体試料の固相イムノアッセイを行う方法か提供される 。

前記標識は要素に、競合アッセイに於いて標識と抗体との間の前接触（結合）が 無い限り、それを要素中に塗布するか、それを試料と共に与えるか又は別の溶液 として与えることによって付与することができる。

図面の簡単な説明 図１は、理想条件下での洗浄工程を示す図解図である。

図２は、洗浄液を中心に適用した場合の、結合していない標識の分布を示す図解 図である。

図３は、標識を要素中に塗布した場合の、試料添加の間の結合していない標識の 分布を示す図解図である。

図４は、洗浄液を試料により濡れた領域の周辺に適用した場合の、結合していな い標識の分布を示す図解図である。

図５（ａ）は、試料を添加した後のイムノアッセイ要素の平面図である。

図５（ｂ）は、抗体（Ａ）で覆われたビーズを取り囲む、溶液中の標識（Ｌ）及 び薬剤（Ｄ）の分布を示す、図５（ａ）の拡大した角の図面である。

図６は、本発明の洗浄方法を示す図解図である。

発明の詳細な説明 本発明はイムノアッセイ用の改良された洗浄方法を提供する。この洗浄液は試料 の適用スポットに対し「オフセンター（ｏｆｆ−ｃｅｎｔｅｒ）Ｊ位置で適用す る。本明細書て使用する用語「オフセンター」は、洗浄液を、試料スポットの中 心と、試料スポットの中心と試料により濡らされた領域の内側周辺との間の５０ ％以下の距離との間の位置で適用することを意味する。

本明細書で使用するとき、用語「リングＪは、試料により濡らされた要素の部分 と乾燥している要素の部分との間の境界を定義する要素の領域を意味する。本明 細書で使用するとき、用語「スポット」又は「試料スポットＪは、試料適用の点 に一致する要素の領域を意味する。

本発明の理解のために、先ずイムノアッセイで現在使用されている種々の洗浄方 法を考慮することが重要である。図１には、理想的条件下での洗浄方法の対象物 を示す図解図が示されている。抗体（Ａ）に線で結ばれている記号Ｌ（標識）及 びＤ（薬剤）は、固定化されている種に結合している。結合していない又は「自 由な」標識及び薬剤は洗浄液と共に周辺１８の方に移動することが自由である。

洗浄液は全ての従来の手段１０を使用して要素１２に１４で添加する。完全に設 計された洗浄方法に於いて、全ての自由な標識は中心１６から洗い出されるべき であり、スポットの中心に僅かに残っている標識は抗体に結合しているものであ る。

現在利用できるイムノアッセイで最も典型的に使用される洗浄方法は、洗浄液を 要素の中心に直接適用することからなる。即ち、試料適用点に直接型なる位置で 中心領域に適用する。図２には、洗浄液を中心に適用したときの分布パターンが 示されている。液体メニスカス（レンズ）２４の周辺で接触線２２に沿って展開 層の中に洗浄液が自然に流れることから、結合していない標識が不均一な分布に なることが明らかである。基本的に、洗浄液２６が試験要素に侵入するとき、レ ンズの直径は何れの点ででも適時に減少し、液体はこの液体レンズの周辺２２（ 接触線）でのみ展開層に侵入する。即ち、実質的にこの直径内にある全ての標識 はレンズが収縮するまで追い出されないであろう。この時点で、（１）遥かに少 ない洗浄液が残り、（２）追い出し距離は増加し、そして（３）結合していない 両分及び結合した画分の可溶化は変化するであろう。結合していない標識は中心 で抗体（図示せず）に結合している標識から区別することができないので、中心 領域に残っている結合していない標識は特定の被検物に対する分析方法の感度を 低下させるであろう。

試料を要素に添加する前に既に標識は展開層中で被覆され得ることか理解される 。これは要素に標識を含有させる好ましい方法であり、試料を要素にスポット付 けする直前に標識を試料と前混合するか又は別の溶液として標識を添加する代わ りの方法に対して非常に望ましい。

洗浄工程の間に起きる同じ不均一な流れ（図２）は試料適用工程の間にも起こり つる。図３には、試料添加の間に作られる標識りの不均一分布が示されている。

液体試料２８は不均一状態で乾燥展開層に入り、図示するように液体の自然の流 れは主としてレンズ３２の周辺で接触線３０に沿っている。この流れパターンは 周辺に沿って標識を洗い出すことによって標識を不均一に再分布させる。その結 果、抗体上の利用可能な吸着部位に対して被検物と有効に競合するために十分な 標識が存在しないので、試料中に存在する薬剤の量に対して感度が低い信号を発 生する濡れた領域の中心を取り囲む環状領域が存在する。

図４には、洗浄液３６を試料で濡らされた領域の周辺３４で適用する影響が示さ れている。この方法を使用すると、周辺の結合していない標識は中心の方に洗い 戻され（矢印で示す）、そこでこれはこの領域内の結合した標識の量を検出する 能力を低下させ、そうして感度を低下させる。基本的に、試料中の薬剤を検出す る能力を低下させる従来の洗浄方法の実際的態様の二つの特徴があり、両方の特 徴は液体が展開層に入るとき必然的に起きる不均一な流れパターンから導かれる 。展開層の頂部に適用される液体は、多孔質媒体に均一に入るのではなく、主と して層の頂部のレンズの環状端に沿って入るので、（１）試料添加の間に標識は スポットの中心の近くの環状領域から洗い出され、限定された数の結合部位に対 して薬剤の均一な分布と競合するために展開層中に標識の不均一な分布を残し、 そして（２）結合していない標識は洗浄工程の間スポットの中心から洗い出され ず、存在する薬剤の量に無関係である過剰の標識を中心に残す。

本発明のオフセンター洗浄方法は、上記の洗浄方法の改良である。

好ましい態様に於いて、図５を参照して、薬剤（Ｄ）を含有する試料３８を従来 の方法を使用して要素の展開層４０にスポット付けする。

拡大した角の図（図５（ｂ））は抗体（Ａ）で被覆されたビーズの周りの溶液中 の標識り及び薬剤りの表示を与えている。最初のインキュベーション期間の間、 Ｌ及びＤは結合のために利用できる限定された数の抗体吸着部位に対して競合す る。優勢な液体流れパターンのために、再構成された標識は再分布される。この 影響は展開層を非常に湿潤性にすることによって最少にすることができ、そうし て液体のレンズは薄いフィルムの上に広がる。システムを（例えば、約５分間） インキュベーションして薬剤りと標識りどの間の競合結合工程に付して平衡にし た後、洗浄液を展開層に適用して固定化抗体に結合した標識から自由な標識を洗 い流す。本発明のオフセンター洗浄方法は競合アッセイで使用するとき上記のよ うに記述される。

このオフセンター洗浄方法は、洗浄工程を必要とするどのようなアッセイ、例え ば、サンドイッチアッセイにも適用することができる。

図６に示すように、洗浄液３８は、スポットの中心（試料の適用点）と薬剤試料 により濡れた領域の周辺４２の内側との間の位置で適用する。本発明の洗浄方法 を使用して、スポットの中心部分は結合していない標識が適当に洗い出され、一 方周辺の過剰の標識は中心の方に再分布されることはない。本発明の洗浄方法を 使用する利点には、試料添加のための標的化効果が洗浄工程に伴われる追加の標 的化により増大しないので、より大きな再現性（正確性）が含まれる。更に、洗 浄の間に生じる標的化は光学的読み取り領域内にはな（、測定をスライド位置付 は及び液体計量工程での小さい変化に対して感度が小さくなるようにする。ある 種のアッセイのためには、結合していない標識のもっと効率の良い洗浄はアッセ イ方法に於けるバックグラウンド信号レベルを低下させるので、より大きな感度 が期待てきる。更に、洗浄液の適用により展開層に与える避けられない損傷は光 学的センサーの視界領域の外になるので、展開層の表面の強靭性について大きく 心配することなく展開層をもつと多孔質に又はもっと湿潤性にすることができる 。

本発明の新規な洗浄方法は、当該技術分野で公知のどのような固相イムノアッセ イの工程にも導入することができることが理解される。更に、全血、血漿、血清 、リンパ液、胆汁、尿、を髄液、唾液、汗等、並びに便分泌物を含むがこれらに 限定されない、動物又は人の生物学的液体のようなどのような液体試料もこの新 規な洗浄方法を使用して分析することができる。骨格筋、心臓、腎臓、肺臓、脳 、骨髄、皮膚等のような人又は動物組織の液体標本を検定することも可能である 。

固相イムノアッセイの好ましい態様に於いて、液体試料を、少なくとも１個の多 孔質展開帯域又は層を有する型の分析要素に適用する。この要素には、対象の被 検物と反応し得る固定化結合剤、及びその中に被覆された結合剤の結合部位に対 して被検物と競合し得るか又は結合剤−被検物錯体と結合してサンドイッチを形 成し得る標識（前記のどうような方法によっても供給される）が含まれている。

展開帯域は、粒子、繊維又はポリマーストランドの間の相互連結した空間又は孔 に起因するような多孔度が帯域の各方向で同じであることを意味する等方性多孔 質であることが望ましい。展開帯域は同一層又は重層で２個又はそれ以上の別々 になった帯域であってもよい。この帯域は、当該技術分野で公知である帯域のよ うな試薬帯域、捕獲帯域若しくは登録帯域、追加の展開帯域、放射線−遮蔽若し くは濾過帯域、下塗り帯域、バリヤー帯域等であってもよい。これらの帯域は一 般に互いに、液体、試薬及び反応生成物（例えば、カラー色素）が隣接する帯域 の重なった領域の間を通過するか又は移動し得ることを意味する、液体接触の状 態である。２個又はそれ以上の帯域が単一の層であってもよいが、好ましくは、 これらの帯域は別々に塗布される。

帯域は自己支持性であってもよい（即ち、その一体性を維持するために十分堅い 材料からなっていてもよい）が、好ましくは別の支持体上に担持する。このよう な支持体は、適当な寸法安定性で、好ましくは非多孔質で、そして約２００〜約 ９００　ｎｍの波長の電磁放射線を透過する透明な（即ち、放射線透過性）材料 のどのようなものであってもよい。特定の要素について選択した支持体は、意図 する検出様式（透過又は反射分光光学法）と一致させるべきである。有用な支持 体は、紙、金属箔、ポリスチレン、ポリエステル〔例えば、ポリ（エチレンテレ フタレート）〕、ポリカーボネート、セルロースエステル（例えば、酢酸セルロ ース）及び当該技術分野で公知の他の材料から製造することができる。多孔質展 開帯域はどのような適当な繊維状又は非繊維状材料又はこれらの何れか若しくは 両方の混合物から製造することができる。この帯域の空洞体積及び平均孔サイズ は目的とする用途に依存して変えることができる。

有用な展開帯域は米国特許第４．２９２．２７２号（１９８１年９月２９日Ｋｉ ｔａｊｉｍａ等に発行）（その開示を本明細書に参照して含める）に記載されて いるように、適当なバインダー材料と混合するか又は織物に織った繊維状材料を 使用して製造することができる。

また好ましくは、展開帯域は、米国特許第３．９９２．１５８号（１９７６年１ １月１６日Ｐｒｚｙｂｙｌｏｗｉｃｚ等に発行）、同第４．２５８．００１号（ １９８１年３月２４日Ｐｉｅｒｃｅ等に発行）、同第４．４３０．４３６号（１ ９８４年２月７日にｏｙａｍａ等に発行）及び特開昭５７　（１９８２）−１０ １７６０号公報（１９８２年６月２４日公開）（これらの開示を本明細書に参照 して含める）に記載されているように、ポリマー組成物（例えば、プラッシュポ リマー）又は微粒子材料から製造される。

本発明に於いて、有機ポリマー粒子を互いに結合して展開帯域の密着した三次元 構造を与えるために、水不溶性の接着剤を使用することができる。全く一般に接 着剤は展開帯域のポリマー組成物中に存在するある種のものと同じ又は同様であ る多くの繰り返し単位を含むポリマーを表すけれども、接着剤は展開帯域に含ま れる特定のポリマーとは異なった有機ポリマーからなっている。当該技術分野で 公知のどのような接着剤も本発明で使用することができるけれども、本発明で使 用ず゛るための好ましい水不溶性接着剤は、付加ホモポリマー及びコポリ１−１ 特に℃ツマーの付加重合性ブ【ノンド物から製造したイ４加コポリマーである。

例えば、米国特許第４．２５８．００１号（その開示を本明細書に参照して含め る）を参照する。

ロイコ染料を展開帯域に含有させることもできる。標識の存在下で酸化さｔまた ときそれか検出できる染料を与えることができるものである限り、任意の適当な ロイコ染料も本発明の実施で使用することができる。有用なロイコ染料の例には 、米国特許第４．０８９．７４７号及びそれに記載されている引例、ヨーロッパ 特許出願第１２２．６４１号（１９８４年ｌＯ月２４日公開）及び特開昭５８　 （１９８３）−０４５，５５７号公報に記載されているもののような、イミダゾ ール誘導体並びに、例えば米国特許第４．６７０．３８５号（その開示を本明細 書に参照して含める）に記載されているトリアリールメタンが含まれるが、これ らに限定されない。

好ましい態様に於いて、本発明は、特に対応する反応剤と錯体を形成する物質で ある免疫学的に反応性のリガンドの測定に有用である。本明細書で使用するとき 、用語「リガンド」は被検物と入れ替えることかできる。このようなリガンドに は抗原、ハブテン、抗体、毒素、ホルモン、治療薬、天然及び合成ステロイド、 蛋白質、ウィルス、細菌、ペプチド、ヌクレオチド等が含まれるが、これらに限 定されない。測定するりガント（アナライト）及び対応する標識化したリガンド 同族体は、固定量の結合剤と競合するか又はサンドイッチを形成する。リガンド 同族体は適当な標識に共有結合したリガンドからなっていてよい。本発明で有用 な標識化リガンド同族体は当業者に公知の任意の信号発生標識及び適当な方法を も使用して製造することができる。例えば、従来の標識には放射性タッグ、酵素 、発色団、発蛍光団並びに酵素補因子及び修飾因子が含まれる。酵素は、標識化 リガンドを基質と反応させることによって測定することができ、標識化リガンド は酵素の作用によって、従来の方法により測定することかできるか又は被挟物濃 度に比例する強度を有する光を発する化学ルミネセンス物質を活性化する色原体 物質又は蛍光原体物質を放出する。酵素補因子又は修飾因子で標識化したリガン ドは同様に、基体の酵素作用へのそれらの効果により検出することができる。発 色団、発蛍光団及び化学ルミネセンス化合物で標識化した化合物は、例えば、蛍 光、紫外分光学又はその他の分光学的手段により直接測定することができる。

標識化リガンド同族体及び対応する結合剤は、使用する前に展開帯域中に含有さ せるか又はアッセイの時点て添加することができる。

好ましくは、両方とも使用する前に展開帯域中に含有させる。更に特に、結合剤 は多孔質展開帯域内で、ガラス若しくはポリマービーズ又は他の粒子、樹脂、繊 維等のようなキャリヤー材料の上に固定化することができる。また、結合剤は展 開帯域とは別の中間層又は帯域内に含有させることができる。更に、標識化リガ ンド同族体は、それを反応剤から単離させるために別の水溶性帯域又は層内に含 有させることができる。

展開帯域又は別の中間層若しくは帯域内に固定化した結合リガンドは、当該技術 分野で公知のどのような結合剤、例えば、ホスホリルコリン、アビジン、ビオチ ン、チロキシン、チロキシン結合グロブリン、多糖類等、抗原、抗体、エストロ ゲン受容体のような全ての公知の受容体からなっていてもよく、好ましくは抗体 である。

前記要素は所望の幅を有する細長いテープ、シート、スライド又はチップを含む 種々の形成することができる。更に、ア・ソセイは手動でも自動でも可能である 。一般に、乾式要素を使用して、被検物（リガンド）測定は、供給ロール、チッ プ包み又はその他の供給源から要素を取り出し、それを被検物を含有すると思わ れる液体の試料（例えば、１〜３０μＬ）と物理的に接触させ、そうして要素内 で試料と試薬とが混合されるようにすることによって行う。このような接触はど のような適当な方法でも、例えば、要素を試料中に浸ける又は浸漬するか又は好 ましくは手又は機械により適当な分配手段を用いて試料の１滴を要素にスポット 付けすることによって行うことができる。

試料を適用した後、要素をインキュベーション、加熱等のような条件に曝す。こ の条件は試験結果を得るのを迅速にする力・又１よ他の方法で容易にし、リガン ド及びリガンド同族体と結合剤との間の錯体を形成するために望ましいものであ る。この反応が生じると、本発明の洗浄方法を前記のようにオフセンターで適用 する。洗浄液（よ洗浄のために使用される当該技術分野で公知のどのような溶液 力１らなっていてもよく、ある態様に於いては好ましくは緩衝剤及び任意に電子 移動剤、過酸化物、キレート化剤及び／又は界面活性剤を含有する緩衝液である 。

次いて、試験試料中のリガンドの量を、使用する特定の標識（こ依存して適当な 検出装置を使用して測定する。前記のように、当該技術分野で公知のとのような 標識及び検出方法も本発明で使用することかできる。

下記の例は本発明の実施を示すために記載する。

下記の配合は、本発明によるＣ−反応性蛋白質要素用のものである。

層　成　分　乾燥塗布量 展開帯域　（ｇ／ｍ”） ＴＢＳ、　ｐｉ（７，５５０，２１９ Ｄｉｍｅｄｏｎｅ　０．５ ４′−ヒドロキシアセトアニリド　、１５０イコ染料　、３００ 接着剤　２．５８３ ジメチルスルホキシド　２．７００ ポリマービーズ　１３０ Ｚｏｎｙｌ　ＦＳＮ　Ｏ，０５４ メタノール　０．６７５ ポリクロ一ナル抗体ポリマービーズ試薬　１．０イソノニルフエノキシボリグリ シドール　０．２３８イソプロピルアルコール　０．４０５ ４′−ヒドロキシアセトアニリド　０．１５ＴＥＳ、　ｐ）１７．０　４．５８ ＴＸ−１０００，０２０ 硬化剤　０．１５０ 上記要素の目的のために、下記の定義を適用する。

ＴＥＳ　＝Ｎ−（）リス（ヒドロキシメチル）メチルツー２−アミノエタン−ス ルホン酸緩衝剤。

Ｄｉｍｅｄｏｎｅ＝　５　、　５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン。

トリアリールイミダゾール ロイコ染料＝４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（４−ヒドロ キシ−３，５−ジメトキシフェニル）イミダゾールブルー形成ロイコ染料。

接着剤＝ポリ（メチルアクリレート−共−ナトリウム２−アクリルアミド−２− メチルプロパンスルホネート−共−２−アセトアセトキシ−エチルメタクリレー ト）。

ポリマービーズ−ポリ（ｍ−及びｐ−ビニルトルエン−共−メタクリル酸）。

ＺｏｎＹＩ　ＦＳＮ　＝非イオン弗素化界面活性剤（ＤｕＰｏｎｔ　ｄｅＮｅｍ ｏｕｒｓ）。

ポリマービーズ 試薬＝ポリ（スチレン−共−ｍ−及びｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル ）スチレン〕。

抗体−ポリマー ビーズ試薬＝ポリマービーズ試薬に共有結合した適当な免疫反応性抗体。

ＴＸ−１００＝Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ＝１００　、オクチルフェノキシポリエトキシ エタノール非イオン界面活性剤（Ｒｏｈｍ　＆　Ｈａａｓ）。

硬化剤＝ヒス（ビニルスルホニルメチル）エーテルゼラチン硬化剤。

上記のＣＲＰ要素に、ＣＲＰ２５．６ｍｇ　／　Ｌ及び３ｎＭモノクローナル抗 体−セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識（ＭＡｂ−ＨＲＰ）を含む試料１０μ Ｉ２を、スライドの中心にスポット付けし、３７°Ｃで５分間インキュベーショ ンしてサンドイッチを形成させた。ＣＲＰアッセイは一対の抗体を使用するサン ドイッチ型酵素イムノアッセイである。抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＡｂ） をセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識化した。ＭＡｂ−ＨＲＰを 信号抗体として使用し、ポリ（スチレン−共−ｍ−及びｐ−（２−クロロエチル スルホニルメチル）スチレン）ポリマービーズの表面に共有結合した第二のヤギ 抗ＣＲＰ抗体（ＰＡｂ）を捕獲抗体として使用した。スライドをインキュベータ から取り出し、洗浄液（過酸化水素１０ｍＭ、燐酸ナトリウム、ｐＨ６，８，１ ０ｍＭ、４′−ヒドロキシアセトアニリド５ｍＭ、ジエチレントリアミン五酢酸 ０．０１ｍＭ）　１０μＬを、スライドの中心で（試料適用の点で）又はスポッ ト（試料を適用した位置）と試料により濡れた領域の内側周辺との間の「オフセ ンターＪ位置（試料スポットの中心と内側周辺領域との間の距離の４３％である 約２．８ｍｍはど中心から離れている）で適用して、結合していないＭＡｂ−Ｈ ＲＰ共役体（ｃｏｎ　ｊｕｇａｔｅ）を観察領域（スライドの中心部分）から除 いた。次いでスライドを３７℃のインキュベータの中に戻した。形成されたＰＡ ｂ−ＣＲＰ−ＭＡｂ−ＨＲＰサンドイッチの量を、０〜１分間読み取り時間窓内 の観察領域内で過酸化水素によるトリアリールイミダゾールロイコ染料酸化の速 度を測定することによって決定した。その結果を下記の表１に示す。

表１ 洗浄位置　中心　中心から２．８ｍｍ（オフセンター）平均速度　０．０７９９ ９　０．０７５３５正確度（％　ＣＶ）　３．６２　２．９９Ｎ　２９　３０ 不正確度をパーセント変動係数として測定した。変動が小さいほど不正確度は小 さい。Ｎは反復回数に等しい（平均速度及び正確度はこの反復回数についての平 均である）。この例の結果は、本発明の中心から２．８ｍｍでの洗浄についての より小さい平均速度が、中心洗浄アッセイで読み取られた汚染物（結合していな い標識）の読みを除いていることを示している。

下記の配合は、本発明によるジゴキシン要素用のものである。

層　成　分　乾燥塗布量 展開帯域　（ｇ／ｍ２） ジゴキシン−ｔ（ＲＰ　Ｏ，００００１６ＭＯＰＳ、　ｐＨ７，００，００４５ ウシ血清アルブミン　０．０００２１５ポリアクリルアミド　０．００１０８ ４′−ヒドロキシアセトアニリド　０．０００３２５ＴＥＳ、　ｐＨ７，ｏ　Ｏ ，２１９ Ｄｉｍｅｄｏｎｅ　０．０５ トリアリールイミダゾールロイコ染料　０．２ジメチルスルホキシド　１．８ 接着剤　２．５８３ ポリマービーズ　１３０．０ Ｚｏｎｙｌ　ＦＳＮ　Ｏ，０５７ メタノール　０．６７５ ４′−ヒドロキシアセトアニリド　０．１５リン酸カリウム、ｐＨ７，００，０ ３９抗体−ポリマービーズ試薬　０．０２０ゼラチン帯域 上記要素の目的のために、下記の定義を適用する。

ＨＲＰ　＝セイヨウワサビペルオキシダーゼ。

ＭＯＰＳ＝３−モルホリノプロパンスルホン酸緩衝剤。

ＴＢＳ　＝Ｎ−（トリス（ヒドロキシメチル）メチルツー２−アミノエタン−ス ルホン酸緩衝剤。

ロイコ染料＝４．５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル−２−（４−ヒドロキ シ−３，５−ジメトキシフェニル）イミダゾールブルー形成ロイコ染料。

接着剤＝ポリ（メチルアク１ルート−共−ナトリウム２−アクリポリマービーズ −ポリ（ｍ−及びｐ−ビニルトルエン−共−メタ試薬＝ポリ〔スチレン−共−ｍ −及びｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）スチレン〕。

抗体−ボリマ− ビーズ試薬＝ポリマービーズ試薬に共有結合した適当な免疫反応性抗体。

ＴＸ−１００＝Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、オクチルフェノキシポリエトキシエ タノール非イオン界面活性剤（Ｒｏｈｍ　＆　Ｈａａｓ）。

硬化剤＝ビス（ビニルスルホニルメチル）エーテルゼラチン硬化剤。

上記のジゴキシン要素に、ジゴキシンを含む試料１０μＬをスポット付けし、３ ７°Ｃで５分間インキュベーションして競合反応を起こさせた。「中心対周辺」 実験で使用したジゴキシンの濃度は１．６ｎｇ／ｍＬであり、「中心Ｊ対「中心 から２．８ｍｍＪ（本発明）実験でのジゴキシンの濃度は３．１　ｎｇ／ｍして あった。薬剤及び薬剤標識化ＨＲＰを固定化抗体の結合部位に対して競合させた 。スライドをインキュベータから取り出し、洗浄液（過酸化水素０．０３％、燐 酸ナトリウム、ｐＨ６，８，１０ｍＭ、４　’−ヒドロキシアセトアニリド５　 ｍＭ、ジエチレントリアミン五酢酸１０ｍＭ及びヘキサデシルピリジニウムクロ リド０．１％）ｌＯμして洗浄した。洗浄は例Ｉに於けるように、スポット（試 料を適用した位置）と試料により濡れた領域の内側周辺との間の点（中心と周辺 との間の距離の４３％である２、８ｍｍはど中心から離れている）で偏心適用し 、スポットの中心に対し又はスポットにより濡れた領域の周辺で適用して、結合 していない薬剤−ＨＲＰをスライドの端の方に外に除いた。次いでスライドを３ ７℃のインキュベータの中に戻した。結合したジゴキシン−）ＩＲＰの量を、０ 〜１００秒間窓内の中心にある観察領域内で過酸化水素によるトリアリールイミ ダゾールロイコ染料酸化の速度を測定することによって決定した。

その結果を下記の表■に示す。

尋工 洗浄位置　中心　周辺 平均速度　０．０５６３　０．０６３０標準偏差　０．００１６４　０．０００ ９６７洗浄位置　中心　中心から２．８ｍｍ 平均速度　０．０６５９　０．０６０６標準偏差　０．００１６９　０．００１ １４この例の結果は、本発明の［中心から２．８ｍ制洗浄につし）てのより小さ い平均速度が、中心及び周辺洗浄アツセイで読み取られた汚染物（結合していな い標識）の読みを除いていることを示してし）る。

中心と本発明の洗浄方法（２，８ｍｍ）との標準偏差（より小さ０標準偏差が望 ましい）の間の差異は著しい。

本発明をその好ましい態様を特に参照して詳細に記載したが、変形及び修正が本 発明の精神及び範囲内で行い得ることは明ら力１である。

ＦＩＧ、　Ｉ ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　３ ＦＩＧ、　５ａ ＦＩＧ、　６ 国際調査報告　。ｒＴ／ＩＫ。ｔｔ、、ａ、。。

フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＥ、　ＩＴ、　ＬＵ、　ＭＣ，ＮＬ、 　ＰＴ、ＳＥ）、ＪＰ アメリカ合衆国、ニューヨーク　１４５３８゜プルトニービル、イースト　レイ ク　ロード　４６６３

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．未知のレベルの被検物を含む液体試料を固相イムノアッセイするにあたり、 被検物と反応し得る固定化された結合剤を含む、少なくとも１個の多孔質帯域を 有する型の分析要素に該液体試料を適用して、該試料の適用点に一致するその中 心の試料スポット及びその周辺のリングにより規定される漏れた領域を要素上に 形成せしめ、該要素に標識を付与し、 ８〜３０μＬの洗浄液の流れを、該試料スポットの中心と、該スポットの中心と 該リングの内側周辺との間の５０％以下の距離との間の位置で要素に適用して、 該洗浄液が結合していない標識を該スポットの中心領域から有効に追い出し、そ して結合した標識が該スポット領域内に存在する広さを測定することを含んでな る固相イムノアッセイ方法。
2. ２．該イムノアッセイが化学ルミネセンスイムノアッセイである請求の範囲第１ 項記載の方法。
3. ３．該イムノアッセイが比色レートイムノアッセイである請求の範囲第１項記載 の方法。
4. ４．該液体試料が人又は動物の生物学的液体である請求の範囲第１項記載の方法 。
5. ５．該被検物がジゴキシン、Ｃ−反応性蛋白質、チロキシン、フェニトイン、フ ェノバルビタール及びカルバマゼピンからなる群がら選択される請求の範囲第４ 項記載の方法。
6. ６．該洗浄液が緩衝液である請求の範囲第１項記載の方法。
7. ７．該洗浄液を該スポットから該リングの内側周辺までの距離の２５〜４５％の 間の位置で適用する請求の範囲第１項記載の方法。
8. ８．１０μＬ以下の該洗浄液を該スポットから該リングの内側周辺までの距離の ４３％の位置で適用する請求の範囲第１項記載の方法。