JPH11153601A - 免疫クロマトグラフィー装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 検出時に生じるバックグラウンドの着色やブ
ランクの発生による、Ｓ／Ｎ比の低下や誤動作をなく
し、水性試料中の抗原を正確、かつ迅速に検出できる免
疫クロマトグラフィー装置を提供する。また、感度の向
上と反応時間の低減を図り、反応のダイナミックレンジ
を拡大する。 【解決手段】 試験片を構成する多孔質担体の試料導入
部から判定部までの間に添加剤含浸部を設け、そこに界
面活性剤、アンモニウム塩、およびｐＨ緩衝剤の少なく
とも一種を、試料に溶出して担体内を試料とともに移動
できるように担持させる。また、標識抗体を担持してい
る標識部を複数に分割する。さらには、試料が標識部を
直列に通過して判定部に至る流路の他に、標識部の端部
のみまたは標識部をまったく経由せずに直接判定部に至
る流路を設ける。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、水中の微生物の検
出や、体液から極微量のマーカー物質を検出する体外診
断薬ないしは携帯用診断装置に係る。さらに詳しくは、
分析設備を有していない小規模医院や被験者自身により
簡便かつ迅速に測定できる免疫クロマトグラフィー装置
の性能向上を図るものである。

【０００２】

【従来の技術】尿、汗、血液などの体液から極微量のマ
ーカー物質を検出する体外診断薬は、臨床診断、在宅医
療の中心的存在として重要性が認められている。免疫ク
ロマト技術は、抗体の持つ反応特異性を利用した体外診
断薬の基盤技術である。なかでも、妊娠検査薬は、すで
に一般用医薬品として市場に流通しているもっとも典型
的な免疫クロマトグラフィー装置である。女性が妊娠す
ると、胎盤からヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（hCG）が
分泌され、それが尿中に排泄される。妊娠検査器に女性
が尿を添加すると、通常３分間程度で妊娠の陽性・陰性
の判定が素人でも簡単にできる。このような免疫クロマ
トグラフィー装置の代表的な構造が、たとえば米国特許
第5,602,040号に開示されている。

【０００３】以下に、最も簡単な免疫クロマトグラフィ
ー装置の構造と動作について、妊娠検査器を例にして説
明する。図１に典型的な免疫クロマトグラフィー装置に
使用される多孔質担体の構造を示す。この多孔質担体１
は、抗体の固定のしやすさからニトロセルロースのシー
トが最も広く用いられている。ただし、全体をニトロセ
ルロースで構成すると、試料の流速が著しく低下するの
で、判定部だけをニトロセルロースで構成し、その他の
部分は試料の流速のより早いガラスろ紙などで構成する
のが好ましい。担体の一端にある試料導入部２は、試料
が迅速に吸収され、しかしながら保持力は弱く、速やか
に反応部に試料が流れていくような性質の、ガラスろ紙
などの多孔質担体で構成されている。多孔質担体１を中
空のケースに収容する場合は、試料導入部２は比較的長
い構成とし、その一部をケースから露出させることによ
って、直接試料導入部に尿を導入することができる。あ
るいは、試料導入部もケース内に収納されているとき
は、ケースに穴をあけておき、そこから試料導入部に、
試料を添加することができる。

【０００４】標識部３は、金コロイドまたは着色ラテッ
クスに吸着した抗hCG抗体の水溶液をガラスろ紙に含浸
させた後、凍結乾燥させることにより作製したものであ
る。判定部４は、ニトロセルロースのシート上に抗体の
水溶液を任意の形状に滴下した後乾燥し、洗浄すること
により作製したものである。ニトロセルロースの非常に
強固な非特異吸着特性により、抗体がニトロセルロース
上に担持されている。抗体を固定化した後、検出反応の
際の非特異吸着によるバックグラウンドの発色を防止す
るため、たとえば牛血清アルブミン（BSA）などで表面
処理を施すことができる。この操作はブロッキングと呼
ばれている。担体の他方の端部にある吸液部５は、過剰
の試料を迅速に吸収するため、優れた吸液力、吸液容量
を有する材料、ガラスろ紙が用いられる。

【０００５】試料として、女性の尿をクロマトグラフィ
ー装置の形状にあわせて定められた量（通常０．１〜２
ｍｌ）を試料導入部２に添加する。試料は標識部３を経
由し、判定部４を通過して、吸液部５に向かって移動す
る。その際、標識部３を試料が通過する際には、標識部
に担持されていた標識抗体が試料の水分に溶解し試料と
ともに移動を開始する。その後、溶解した標識抗体は判
定部４を通過する。ここで、抗原・抗体の特異的結合反
応に基づき、陽性の場合は、判定部で固定化抗体と標識
抗体とが抗原を介して反応し、判定部が着色される。陰
性の場合は、反応が起こらず、標識抗体が判定部を通過
し吸液部に吸収される。これにより、水性試料液中の抗
原の有無を判定することができる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記のような免疫クロ
マトグラフィー装置において、判定部の固定相抗体以外
の部分の着色（バックグラウンド）及び検出物質が存在
しない場合での固定化相の発色（ブランク）は、検出時
のＳＮ比を下げるばかりでなく、誤動作の原因にもなり
うる。バックグラウンド着色の原因は、可視化された移
動相抗体と多孔質担体との疎水的な結合である。また、
ブランク発色の原因は、負電荷を帯びた移動相抗体と正
電荷を帯びた固定相抗体との電気的相互作用である。

【０００７】通常、検出に用いられる試料には、疎水結
合や電気的相互作用を打ち消す効果のある物質、例えば
界面活性剤やｐＨ緩衝剤等は含まれていない。従って、
従来の免疫クロマトグラフィー装置においては、少なか
らずバックグラウンドの着色が起こり、場合によっては
ブランクが発生するという問題があった。これは、有機
色素を用いて移動相抗体を可視化したときに、特に顕著
にみられる。

【０００８】上記の免疫クロマトグラフィー装置におい
て、標識部に担持された標識抗体の量及び濃度を増加さ
せることにより感度の向上を図ることができる。しかし
ながら、この方法をとると、標識抗体が十分に流れきっ
てバックグラウンドが消色し、目視確認ができるように
なるまでの時間が増大する。すなわち、感度の向上と反
応時間の低減が相反していた。さらに、試料中に含まれ
る抗原が大過剰の場合には、移動相の抗体がすべて抗原
と反応してしまうことにより、判定部にとどまることが
できなくなるため、見かけ上抗原が少ないような誤動作
をすることになる。この理由から、免疫クロマトグラフ
ィーには本質的に反応が起きるダイナミックレンジが存
在することになり、通常妊娠検査器の場合で反応のダイ
ナミックレンジは50〜100,000 IU/Lの範囲であった。ま
た、試料が必ず標識部を経由して判定部に移動するよう
に構成すると、hCGが固定化抗体と反応する前に、標識
された抗体と反応してしまうため、低濃度での抗原の検
出が不利である。

【０００９】本発明は、上記に鑑み、検出時の誤動作の
要因となりうるバックグラウンドの着色やブランク発色
を除去し、液体試料中の抗原を正確にかつ迅速に検出す
ることができる免疫クロマトグラフィー装置を提供する
ことを目的とする。本発明は、また、感度の向上と反応
時間の低減とを同時に達成し、さらには反応のダイナミ
ックレンジを拡大する効果を達成する画期的な免疫クロ
マトグラフィー装置を提供することを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題を解
決するために、多孔質担体の試料導入部から判定部まで
の間に添加剤含浸部を設け、添加剤含浸部には界面活性
剤、可溶性アンモニウム塩、およびｐＨ緩衝剤からなる
群より選ばれた少なくとも１種が、担体に導入される試
料に溶出し、担体内を試料の移動とともに移動できる状
態で担持されている免疫クロマトグラフィー装置を提供
する。本発明は、また前記標識部が複数に分割されてい
る免疫クロマトグラフィー装置を提供する。

【００１１】また、本発明は、抗体の一方を含む標識部
と抗体の他方を含む判定部とを試料導入部に導入された
試料が標識部を経て判定部に移動するように両者を配列
した多孔質担体からなる試験片を備え、前記多孔質担体
にはさらに、試料導入部から標識部の端部を経由するか
または標識部を経由せずに判定部に至る試料のバイパス
流路を設けた免疫クロマトグラフィー装置を提供する。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明の免疫クロマトグラフィー
装置は、抗原・抗体の特異的結合反応に基づいて水性試
料液中の抗原を検出するものであって、検出対象の抗原
に結合する少なくとも２種の抗体、および前記抗体の一
方を含む標識部と抗体の他方を含む判定部とを試料導入
部に導入された試料が標識部を経て判定部に移動するよ
うに両者を配列した多孔質担体からなる試験片を備え、
前記一方の抗体すなわち移動相抗体は、化学的に可視化
処理が施されており、担体に導入される試料液に溶出
し、担体内を試料の移動とともに移動できる状態で担体
の標識部に含有され、他方の抗体すなわち固定相抗体
は、担体の判定部に、試料の移動に伴う位置の変化が起
きない強度で固定化されている。さらに前記担体には、
試料導入部から判定部までの間に添加剤含浸部が設けら
れ、添加剤含浸部には界面活性剤、可溶性アンモニウム
塩、およびｐＨ緩衝剤からなる群より選ばれた少なくと
も１種が、試料液に溶出し、担体内を試料の移動ととも
に移動できる状態で担持されていることを特徴とする。
ここで、添加剤含浸部は、試料導入部と標識部との間
に、または試料導入部と一体化して設けることができ
る。

【００１３】試料導入部から判定部までの間に添加剤含
浸部を設けることにより、分析時には界面活性剤、アン
モニウムイオンまたはｐＨ緩衝剤が試料と混合しながら
移動する。そして、この試料は判定部に達した後、吸液
部に吸収される。添加剤のうち界面活性剤は、液体試料
の表面張力を抑え、試料の流れを助長すると共に移動相
抗体の表面特性を改質して多孔質担体との疎水結合力を
弱める。その結果、免疫クロマトグラフィー装置を用い
た検出時間が短縮でき、さらにバックグラウンドの着色
を抑えることが可能となる。一方、アンモニウムイオン
は、典型的な正電荷化合物であるため、移動相抗体の負
電荷を打ち消す効果がある。また、ｐＨ緩衝剤は、導入
された試料のｐＨを制御することにより、固定相抗体の
正電荷を相殺することができる。これらの結果として、
移動相抗体と固定相抗体との電気的相互作用は解消さ
れ、ブランクの発色を除去することが可能となる。

【００１４】本発明の好ましい態様において、標識部が
複数に分割され、それぞれの標識部の間は、試料および
標識抗体の移動を許す多孔質材料をスペーサーとして補
完して、試料は分割された標識部を流れる構成をとる。
また、この構成に加えて、各標識部に担持された標識抗
体の種類および／または絶対量を異なるものにすること
ができる。標識部を複数に分割し、判定部に近い側の標
識部すなわち流路の下流側の標識部に比較的大量の標識
抗体を担持し、上流側の標識部には少量の標識抗体を担
持させることができる。この構成をとったとき、まず、
試料中に大量の抗原があるときには流路の下流側で大量
の抗原と大量の標識抗体が共存することになり、抗体が
不足を起こすことなく、非常に早い反応の初期に濃い発
色を得ることができる。また、試料中の抗原が少量の場
合には、前記の下流での大量の標識抗体はあまり反応に
寄与しないが、判定部において抗原が濃縮されつつ、後
から時間をかけて均一に近い状態で流れてくる標識抗体
により発色する。つまり、感度は高いまま維持できる。
この場合、後から流れてくる標識抗体の濃度は低いた
め、バックグラウンドは低減したままであり、判定部の
発色を妨げることはない。この構成によれば、抗原の高
い濃度、低い濃度それぞれで最適な反応系が働くため、
結果として感度のダイナミックレンジが向上することに
なる。

【００１５】また、試料が標識部の一部を経由するかま
たは標識部を全く経由せずに直接判定部に至るバイパス
流路を設ける構成により生じる効果は、試料の流路が２
系統に別れることである。つまり、一つの経路は、単純
に試料導入部から担体を経由し、判定部に達する。この
経路は最も障害が少なく試料の流れは早く進行する。も
う一つの経路は、標識部、好ましくは分割された標識
部、を通過することにより、標識部とスペーサとの界面
で接触抵抗が生じ、そのために遅延された試料の流路で
ある。いいかえれば、この構成をとることにより、試料
を導入すると、まず実質的に試料のみが判定部に達し、
一定の時間が経過した後試料によって溶出された標識抗
体が判定部に達する。この遅延時間の間に、判定部で
は、あらかじめ抗原がある程度結合した状態で標識抗体
と抗原の混合物を迎えることになり、少量の抗原しか存
在していない場合でも効率的にこれを捕らえることが可
能となり、結果として感度を向上させることができる。
この構成によれば、遅延時間を設けることによって、一
見反応時間は増大することになるが、実際には担持する
標識抗体の絶対量を増加させることなく感度向上が図れ
るので、バックグラウンド消失の時間が縮減され、全体
としては反応時間は短縮されることになる。

【００１６】本発明において、化学的に可視化された抗
体、すなわち移動相抗体は、金コロイド、ラテックス粒
子、有機色素、顔料、金属、金属酸化物、および酵素の
うちのいずれかもしくはこの中のいくつかの組み合わせ
を結合させることにより、可視化されていることが好ま
しい。次の構造式（化２）で表されるシアニン系色素
は、好ましい色素の例である。

【００１７】

【化２】

【００１８】本発明の免疫クロマトグラフィー装置は、
抗原がhCG、LH（黄体形成ホルモン）、またはCRP（Ｃ反
応性タンパク質）のいずれかである場合に特に有効であ
る。本発明に用いる界面活性剤としては、アルキルフェ
ノールエーテル系の非イオン界面活性剤が用いられる。
トリトン系界面活性剤、なかでもトリトン（Triton）X-
100の名で販売されているものが好ましい。アンモニウ
ム塩としては、テトラメチルアンモニウム塩、例えば塩
化テトラメチルアンモニウム、臭化テトラメチルアンモ
ニウム、ヨウ化テトラメチルアンモニウムなどが好まし
い。添加剤含浸部におけるｐＨ緩衝剤の担持量は、担体
の試料導入部にあらかじめ定めた体積の試料を添加した
とき、判定部における試料のｐＨが８．０〜８．５の範
囲になる量であることが好ましい。ｐＨ緩衝剤は、ホウ
酸、２−（Ｎ−モルフォリノ)エタンスルフォン酸、ト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、およびリン酸
からなる群より選ばれたものが好ましい。

【００１９】図２は、本発明の免疫クロマトグラフィー
装置に用いる多孔質担体からなる試験片の構成例を示
す。試験片１０は、多孔質担体からなり、試料導入部１
１、添加剤含浸部１２、可視化処理が施された移動相抗
体を含有する標識部１３、固定相抗体の固定化部１５を
有する判定部１４、および吸液部１６が順次配列された
構成を有する。この試験片は、液体を透過しない材質の
中空の容器内に収納される。そして、容器には、外部か
ら担体上の判定部を目視するための窓が設けられる。さ
らに、外部から試料を多孔質担体上に導入できるよう
に、中空の容器の一部を開放するか、または標識部を中
心として、判定部の反対方向に多孔質担体が延長され、
その一部が試料の導入部となるように、中空の容器から
外部に露出される。図３は試験片の他の好ましい構成例
を示す。標識部１３は、１３ａ、１３ｂ、および１３ｃ
に分割されている。図示していないが、添加剤含浸部１
２は設けてある。

【００２０】

【実施例】以下、本発明の実施例を詳細に説明する。 《実施例１》 ［各部材の作製方法］ （１）判定部のブロッキング剤及び洗浄剤の作製方法 蒸留水１Ｌにトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
（以下Trisで表す）を０．１ｍｏｌ（１２．１１ｇ）加
えて攪拌した後、１ＮのＨＣｌによりｐＨ８．２に調整
し、ニトロセルロースの洗浄剤とした。また、前記の洗
浄剤にスキムミルクを１０ｇ加えて攪拌し、ニトロセル
ロースのブロッキング剤とした。

【００２１】（２）判定部の抗体固定化方法 ニトロセルロースのシート（ミリポア社製：HFM SPHF04
020）を大きさ０．９ｃｍ×１．２ｃｍに裁断した厚さ
約２２０μｍ（支持体を含む）のシートを担体とした。
このシートの上に、試料導入部側から０．５ｃｍ、吸液
部側から０．７ｃｍの箇所に、ヒト絨毛性性腺刺激ホル
モンに対する抗hCGβ抗体（α-hCGβ）のリン酸緩衝溶
液（以下PBS溶液で表す）（５ｍｇ／ｍＬ）を塗布し、
４０℃で８時間遮光状態で乾燥した。乾燥後、シートを
上記のブロッキング剤に、ブロッキング剤が３０シート
あたり７０ｍＬの割合となるよう浸潤し、３０℃で３０
分間シェイカーにてブロッキングした。ブロッキング
後、上記の洗浄剤（７０ｍＬ／３０シート）により３０
℃で３０分間洗浄する操作を３回繰り返した後、デシケ
ータ内にて一晩乾燥した。 （３）添加剤含浸部の作製方法 蒸留水１ＬにTrisを１ｍｏｌ（１２１．１ｇ）加えて攪
拌した後、１ＮのＨＣｌによりｐＨ８．２に調整した。
これに塩化テトラメチルアンモニウム（以下TMAで表
す）１ｍｏｌ（１０９．６ｇ）とトリトン系界面活性剤
Triton X-100（以下Tritonで表す）の１０％水溶液１０
ｍＬを加えて攪拌し、ｐＨ８．２のTris(1M)-TMA(1M)-T
riton(0.1%)溶液を作製した。これをガラス繊維濾紙を
大きさ０．９ｃｍ×６．０ｃｍに裁断したものに０．３
６ｍＬ含浸した後、凍結乾燥した。

【００２２】（４）標識部の作製方法 ａ）抗hCGα抗体（α-hCGα）PBS溶液（１０ｍｇ／ｍ
Ｌ）にジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネ
ート）（以下DTSSPで表す）のPBS溶液（４．０６ｍｇ／
０．１ｍＬ）をゆっくり滴下し、３５℃で３０分間攪拌
した後、分子量分画カラム（ファルマシア社製：セファ
デックスG25Ｍ）にてゲル濾過した。 ｂ）ゲル濾過後、抗hCGα重合抗体のPBS溶液（１０ｍｇ
／６ｍL）となった。これを４℃で保存した。 ｃ）ウシ血清アルブミン（BSA）のPBS溶液（１１０ｍｇ
／ｍＬ）にジチオスレイトール（DTT）７７ｍｇを加
え、室温で３０分間攪拌した後（最終濃度７．７ｍｇ／
ｍＬ）、速やかに分子量分画カラム（ファルマシア社
製：セファデックスG25Ｍ）にてゲル濾過した。その結
果、SH基の遊離したBSA（全体量２４ｍＬ）溶液を得
た。 ｄ）前記SH基の遊離したBSA（全体量２４ｍＬ）に、
ｂ）の４℃保存の抗hCGα重合抗体のPBS溶液（１０ｍｇ
／６ｍＬ）を混合し、４℃で２０時間攪拌した。 ｅ）未反応のBSAを除くため分子量分画カラム（ファル
マシア社製：セファクリルS300HR）にてゲル濾過した。
抗hCGα重合抗体−BSA（全体量４０ｍＬ〜５０ｍＬ）が
得られた。 ｆ）これに上記化２に示したシアニン系色素（以下SLIC
3で表す）のPBS溶液（３５０ｍｇ／２ｍＬ）をゆっくり
滴下した後、４℃で２０時間攪拌した。 ｇ）未反応のシアニン系色素を除くため分子量分画カラ
ム５０ｃｍと１５０ｃｍ（ファルマシア社製：セファデ
ックスG25Ｍ）にてゲル濾過した。抗hCGα重合抗体−BS
A−SLIC3（全体量６０ｍＬ〜９０ｍＬ）が得られた。こ
れを標識抗体原液と呼ぶ。 ｈ）標識抗体原液に安定剤としてBSAとスクロースをそ
れぞれ１％添加した。 ｉ）ガラス濾紙を大きさ０．９ｃｍ×５．０ｃｍに裁断
し、これに前記安定剤を添加した標識抗体原液を１シー
ト当たり０．３ｍＬの割合で含浸した後、凍結乾燥し
た。 ｊ）凍結乾燥後、遮光乾燥状態で保存した。 （５）吸液部の作製方法 ガラス繊維濾紙を大きさ０．９ｃｍ×２．５ｃｍに裁断
し、これを６枚重ねて使用する。

【００２３】［試験片の作製方法］図４に本実施例によ
る試験片２０の構造を示す。図４は、各構成材のサイズ
は必ずしも正確に表していない。大きさ０．９ｃｍ×
５．５ｃｍの両面テープを全面に張った大きさ０．９ｃ
ｍ×５．５ｃｍ、厚さ０．５ｍｍの白色硬質ポリ塩化ビ
ニル製の裏打ち２１の表面に、判定部２６、その下流側
に吸液部２７、判定部２６の上流側に標識部２４をそれ
ぞれ接着させた。また、標識部２４の上流側にガラス繊
維濾紙の大きさ０．９ｃｍ×０．５ｃｍのもの２３およ
び添加剤含浸部２２を順次接着させ、さらに標識部２４
から添加剤含浸部２２の上部全体に、ガラス繊維濾紙の
大きさ０．９ｃｍ×３．５ｃｍのもの２枚をバイパス用
多孔質体２５として装着した。こうして得た試験片２０
を中空のケースに組み込んだ。

【００２４】この試験片２０は、添加剤含浸部２２の端
部側が試料導入部を兼ねている。試料を図の矢印２８の
ように試験片へ添加すると、主に添加剤含浸部２２から
ガラス繊維濾紙２３、標識部２４を経由して判定部２６
に至る流路２９ａと、バイパス用多孔質体２５から標識
部２４の端部を経由するかまたはこれを越えて判定部２
６に至る流路２９ｂとに流れる。図では、多孔質体２５
の端部には標識部２４が接しているが、標識部を越えて
直接判定部２６に接するようにするのがより好ましい。

【００２５】この構成によると、標識部２４全体を通過
する流路２９ａに比べて標識部２４の端部を経由するか
またはこれを越えて判定部に至る流路２９ｂとでは、後
者の流路の方が障害が少なく、試料の流れは早く進行す
る。従って、前者の流路２９ａは、遅延された試料の流
路である。そのため、試料を導入すると、標識部の抗体
を殆ど含まない試料がまず判定部に達し、一定の時間が
経過した後、試料によって溶出された標識抗体が判定部
に達する。この遅延時間の間に、判定部では、あらかじ
め抗原がある程度結合した状態で標識抗体と抗原の混合
物を迎えることになり、少量の抗原しか存在していない
場合でも効率的にこれを捕らえることが可能となる。そ
の結果、視認性が高くなり、感度が向上する。この構成
によれば、遅延時間を設けることによって、一見反応時
間は増大することになるが、実際には担持する標識抗体
の絶対量を増加させることなく感度向上が図れるので、
バックグラウンド消失の時間が縮減され、全体としては
反応時間は短縮されることになる。

【００２６】《比較例１》図４の試験片のうち、添加剤
含浸部２２の代わりに２３と同じガラス繊維濾紙を用
い、さらにガラス繊維濾紙２５を省いた他は実施例１と
同じである。

【００２７】上記実施例１の試験片及び比較例１の試験
片を用いた免疫クロマトグラフィー装置について、感
度、反応時間及び視認性の試験を行った。分析対象物
は、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（hCG）である。測定
濃度（感度）は１００，０００ IU/L〜0 IU/L、試料導
入部に添加するhCG溶液量は０．４５ｍＬとした。この
場合の反応時間とは、hCG溶液を試料導入部に添加して
から、固定化抗体の抗hCGβ抗体と標識抗体の抗hCGα抗
体とがhCGを介して反応し固定化部のラインが見え始め
るまでの時間のことである。また、視認性の数値に関し
ては、反射吸光度測定（島津製作所製：CS-9300）によ
るもので、入射光５５０ｎｍ（SLIC3の吸収）に対する
反射光の強度を測定している。基準値は未使用のニトロ
セルロースの吸光度であり、反射光強度の測定時間はク
ロマトグラフィー終了後３０分以内である。

【００２８】図５は視認性を上記吸光度で比較したもの
であり、図６は速度の比較を表している。また、図には
表していないが、hCG濃度が１０，０００IU/Lの際に
は、比較例１では試料添加後３０秒で吸光度が０．５に
達したのに対し、本実施例では試料添加後２０秒で吸光
度が０．７に達した。これらの結果から、本発明による
免疫クロマトグラフィー装置は、感度、速度及び視認性
において従来例に相当する比較例１に比べて優れている
ことがわかる。

【００２９】《実施例２》添加剤含浸部の作製方法にお
いて、実施例１のTris(1M)-TMA(1M)-Triton(0.1%)溶液
の代わりにTris(1M)-TMA(1M)溶液を用いた他は実施例１
と同様にして試験片を作製した。

【００３０】《実施例３》添加剤含浸部の作製方法にお
いて、実施例１のTris(1M)-TMA(1M)-Triton(0.1%)溶液
の代わりにTris(1M)-Triton(0.1%)溶液を用いた他は実
施例１と同様にして試験片を作製した。

【００３１】《比較例２》実施例２の添加剤含浸部の代
わりに添加剤を含浸していない２３と同じガラス繊維濾
紙を用いた他は実施例２と同じとした試験片を作製し
た。

【００３２】実施例２、３及び比較例２の試験片を用い
た免疫クロマトグラフィー装置について、実施例１と同
様の試験をした結果を図７〜１０に示す。また、添加剤
含浸部の作製方法において、実施例１のTris(1M)-TMA(1
M)-Triton(0.1%)溶液の代わりに各ｐＨのTris溶液を用
いた他は実施例１と同様にして試験片を作製した。こう
して、あらかじめ定めた体積の試料を添加したとき試料
のｐＨが各種の値となるようにした。試料分析時のｐＨ
と吸光度の関係を図１１に示す。黒丸はｐＨ８．２のと
きのプロットを表し、他はｐＨ８．２以外のｐＨ６．５
〜９．０のときのプロットを表す。ブランク発色（０IU
/L）の原因は、負電荷を有する色素標識抗体と正電荷を
有する固定化抗体との電気的結合であるため、試験片に
展開させる試料液をｐＨ８．２に調整すると、固定化抗
体の正電荷を打ち消すことが可能となり、さらに正電荷
を有するTMAを添加すると、色素標識抗体の色素の負電
荷を打ち消すことが可能となり、ブランクの発色を除去
することができた（図７参照）。また、界面活性剤を添
加することにより、発色と検出時間を短縮することがで
きた（図１０参照）。

【００３３】《実施例４》標識部を次のようにして作製
した他は実施例１と同様にして試験片を作製した。 標識部の作成方法：実施例１の標識部の作製方法におい
て、ａ）〜ｋ）の処理をした後、さらに次の処理をし
た。 ｋ）凍結乾燥した標識部含浸濾紙を大きさ０．９ｃｍ×
０．１ｃｍに裁断した。これを標識部２４ｃとした。 ｌ）標識抗体原液をPBSで４倍に希釈したものを前記と
同様の方法でガラス繊維濾紙に含浸した後、凍結乾燥
し、大きさ０．９ｃｍ×０．１ｃｍに裁断した。これら
を標識部２４ａおよび２４ｂとした。標識部２４ａ、２
４ｂ、２４ｃを同一サイズのガラス繊維濾紙からなるス
ペーサ３０を挟んで図１２のように配列して接着させ
た。

【００３４】《実施例５》図１３に示すように、実施例
４における添加剤含浸部２２を設けず、代わりにガラス
繊維濾紙で構成した他は実施例４と同様にして試験片を
作製した。まず、標識部を分割してことによる効果を実
証するための比較実験の結果を示す。本実験で用いたの
は、実施例５の試験片を用いた免疫クロマトグラフィー
装置、および、標識部は分割せずに比較例用標識部をそ
の判定部側を実施例５における標識部２４ｃと同一の場
所になるようにした他は実施例５と同様の試験片を用い
た比較例の装置である。つまり、両者で用いた標識部お
よび標識部に担持された標識抗体の全体量は同一であ
る。分析対象物にはヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（hC
G）を用いた。また、反応の呈色の測定は、反射吸光度
測定（島津製作所製：CS-9300）によるもので、入射光
５５０ｎｍ（SLIC3の吸収）に対する反射光の強度を測
定している。０設定は未使用のニトロセルロースとし
た。0、50、1,000、10,000 IU/Lの濃度に調整したhCGの
リン酸緩衝液(PBS)を試験片の試料導入部へ添加し、装
置を室温（２５℃）中で水平に放置し、反応を検出し
た。

【００３５】図１４は試料添加３分後の各hCG濃度にお
ける吸光度（発色濃度）を測定した結果を示し、図１５
は試料を添加してから、判定とバックグラウンドでの吸
光度の差が０．２になるまでの時間をプロットしたもの
である。図１４に示されているように、hCG濃度の全域
にわたり、本実施例の装置では高い発色を示している。
特に、10,000 IU/Lの高濃度領域において、比較例では
発色が下がる誤動作が発生しているのに対し、本実施例
ではこの濃度においても正常な発色が見られ、本発明に
よる感度向上と、ダイナミックレンジの改善を示唆して
いる。また、図１５に示されているように、発色時間
(反応時間)は、やはりhCG全域にわたり比較例より加速
されている。また、図では表現されていないが、hCG濃
度が10,000IU/Lの際には、比較例では試料添加後３０秒
で吸光度が０．５に達したのに対し、本実施例では試料
添加後２０秒で吸光度が０．７に達した。

【００３６】次に、実施例４、５および実施例１の試験
片を用いたクロマトグラフィー装置の比較試験の結果を
説明する。分析対象物にはヒト絨毛性性腺刺激ホルモン
（hCG）を用いた。前記と同様に視認性に関しては入射
光５５０ｎｍに対する反射光の強度を測定した。０、５
０、１００、１０００、および１００００ IU/Lの濃度
に調整したhCGのリン酸緩衝液（PBS）を試験片の試料導
入部へ添加し、室温（２５℃）で水平に放置した。試料
添加３分後の各hCG濃度における吸光度（発色強度）の
比較を図１６に示す。添加剤を組み込むとともに標識部
を複数に分割した構成の実施例４は、どちらか一方を採
用した実施例１および実施例５に比べて、発色強度が向
上していることがわかる。また、誤動作の要因となる０
IU/Lにおける発色も完全に除去することができた。

【００３７】

【発明の効果】以上のように本発明によれば、検出時の
誤動作の要因となりうるバックグラウンドの着色やブラ
ンク発色を完全に除去することができる。従って、本発
明の免疫クロマトグラフィー装置を用いれば、あらゆる
液体試料中の抗原を正確にかつ迅速に検出することがで
きる。また、本発明によれば、標識抗体を最適な条件で
反応に用いることが可能となり、検出速度の向上、検出
感度の増加、および検出感度のダイナミックレンジの拡
大を同時に達成することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】従来の免疫クロマトグラフィー装置の試験片を
示す斜視図である。

【図２】本発明の免疫クロマトグラフィー装置に用いる
試験片の構成例を示す斜視図である。

【図３】本発明の免疫クロマトグラフィー装置に用いる
試験片の他の構成例を示す斜視図である。

【図４】実施例に用いた試験片の縦断面図である。

【図５】試料中のｈＣＧ濃度と判定部における吸光度
（発色強度）との関係を比較したグラフである。

【図６】試料中のｈＣＧ濃度と検出可能な最短時間との
関係を比較したグラフである。

【図７】試料中のｈＣＧ濃度と判定部における吸光度と
の関係を比較したグラフである。

【図８】試料中のｈＣＧ濃度と検出可能な最短時間との
関係を比較したグラフである。

【図９】試料中のｈＣＧ濃度と判定部における吸光度と
の関係を比較したグラフである。

【図１０】試料中のｈＣＧ濃度と検出可能な最短時間と
の関係を比較したグラフである。

【図１１】試験片に展開する試料液のｐＨを変えたとき
の試料中のｈＣＧ濃度と判定部における吸光度との関係
を示すグラフである。

【図１２】他の実施例に用いた試験片の縦断面図であ
る。

【図１３】さらに他の実施例に用いた試験片の縦断面図
である。

【図１４】試料中のｈＣＧ濃度と判定部における吸光度
との関係を比較したグラフである。

【図１５】試料中のｈＣＧ濃度と検出可能な最短時間と
の関係を比較したグラフである。

【図１６】試料中のｈＣＧ濃度と判定部における吸光度
との関係を比較したグラフである。

【符号の説明】

１０、２０ 試験片 １１ 試料導入部 １２、２２ 添加剤含浸部 １３、２４ 標識部 １４、２６ 判定部 １５ 固定化部 １６、２７ 吸液部 ２９ｂ バイパス流路

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗原・抗体の特異的結合反応に基づいて
   水性試料液中の抗原を検出する免疫クロマトグラフィー
   装置であって、検出対象の抗原に結合する少なくとも２
   種の抗体、および前記抗体の一方を含む標識部と抗体の
   他方を含む判定部とを試料導入部に導入された試料が標
   識部を経て判定部に移動するように両者を配列した多孔
   質担体からなる試験片を備え、前記一方の抗体は化学的
   に可視化処理が施されており、担体に導入される試料液
   により溶出し、担体内を試料の移動とともに移動できる
   状態で担体の標識部に含有され、他方の抗体は担体の判
   定部に、試料の移動に伴う位置の変化が起きない強度で
   固定化されており、さらに前記担体には、試料導入部か
   ら判定部までの間に添加剤含浸部が設けられ、添加剤含
   浸部には界面活性剤、アンモニウム塩、およびｐＨ緩衝
   剤からなる群より選ばれた少なくとも１種が、試料液に
   より溶出し、担体内を試料の移動とともに移動できる状
   態で担持されていることを特徴とする免疫クロマトグラ
   フィー装置。
2. 【請求項２】 前記標識部は複数に分割されている請求
   項１記載の免疫クロマトグラフィー装置。
3. 【請求項３】 前記一方の抗体が、金コロイド、ラテッ
   クス粒子、有機色素、顔料、金属、金属酸化物、および
   酵素からなる群より選ばれた少なくとも１種と結合して
   可視化されている請求項１記載の免疫クロマトグラフィ
   ー装置。
4. 【請求項４】 可視化処理された抗体が化１で示される
   構造のシアニン系色素で標識された抗体である請求項１
   記載の免疫クロマトグラフィー装置。 【化１】
5. 【請求項５】 界面活性剤がアルキルフェノールエーテ
   ル系の非イオン界面活性剤である請求項１記載の免疫ク
   ロマトグラフィー装置。
6. 【請求項６】 アンモニウム塩がテトラメチルアンモニ
   ウム塩である請求項１記載の免疫クロマトグラフィー装
   置。
7. 【請求項７】 添加剤含浸部におけるｐＨ緩衝剤の担持
   量が、担体の試料導入部にあらかじめ定めた体積の試料
   を添加したとき、判定部における試料のｐＨが８．０〜
   ８．５の範囲になる量である請求項１記載の免疫クロマ
   トグラフィー装置。
8. 【請求項８】 ｐＨ緩衝剤が、ホウ酸、２−（Ｎ−モル
   フォリノ)エタンスルフォン酸、トリス（ヒドロキシメ
   チル）アミノメタン、およびリン酸からなる群より選ば
   れた少なくとも１種である請求項１記載の免疫クロマト
   グラフィー装置。
9. 【請求項９】 分割された１つの標識部に担持された標
   識抗体の含有量が他の標識部に担持された標識抗体の含
   有量と異なる請求項２記載の免疫クロマトグラフィー装
   置。
10. 【請求項１０】 分割された標識部のうち、判定部に近
    い側に担持される標識抗体の含有量が判定部に遠い側の
    標識部に含有される標識抗体の量よりも多い請求項９記
    載の免疫クロマトグラフィー装置。
11. 【請求項１１】 試料が複数の標識部を直列に通過して
    判定部に至る流路の他に、標識部の一部を経由するかま
    たは標識部を全く経由せずに直接判定部に至る流路を有
    する請求項２記載の免疫クロマトグラフィー装置。
12. 【請求項１２】 複数個の標識部間に、試料および標識
    抗体の移動を許す多孔質材料が介在している請求項２記
    載の免疫クロマトグラフィー装置。
13. 【請求項１３】 さらに、前記担体には、前記試料導入
    部から標識部の端部を経由するかまたは標識部を経由せ
    ずに判定部に至る試料のバイパス流路を有する請求項１
    記載の免疫クロマトグラフィー装置。
14. 【請求項１４】 抗原・抗体の特異的結合反応に基づい
    て水性試料液中の抗原を検出する免疫クロマトグラフィ
    ー装置であって、検出対象の抗原に結合する少なくとも
    ２種の抗体、および前記抗体の一方を含む標識部と抗体
    の他方を含む判定部とを試料導入部に導入された試料が
    標識部を経て判定部に移動するように両者を配列して設
    けた多孔質担体を備え、前記一方の抗体は、化学的に可
    視化処理が施されており、担体に導入される試料液に溶
    出し、担体内を試料の移動とともに移動できる状態で担
    体の標識部に含有され、他方の抗体は、担体の判定部
    に、試料の移動に伴う位置の変化が起きない強度で固定
    化されており、かつ前記標識部は複数に分割されている
    ことを特徴とする免疫クロマトグラフィー装置。
15. 【請求項１５】 抗原・抗体の特異的結合反応に基づい
    て水性試料液中の抗原を検出する免疫クロマトグラフィ
    ー装置であって、検出対象の抗原に結合する少なくとも
    ２種の抗体、および前記抗体の一方を含む標識部と抗体
    の他方を含む判定部とを試料導入部に導入された試料が
    標識部を経て判定部に移動するように両者を配列した多
    孔質担体からなる試験片を備え、前記一方の抗体は化学
    的に可視化処理が施されており、担体に導入される試料
    液により溶出し、担体内を試料の移動とともに移動でき
    る状態で担体の標識部に含有され、他方の抗体は担体の
    判定部に、試料の移動に伴う位置の変化が起きない強度
    で固定化されており、さらに前記担体には、前記試料導
    入部から標識部の端部を経由するかまたは標識部を経由
    せずに判定部に至る試料のバイパス流路を有することを
    特徴とする免疫クロマトグラフィー装置。