SU1656455A1 - Способ определени антител к катехоламину - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к химии получени  новых соединений дл  их использовани  в технике иммунохимических иследований. Цель изобретени  - повышение чувствительности к катехоламину. Дл  этого в раствор пероксидазы в воде добавл ют катехоламин и глутаровый альдегид в мол рном соотношении компонентов 1:100:(8-16). Смесь инкубируют при 20-30°С в течение 3 ч, затем выдел ют целевой продукт диализом против воды. Дл  повышени  чувствительности способа твердую фазу сенсибилизируют вторичными антителами, их подвергают взаимодействию с исследуемой сывороткой при 37°С 40 мин, затем твердую фазу промывают водой, добавл ют меченый пе- роксидазой катезоламин в разведении 1:100. Перед конъюгированием ферментно- меченого катезоламина пероксидазу хрена активируют периодатом натри  при мол рном соотношении 1:(150-200), выдерживают 30-40 мин и используют в соотношении катехоламином 1:200. Реакционную смесь инкубируют 40 мин при 37°С, промывают водой, добавл ют субстратную смесь и по оптической плотности раствора определ ют титр антител . 2 з.п. ф-лы. fe

Description

Изобретение относитс  к химии получени  новых соединений дл  их использовани  в технике иммунохимических исследований.

Цель изобретени  - повышение чувствительности способа при определении титров антител к катехоламину.

Способ осуществл ют следующим образом .

В раствор пероксидазы в воде добавл ют катехолэмин и глутаровый альдегид в мол рном соотношении компонентов 1:100:8-16 соответственно, смесь инкубируют при 20-30°С в течение 3 ч, после чего выдел ют целевой продукт диализом против воды.

Возможен также вариант, при котором пероксидазу раствор ют в воде, в раствор

добавл ют перйодат натри  в количестве 150-200 М на 1 М пероксидазы, реакционную смесь инкубируют 30-40 мин, диализу ют против воды, после чего в ней раствор ют катехоламин в количестве 200 М на 1 М пероксидазы, инкубируют при 20-30°С в течение 3 ч, а затем выдел ют целевой продукт диализом против воды.

Дл  повышени  чувствительности способа определени  титров антител к катехоламину путем обработки иммобилизованного на твердой фазе комплекса антиген-антитело ферментсодержащим биологически активным веществом, взаимодействи  с субстратной смесью и последующего определени  титра антител по интенсивности окраски, твердую фазу сенсибилизируют вторыми антителами, их подО

ел (

ft

с 

вергают взаимодействию с исследуемой сывороткой при 37°С в течение 40 мин, после чего твердую фазу промывают водой и к ней добавл ют меченый пероксидазой катехоламин в разведении 1:100, реакционную смесь инкубируют 40 мин при 37°С, промывают водой, добавл ют субстратную смесь и по оптической плотности раствора определ ют титр антител.

Согласно способу определени  катехо- ламинов, антитела к катехоламину сенсибилизируют на твердой фазе, затем к иммобилизованным антителам добавл ют исследуемую пробу, инкубируют при 37°С в течение 40 мин, отмывают водой, после чего к образовавшемус  комплексу добавл ют меченый пероксидазой катехоламин, инкубируют при 37°С в течение 40 мин, промывают водой, добавл ют субстратную смесь и по оптической плотности раствора определ ют количество катехоламина в исследуемой пробе.

.По первому способу катехоламин св зываетс  с пероксидазой при помощи бифункционального реагента - глутарового альдегида.

Пример 1. Получение меченого пероксидазой норадреналина 0,1 мкМ пе- роксидазы раствор ют в 2 мл воды, добавл ют в раствор 10 мкМ норадреналина и по капл м 2 мл раствора, содержащего 0.8 мкМ глутарового альдегида. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 3 ч, а затем подвергают диализу против воды на диализной мембране 20/32 фирмы Serva (ФРГ) в течение 24 ч.

Дл  сенсибилизации поверхности полистиролового планшета используют вторые антитела, в качестве которых примен ют IgG морской свинки к IgG кролика, в концентрации 20 мкг/мл в 0,1 М карбонатбикарбо- натном буфере рН 9,6. В каждую лунку планшета внос т по 50 мкл раствора вторых антител и инкубируют в течение 18 ч при 4°С, после чего лунки промывают водой с добавлением твина-20 фирмы Ferak (Западный Берлин). Затем в каждую из лунок внос т антисыворотку к определ емому катехоламину в двукратных разведени х (по 50 мкл), начина  с разведени  1:200, инкубируют в течение 40 мин при 37°С, затем отмывают водой с твином- 20 и внос т в каждую из лунок по 50 мкл меченого пероксидазой катехоламина, вид которого соответствует определ емому типу антител, в разведении 1:100. Смесь инкубируют в течение 40 мин при 37°С, после чего планшеты отмывают водой с твином-20 и добавл ют в каждую из лунок по 50 мкл субстратной смеси, состо щей из 5 мл раствора ортофенилендиамина (0,4 мг/мл) в 0,1 М цитратно-фосфатном буфере рН 5,0 и 20 мкл 3%-ной перекиси водорода. После инкубации в течение 5 мин ферментативную реакцию останавливают 50%-ным раствором серной кислоты. Оптическую плотность раствора в каждой лунке регистрируют на многоканальном фотометре FP-901. фирмы Labsystems Oy (Финл н0 дн ) при 500 нм.

По второму способу углеводную часть пероксидазы предварительно подвергают окислению перйодатом натри  и активированный таким образом фермент вступает в

5 реакцию с катехоламином.

Пример 2. Получение меченого пероксидазой норадреналина.

0.2 мкМ пероксидазы раствор ют в 1 мл дистиллированной воды. Затем к этому

0 раствору добавл ют 0,2 мл раствора, содержащего 30 мкМ перйодата натри , перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре и диализуют против воды. 40 мкМ норадреналина раство5 р ют в 1 мл фосфатного буфера рН 7,2 и добавл ют к раствору окисленной перйодатом пероксидазе. Смесь перемешивают в течение 3 ч при комнатной температуре, а затем диализуют против воды на диализной

0 мембране 20/32 фирмы Serva (ФРГ) в течение 24 ч.

Определение титра антител провод т как в примере 1

Препарат, синтезированный по перво5 му способу, содержит большее количество катехоламина, присоединенного к пероксидазе (6-8 М на 1 М пероксидазы), чем препарат, полученный по второму способу (3-4 М на 1М пероксидазы). В то же врем 

0 препарат, полученный по второму способу, обладает большей ферментативной активностью ( М против 5- М). Из практических соображений предпочтение к использованию одного из препаратов от5 дать затруднительно, так как качественные параметры их примерно одинаковы. Отсюда следует, что первый и второй способы получени   вл ютс  альтернативными .

0 Основным критерием оценки свойств полученных препаратов служит определение св зывающей способности антител к катехоламинам по отношению к этим препаратам .

5 Дл  сравнени  производ т определение титров антител прототипным способом, при котором полист ироловыи планшет сенсибилизируют соответствующим катехоламином , а образовавшийс  комплекс катехоламин - антитело индентифицируют

вторыми антителами, мечеными перокси- дазой. По данным измерени  оптической плотности построены зависимости в координатах - оптическа  плотность против фактора разведени  антисыворотки: при определении известным способом и предлагаемым способом. В известном определении: при разведении антител 1:3200 и выше оптическа  плотность не измен етс  и равна 0,17. В предлагаемом определении это зна- чение оптической плотности достигаетс  при разведении 1:891.200 и выше. Это говорит о том, что образовавшийс  комплекс катехоламин-антитело вы вл етс  в предлагаемом способе в 256 раз чувствительнее, чем в прототипном. Таким образом, применение меченого пероксидазой катехоламина в предлагаемой схеме определени  титров позвол ет повысить чувствительность определени  более чем в 200 раз.

Claims (3)

1. Формула изобретени  1. Способ определени  антител к кате- холамину, включающий сенсибилизацию твердой подложки, добавление исследуе- мой сыворотки, ферментспецифического субстрата и определение количества антител по развитию специфического окрашивани , отличающийс  тем. что, с целью увеличени  чувствительности способа, твердую подложку сенсибилизируют вторичными , антителами и после добавлени  исследуемой сыворотки внос т ферментно- меченный катехолэмин. приготовленный путем его конъюгировани  и инкубировани  в течение 3 ч при комнатной температуре с последующим диализом.
2. 2.Способ по п. 1, отличающийс  тем,- что при конъюгировании ферментно- меченного катехоламина используют ка- техоламин, пероксидазу хрена и глутаровый альдегид в мол рном соотношении 1:100:8-16.
3. 3.Способ по п. 1, отличающийс  тем. что перед коньюгированием фермент- но-меченного катехоламина пероксидаэу хрена активируют перйодатом натри , вз тых в мол рном соотношении 1:150-200, выдерживают 30-40 мин при комнатной температуре и используют в соотношении с катехоламином 1:200.