JP2000235033A - 高感度免疫測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 乾式免疫測定試薬におけるリポソーム安定化
剤によるリポソーム崩壊への悪影響を減じ、標識物質を
滞り無く漏出させ、ひいては免疫測定試薬の保存安定性
の向上と高感度化の両立させる。 【解決手段】 内部に標識物質を封入するとともに抗体
を結合してなるリポソームと、補体とを含む乾式免疫測
定試薬において、リポソーム分解酵素をリポソーム内に
封入することを特徴とする。また、リポソーム安定化剤
が添加される際に、標識物質が酵素であるとき、該標識
用酵素の基質が安定化剤であることも特徴とすること
で、標識酵素の基質と、リポソームの安定化剤を共有化
できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中に存在する
特定の抗原を定量又は定性分析するための高感度な乾式
免疫測定用試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】試料中の免疫測定方法としては、交差免
疫電気泳動法（ＣＩＥ）、二次元免疫拡散法（ＭＯ）、
受身赤血球凝集反応（ＰＨＡ）、免疫粘着赤血球凝集反
応（ＩＡＨＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、固相放射
免疫測定法（ＲＩＡ）等が知られている。現在では、主
に酵素免疫測定法（ＥＩＡ）が用いられている。

【０００３】また、特開昭６３−３０９８６４号公報に
は、表面に親水性の抗体又は抗原を固定化し、内部に親
水性の標識物質（例えば蛍光物質）を封入したリポソー
ム試薬を用いた測定方法が提案されている。この方法は
ＬＩＬＡ（リポソーム・イムノライシス・アッセイ）と
称される。

【０００４】このＬＩＬＡは以下のようなものである。
すなわち、抗原又は抗体又は補体が存在する試薬中にリ
ポソーム試薬を加え、これと別に補体又は膜を侵襲出来
る物質を加える（補体測定の場合は不要であり、試料中
に補体成分が含まれる場合には別途補体を加えても良い
し加えなくても良い）と、抗原−抗体反応及びそれに伴
う補体又は膜を侵襲出来る物質の活性化が起こり、補体
又は膜を侵襲出来る物質の膜障害作用によってリポソー
ムが破壊され、封入されていた標識物質が流出する。こ
の流出した標識物質の量と、試料中の被検物質、すなわ
ち抗体又は抗原又は補体との間には相関関係があるの
で、流出した標識物質を所定の分析方法（例えば蛍光分
析）によって定量することにより、被検物質を定量する
ことが出来る。

【０００５】しかしながら、このＬＩＬＡ法は溶液系の
反応であるため、試料や試薬を順次加えていくという操
作が必要で、自動化を行うためには分注装置を備えた大
規模装置を必要とする。廃液が出てしまうことも問題で
ある。

【０００６】一方で、このような自動化の装置を必要と
しない測定方法として、生化学検査（ヘモグロビン、総
タンパク、総コレステロール、血糖、尿酸、カリウム、
ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＡＬＰ、ＬＤＨ、アミラーゼ）におい
ては専用固相試薬に試料を滴下し反応させたのち、光学
的，電気的手段により測定する、所謂「ドライケミスト
リー」による測定法が確立されている。

【０００７】ドライケミストリーと免疫測定の長所を組
み合わせた方法として、特開平８−２１１０６２号公報
では、抗体結合リポソームと補体を含有させた液と、ゼ
ラチンや寒天などのゲル状物質とを混合し、基材（スラ
イドガラス）上に薄膜を形成させた層状構造体の免疫測
定試薬を得ている。

【０００８】このようなリポソームに封入する標識物質
として、蛍光物質や発光物質，色素や放射性元素を用い
る一方で、酵素免疫測定法などで用いられるβ−ガラク
トシダーゼやペルオキシダーゼなどの酵素類等も好まし
く使用される。

【０００９】一方、標識封入抗体感作リポソームを含ま
せて、試験具タイプの乾式免疫測定試薬に加工した場
合、該リポソームの安定性を向上させるため（保存時の
リポソームの崩壊率を抑えるため）に、水溶性高分子、
特に糖類といったリポソーム安定化剤を添加することが
ある。

【００１０】ところが、検体試料が滴下されて免疫反応
が開始された際に、標識物質がリポソームから漏出しに
くいことがある。この現象は、標識物質が酵素といった
巨大分子であるほど顕著である。

【００１１】また同時に、リポソームの安定化のため
に、糖類といった高分子化合物をマトリックス内に添加
すると、試料を適用して補体反応が開始されてリポソー
ムが崩壊し始める際に、リポソームからの標識物質の漏
出を遅延させてしまうことが判明した。この現象も、標
識物質が酵素といった巨大分子であるほど顕著である。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】そこで本発明の目的
は、試験具タイプに加工した乾式免疫測定試薬における
リポソームの漏出低下を押さえ、更にリポソーム安定化
剤によるリポソーム崩壊への悪影響を減じ、標識物質を
滞り無く漏出させ、ひいては、該乾式免疫測定試薬の保
存安定性の向上と高感度化を両立させることにある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明は、内部に標識物質を封入するとともに抗体
を結合してなるリポソームと、補体とを含む乾式免疫測
定試薬において、リポソーム分解酵素をリポソーム内に
封入することを特徴とする。

【００１４】また、リポソーム安定化剤が添加される際
に、標識物質が酵素であるとき、該標識用酵素の基質が
安定化剤であることも特徴とする。そうすることで、標
識酵素の基質と、リポソームの安定化剤を共有化でき
る。

【００１５】検体試料が乾式免疫測定試薬に適用され、
補体反応が惹起されてリポソームが崩壊し始め、糖分解
酵素が漏出し、そしてその漏出効率をリポソーム分解酵
素が促進する。リポソーム安定剤は糖類なので、糖分解
酵素の基質でもある。糖分解酵素の活性を標識として測
定し、検体試料中の被測定物質を測定するものである。

【００１６】リポソームに封入されているリポソーム分
解酵素のために、同じく内封されている標識物の漏出が
効率的に進み、反応時間が短縮され、測定の高感度化に
もつながる。

【００１７】

【発明の実施の形態】以下、本発明を更に詳細に説明す
る。本発明において、リポソームはリン脂質や糖脂質等
を主要構成成分とするものであれば、従来使用されてい
る一般のものでよい。

【００１８】リン脂質の例としては、動物や微生物など
の細胞膜に広く存在するリン脂質、例えばホスファチジ
ルエタノールアミン類、ホスファチジルコリン類、ホス
ファチジルセリン類、スフィンゴミエリン類などの各種
リン脂質が挙げられる。もちろん、天然の卵黄、牛脳や
大豆などから得られるホスファチジルコリンも適用でき
る。また、古細菌に属する好熱性菌脂質の天然の抽出物
又は人工合成物も適用できる。

【００１９】糖脂質の例としては、リポソームを形成す
るものであれば特に限定されず、スフィンゴ糖脂質でも
グリセロ糖脂質であってもよい。このようなグリセロ糖
脂質としてはマンノシルホスファチジルイノシトール
類、ガラクトシルジアシルグリセロール類、スルフォキ
ノボシルジアシルグリセロール、グリコシルジアシルグ
リセロール、セミノリピドなどが、スフィンゴ糖脂質と
してはマンノシルグルコシルセラミド、マンノシルイノ
シトールホスホリルセラミド類などが挙げられ、これら
は単独又は２種以上組み合わせて用いられる。

【００２０】これらリン脂質と糖脂質は、単独又は混合
して用いてもよい。

【００２１】本発明に用いられるリポソームの形状は、
多重層リポソーム（以下、ＭＬＶと記す）、小さな一枚
膜リポソーム（以下、ＳＵＶと記す）、大きな一枚膜リ
ポソーム（以下、ＬＵＶと記す）の何れであってもよ
い。また、これらリポソームは公知の方法で製造するこ
とができる。

【００２２】リポソーム内に封入されるリポソーム分解
酵素は、ホスホリパーゼＡ，ホスホリパーゼＢ，ホスホ
リパーゼＣからなる群から選ばれる単独又は組み合わせ
が使用できる。

【００２３】リポソーム内に封入される標識物質は、一
般に好ましく使用されているリポソーム安定化剤が糖類
であるので、酵素は糖分解酵素を使用すればよい。例え
ば、安定化剤がトレハロースであるとき、酵素はトレハ
ラーゼ又はアミラーゼである。

【００２４】リポソーム上に感作させる抗体は、被検目
的に応じて適宜選択される。例えば、Ａｎｔｉ−ＨＢｓ
Ａｂ、Ａｎｔｉ−ＨＢｃＡｂ、Ａｎｔｉ−ＨＣＶ、Ａｎ
ｔｉ−ＨｌＶＡｂ、ヒューマン・Ｔセル・ロイケミア・
ウイルス−Ｉ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）、ヒューマン・Ｔセル
・ロイケミア・ウイルス−ＩＩ型（ＨＴＬＶ−ＩＩ）な
どのウイルス関連等の抗体が挙げられる。これらは単独
又は２種以上組み合わせて用いられる。

【００２５】抗体のリポソームへの結合は、公知の方法
に従えばよい。例えば、レスルマン（Ｌｅｓｒｍａｎ）
らの方法（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）誌、２８８、６
０４〜６０６、１９８０）、マルチン（Ｍａｒｔｉｎ）
らの方法（バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ）誌、２０、４２２９〜４２３８、１９８１）など
により行われる。

【００２６】リン脂質や糖脂質をフラスコに入れ、溶媒
を加えて反応させた後、溶媒を留去し、吸引乾燥する。
しかる後に壁面に薄膜が形成されたフラスコ内に所定の
標識物質およびリポソーム分解酵素の水溶液を加え、密
栓をして振盪し、標識物質とリポソーム分解酵素が封入
されたリポソームを得る。このとき、完成したリポソー
ムを直ちに凍結乾燥させる必要がある。直ちに凍結乾燥
させたリポソームは、内封されたリポソーム分解酵素に
より破壊されることはなく保存される。

【００２７】一方、抗体と架橋剤とを緩衝液中で反応さ
せて架橋剤を導入し、しかる後、必要に応じ、架橋基を
還元する試薬（例えばジチオスライトール；ＤＴＴ）と
反応させて、修飾抗体を得る。標識物質とリポソーム分
解酵素が封入されたリポソームと修飾抗体とを緩衝液中
で反応せしめることにより、本発明の測定試薬である抗
体感作リポソームが得られる。

【００２８】上記製造法における架橋剤としては、例え
ば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）
プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４
−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰ
Ｂ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェ
ニル）アセテート（ＳＭＰＡ）、Ｎ−スクシンイミジル
４−（ｐ−マレイミドフェニル）プロピオネート（ＳＭ
ＰＰ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシ
ンイミド（ＧＭＢＳ）、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイ
ルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）、グルタルアル
デヒド、テレフタルアルデヒド等のジアルデヒド等が挙
げられ、これらは単独又は２種以上組み合わせて用いら
れる。

【００２９】最後に、標識物質とリポソーム分解酵素を
封入し、表面に結合された抗体を担持したリポソーム
を、最終的な乾式免疫測定試薬へ加工する。加工の手法
としては、層状構造体内に凍結乾燥させて保持させるこ
とが好ましい。というのも、凍結乾燥させて保存してあ
るリポソーム分解酵素封入リポソームを測定試薬へ加工
する際には、必ず水溶液に混合する必要が生じる。該リ
ポソームを水混和すると、リポソーム分解酵素がリポソ
ームを破壊し始めてしまう。その事態を避けるために、
凍結乾燥手段を用いて層状構造体内へ加工する必要があ
るからである。

【００３０】乾式免疫測定試薬におけるリポソームの安
定性向上のために、安定化剤を添加することもある。そ
の際、先述のように、標識用物質を酵素に、標識用酵素
の基質を安定化剤にすることで、標識酵素の基質と、リ
ポソームの安定化剤を共有化できる。

【００３１】安定化剤の例としては、糖質，ＢＳＡ，グ
リセリン，オリゴペプチドなどの水溶性高分子が使用で
きる。これらが基質である酵素を、標識用酵素に用い
る。安定化剤として特に糖質が好ましく、その際の標識
用酵素としては糖分解酵素を用いる。例えば、安定化剤
がトレハロースであるならば、酵素はトレハラーゼ又は
アミラーゼである。

【００３２】このようにして調製した乾式免疫測定試薬
を用いて検体試料中の抗原を測定するには、該試薬上に
被検試料を滴下すればよい。この滴下により反応量に比
例してリポソーム内から標識用酵素がリポソーム分解酵
素の作用で良好に放出されてくるので、この標識用酵素
と、安定化剤である基質物質に応じた分析方法により定
量を行い、例えば、予め作成した検量線により、試料中
の抗原の量を測定することができる。

【００３３】標識用酵素と、安定化剤である基質物質に
応じた分析方法の例としては、例えば、糖分解酵素によ
って発生したグルコースを、予め乾式免疫測定試薬へ含
ませておいたグルコース酸化酵素／ペルオキシダーゼ系
の反応で、過酸化水素とトリンダー試薬から生じる色素
を測定する。この場合、検体試料中に元々含まれている
グルコースが誤差になるが、滴下した瞬間に反応着色し
た際に、予め吸光度や反射率を測定し、バックグラウン
ドとしてキャンセルできる。

【００３４】この測定操作において使用する補体は特に
限定されないが、通常、モルモット血清が用いられる。
ウサギ、マウス、ヒト等の血清を使用してもよい。

【００３５】

【実施例】（１）標識物質とリポソーム分解酵素を封入
したリポソームの調製：７２μｍｏｌＤＭＰＣ（ジミリ
ストイルホスファチジルコリン）と、８μｍｏｌＤＭＰ
Ｇ（ジミリストイルホスファチジルグリセロール）、８
０μｍｏｌコレステロール、１μｍｏｌジチオピリジル
−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（Ｄ
ＴＰ−ＤＰＰＥ）／ブロモアセチル（ＢｒＡｃ）−ＤＰ
ＰＥのクロロフォルム溶液を５ｍｌのクロロフォルム溶
液に溶解して、ロータリーエバポレーターで乾燥して、
窒素気流中で、脂質薄膜に調製した。そこへ、１０ｍｍ
ｏｌ／ｌトリス−塩酸、３０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウ
ム、０．５ｍｍｏｌ／ｌＥＤＴＡに溶解した５０ｍｋａ
ｔ／ｌトレハラーゼ、ホスホリパーゼＡ及びホスホリパ
ーゼＢ溶液を加えて、撹拌した。直ちにこの液を氷浴中
に浸漬した。

【００】（２）抗体の修飾（Ｆａｂ’の調製） １ｍｇ／ｍｌペプシン（０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液）
１ｍｌに抗ＣＲＰ抗体（ＯＹ−Ｍｅｄｉｘ社）１０ｍｇ
を混合し、３７℃で１０時間インキューベートした。２
ｍｏｌ／ｌトリス−塩酸緩衝液２５μｌ及び０．５ｍｏ
ｌ／ｌ水酸化ナトリウムを加えて、反応を停止させた
後、反応混合物を０．２２μｍのミリポアフィルターで
濾過し、ＴＳＫ−ゲル濾過カラムで精製し、アミコンの
Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐで濃縮した。

【００】修飾した抗体の最終濃度は０．１ＭＰＢＳ（ｐ
Ｈ６．０）で約３ｇ／ｌであった。これに２−メルカプ
トエチルアミン−ハイドロクロライドを加えて、３７℃
で３０分間インキュベートした。この反応液をゲル濾過
カラム（ＰＤ−１０，フアルマシア社）で精製し、Ｆａ
ｂ’溶液を得た。Ｆａｂ’は約１ｇ／ｌであった。

【００】（３）リポソームへのＦａｂ’の結合：先に得
られて氷浴中のリポソーム縣濁液とＦａｂ’溶液をゆっ
くり撹拌しながら窒素下で４℃で混合し、２０時間反応
させた。リポソームを４℃で１０万Ｇで２０分間遠心す
ることで収集し、ゼラチンバルビタール緩衝液（ＧＢ
Ｓ）２ｍｌに再縣濁して、直ちに下記の試薬作製に用い
る。

【００】（４）リポソームを内包する多孔性構造体の作
製：５％トレハロース、１％ＢＳＡ、補体価１〜３ＣＨ
_５０のモルモット血清補体、４０ＫＵグルコースオキシ
ダーゼ、６０ＫＵペルオキシダーゼ、０．１５％４−ア
ミノアンチピリン、２．５％ＭＡＯＳ（同仁化学製トリ
ンダー試薬）を含んだ０．３ＭＡＤＡ緩衝液及び、上記
（３）で得た抗ＣＲＰ抗体結合リポソームを含んだ０．
０５Ｍ−ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を、濾紙ＧＡ−１
００（東洋濾紙製）を、上記緩衝液５００ｍｌに対して
５枚浸漬させて、直ちに引き上げ、凍結温度−４０℃、
真空度０．０５〜０．０２８Ｔｏｒｒ，乾燥時間２３．
５時間の条件で凍結乾燥させ、免疫測定試薬を得た。得
られた免疫測定試薬は、窒素封入した容器に保存した。
凍結乾燥前の操作は、全て４℃の低温室内で行った。

【００】（５）ＣＲＰの測定：上記試薬の多孔性構造体
に、ＣＲＰを含む緩衝液（０．０５ＭのＧＢＳ：ｐＨ
７．０）を倍々希釈したものを１０μｌ添加し、室温で
３０分間反応させた。発色した多孔性構造体に対して、
色差計（日本電装）にて、６４０ｎｍの反射率で測定
し、トレハラーゼの活性を測定した。

【００】対照のための１００％流出のカルボキシフルオ
レスセン量は、１０％トリトン−Ｘ１００を２０μｌ添
加することで測定した。各測定値は、酵素の流出の割合
で示した。図１は各流出率と抗原濃度を示し、ホスホリ
パーゼＡ及びＢを封入しない抗体結合リポソームと、封
入した抗体結合リポソームで測定した結果を示す。図か
ら判別できるように、ホスホリパーゼを添加した測定試
薬の方が、リポソームの崩壊率（＝標識の漏出率）が高
いことが判る。

【００】

【発明の効果】以上詳説したように、本発明を用いる
と、たとえリポソーム安定化剤が含有されている乾式免
疫測定試薬であっても、内封されている標識物の漏出が
効率的に進み、反応時間が短縮され、測定の高感度化に
もつながる。

【図面の簡単な説明】

【図１】抗ヒトＣＲＰ抗体感作リポソームを用いてヒト
ＣＲＰの測定を行った場合における、標識流出率と抗原
濃度の関係を示す図である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 内部に標識物質を封入するとともに抗体
   を結合してなるリポソームと、補体とを含む乾式免疫測
   定試薬において、リポソーム内にリポソーム分解酵素を
   封入することを特徴とした乾式免疫測定試薬。
2. 【請求項２】 リポソーム分解酵素が、ホスホリパーゼ
   Ａ，ホスホリパーゼＢ，ホスホリパーゼＣからなる群か
   ら選ばれる単独又は組み合わせである、特許請求の範囲
   第１項に記載の乾式免疫測定試薬。
3. 【請求項３】 さらにリポソーム安定化剤を含む、特許
   請求の範囲第１項に記載の乾式免疫測定試薬。
4. 【請求項４】 標識物質が酵素であり、該標識用酵素の
   基質がリポソーム安定化剤であることを特徴とする、特
   許請求の範囲第３項に記載の乾式免疫測定試薬。
5. 【請求項５】 安定化剤が糖類であり、酵素が糖分解酵
   素である、特許請求の範囲第４項に記載の乾式免疫測定
   試薬。
6. 【請求項６】 安定化剤がトレハロースであり、酵素が
   トレハラーゼ又はアミラーゼである、特許請求の範囲第
   ５項に記載の乾式免疫測定試薬。