CN111500284B - 一种包封石墨烯量子点的纳米脂质体及制备以及其在生物酶活性检测中的应用 - Google Patents

一种包封石墨烯量子点的纳米脂质体及制备以及其在生物酶活性检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种包封石墨烯量子点的纳米脂质体及制备以及其在生物酶活性检测中的应用。该方法包括如下步骤：(1)将卵磷脂与胆固醇加入到氯仿中，超声使其分散均匀，然后旋蒸除去氯仿，得到脂质体薄膜；(2)将石墨烯量子点溶液加入到脂质体薄膜中，冰浴超声分散均匀，得到混合溶液I；然后将混合溶液通过聚碳酸酯膜反复挤压，得到混合溶液II；再将混合溶液II进行透析，得到包封石墨烯量子点的纳米脂质体。本发明中制备的纳米脂质体生物安全性高且发光长效稳定，在磷脂酶A2存在下使得该脂质体破裂，释放包裹在其中的荧光信号分子，因此可将其用于胰腺炎标志物磷脂酶A2的活性检测，在生物检测和临床诊断等方面具有广泛应用前景。

Description

一种包封石墨烯量子点的纳米脂质体及制备以及其在生物酶 活性检测中的应用
技术领域
本发明属于有机/无机复合光学探针材料及疾病相关标志物检测领域，特别涉及一种包封石墨烯量子点的纳米脂质体及制备以及其在生物酶活性检测中的应用。
背景技术
磷脂酶(phospholipase)广泛分布于人体，在磷脂更新、细胞膜重构、胞吐和信息传递等生理过程中发挥重要作用。磷脂酶主要包含有磷脂酶A1、A2、B1、B2、C和D，它们会特异的作用于磷脂分子内部的各个酯键，形成不同的产物。其中磷脂酶A2(PhospholipaseA2，PLA2)能够水解磷脂sn-2酯键产生游离脂肪酸和溶血磷脂，其在炎症和组织损伤时对于信息传递和膜通道活化等病理生理过程中起关键性作用。急性胰腺炎(Acutepancreatitis，AP)是胰酶激活后引起的胰腺组织自身消化、水肿甚至坏死的炎症反应。研究发现，磷脂酶A2在急性胰腺炎发生时会出现过早激活和过度释放，可直接参与并影响急性胰腺炎的发病过程。因此，检测血清中磷脂酶A2的生物活性对于急性胰腺炎的诊断和治疗来说具有重要临床意义。目前，已开发的磷脂酶A2测定方法主要有：1)分光光度法、2)电化学法、3)放射性免疫法、4)酶联免疫法、5)色谱质谱联用等方法。如公开号为CN103698535 B的中国专利申请“脂蛋白相关磷脂酶A2定量检测试剂盒及制备、操作方法中以免疫磁珠微粒与化学发光酶免疫分析技术相结合，实现了灵敏检测并获得了较佳的性能参数。又如公开号为CN 104634970 A的中国专利申请“用于检测脂蛋白相关磷脂酶A2的试剂盒及其制备和应用”以抗体包被磁球和示踪标记物标记抗体结合，能够准确灵敏检测脂蛋白相关磷脂酶A2。然而，这些方法中有的由于涉及到昂贵的抗原抗体使得检测成本较高，而有的受限于检测流程繁杂耗时。
近些年来，新兴纳米材料在生物传感领域的潜在应用价值日益突显。石墨烯量子点(Graphene quantum dot,GQD)，是一种只有几个原子厚度和纳米级别的宽度的平面碳材料，属于零维纳米材料家族中的新成员。GQD由于其小尺寸所带来的量子效应而表现出优异的荧光性能。相比传统的有机荧光探针和半导体量子点，其具有优异的抗光漂白性、发光稳定性、生物相容性和易于表面功能化等优点，已成为了最具应用潜力的光致发光材料之一。目前，石墨烯量子点在生物成像、标记与示踪、能量的储存与转换等具有广泛的应用。
脂质体(Liposomes)是由磷脂分子和胆固醇分子分散在水中自组装形成的囊泡结构，其具有类细胞膜结构的双分子层。这样的中空双层囊泡结构具有特殊能力—内腔和双分子层都可以负载药物，酶，荧光团或其他信号分子。脂质体囊泡已应用于药物载体、肿瘤成像、生物传感等领域。尤其在生物传感检测领域，使用脂质体囊泡的探针相比于传统小分子探针，具有明显的信号放大优势，并显现响应快速和使用方便等特点。因此，近年来脂质体囊泡探针的开发应用正逐渐成为生物传感器研究的一个热门领域。如公开号为CN103599070 B的中国专利“负载金纳米簇和抗癌药物的脂质体温度荧光探针的制备方法”，利用超临界二氧化碳法将金纳米簇悬浊液和抗癌药物的混合溶液包封与脂质体的水相内腔中，制备得到的脂质体具有光致热敏性，可成为新型温度荧光探针。再如专利公开号为CN107966568A的中国专利“基于铁(Ⅱ)与邻菲罗啉体系和脂质体包裹葡萄糖的免疫分析方法”，通过脂质体包裹葡萄糖用于信号放大，并且利用亚铁离子和邻菲罗啉指示剂作为显色基团，可用于链霉素的检测。再如专利公开号为CN 107674884A的中国专利“一种用于检测胰腺癌标记物REG1A的生物素化脂质体及其制备方法和应用”，利用免疫LAMP反应与脂质体纳米囊泡结合，实现了胰腺癌标志物REG1A的灵敏检测，并且该方法具有成本低、特异性好以及稳定性高等优点。值得注意的是，这些方法中脂质体破裂以释放包封在内的信号分子手段都是通过加入曲拉通-100(Triton X-100)或其他表面活性剂的方式。然而，加入的用于磷脂囊泡破裂的表面活性剂不容易从反应体系中除去，其引入不仅给体系带来杂质使得反应过程变得复杂，甚至对生物物质存在不良影响。虽然利用脂质体进行酶联免疫测定的方法具有亲和力强的优点，但是仍存在着抗原抗体的稳定性差以及成本高昂等缺陷。这些也限制脂质体在生物传感器领域进一步发展。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种包封石墨烯量子点的纳米脂质体的制备方法。
本发明的另一目的在于提供所述方法制备得到的包封石墨烯量子点的纳米脂质体。
本发明的再一目的在于提供所述包封石墨烯量子点的纳米脂质体在生物酶活性检测中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种包封石墨烯量子点的纳米脂质体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将卵磷脂与胆固醇加入到氯仿中，超声使其分散均匀，然后旋蒸除去氯仿，得到脂质体薄膜；
(2)将石墨烯量子点溶液加入到脂质体薄膜中，冰浴超声分散均匀，得到混合溶液I；然后将混合溶液I通过聚碳酸酯膜反复挤压，得到混合溶液II；再将混合溶液II进行透析，得到包封石墨烯量子点的纳米脂质体。
步骤(1)中所述的卵磷脂与胆固醇的摩尔比为1～5：1；优选为5：1。
步骤(1)中所述的氯仿的用量为按每1.8mmol胆固醇配比1ml氯仿计算(或每10.8mmol卵磷脂和胆固醇配比1ml氯仿计算)。
步骤(1)中所述的超声的条件为：100W超声5～10min；优选为：100W超声5min。
步骤(1)中所述的旋蒸的条件为：40℃旋蒸15～60分钟；优选为40℃旋蒸60分钟。
步骤(2)中所述的石墨烯量子点与所述卵磷脂和胆固醇的总质量比为0.02～0.4:30；优选为0.2:30。
步骤(2)中所述的石墨烯量子点溶液为石墨烯量子点水溶液，或将石墨烯量子点溶于磷酸缓冲溶液得到的溶液；其浓度为0.01～0.2mg/mL；优选为0.1mg/mL。
所述的磷酸缓冲溶液为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的混合溶液，调节pH为7.0。
步骤(2)中所述的石墨烯量子点优选为通过如下方法制备得到：
S1、将碳黑加入到浓硝酸溶液中，于130℃条件下搅拌回流反应，待反应结束后冷却至室温，吸取上清液，加热除酸至pH为5～7，得到溶液A；
S2、将溶液A过滤，取滤液；然后将滤液进行离心，取上清液；再将上清液加入到超滤离心管中，离心，取清液；最后将清液进行透析，待透析结束后，冷冻干燥，得到石墨烯量子点。
步骤S1中所述的碳黑优选为carbot vulcan XC-72碳黑。
步骤S1中所述的浓硝酸溶液的浓度5～8mol/L；优选为6mol/L。
步骤S1中所述的回流反应优选为在油浴下进行回流反应。
步骤S1中所述的回流反应的时间优选为24小时。
步骤S2中所述的过滤为依次用滤纸和针式过滤器进行过滤。
所述的针式过滤器的孔径大小为0.22μm。
步骤S2中所述的离心的条件均为：8000rpm离心10分钟。
步骤S2中所述的超滤离心管的孔径大小为3000Da。
步骤S2中所述的透析为采用截留分子量为100～500Da的透析袋进行透析。
步骤S2中所述的透析的条件为：以去离子水为透析液透析24h。
步骤(2)中所述的挤压的温度优选为40±2℃。
步骤(2)中所述的挤压为在脂质体挤出仪中进行。
步骤(2)中所述的聚碳酸酯膜的孔径大小为200nm。
步骤(2)中所述的挤出的次数为21次以上。
步骤(2)中所述的透析为采用截留分子量为8000Da的透析膜进行透析。
步骤(2)中所述的透析的时间为24小时。
步骤(2)中所述的超声的条件为：100W超声40～60min；优选为：100W超声50min。
一种包封石墨烯量子点的纳米脂质体，通过上述任一项所述的方法制备得到。
所述的包封石墨烯量子点的纳米脂质体在制备荧光探针或胰腺炎标志物检测传感器中的应用。
所述的荧光探针为用于检测磷脂酶A2(胰腺炎标记物磷脂酶A2)的荧光探针。
一种利用所述包封石墨烯量子点的纳米脂质体进行非疾病诊断目的的测定磷脂酶A2含量的方法，包括如下步骤：
(a)将至少五个浓度梯度的磷脂酶A2水溶液分别与所述的包封石墨烯量子点的纳米脂质体混合后水浴反应，然后分别测量荧光光谱，得到荧光光谱最大强度；
(b)根据步骤(a)中得到的荧光光谱最大强度与磷脂酶A2水溶液的浓度，绘制标准曲线，得到线性方程；
(c)将待测样品与所述的包封石墨烯量子点的纳米脂质体混合后水浴反应，然后测量荧光光谱，得到待测样品的荧光光谱最大强度；再根据步骤(b)得到的线性方程获得待测样品的含量。
步骤(a)中所述的磷脂酶A2水溶液的用量为按其在所述反应体系的终浓度为0～20U/L添加；优选为按其在所述反应体系的终浓度为0、2、5、10和20U/L添加。
步骤(a)中所述的包封石墨烯量子点的纳米脂质体的用量为按其在所述反应体系的终浓度为0.26～0.28mg/mL添加；优选为按其在所述反应体系的终浓度为0.265～0.275mg/mL添加。
步骤(a)和(c)中所述的荧光光谱最大强度为激发波长为530nm下测定的荧光光谱强度。
步骤(a)和(c)中所述的水浴反应的条件为：37℃水浴1小时。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明以卵磷脂和胆固醇为合成材料，使用薄膜分散法制备包裹石墨烯量子点的脂质体。然后使用磷脂酶A2的酶促反应底物—磷脂分子自组装形成包裹了石墨烯量子点的脂质体，在磷脂酶A2存在下使得该脂质体破裂，释放包裹在其中的荧光信号分子，这样可有效避免第三方试剂(如曲拉通-100)作为脂质体破裂剂的加入。此外，避免了昂贵抗原抗体等生物试剂的使用，使得检测成本大大降低，在生物检测和临床诊断等方面具有广泛应用前景。
(2)本发明中的包封石墨烯量子点的纳米脂质体具有优异的生物相容性和长效光稳定性，其生物安全性高、发光长效稳定，具有良好的生物应用潜力。
(3)本发明利用脂质体独特的负载能力包裹石墨烯量子点荧光纳米探针，提供生化检测传感的光学信号放大策略，该纳米探针可作为疾病标志物检测传感器。
(4)本发明利用磷脂酶A2水解降解使得脂质体分解破裂释放石墨烯量子点荧光探针，其释放程度所引起的荧光强度变化与磷脂酶A2活性存在一定定量关系，建立用于疾病(如急性胰腺炎)标志物磷脂酶A2的荧光检测传感新方法，即该方法可对磷脂酶A2进行定量检测：将梯度浓度的磷脂酶A2加入脂质体，使其破裂释放出石墨烯量子点荧光探针，然后检测其在不同磷脂酶A2浓度下的荧光强度，制作出荧光强度变化与磷脂酶A2浓度相关的标准曲线，最后加入未知浓度的磷脂酶A2样品并检测其荧光强度，根据标准曲线得出检测结果。
(5)本发明采用将待测物直接作为脂质体破裂的方法，打破传统利用表面活性剂等物质破裂脂质体的方案，而是将待测物磷脂酶A2直接作为引起磷脂囊泡破裂的刺激因素，能够实现胰腺炎标志物磷脂酶A2的灵敏检测，并且该方法还具有成本低，检测方便快捷的优点，为环境刺激响应的智能仿生微囊泡的设计和构建新型智能仿生系统提供新思路。
附图说明
图1是本发明包封石墨烯量子点脂质体的纳米探针用于磷脂酶A2荧光检测的原理示意图。
图2是石墨烯量子点的表征图；其中，A为石墨烯量子点的扫描电镜照片；B为石墨烯量子点的原子力显微镜照片。
图3是在不同激发波长下的石墨烯量子点发射光谱图(插图为白光和365nm紫外光照射时石墨烯量子点溶液的图像)。
图4是石墨烯量子点水溶液的浓度诱导荧光变化图；其中，A为不同浓度的石墨烯量子水溶液在465nm激发波长下的发射光谱图；B是石墨烯量子点水溶液在530nm处发射荧光强度随其浓度变化的标准曲线。
图5是脂质体的表征图；其中，A为脂质体的扫描电镜照片；B为脂质体的粒径分布情况(插图为白光照射时脂质体溶液图像)。
图6是在卵磷脂和胆固醇的摩尔比1:1下制备的包封石墨烯量子点的脂质体的粒径分布图；其中，A为脂质体的扫描电镜照片；B为脂质体的粒径分布图。
图7是在卵磷脂和胆固醇的摩尔比5:2下制备的包封石墨烯量子点的脂质体的粒径分布图；其中，A为脂质体的扫描电镜照片；B为脂质体的粒径分布图。
图8是包封不同浓度的石墨烯量子点溶液(0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml)合成的脂质体在磷脂酶A2作用下破裂释放荧光探针引起的光谱变化图。
图9是包封石墨烯量子点的脂质体用于检测磷脂酶A2活性的荧光检测结果图；其中，A为释放的石墨烯量子点的荧光强度随磷脂酶A2活性变化的趋势图(其活性浓度变化范围为0～250U/L)；B为释放的石墨烯量子点的荧光强度随磷脂酶A2活性变化从0～20U/L的标准曲线。
图10是包封石墨烯量子点的脂质体对磷脂酶A2的选择性实验结果图。
图11是本发明包封石墨烯量子点脂质体作为新型荧光探针用于生物检测的生物安全性比较图。
图12是本发明包封石墨烯量子点脂质体作为新型荧光探针用于生物检测的光稳定性比较图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
实施例1
本实施例提供一种石墨烯量子点合成方法。
称取0.4g carbot vulcan XC-72碳黑(品牌：麦考林，购于广州普智生物科技有限公司)，加入到100mL 6mol/L的HNO3中，130℃(油浴)条件下搅拌回流反应24小时。然后将反应后的溶液冷却至室温，吸取上清液，加热除酸至pH为5～7，最终溶液体积为50mL，命名为溶液1。将得到的溶液1用滤纸(中速定性滤纸(速率102)，孔径为30～50微米，品牌：Biorad,北京百诺威生物科技有限公司)过滤两次，得到溶液2。再将溶液2用0.22μm的针式过滤器进行再次过滤，得到溶液3。将溶液3在8000rpm下离心10分钟，然后将上清液吸取到超滤离心管(孔径大小为3000Da)中，得到溶液4。将溶液4在8000rpm下离心(10分钟)，基本将所有清液与沉淀分离，最后将分离得到的清液放入截留分子量为100～500Da的透析袋中，以去离子水为透析液，透析24h。透析结束后，将溶液加到离心管内，冻干处理后即为石墨烯量子点。
石墨烯量子点的扫描电镜照片如图2A所示，原子力显微镜照片如图2B所示。石墨烯量子点在不同激发波长(荧光分光光度计，405、425、445、465、485、505、525nm)下的发射光谱，以及在白光和365nm紫外光照射下的石墨烯量子点溶液的图像如图3所示。
将石墨烯量子点配制成0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1mg/ml的石墨烯量子点水溶液，观察石墨烯量子点水溶液的浓度诱导荧光变化性质。结果如图4所示：图4A为不同浓度的石墨烯量子水溶液在465nm激发波长下的发射光谱图；图4B为石墨烯量子点水溶液在530nm处发射荧光强度随其浓度变化的标准曲线。
实施例2
本实施例提供一种脂质体的合成方法。
卵磷脂和胆固醇以5：1(摩尔比，共43.2mmol，30mg)的比例混合，溶于4ml氯仿中，超声(功率100W)5分钟使其分散均匀。随后通过旋转蒸发器在40℃下、减压旋蒸1小时以除去有机溶剂，烧瓶底部均匀的形成一层透明薄膜。此时加入2mL 0.1mg/ml的石墨烯量子点溶液(将实施例1制备石墨烯量子点溶于磷酸缓冲溶液(pH7.0)中)，冰浴超声(功率100W)50分钟，得到乳白色的浑浊液体。将其通过200nm的聚碳酸酯膜(即脂质体挤出仪使用的滤膜孔径为200nm)，反复挤压21次(40℃)。最后将得到的脂质体溶液用透析膜(截留分子量小于8000D)透析，以去离子水为透析液，透析24小时，移除未包封的石墨烯量子点，将获得的脂质体溶液储存在4℃下。
脂质体的扫描电镜结果如图5A所示，粒径分布情况如图5B所示(插图为白光照射时脂质体溶液图像)。从粒径分布和扫描电镜结果可知，本实施例制备的脂质体囊泡尺寸均匀，分散性好。
实施例3
不同比例的卵磷脂与胆固醇合成的脂质体
合成方法同实施例2，不同之处在于：卵磷脂和胆固醇以1:1(摩尔比，共52.37mmol，30mg)或5:2(摩尔比，共45.99mmol，30mg)的比例混合。
其扫描电镜结果和粒径分布如图6和7所示。
实施例4
不同浓度的石墨烯量子点溶液合成的脂质体
合成方法同实施例2，不同之处在于：石墨烯量子点溶液(将实施例1制备石墨烯量子点溶于磷酸缓冲溶液(pH7.0)中)的浓度为0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/mL、0.2mg/ml。
分别取4uL上述不同浓度的石墨烯量子点包封所制备的脂质体溶液(浓度均为13.6mg/mL)用水稀释50倍，然后分别与磷脂酶A2(品牌：源叶，上海源叶生物科技有限公司)混合，混合体系中磷脂酶A2的终浓度均为10U/L，37℃水浴反应1小时，然后测量荧光强度。
图8是包封石墨烯量子点溶液浓度为0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/mL、0.2mg/ml的脂质体在一定磷脂酶A2浓度作用下破裂引起荧光强度变化情况。如图8所示，当采用的石墨烯量子点溶液为0.2mg/ml时所检测的荧光强度比起0.1mg/ml的变化不明显，说明受限于脂质体空腔大小容积的限制，制备包封石墨烯量子点脂质体时加入更大浓度的石墨烯量子点也包封不进去了，所以本发明优选为0.1mg/ml的石墨烯量子点溶液来制备脂质体探针。
实施例5
本实施例提供一种包封石墨烯量子点的纳米脂质体的荧光探针用于疾病标志磷脂酶A2的灵敏特异检测方法，其原理如图1所示。
(1)将4uL 13.6mg/mL的脂质体溶液(即实施例2制备的脂质体)用水稀释50倍，加入5uL不同浓度的磷脂酶A2(品牌：源叶，上海源叶生物科技有限公司)在37℃水浴1小时后(磷脂酶A2的终浓度分别为0、2、5、10、20、50、100、150、200、300U/L)，530nm处观察荧光强度。
结果如图9所示：图9是包封石墨烯量子点的脂质体用于磷脂酶A2活性的荧光检测结果；其中，图9A为释放的石墨烯量子点的荧光强度随磷脂酶A2活性变化的趋势图(其活性浓度变化范围为0～250U/L)；图9B为释放的石墨烯量子点的荧光强度随磷脂酶A2活性变化从0～20U/L的标准曲线。结果表明：530nm处的荧光强度随着磷脂酶A2的浓度增加而增加，其中0到20U/L之间存在良好线性关系。
(2)为验证该方法对磷脂酶A2的特异性检测，用10uL 50U/L的磷脂酶C(PLC)，磷脂酶D(PLD)(磷脂酶C和磷脂酶D，品牌：源叶生物，均购自广州齐云生物科技有限公司)以及磷脂酶A2(PL A2)溶液分别与50倍稀释后的脂质体(即实施例2制备的脂质体)溶液400uL混合水浴1小时(37℃)，以不加入磷脂酶为空白对照(同样含量的脂质体，但没有任何酶加入时，磷脂囊泡不会自己破裂释放石墨烯量子点荧光探针)(BLANK)。
结果如图10所示，与50U/L磷脂酶C，磷脂酶D溶液混合水浴后的脂质体溶液，荧光强度并没有明显变化。而与磷脂酶A2溶液混合水浴后的脂质体，荧光强度显著升高，表明该方法对磷脂酶A2具有良好选择性。
实施例6
1.生物安全性实验
本实验以不同质量浓度的不同类型的荧光探针，如新兴纳米荧光探针(包括石墨烯量子点、水溶性CdSe半导体量子点)和传统有机分子荧光探针(包括罗丹明B和1-萘酚)为例染毒Hela细胞，通过检测细胞存活率进行其各自的生物安全性评估。其中，所涉及的材料如下：海拉细胞株(Hela)购于生工生物工程(上海)股份有限公司；石墨烯量子点的制备同实施例1；CdSe半导体量子点购于广州锂阁科技有限公司；罗丹明B和1-萘酚购于上海阿拉丁生化科技有限公司，纯度大于99％；DMEM高糖培养基购于广州恒研生物科技有限公司；胰蛋白酶(0.25％，含EDTA)和胎牛血清购于上海麦克林生化科技有限公司；MTT检测试剂盒购于广州鲁诚生化科技有限公司。
以不同质量浓度(0、50、100、150和200μg/mL)的四种荧光探针(石墨烯量子点、水溶性CdSe半导体量子点、罗丹明B和1-萘酚)分别染毒Hela细胞，采用MTT法(常用于细胞毒性/存活率的分析方法)检测细胞存活率，具体步骤如下：
(1)配制荧光探针溶液和细胞培养液
①石墨烯量子点、水溶性CdSe半导体量子点、罗丹明B和1-萘酚的母液配制：分别取1mg的石墨烯量子点、水溶性CdSe半导体量子点、罗丹明B和1-萘酚的粉末分散溶解于1mL磷酸缓冲溶液PBS(pH7.0)，得到终浓度均为1mg/mL的溶液；
②Hela细胞培养液配制：用DMEM高糖培养基500mL，加胎牛血清50mL，得到含l0％胎牛血清的DMEM高糖培养基，4℃保存备用；
(2)细胞培养
Hela细胞(细胞的接种密度为1×104/cm2)在含l0％胎牛血清的DMEM高糖培养基中培养，培养条件为5％(v/v)CO2，37℃，饱和湿度。
(3)细胞存活率检测
方法：细胞存活率是细胞毒性实验常用指标，本实验采用MTT检测试剂盒以比色法测定细胞存活率。调整Hela细胞密度为1×105cells/mL，接种于96孔板中，每孔100μL，细胞培养24小时后，吸弃原培养液，每次分别在每孔加入终质量浓度为0、50、100、150、200μg/mL的石墨烯量子点溶液，每个质量浓度设3个重复，以水溶性CdSe半导体量子点，罗丹明B和1-萘酚为对比，每次实验加入方法同上。分别作用24h后，每孔加入20μL 5mg/mL MTT试剂，继续孵育2h后，选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光度(OD)值。细胞相对存活率计算公式为：
Figure BDA0002490035580000101
结果如图11所示：由图11的实验结果可知，Hela细胞经过与不同质量浓度的不同类型的荧光探针共培养24小时后，随着加入的不同探针的质量浓度升高，石墨烯量子点未引起Hela细胞存活率的明显变化，即使浓度为200μg/m时，Hela的细胞存活率还保持96.8％，说明石墨烯量子点具有优异的生物安全性，适合生物分析应用；有机荧光分子如罗丹明B和1-萘酚也都表现出一定的细胞毒性，随着浓度的不断增加，Hela细胞存活率大大降低分别至(45.4％和38.6％)；相比之下，水溶性CdSe半导体量子点具有明显毒性，导致Hela细胞存活率显著降低(18.4％)。
因此，通过比较不同类型的荧光探针的生物安全性，本发明所采用的石墨烯量子点作为新型荧光探针较其他的有机荧光分子和半导体量子点等具有明显的优异的生物相容性，具有良好的生物应用潜力。
2.光稳定性实验
本实验比较不同类型的荧光探针包括石墨烯量子点、水溶性CdSe半导体量子点和1-萘酚的荧光发光稳定性，评估其长效应用性能。其中涉及的材料如下：石墨烯量子点的制备同实施例1，CdSe半导体量子点购于广州锂阁科技有限公司；1-萘酚购于上海阿拉丁生化科技有限公司，纯度大于99％。具体步骤如下：
(1)石墨烯量子点、水溶性CdSe半导体量子点和1-萘酚的溶液配制：
分别取200ng石墨烯量子点、水溶性CdSe半导体量子点和1-萘酚的粉末分散溶解于1mL磷酸缓冲溶液PBS(pH7.0)，得到终浓度均为200ng/mL的样品溶液；
(2)荧光发光稳定性实验
将上述配制的三个样品溶液分别用氙灯(北京卓立汉光仪器有限公司，ZolixLSB-500W，功率500瓦)连续照射120分钟。荧光分光光度计(Hitachi,F-4500)检测照射前后三个样品溶液分别照射前后的荧光强度变化(A0为照射前，A为经历不同时间照射后在500nm波长处的荧光强度)。
结果如图12所示：由图12的实验结果可知，经过120分钟的连续强激光照射，本发明中所采用的荧光探针石墨烯量子点在照射前后并未发生明显的光致发光强度变化，说明该材料作为荧光探针具有优异的长效光稳定性；而对照组中现有方法所采用的量子点荧光探针在经历了长时间的强光激发照射下呈现出缓慢的发光强度衰减，120分钟连续照射后，CdSe量子点的发光衰减35％；相比之下，1-萘酚作为有机发光分子，其分子化学结构在长时间高强度激光照射下发生明显的破坏，呈现出明显的光漂白性，其发光强度在120分钟照射后衰减了75％。因此，本发明所采用的石墨烯量子点相比其他量子点和有机分子荧光探针在生物分析传感检测应用中具有优异的发光长效稳定的优点。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种包封石墨烯量子点的纳米脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将卵磷脂与胆固醇加入到氯仿中，超声使其分散均匀，然后旋蒸除去氯仿，得到脂质体薄膜；
(2)将石墨烯量子点溶液加入到脂质体薄膜中，冰浴超声分散均匀，得到混合溶液I；然后将混合溶液I通过聚碳酸酯膜反复挤压，得到混合溶液II；再将混合溶液II进行透析，得到包封石墨烯量子点的纳米脂质体。
2.根据权利要求1所述的包封石墨烯量子点的纳米脂质体的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的卵磷脂与胆固醇的摩尔比为1～5：1；
步骤(2)中所述的石墨烯量子点与所述卵磷脂和胆固醇的总质量比为0.02～0.4:30；
步骤(2)中所述的石墨烯量子点溶液为石墨烯量子点水溶液，或将石墨烯量子点溶于磷酸缓冲溶液得到的溶液；所述的石墨烯量子点溶液的浓度为0.01～0.2mg/mL。
3.根据权利要求2所述的包封石墨烯量子点的纳米脂质体的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的卵磷脂与胆固醇的摩尔比为5：1；
步骤(2)中所述的石墨烯量子点与所述卵磷脂和胆固醇的总质量比为0.2:30；
步骤(2)中所述的石墨烯量子点溶液的浓度为0.1mg/mL。
4.根据权利要求1所述的包封石墨烯量子点的纳米脂质体的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的石墨烯量子点通过如下方法制备得到：
S1、将碳黑加入到浓硝酸溶液中，于130℃条件下搅拌回流反应，待反应结束后冷却至室温，吸取上清液，加热除酸至pH为5～7，得到溶液A；
S2、将溶液A过滤，取滤液；然后将滤液进行离心，取上清液；再将上清液加入到超滤离心管中，离心，取清液；最后将清液进行透析，待透析结束后，冷冻干燥，得到石墨烯量子点。
5.根据权利要求4所述的包封石墨烯量子点的纳米脂质体的制备方法，其特征在于：
步骤S1中所述的碳黑为carbot vulcan XC-72碳黑；
步骤S1中所述的浓硝酸溶液的浓度5～8mol/L；
步骤S1中所述的回流反应为在油浴下进行回流反应；
步骤S1中所述的回流反应的时间为24小时；
步骤S2中所述的过滤为依次用滤纸和针式过滤器进行过滤；
所述的针式过滤器的孔径大小为0.22μm；
步骤S2中所述的离心的条件均为：8000rpm离心10分钟；
步骤S2中所述的超滤离心管的孔径大小为3000Da；
步骤S2中所述的透析为采用截留分子量为100～500Da的透析袋进行透析；
步骤S2中所述的透析的条件为：以去离子水为透析液透析24h。
6.根据权利要求1所述的包封石墨烯量子点的纳米脂质体的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的超声的条件为：100W超声5～10min；
步骤(1)中所述的旋蒸的条件为：40℃旋蒸15～60分钟；
步骤(2)中所述的超声的条件为：100W超声40～60min；
步骤(2)中所述的挤压的温度为40±2℃；
步骤(2)中所述的挤压为在脂质体挤出仪中进行；
步骤(2)中所述的聚碳酸酯膜的孔径大小为200nm；
步骤(2)中所述的挤出的次数为21次以上；
步骤(2)中所述的透析为采用截留分子量为8000Da的透析膜进行透析；
步骤(2)中所述的透析的时间为24小时。
7.一种包封石墨烯量子点的纳米脂质体，其特征在于：通过权利要求1～6任一项所述的方法制备得到。
8.权利要求7所述的包封石墨烯量子点的纳米脂质体在制备荧光探针或胰腺炎标志物检测传感器中的应用。
9.一种利用权利要求7所述包封石墨烯量子点的纳米脂质体进行非疾病诊断目的的测定磷脂酶A2含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)将至少五个浓度梯度的磷脂酶A2水溶液分别与权利要求7所述的包封石墨烯量子点的纳米脂质体混合后水浴反应，然后分别测量荧光光谱，得到荧光光谱最大强度；
(b)根据步骤(a)中得到的荧光光谱最大强度与磷脂酶A2水溶液的浓度，绘制标准曲线，得到线性方程；
(c)将待测样品与包封石墨烯量子点的纳米脂质体混合后水浴反应，然后测量荧光光谱，得到待测样品的荧光光谱最大强度；再根据步骤(b)得到的线性方程获得待测样品的含量。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：
步骤(a)中所述的磷脂酶A2水溶液的用量为按其在所述反应体系的终浓度为0～20U/L添加；
步骤(a)中所述的包封石墨烯量子点的纳米脂质体的用量为按其在所述反应体系的终浓度为0.26～0.28mg/mL添加；
步骤(a)和(c)中所述的荧光光谱最大强度为激发波长为530nm下测定的荧光光谱强度；
步骤(a)和(c)中所述的水浴反应的条件为：37℃水浴1小时。
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