KR20220069858A - 엑소좀에 특이적인 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀 및 이를 이용한 엑소좀 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 엑소좀에 특이적인 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀 및 이를 이용한 엑소좀 검출 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 엑소좀에 특이적인 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀은 복잡한 절차 없이 단순 혼합에 의해 세포 배양액은 물론, 혈액, 소변, 침 등 다양한 생체 시료 내 엑소좀을 검출할 수 있고, 또한, 폴리디아세틸렌 리포좀의 광학적 특성으로 인해 엑소좀과 결합 시 적색 형광 방출 특성을 보여, 엑소좀을 어려운 장비 없이 쉽게 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 형광 세기를 활용하여 엑소좀을 정량할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 엑소좀에 특이적인 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀 및 이를 이용한 엑소좀 검출 방법에 관한 것이다.
세포는 다양한 크기의 지질 이중 막에 둘러싸여 세포외 소포(Extracellular vesicles)를 분비하는 것으로 알려져 있다. 이러한 세포외 소포는 사이즈에 따라 엑소좀(exosome), 미세소포(microvesicle), 및 대형 온코좀(Large oncosome)으로 구분된다. 이중 엑소좀은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭이다.
엑소좀의 직경은 대략 30 내지 200 nm인 것으로 보고되어 있으며, 전자 현미경을 통한 연구에서 원형질막으로부터 직접 이탈되기보다는 다낭체(multivesicular bodies, MVBs)로 불리는 세포 내 특정 구획으로부터 기원하며 세포 외부로 방출 및 분비되는 점이 관찰되었다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어날 경우, 이러한 소낭들은 세포 외부의 환경으로 방출되는데, 이를 엑소좀이라고 지칭하고 있다.
최근, 질병진단 분야에서 새롭게 부상하고 있는 엑소좀은 다양한 질병의 진단과 약물전달 매개체로서 그 효용성이 각광받고 있다. 즉, 세포유래의 속성을 갖는 엑소좀은 세포 외로 방출되어 혈액, 침, 오줌 등과 같은 다양한 형태의 체액에 포함되어 있으며, 체액 속에 존재하는 엑소좀을 분석하여 세포 유래의 특정 바이오마커를 확인함으로써 질병을 진단하는 방식이다.
그러나, 다양한 체액에 존재하는 엑소좀은 작은 크기, 저밀도 및 희소성으로 인해 엑소좀의 선택적 분리 및 스크리닝을 위한 방법은 리소그래피를 통한 금막 증착, 플로우 셀 제조, 수용체 도입과 같은 복합한 실험 절차 또는 정교한 장비를 필요로 한다는 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 엑소좀에 특이적인 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀을 제조하고, 상기 폴리디아세틸렌 리포좀은 복잡한 절차 없이 단순 혼합에 의해 시료 내 엑소좀을 검출할 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 엑소좀에 특이적인 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 폴리디아세틸렌 리포좀의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엑소좀의 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 엑소좀에 특이적인 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀을 제공한다.
또한, 본 발명은 디아세틸렌 단량체를 활성화하는 단계(단계 1);
상기 단계 1의 활성화된 디아세틸렌 단량체에 엑소좀 특이적인 리간드를 결합하여 디아세틸렌 복합체를 형성하는 단계(단계 2);
상기 단계 2의 디아세틸렌 복합체, 디아세틸렌 단량체 및 인지질을 자가-조립하여 디아세틸렌 리포좀 복합체를 형성하는 단계(단계 3); 및
상기 단계 3의 디아세틸렌 리포좀 복합체를 중합 반응시켜 엑소좀 특이적인 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀을 형성하는 단계(단계 4);를 포함하는, 폴리디아세틸렌 리포좀의 제조방법을 제공한다.
나아가 본 발명은 제1항의 폴리디아세틸렌 리포좀을 엑소좀 함유 시료와 접촉시키는 단계(단계 1); 및
상기 단계 1에 의해 유도되는 광학적 특성 변화를 측정하는 단계(단계 2); 를 포함하는, 엑소좀의 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 엑소좀에 특이적인 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀은 복잡한 절차 없이 단순 혼합에 의해 세포 배양액은 물론, 혈액, 소변, 침 등 다양한 생체 시료 내 엑소좀을 검출할 수 있고, 또한, 폴리디아세틸렌 리포좀의 광학적 특성으로 인해 엑소좀과 결합 시 적색 형광 방출 특성을 보여, 엑소좀을 어려운 장비 없이 쉽게 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 형광 세기를 활용하여 엑소좀을 정량할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 엑소좀에 특이적인 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀을 이루는 구성에 관한 개념도이다.
도 2는 엑소좀에 특이적인 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀을 사용하여 엑소좀과의 반응에 관한 개념도이다.
도 3(a)는 실시예 1-2의 엑소좀 특이적인 리간드가 결합된 디아세틸렌 복합체의 합성결과를 확인한 흡광도이다.
도 3(b)는 5'-amine Random DNA가 결합된 디아세틸렌 복합체의 합성결과를 확인한 흡광도이다.
도 4(a)는 실시예 1-3의 엑소좀 특이적인 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀의 합성결과를 확인한 흡광도이다.
도 4(b)는 5'-amine Random DNA가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀의 합성결과를 확인한 흡광도이다.
도 5는 결장암 세포(HT-29)에서 분리한 엑소좀의 TEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 1 및 비교예 1의 엑소좀 유무에 따른 엑소좀 검출 효과를 확인한 결과이다.
도 7(a)는 엑소좀 특이적인 리간드인 EpCAM 압타머가 결합되지 않은 폴리디아세틸렌 리포좀의 SEM이미지이다.
도 7(b)는 엑소좀 특이적인 리간드인 EpCAM 압타머가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀의 SEM이미지이다.
도 2는 엑소좀에 특이적인 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀을 사용하여 엑소좀과의 반응에 관한 개념도이다.
도 3(a)는 실시예 1-2의 엑소좀 특이적인 리간드가 결합된 디아세틸렌 복합체의 합성결과를 확인한 흡광도이다.
도 3(b)는 5'-amine Random DNA가 결합된 디아세틸렌 복합체의 합성결과를 확인한 흡광도이다.
도 4(a)는 실시예 1-3의 엑소좀 특이적인 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀의 합성결과를 확인한 흡광도이다.
도 4(b)는 5'-amine Random DNA가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀의 합성결과를 확인한 흡광도이다.
도 5는 결장암 세포(HT-29)에서 분리한 엑소좀의 TEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 1 및 비교예 1의 엑소좀 유무에 따른 엑소좀 검출 효과를 확인한 결과이다.
도 7(a)는 엑소좀 특이적인 리간드인 EpCAM 압타머가 결합되지 않은 폴리디아세틸렌 리포좀의 SEM이미지이다.
도 7(b)는 엑소좀 특이적인 리간드인 EpCAM 압타머가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀의 SEM이미지이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
엑소좀에 특이적인 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀
본 발명은 엑소좀에 특이적인 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 엑소좀에 특이적인 리간드는 엑소좀 표면에 존재하는 단백질과 특이적으로 결합할 수 있고,
상기 단백질의 예로는 EpCAM, CD-9, CD-63, CD-81, CD-82, Flotillin2, ALIX, TSG101, HSP60 또는 HSP70일 수 있고, 바람직하게 EpCAM일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 엑소좀에 특이적인 리간드의 예로는 EpCAM 압타머, 항-EpCAM 항체, CD-9 압타머, 항-CD-9 항체, CD-63 압타머, 항-CD-63 항체, CD-81 압타머, 항-CD-81 항체, CD-82 압타머, 항-CD-82 항체, Alix 압타머 또는 항-Alix 항체일 수 있고, 바람직하게 EpCAM 압타머 또는 항-EpCAM 항체일 수 있고, 보다 바람직하게 EpCAM 압타머일 수 있다.
폴리디아세틸렌 리포좀의 제조방법
본 발명은 디아세틸렌 단량체를 활성화하는 단계(단계 1);
상기 단계 1의 활성화된 디아세틸렌 단량체에 엑소좀 특이적인 리간드를 결합하여 디아세틸렌 복합체를 형성하는 단계(단계 2);
상기 단계 2의 디아세틸렌 복합체, 디아세틸렌 단량체 및 인지질을 자가-조립하여 디아세틸렌 리포좀 복합체를 형성하는 단계(단계 3); 및
상기 단계 3의 디아세틸렌 리포좀 복합체를 중합 반응시켜 엑소좀 특이적인 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀을 형성하는 단계(단계 4);를 포함하는, 폴리디아세틸렌 리포좀의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계 1은 엑소좀 특이적인 리간드와 결합하기 위한 것으로, 디아세틸렌 단량체에 N-하이드록시서식니미드 (N-hydroxysuccinimide) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필 카보디이미드 (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)를 첨가하여 커플링 반응에 의해 디아세틸렌 단량체가 활성화될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계 2는 디아세틸렌 복합체를 형성하기 전, 엑소좀 특이적인 리간드의 말단을 아민기로 치환시키는 단계를 포함할 수 있고, 상기 단계 1의 활성화된 디아세틸렌 단량체와 말단이 아민기로 치환된 엑소좀 특이적인 리간드가 반응하여 아미드 결합할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 디아세틸렌 단량체의 예로는 펜타코사다이이노익산 (pentacosadiynoic acid, PCDA), 트리코사다이이노익산 (tricosadiynoic acid, TCDA), 헤네이코사다이이노익산 (heneicosadiynoic acid, HCDA), 헵타데카다이이노익산(heptadecadiynoic acid, HDDA), 헤네이코사다이이노익산(heneicosadiynoic acid, HCDA) 또는 에이코사다이이노익산(eicosadiynoic acid, ECDA)을 사용할 수 있고, 바람직하게 트리코사다이이노익산 (tricosadiynoic acid, TCDA) 또는 펜타코사다이이노익산 (pentacosadiynoic acid, PCDA)을 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 인지질의 예로는 디미리스토일포스파티딜에탄올아민 (Dimyristoyl phosphatidylethanolamine, DMPE), 디미리스토일포스파티딜콜린 (Dimirystoyl phosphatidylcholine, DMPC), 디미리스토일포스파티딜글리세롤 (Dimirystoyl phosphatidylglycerol, DMPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤 (Dipalmitoyl phosphatidylglycerol, DPPG), 디스테아로일포스파티딜콜린 (Distearoyl phosphatidylcholine, DSPC), 디스테아로일포스파티딜글리세롤 (Distearoyl phosphatidylglycerol, DSPG), 디올레일포스파티딜에탄올아민 (Dioleoyl phosphatidylethanolamine, DOPE), 팔미토일스테아로일포스파티딜콜린 (Palmitoyl stearoyl phosphatidylcholine, PSPC), 팔미토일스테아로일포스파티딜 글리세롤 (Palmitoyl stearoylphosphatidyl glycerol, PSPG), 모노-올레오일-포스파티딜에탄올아민 (mono-oleoyl-phosphatidyl ethanolamine, MOPE), 디라우로일 에틸포스포콜린 (Dilauroyl ethylphosphocholine, DLEP), 디미리스토일 에틸포스포콜린 (Dimirystoyl ethylphosphocholine, DMEP), 디팔미토일 에틸포스포콜린 (Dipalmitoyl ethylphosphocholine, DPEP) 또는 디스테아로일 에틸포스포콜린 (Distearoyl ethylphosphocholine, DSEP)을 사용할 수 있고, 바람직하게 디미리스토일포스파티딜에탄올아민 (Dimyristoyl phosphatidylethanolamine, DMPE)를 사용할 수 있다.
엑소좀의 검출 방법
본 발명은 제1항의 폴리디아세틸렌 리포좀을 엑소좀 함유 시료와 접촉시키는 단계(단계 1); 및
상기 단계 1에 의해 유도되는 광학적 특성 변화를 측정하는 단계(단계 2); 를 포함하는, 엑소좀의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 도 4a를 참조하면, 엑소좀에 특이적인 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀은 최대 흡수 파장이 640 nm인 청색을 발현한다. 이후, 시료 내 엑소좀과 엑소좀에 특이적인 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀과 반응함에 따라 흡수 스펙트럼이 변화하여 최대 흡수 파장이 540 nm인 적색으로 색 전이 및 적색 형광이 일어날 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 광학적 특성 변화는 육안 또는 측정 장치에 의하여 측정될 수 있고, 상기 광학적 특정 장치는 UV-Vis 분광기 또는 형광 분광기를 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 엑소좀 함유 시료는 엑소좀과 단백질이 공존하는 임의의 생체 시료로서 그 종류가 특별히 한정되는 것은 아니며, 예를 들어 인간과 같은 포유동물에서 유래한 세포 배양액(구체적으로는, 세포 배양액으로부터 분리한 엑소좀 시료), 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈액, 혈장 또는 혈청일 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<준비예>
TCDA (10,12-Tricosadiynoic acid), EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide), NHS (N-hydroxysuccinimide), PCDA (10,12-pentacosadiynoic acid), DMPE (1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 염화 나트륨 (sodium chloride) 및 황산마그네슘(magnesium sulfate)은 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입하였고, 다이클로로메테인 (dichloromethane, methylene chloride, DCM)은 Samchun(Korea)에서 구입하였으며, 디메틸설폭사이드 (Dimethyl Sulfoxide, DMSO)는 Thermo Fisher Scientific (USA)에서 구입하여 사용하였다.
EpCAM 앱타머 (5'-TGAAGGTTCGTTGTTTCGGTGGGTGTAGACTCTTTAGAAGAGATACAGATTTTGGGAATG-3) 및 RNADOM DNA (5'-TAAGTATATCGTGCCTG CGACTATGTTATGATGAGGCAGT CTTTAACCTGACTCGTAATA-3')는 Bioneer(Korea)사에서 5'자리에 C6-amine을 붙인 것을 주문하여 사용하였다.
실시예 1
<1-1> NHS가 활성화된 디아세틸렌 단량체의 합성
NHS가 활성화된 디아세틸렌 단량체를 합성하기 위해, 우선, TCDA(10,12-Tricosadiynoic acid) (0.1g, 0.289mmol)을 다이클로로메테인(dichloromethane, methylene chloride, DCM)에 용해시킨 후, EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) (0.08 g, 0.434 mmol) 및 NHS(N-hydroxysuccinimide) (0.05 g, 0.434 mmol)를 첨가하였다. 그 후, 실온에서 4시간 동안 교반하고, 반응용액 (다이클로로메테인, DCM)을 감압증류 하에서 제거하였다. 그 후, 에틸아세테이트(Ethyl acetate) 및 물을 사용하여 2번 추출하였다. 추출한 후, 염화 나트륨 수용액 (sodium chloride solution)을 사용하여 유기층을 세척한 후, MgSO4 (Magnesium sulfate)로 유기층을 건조(drying)하였다. 그 후, 유기층 용매를 제거하여 흰색 고체 형태의 NHS가 활성화된 디아세틸렌 단량체(TCDA-NHS)를 수득하였다.
<1-2> 엑소좀 특이적인 리간드가 결합된 디아세틸렌 복합체의 합성
상기 실시예 1-1에서 얻은 TCDA-NHS (450 nmol)을 디메틸설폭사이드(Dimethyl sulfoxide, DMSO) (20 μL)에 용해시킨 후, 5'-amine EpCAM Apt(1 nmol)을 첨가하고, 37 ℃에서 4시간 동안 인큐베이션을 진행하였다. 그 후, MWCO(Molecular weight cut-off)을 사용하여, 3000 x g, 15 min, 4 ℃ 조건으로 원심분리필터를 사용하여 반응하지 않은 5'-amine EpCAM Apt 및 TCDA-NHS를 제거하고, 엑소좀 특이적인 리간드가 결합된 디아세틸렌 복합체를 수득하였다.
그 결과, 도 3(a)에 나타낸 바와 같이, 260nm에서 흡수피크를 나타내어, 성공적으로 합성한 것을 확인하였다.
<1-3> 엑소좀 특이적인 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀의 합성
PDA(polydiacetylene)는 D.W(distilled water) 3 ml 기준으로 1 mM 농도로 합성되었으며, 보다 구체적으로, PCDA(10,12-pentacosadiynoic acid) (0.7 mg) 및 DMPE(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) (0.8 mg)을 클로로포름 1 ml에 용해시켰다. 그 후 퍼지가스로 질소를 사용하여, 유기용매인 클로로포름을 제거하여 하얀 필름상태를 수득하였다. 그 후, D.W(distilled water) 3 ml 첨가하고, 80 ℃에서 5분 간 초음파처리(sonication)하였다. 초음파 처리한 후, 0.8 μm 필터를 사용하여 거른 후, 상기 실시예 1-2에서 수득한 엑소좀 특이적인 리간드가 결합된 디아세틸렌 단량체를 첨가하고 냉장고에서 밤새 보관하였다. 그 후, 254 nm UV light (200 μW/cm2, UVP® CL-1000® Ultraviolet Crosslinkers, USA)에서 5 분간 광중합하여 엑소좀 특이적인 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀을 합성하였다.
도 4(a)에 나타낸 바와 같이, 640nm에서 강한 청색의 흡수 피크를 나타내으며, 또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 엑소좀 특이적인 리간드인 EpCAM 압타머가 결합되지 않은 폴리디아세틸렌 리포좀(도 7(a)참조) 보다 엑소좀 특이적인 리간드인 EpCAM 압타머가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀(도 7(b)참조)의 경우 표면이 거칠어지고 크기가 증가하여 성공적으로 합성한 것을 확인하였다.
<비교예 1>
상기 실시예 1-1에서 얻은 TCDA-NHS (450 nmol)을 디메틸설폭사이드(Dimethyl sulfoxide, DMSO) (20 μL)에 용해시킨 후, Random DNA (1 nmol)을 첨가하고, 37 ℃에서 4시간 동안 인큐베이션을 진행하였다. 그 후, MWCO(Molecular weight cut-off)을 사용하여, 3000 x g, 15 min, 4 ℃ 조건으로 원심분리를 사용하여 필터를 진행하여 5'-amine Random DNA가 결합된 디아세틸렌 복합체를 수득하였다. 도 3(b)에 나타낸 바와 같이, 260nm에서 흡수피크를 나타내어, 성공적으로 합성한 것을 확인하였다.
그 후, 상기 실시예 1-3과 동일한 과정으로 5'-amine Random DNA가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀을 합성하였다. 도 4(b)에 나타낸 바와 같이, 640nm에서 강한 청색의 흡수 피크를 나타내어, 성공적으로 합성한 것을 확인하였다.
<실험예 1> 시료내 엑소좀의 검출
엑소좀 검출을 위해 미리 결장암 세포(HT-29) 배양액의 상층액에서 엑소좀을 분리하였으며, 이를 TEM이미지로 확인하였다(도 5참조). 크기는 94.71±15.98 nm로 인지질 이중층의 형태를 나타내는 것을 확인하였다.
상기 실시예 1에서 합성한 엑소좀 특이적인 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀 용액(50 μL)과 결장암 세포에서 분리한 엑소좀 용액(10 μL, 2.38x109 particles)을 혼합하여 실온에서 반응시킨 후, 형광신호 분석을 위해 Molecular Device (USA)사의 GenePix 4000B (Molecular D) 장비를 사용하여, 532nm의 파장에서 형광세기를 확인하였다.
대조군으로 비교예 1의 Random DNA가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀을 사용하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 엑소좀을 첨가하지 않은 비교예 1 및 실시예 1에서 백그라운드인 형광 신호가 관찰되었으나, 엑소좀 및 실시예 1의 엑소좀 특이적인 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀에서 강한 적색 형광 신호가 관찰되었다. 상기 실험 결과는 본 발명에 따라 합성한 엑소좀 특이적인 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀과 엑소좀이 강하게 반응하는 것을 확인할 수 있는 결과이다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (16)
- 엑소좀에 특이적인 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀.
- 제1항에 있어서,
상기 엑소좀에 특이적인 리간드는 엑소좀 표면에 존재하는 단백질과 특이적으로 결합할 수 있고,
상기 단백질은 EpCAM, CD-9, CD-63, CD-81, CD-82, Flotillin2, ALIX, TSG101, HSP60 및 HSP70로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 폴리디아세틸렌 리포좀.
- 제2항에 있어서,
상기 엑소좀에 특이적인 리간드는 엑소좀 표면에 존재하는 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있고,
상기 단백질은 EpCAM인 것을 특징으로 하는, 폴리디아세틸렌 리포좀.
- 제1항에 있어서,
상기 엑소좀에 특이적인 리간드는 EpCAM 압타머, 항-EpCAM 항체, CD-9 압타머, 항-CD-9 항체, CD-63 압타머, 항-CD-63 항체, CD-81 압타머, 항-CD-81 항체, CD-82 압타머, 항-CD-82 항체, Alix 압타머 및 항-Alix 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 폴리디아세틸렌 리포좀.
- 제4항에 있어서,
상기 엑소좀에 특이적인 리간드는 EpCAM 압타머 또는 항-EpCAM 항체인 것을 특징으로 하는, 폴리디아세틸렌 리포좀.
- 디아세틸렌 단량체를 활성화하는 단계(단계 1);
상기 단계 1의 활성화된 디아세틸렌 단량체에 엑소좀 특이적인 리간드를 결합하여 디아세틸렌 복합체를 형성하는 단계(단계 2);
상기 단계 2의 디아세틸렌 복합체, 디아세틸렌 단량체 및 인지질을 자가-조립하여 디아세틸렌 리포좀 복합체를 형성하는 단계(단계 3); 및
상기 단계 3의 디아세틸렌 리포좀 복합체를 중합반응시켜 엑소좀 특이적인 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 리포좀을 형성하는 단계(단계 4);를 포함하는, 폴리디아세틸렌 리포좀의 제조방법.
- 제6항에 있어서,
상기 단계 1은 상기 디아세틸렌 단량체에 N-하이드록시서식니미드 (N-hydroxysuccinimide) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필 카보디이미드 (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)를 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리디아세틸렌 리포좀의 제조방법.
- 제6항에 있어서,
상기 단계 2는 디아세틸렌 복합체를 형성하기 전, 엑소좀 특이적인 리간드의 말단을 아민기로 치환시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리디아세틸렌 리포좀의 제조방법.
- 제6항에 있어서,
상기 디아세틸렌 단량체는 펜타코사다이이노익산 (pentacosadiynoic acid, PCDA), 트리코사다이이노익산 (tricosadiynoic acid, TCDA), 헤네이코사다이이노익산 (heneicosadiynoic acid, HCDA), 헵타데카다이이노익산(heptadecadiynoic acid, HDDA) 및 에이코사다이이노익산(eicosadiynoic acid, ECDA)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 폴리디아세틸렌 리포좀의 제조방법.
- 제9항에 있어서,
상기 디아세틸렌 단량체는 트리코사다이이노익산 (tricosadiynoic acid, TCDA) 및 펜타코사다이이노익산 (pentacosadiynoic acid, PCDA)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 폴리디아세틸렌 리포좀의 제조방법.
- 제6항에 있어서,
상기 인지질은 디미리스토일포스파티딜에탄올아민 (Dimyristoyl phosphatidylethanolamine, DMPE), 디미리스토일포스파티딜콜린 (Dimirystoyl phosphatidylcholine, DMPC), 디미리스토일포스파티딜글리세롤 (Dimirystoyl phosphatidylglycerol, DMPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤 (Dipalmitoyl phosphatidylglycerol, DPPG), 디스테아로일포스파티딜콜린 (Distearoyl phosphatidylcholine, DSPC), 디스테아로일포스파티딜글리세롤 (Distearoyl phosphatidylglycerol, DSPG), 디올레일포스파티딜에탄올아민 (Dioleoyl phosphatidylethanolamine, DOPE), 팔미토일스테아로일포스파티딜콜린 (Palmitoyl stearoylphosphatidylcholine, PSPC), 팔미토일스테아로일포스파티딜 글리세롤 (Palmitoyl stearoylphosphatidyl glycerol, PSPG), 모노-올레오일-포스파티딜에탄올아민 (mono-oleoyl-phosphatidyl ethanolamine, MOPE), 디라우로일 에틸포스포콜린 (Dilauroyl ethylphosphocholine, DLEP), 디미리스토일 에틸포스포콜린 (Dimirystoyl ethylphosphocholine, DMEP), 디팔미토일 에틸포스포콜린 (Dipalmitoyl ethylphosphocholine, DPEP) 및 디스테아로일 에틸포스포콜린 (Distearoyl ethylphosphocholine, DSEP)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 폴리디아세틸렌 리포좀의 제조방법.
- 제11항에 있어서,
상기 인지질은 디미리스토일포스파티딜에탄올아민 (Dimyristoyl phosphatidylethanolamine, DMPE)인 것을 특징으로 하는, 폴리디아세틸렌 리포좀의 제조방법.
- 제1항의 폴리디아세틸렌 리포좀을 엑소좀 함유 시료와 접촉시키는 단계(단계 1); 및
상기 단계 1에 의해 유도되는 광학적 특성 변화를 측정하는 단계(단계 2);
를 포함하는, 엑소좀의 검출 방법.
- 제13항에 있어서,
상기 광학적 특성 변화는 육안 또는 측정 장치에 의하여 측정되는 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 검출 방법.
- 제14항에 있어서,
상기 광학적 특성 변화 측정 장치는 UV-Vis 분광기 또는 형광 분광기인 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 검출 방법.
- 제13항에 있어서,
상기 시료는 세포 배양액, 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈액, 혈장 및 혈청으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 검출 방법.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024043375A1 (ko) * | 2022-08-26 | 2024-02-29 | 서울대학교 산학협력단 | 폴리다이아세틸렌 리포좀의 마이크로어레이 기반의 엑소좀 표면 바이오마커의 무표지 검출 방법 |
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| KR20170010616A (ko) * | 2015-07-20 | 2017-02-01 | 고려대학교 산학협력단 | 표면증강 라만 분광기반 플라즈모닉 결합(plasmon coupling) 현상을 이용한 DNA의 후성유전학적 변이 검출 방법 |
| US20180065748A1 (en) | 2016-07-27 | 2018-03-08 | International Business Machines Corporation | Drone-based mosquito amelioration based on risk analysis and pattern classifiers |
-
2021
- 2021-11-19 KR KR1020210160352A patent/KR102666913B1/ko active IP Right Grant
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| Publication number | Publication date |
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