CN112748105A - 一种用于血糖/尿糖快速检测的单原子催化剂基比色试纸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物分析检测领域，具体涉及一种用于血糖/尿糖快速检测的单原子催化剂基比色试纸的制备方法。该方法具体为：将碳源、氮源分别加入氯化铜水溶液中制备冻干粉末；将冻干粉末高温煅烧，得单原子纳米过氧化氢模拟酶；将单原子纳米模拟酶分散于乙二醇中，超声分散后搅拌，过滤后将沉淀分散于乙二醇，将氯金酸缓慢加入，反应，过滤洗涤，烘干备用；将烘干后的单原子纳米模拟酶研磨，分散于TMB的缓冲液中，超声混合，添加胶黏剂，并涂饰于显色试纸上，烘干备用；构建葡萄糖比色检测试纸。本发明能够实现对血糖或尿糖的实时监测和定量检测，大大提高了血糖（尿糖）的便利性及检测成本，在居民医养健康领域具有重大的应用潜力和市场价值。
Description
技术领域
本发明属于生物分析检测领域，具体涉及一种用于血糖/尿糖快速检测的单原子催化剂基比色试纸的制备方法。
背景技术
血糖作为人体的主要能量来源，其异常波动对人体正常的生命健康具有十分重要的意义。而尿糖的精确检测则对人体糖代谢的调控具有十分重要的作用。而纳米模拟酶可克服生物蛋白酶环境耐受性差、贮存使用条件受限、价格昂贵等劣势，利用单原子基纳米模拟酶实现对血糖基尿糖的快速比色检测具有重要意义。
专利CN107315005B中报道了一种综合血糖试纸，该法分别在基片上铺设尿糖检测基片及血糖检测基片，需进行多部处理，并且血糖试纸制备工艺有待精简。
专利CN110082347A报道了一种简易的尿糖定量检测方法及尿糖定量检测试剂盒，该方法利用辣根过氧化氢酶作为双氧水催化分解催化剂，利用葡萄糖氧化酶作为葡萄糖分解催化剂，传统的蛋白酶的环境耐受性有待提高，应用局限性相对较大。
专利CN103048286B报道了一种糖尿病检测分析仪，该法需要利用微型计算机的辅助下实现血糖的实时监测和定量检测，检测设备成本有待进一步降低。
因此，研发一种能够实现快速检测的试纸成为了亟待需要解决的问题。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种用于血糖/尿糖快速检测的单原子催化剂基比色试纸的制备方法。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种用于血糖/尿糖快速检测的单原子催化剂基比色试纸的制备方法，包括以下步骤：
（1）将碳源、氮源分别加入氯化铜水溶液中，超声1h充分混合，之后搅拌12小时，得冻干粉末备用；
（2）将冻干粉末转移至磁舟中，在氩气氛围下，高温煅烧，自然降至室温后，将所得粉末进行充分研磨后得单原子纳米过氧化氢模拟酶；
（3）将单原子纳米模拟酶分散于乙二醇中，并超声分散30分钟，后搅拌12小时，过滤后将沉淀分散于等体积的乙二醇中超声30min后，将一定量的氯金酸缓慢加入，回流反应，降至室温后过滤，并用水和乙醇多次洗涤，得单原子模拟酶，70 ℃下烘干备用；
（4）将烘干后的单原子纳米模拟酶充分研磨，并分散于TMB的缓冲液中，充分超声混合，向混合液中添加胶黏剂，并涂饰于显色试纸上，缓慢烘干备用；
（5）配制系列浓度的葡萄糖溶液，利用上述单原子模拟酶基葡萄糖比色试纸，确定葡萄糖的浓度响应曲线及相应葡萄糖浓度下的显色对照，以构建葡萄糖比色检测试纸。
进一步的，步骤（1）中，所述的碳源和氮源的质量比为1：4；所述碳源同氯化铜水溶液的比例关系为1g：2mL；所述碳源为单糖或多糖，优化的，所述碳源为葡萄糖、葡聚糖、淀粉或纤维素，纯度>99%；所述氮源为二氰二胺、一氰胺或三聚氰胺，纯度>99%。
进一步的，步骤（1）中，所述氯化铜水溶液浓度为10mM~1M。
本发明所述的高温煅烧为在管式炉中，以2~6℃/min的升温速率升温至900~1100℃，煅烧0.5~2h。
进一步的，步骤（3）中，所述单原子纳米模拟酶同乙二醇的比例为10mg：20 ~50mL；所述单原子纳米模拟酶与氯金酸投加量之比为100g：10mg~5g（金含量计）。
进一步的，所述回流反应为首先在100℃下回流1小时后，后以5 ~15℃/min℃/min升温至155-170 ℃回流2~6小时。
进一步的，所述氯金酸溶液的浓度为5 mM~100mM。
进一步的，步骤（4）中，所述TMB的浓度为0.1mM~0.5mM，体积为2~5mL；烘干后，所述TMB的含量为0.1%~0.5%，优化的TMB含量为0.3%；所述缓冲液的pH为3.0~6.0。
进一步的，步骤（5）中，所述葡萄糖浓度分别为0.1 μM~100mM之间系列浓度，利用紫外光谱仪测量体系在652nm处的紫外吸收值与葡萄糖浓度之间的响应曲线，并构建比色参照试纸。
本发明的有益效果为：
（1）本发明利用单原子基纳米模拟酶实现对血糖基尿糖的快速比色检测，制备工艺简单，适应范围广；
（2）本发明制备的比色试纸能够实现对血糖或尿糖的实时监测和定量检测，无需昂贵的检测仪器，利用单原子酶、显色底物（TMB）制备比色检测试纸，实现血糖（尿糖）的快速、灵敏比色检测。本发明利用纳米模拟酶高催化活性、高环境适应性、低成本等优势，大大提高了血糖（尿糖）的便利性及检测成本，在居民医养健康领域具有重大的应用潜力和市场价值。
附图说明
图1为血糖（尿糖）比色检测构建机理图。
图2为铜单原子-金纳米团簇模拟酶透射电子显微镜图（TEM）。
图3为铜单原子-金团簇球差校正电子显微镜图片（HAADF-STEM）。
图4为单原子模拟酶比色验证实验。
图5为单原子模拟酶浓度响应曲线。
具体实施方式
为了更清晰的说明本发明，下面结合优选实例和附图对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
本发明中，制备方法如无特殊说明则均为常规制备方法，所用的试剂如无特殊说明均为从公开商业途径获得或根据现有方法获得。本发明中所述的百分比如无特殊说明均为质量百分比。
实施例1
步骤A：将20g 葡萄糖，80g 二氰二胺分别加入40mL（0.1 M）氯化铜水溶液，超声2小时后，快速搅拌12小时以确保上述碳源、氮源、金属盐充分混合分散。将上述混合液置于冷冻干燥机中冻干备用。将粉末转移至磁舟，在氩气氛围下，在管式炉中以5℃/min升温至1000℃高温煅烧1小时，自然降温至室温后，将所得粉末进行充分研磨后即得单原子纳米过氧化氢模拟酶。
步骤B：将100 mg单原子纳米模拟酶分散于40ml 乙二醇中，并超声分散30分钟，后搅拌12小时，过滤后将沉淀分散于40ml 乙二醇中超声30min后，将一定量的氯金酸（Au理论含量25mg）缓慢加入，在100℃下回流1小时后，后以10℃/min升温至160 ℃回流4 小时，降至室温后过滤，并用水和乙醇多次洗涤，得单原子模拟酶，70 ℃下烘干备用。
步骤C：将单原子纳米模拟酶充分研磨，并分散于1mL TMB的缓冲液中，充分超声混合。向上述混合液中添加适量的胶黏剂，并涂饰于显色试纸上，缓慢烘干备用。配制系列浓度的葡萄糖溶液，利用上述单原子模拟酶基葡萄糖比色试纸，确定葡萄糖的浓度响应曲线及相应葡萄糖浓度下的显色对照，以构建葡萄糖比色检测试纸。
实施例2
步骤A：将40g 葡萄糖，160g 二氰二胺分别加入80mL（0.1 M）氯化铜水溶液，超声2小时后，快速搅拌12小时以确保上述碳源、氮源、金属盐充分混合分散。将上述混合液置于冷冻干燥机中冻干备用。将粉末转移至磁舟，在氩气氛围下，在管式炉中以4℃/min升温至900℃高温煅烧2小时，自然降温至室温后，将所得粉末进行充分研磨后即得单原子纳米过氧化氢模拟酶。
步骤B：将200 mg单原子纳米模拟酶分散于40ml 乙二醇中，并超声分散30分钟，后搅拌12小时，过滤后将沉淀分散于40ml 乙二醇中超声30min后，将一定量的氯金酸（Au理论含量200mg）缓慢加入，在100℃下回流1小时后，后以10℃/min升温至160 ℃回流3小时，降至室温后过滤，并用水和乙醇多次洗涤，得单原子模拟酶，70 ℃下烘干备用。
步骤C：将单原子纳米模拟酶充分研磨，并分散于2 mL TMB的缓冲液中，充分超声混合。向上述混合液中添加适量的胶黏剂，并涂饰于显色试纸上，缓慢烘干备用。配制系列浓度的葡萄糖溶液，利用上述单原子模拟酶基葡萄糖比色试纸，确定葡萄糖的浓度响应曲线及相应葡萄糖浓度下的显色对照，以构建葡萄糖比色检测试纸。
效果实施例
图1为血糖/尿糖比色检测构建机理图。图1描绘了单原子催化剂基比色检测探针的构建流程，并给出了血糖/尿糖的比色检测机理。
图2为铜单原子-金纳米团簇模拟酶透射电子显微镜图。由图2 可见，制备的单原子催化剂具有较为规整的形貌，且二维石墨化材料没有明显的金属颗粒出现。图3为铜单原子-金团簇球差校正电子显微镜图片(HAADF-STEM)。由高角环形暗场像扫描透射电子显微镜(HAADF-STEM)表征可见，单原子催化剂中均匀分布着单原子分散的铜单原子及金团簇。
单原子模拟酶比色验证实验：利用单原子纳米模拟酶中的金团簇催化葡萄糖分解产生过氧化氢，进而基于铜单原子的高效芬顿催化作用，催化过氧化氢分解产生强氧化性的羟基自由基，与过氧化物酶催化活性底物（3,3′,5,5′-四甲基联苯胺二盐酸盐， TMB） 发生氧化反应，产生颜色变化（TMB 被氧化后得蓝色产物 oxTMB）。通过观察反应液颜色变化及652 nm 处的紫外吸光度值（oxTMB 在 652 nm 处具有最大吸收峰）实现葡萄糖的定量及定性检测，具体结果如图4所示，图4中a为葡萄糖+单原子模拟酶+缓冲液+TMB；b为单原子模拟酶+缓冲液+TMB；c为葡萄糖+缓冲液+TMB；d为缓冲液+TMB；
图5为单原子模拟酶浓度响应曲线。
配置系列浓度的葡萄糖溶液，取200 μL单原子模拟酶、200 μL 葡萄糖溶液、1.4mL缓冲液、200 μL TMB (1mM)孵育5分钟后测定其在652 nm 处的紫外吸收强度。并绘制如图5所示的浓度响应曲线。
Claims (9)
1.一种用于血糖/尿糖快速检测的单原子催化剂基比色试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将碳源、氮源分别加入氯化铜水溶液中，超声1h充分混合，之后搅拌12小时，得冻干粉末备用；
（2）将冻干粉末转移至磁舟中，在氩气氛围下，高温煅烧，自然降至室温后，将所得粉末进行充分研磨后得单原子纳米过氧化氢模拟酶；
（3）将单原子纳米模拟酶分散于乙二醇中，并超声分散30分钟，后搅拌12小时，过滤后将沉淀分散于等体积的乙二醇中超声30min后，将一定量的氯金酸缓慢加入，回流反应，降至室温后过滤，并用水和乙醇多次洗涤，得单原子模拟酶，70 ℃下烘干备用；
（4）将烘干后的单原子纳米模拟酶充分研磨，并分散于TMB的缓冲液中，充分超声混合，向混合液中添加胶黏剂，并涂饰于显色试纸上，缓慢烘干备用；
（5）配制系列浓度的葡萄糖溶液，利用上述单原子模拟酶基葡萄糖比色试纸，确定葡萄糖的浓度响应曲线及相应葡萄糖浓度下的显色对照，以构建葡萄糖比色检测试纸。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的碳源和氮源的质量比为1：4；所述碳源同氯化铜水溶液的比例关系为1g：2mL；所述碳源为单糖或多糖，优化的，所述碳源为葡萄糖、葡聚糖、淀粉或纤维素，纯度>99%；所述氮源为二氰二胺、一氰胺或三聚氰胺，纯度>99%。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述氯化铜水溶液浓度为10mM~1M。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述高温煅烧为在管式炉中，以2~6℃/min的升温速率升温至900~1100℃，煅烧0.5~2h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述单原子纳米模拟酶同乙二醇的比例为10mg：20 ~50 mL；所述单原子纳米模拟酶与氯金酸投加量之比为100g：10mg~5g（金含量计）。
6.根据权利要求1或5所述的制备方法，其特征在于：所述回流反应为首先在100℃下回流1小时后，后以5 ~15℃/min℃/min升温至155-170 ℃回流2~6小时。
7.根据权利要求1、5或6所述的制备方法，其特征在于：所述氯金酸溶液的浓度为5 mM~100mM。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，所述TMB的浓度为0.1mM~0.5mM，体积为2~5mL；烘干后，所述TMB的含量为0.1%~0.5%，优化的TMB含量为0.3%；所述缓冲液的pH为3.0~6.0。
9.根据权利要求1-8任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤（5）中，所述葡萄糖浓度分别为0.1 μM~100mM之间系列浓度，利用紫外光谱仪测量体系在652nm处的紫外吸收值与葡萄糖浓度之间的响应曲线，并构建比色参照试纸。
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| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |