CN116271074B - 一种具有双重治疗机制的肿瘤靶向治疗药物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有双重治疗机制的肿瘤靶向治疗药物，属于化学技术领域。本发明提供了一种肿瘤靶向治疗药物，包括聚阴离子靶向配体、聚阳离子还原敏感性喜树碱前药以及聚阴离子纳米金棒，聚阳离子还原敏感性喜树碱前药由聚阳离子化合物和喜树碱类似物缩合而成，聚阴离子纳米金棒为表面修饰有聚阴离子化合物的纳米金棒，聚阴离子靶向配体和聚阳离子还原敏感性喜树碱前药通过静电效应在聚阴离子纳米金棒表面层层自组装。其中，聚阴离子修饰的纳米金棒显著提高了喜树碱的溶解性，聚阴离子靶向配体提高了药物的肿瘤靶向性，进而克服了喜树碱药物选择性差和毒副作用强的缺陷，聚阴离子纳米金棒和喜树碱则共同给予了药物双重治疗机制。

Description

一种具有双重治疗机制的肿瘤靶向治疗药物
技术领域
本发明涉及一种具有双重治疗机制的肿瘤靶向治疗药物，属于化学技术领域。
背景技术
化疗药物是用于治疗肿瘤的药物，这些药物能作用在肿瘤细胞生长繁殖的不同环节上，抑制或杀死肿瘤细胞。化疗药物治疗是目前治疗肿瘤的主要手段之一。根据来源和化学结构，化疗药物分为烷化剂、抗代谢药、抗癌抗生素、植物类、激素类和杂类等。
喜树碱是一种植物类抗癌药物，其拓扑异构酶I抑制机制及其对缺氧诱导因子1α（HIF-1α）通路的抑制作用使其对多种恶性肿瘤尤其是耐药肿瘤细胞具有显著疗效。然而，喜树碱的药物选择性差、水溶性差且毒副作用强，导致其成药性差，这限制了其在临床治疗中的应用。
纳米药物能够利用实体瘤的高渗透和长滞留效应（EPR效应），在肿瘤组织富集，进而克服传统化疗药物选择性差、水溶性差和毒副作用强的劣势，若能将喜树碱与纳米药物结合，有助于改善喜树碱的成药性，进而推动喜树碱在临床治疗中的应用。可是，纳米药物仍存在在血液循环过程中形貌难以保持、到达肿瘤组织后肿瘤细胞内吞较差亦或不能及时释放药物等缺陷。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种肿瘤靶向治疗药物，所述肿瘤靶向治疗药物包括聚阴离子靶向配体、聚阳离子还原敏感性喜树碱前药以及聚阴离子纳米金棒；所述聚阳离子还原敏感性喜树碱前药由聚阳离子化合物和喜树碱类似物缩合而成；所述聚阴离子纳米金棒为表面修饰有聚阴离子化合物的纳米金棒；所述聚阴离子靶向配体和聚阳离子还原敏感性喜树碱前药通过静电效应在聚阴离子纳米金棒表面层层自组装。
在本发明的一种实施方式中，所述聚阴离子靶向配体包括苯硼酸、叶酸、半乳糖修饰的透明质酸、葡聚糖、聚谷氨酸或聚天冬氨酸中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述聚阴离子靶向配体为由苯硼酸和透明质酸缩合而成的聚阴离子双靶向配体。
在本发明的一种实施方式中，所述聚阳离子化合物包括聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、鱼精蛋白或聚精氨酸中的至少一种。
在本发明的一种实施方式中，所述喜树碱类似物包括CPT-ss-OH、SN38-ss-OH、HCPT-ss-OH或9-AC-ss-OH中的至少一种；
所述CPT-ss-OH的结构式如下：
；
所述SN38-ss-OH的结构式如下：
；
所述HCPT-ss-OH的结构式如下：
；
所述9-AC-ss-OH的结构式如下：
。
在本发明的一种实施方式中，所述聚阳离子还原敏感性喜树碱前药由聚阳离子化合物和CPT-ss-OH缩合而成。
在本发明的一种实施方式中，所述聚阳离子还原敏感性喜树碱前药由聚乙烯亚胺和CPT-ss-OH缩合而成。
在本发明的一种实施方式中，所述聚阴离子化合物为11-巯基十一烷酸、12-巯基十二烷酸、13-巯基十三烷酸或14-巯基十四烷酸中的至少一种。
本发明还提供了一种制备上述肿瘤靶向治疗药物的方法，所述方法为：将喜树碱类似物经20位羟基衍生化改性反应引入二硫键，得到引入二硫键的喜树碱类似物；将引入二硫键的喜树碱类似物和聚阳离子化合物混合后进行缩合反应，得到聚阳离子还原敏感性喜树碱前药；将聚阳离子还原敏感性喜树碱前药滴加至聚阴离子纳米金棒中，于避光条件下进行反应，得到反应液；将聚阴离子靶向配体滴加至反应液中，于避光条件下进行反应，得到肿瘤靶向治疗药物。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包含如下步骤：
步骤一：将CPT-ss-OH、丁二酸酐和吡啶于溶剂中混合后进行反应，得到CPT-ss-COOH；将CPT-ss-COOH、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶和聚乙烯亚胺于溶剂中混合后进行反应，得到聚阳离子还原敏感性喜树碱前药；
步骤二：将四氯金酸、十六烷基三甲基溴化铵和硼氢化钠于溶剂中混合后进行反应，得到纳米金种；将十六烷基三甲基溴化铵、硝酸银、四氯金酸和抗坏血酸于溶剂中混合后进行反应，得到反应液A；将纳米金种和反应液A混合后进行反应，得到十六烷基三甲基溴化铵修饰的纳米金棒；将十六烷基三甲基溴化铵修饰的纳米金棒与十二烷基硫醇于溶剂中混合后进行反应，得到十二烷基硫醇修饰的纳米金棒；将十二烷基硫醇修饰的纳米金棒与11-巯基十一烷酸于溶剂中混合后进行反应，得到聚阴离子纳米金棒；
步骤三：制备聚阴离子靶向配体；
步骤四：将聚阳离子还原敏感性喜树碱前药滴加至聚阴离子纳米金棒中，于避光条件下进行反应，得到反应液B；将反应液B离心取沉淀后，将聚阴离子靶向配体滴加至沉淀中，于避光条件下进行反应，得到反应液C；将反应液C离心取沉淀，得到肿瘤靶向治疗药物。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤一中，CPT-ss-OH、丁二酸酐和吡啶的摩尔比为1：1~1.5：0.25-1，CPT-ss-COOH、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶和聚乙烯亚胺的摩尔比为1：1~1.5：1~1.5：0.25~1：1~1.5。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤一中，CPT-ss-OH、丁二酸酐和吡啶的摩尔比为1：1.2：0.5，CPT-ss-COOH、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶和聚乙烯亚胺的摩尔比为1：1.2：1.2：0.5：1.1。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤一为：将CPT-ss-OH、丁二酸酐和吡啶于溶剂中混合后，于20~37℃下进行反应，得到CPT-ss-COOH；将CPT-ss-COOH、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶和聚乙烯亚胺于溶剂中混合后，于20~37℃下进行反应，得到聚阳离子还原敏感性喜树碱前药。
在本发明的一种实施方式中，所述聚阳离子还原敏感性喜树碱前药中，喜树碱的负载量为25%~30%。
在本发明的一种实施方式中，所述聚阳离子还原敏感性喜树碱前药中，喜树碱的负载量为28%。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤二中，四氯金酸、十六烷基三甲基溴化铵和硼氢化钠的摩尔比为1：100~500：1~10，四氯金酸、十六烷基三甲基溴化铵、硝酸银、抗坏血酸和纳米金种的摩尔比为1：100~500：0.1~1：1~2：0.001~0.01，十六烷基三甲基溴化铵修饰的纳米金棒与十二烷基硫醇的摩尔比为1：1×104~5×104，十二烷基硫醇修饰的纳米金棒与11-巯基十一烷酸的摩尔比为1：1×104~5×104。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤二中，四氯金酸、十六烷基三甲基溴化铵和硼氢化钠的摩尔比为1：400：2.4，四氯金酸、十六烷基三甲基溴化铵、硝酸银、抗坏血酸和纳米金种的摩尔比为1：200：0.16：1.2：0.005，十六烷基三甲基溴化铵修饰的纳米金棒与十二烷基硫醇的摩尔比为1：2×104，十二烷基硫醇修饰的纳米金棒与11-巯基十一烷酸的摩尔比为1：2×104。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤二为：聚阴离子纳米金棒的制备：将四氯金酸、十六烷基三甲基溴化铵和硼氢化钠于溶剂中混合后，于20~37℃下进行反应，得到纳米金种；将十六烷基三甲基溴化铵、硝酸银、四氯金酸和抗坏血酸于溶剂中混合后，于20~37℃下进行反应，得到反应液A；将纳米金种和反应液A混合后，于20~37℃下进行反应，得到十六烷基三甲基溴化铵修饰的纳米金棒；将十六烷基三甲基溴化铵修饰的纳米金棒与十二烷基硫醇于溶剂中混合后进行反应，得到十二烷基硫醇修饰的纳米金棒；将十二烷基硫醇修饰的纳米金棒与11-巯基十一烷酸于溶剂中混合后，于70~80℃下进行反应，得到聚阴离子纳米金棒。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤四中，聚阴离子纳米金棒、聚阳离子还原敏感性喜树碱前药和聚阴离子靶向配体的质量比为1：0.8~1：0.8~1。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤四中，聚阴离子纳米金棒、聚阳离子还原敏感性喜树碱前药和聚阴离子靶向配体的质量比为1：1：1。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤四为：将聚阳离子还原敏感性喜树碱前药滴加至聚阴离子纳米金棒中，于避光、20~37℃下进行反应，得到反应液B；将反应液B离心取沉淀后，将聚阴离子靶向配体滴加至沉淀中，于避光、20~37℃下进行反应，得到反应液C；将反应液C离心取沉淀，得到肿瘤靶向治疗药物。
在本发明的一种实施方式中，所述CPT-ss-OH的制备方法为：将喜树碱、三光气、4-二甲氨基吡啶和2,2’-二硫二乙醇于溶剂中混合后进行改性反应，得到CPT-ss-OH。
在本发明的一种实施方式中，所述喜树碱、三光气、4-二甲氨基吡啶与2,2’-二硫二乙醇的摩尔比为1：0.7~1：5~6：1.5~5。
在本发明的一种实施方式中，所述喜树碱、三光气、4-二甲氨基吡啶与2,2’-二硫二乙醇的摩尔比为1：0.7：6：5。
在本发明的一种实施方式中，所述CPT-ss-OH的制备方法为：将喜树碱、三光气、4-二甲氨基吡啶和2,2’-二硫二乙醇于溶剂中混合后，于20~37℃下进行改性反应，得到CPT-ss-OH。
在本发明的一种实施方式中，当聚阴离子靶向配体为由苯硼酸和透明质酸缩合而成的聚阴离子双靶向配体时，所述步骤三为：将透明质酸（HA）、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶和3-氨基苯硼酸（PBA）于溶剂中混合后进行反应，得到聚阴离子双靶向配体。
在本发明的一种实施方式中，所述透明质酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶和3-氨基苯硼酸的摩尔比为1：1~1.5：1~1.5：0.25~1：0.25~1。
在本发明的一种实施方式中，所述透明质酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶和3-氨基苯硼酸的摩尔比为1：1.2：1.2：0.5：0.7。
在本发明的一种实施方式中，所述聚阴离子双靶向配体的制备方法为：将透明质酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶和3-氨基苯硼酸于溶剂中混合后，于20~37℃下进行反应，得到聚阴离子双靶向配体。
本发明还提供了上述方法在制备肿瘤靶向治疗药物中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述肿瘤包括肝癌、肺癌、乳腺癌、肾母细胞瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、鼻咽癌、间皮质瘤、胰岛细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胰腺癌、子宫肌瘤、宫颈癌或甲状腺癌中的至少一种。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了一种肿瘤靶向治疗药物，所述肿瘤靶向治疗药物包括聚阴离子靶向配体、聚阳离子还原敏感性喜树碱前药以及聚阴离子纳米金棒；所述聚阳离子还原敏感性喜树碱前药由聚阳离子化合物和喜树碱类似物缩合而成；所述聚阴离子纳米金棒为表面修饰有聚阴离子化合物的纳米金棒；所述聚阴离子靶向配体和聚阳离子还原敏感性喜树碱前药通过静电效应在聚阴离子纳米金棒表面层层自组装。所述肿瘤靶向治疗药物以聚阴离子修饰的纳米金棒为基础，通过带相反电荷的聚电解质（聚阳离子还原敏感性喜树碱前药）和聚阴离子靶向配体在聚阴离子修饰的纳米金棒表面进行层层自组装而得，其中，聚阴离子修饰的纳米金棒显著提高了喜树碱的溶解性，聚阴离子靶向配体提高了药物的肿瘤靶向性，增强了药物在肿瘤细胞内的富集，提高了药物对肿瘤细胞的杀伤能力，进而克服了喜树碱药物选择性差和毒副作用强的缺陷，聚阴离子纳米金棒和喜树碱则共同给予了药物双重治疗机制，使得药物能够在近红外光辐照下引起光热效应实现热疗，达到化学疗法和光热疗法的双重治疗效果。并且，球状纳米药物通常在血流中心移动，而血红细胞和巨噬细胞也多集中在血流中心，因此，球形纳米粒子较容易被巨噬细胞吞噬清除，而所述肿瘤靶向治疗药物使用的纳米金棒为棒状纳米药物，棒状纳米药物多在靠近血管壁的近壁层流动，被巨噬细胞吞噬清除的量相对较小，因此，能延长药物的血液循环，同时，棒状药物在形貌上的各向异性使其具有增强药物吞噬效果，提高药效。
进一步地，所述聚阳离子还原敏感性喜树碱前药由聚阳离子化合物和CPT-ss-OH缩合而成。此设置下，所述药物的聚阳离子还原敏感性喜树碱前药能够在还原性环境下断裂二硫键释放母药喜树碱，具有肿瘤微环境还原敏感释药特性。
进一步地，所述聚阴离子靶向配体为由苯硼酸和透明质酸缩合而成的聚阴离子双靶向配体。此设置下，所述药物具有双重靶向性，对肿瘤的靶向性更强，治疗效果更好。
附图说明
图1：聚阳离子还原敏感性喜树碱前药的合成路线。
图2：聚阴离子双靶向配体的合成路线。
图3：聚阴离子纳米金棒的合成路线。
图4：双靶向配体的还原敏感喜树碱和纳米金棒联合治疗前药PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au的结构示意图。
图5：喜树碱CPT的高效液相色谱图。
图6：喜树碱类似物CPT-ss-OH的高效液相色谱图。
图7：喜树碱类似物CPT-ss-OH的1H NMR谱图。
图8：中间产物CPT-ss-COOH的1H NMR谱图。
图9：聚阳离子还原敏感性喜树碱前药PEI-ss-CPT的1H NMR谱图。
图10：双靶向配体的还原敏感喜树碱和纳米金棒联合治疗前药PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au的透射电镜图。
图11：双靶向配体的还原敏感喜树碱和纳米金棒联合治疗前药PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au的在5℃水相环境中储存14天后的透射电镜图。
图12：双靶向配体的还原敏感喜树碱和纳米金棒联合治疗前药PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au在不同二硫苏糖醇浓度条件下的累积药物释放曲线图。
图13：HepG2细胞对双靶向配体的还原敏感喜树碱和纳米金棒联合治疗前药PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au和游离喜树碱的细胞吞噬药物百分比的统计图。
图14：游离喜树碱、双靶向配体的还原敏感喜树碱和纳米金棒联合治疗前药PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au（无辐照）和双靶向配体的还原敏感喜树碱和纳米金棒联合治疗前药PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au（近红外辐照）对HepG2细胞相对活率的影响统计图。
图15：HepG2细胞对双靶向配体的还原敏感喜树碱和纳米金棒联合治疗前药PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au、PBA预饱和后PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au和HA预饱和后PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au的细胞吞噬药物百分比的统计图。
图16：对HepG2细胞相对活率的影响统计图。
图13~图16中，“*”为p值小于0.05，“**”为p值小于0.01，“***”为p值小于0.001，“****”为p值小于0.0001。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例中涉及的喜树碱、三光气、4-二甲氨基吡啶、2,2’-二硫二乙醇、丁二酸酐、吡啶、TBE缓冲液购自安耐吉公司；下述实施例中涉及的培养基为购自Hyclone公司的DMEM培养基；下述实施例中涉及的HepG2细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；下述实施例中涉及的胰酶购自KEL biotech；下述实施例中涉及的高效液相色谱图使用Agilent 1200高效液相色谱仪测得，1H NMR谱图使用Bruker AscendTM-400型傅里叶变换核磁共振测试仪测得，透射电镜图使用JEOL 2100（日本电子公司，日本）测得。
下述实施例中涉及的三联液的配置过程为：将10g SDS+5mL异丁醇+0.1mL 10MHCl使用双蒸水配成100mL，得到三联液。
实施例1：一种肿瘤靶向治疗药物及其制备方法
本实施例提供了一种肿瘤靶向治疗药物，所述肿瘤靶向治疗药物由聚阴离子靶向配体、聚阳离子还原敏感性喜树碱前药PEI-ss-CPT以及聚阴离子纳米金棒组成；所述聚阴离子靶向配体为由苯硼酸和透明质酸缩合而成的聚阴离子双靶向配体PBA-HA；所述聚阳离子还原敏感性喜树碱前药PEI-ss-CPT由聚乙烯亚胺和喜树碱类似物CPT-ss-OH缩合而成；所述聚阴离子纳米金棒为表面修饰有11-巯基十一烷酸的纳米金棒；所述聚阴离子靶向配体和聚阳离子还原敏感性喜树碱前药通过静电效应在聚阴离子纳米金棒表面层层自组装。将此肿瘤靶向治疗药物命名为双靶向配体的还原敏感喜树碱和纳米金棒联合治疗前药PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au（聚阳离子还原敏感性喜树碱前药的合成路线见图1，聚阴离子双靶向配体的合成路线见图2，聚阴离子纳米金棒的合成路线见图3，双靶向配体的还原敏感喜树碱和纳米金棒联合治疗前药PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au的结构见图4）。
所述肿瘤靶向治疗药物（即双靶向配体的还原敏感喜树碱和纳米金棒联合治疗前药PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au）的制备方法包含如下步骤：
步骤一：聚阳离子还原敏感性喜树碱前药PEI-ss-CPT的合成
称取喜树碱（2mmol）、三光气（1.4mmol）及100mL无水二氯甲烷于反应瓶中，室温（25℃）下反应0.5h后，在氮气保护下依次加入4-二甲氨基吡啶（12mmol）以及2,2’-二硫二乙醇（10mmol），于室温（25℃）下反应5h后，反应液变澄清；将澄清的反应液用饱和NaCl水溶液萃取三次后，用无水NaSO4干燥有机相；将有机相过滤后，取滤液浓缩拌样过硅胶柱纯化，硅胶柱纯化的流动相为二氯甲烷与甲醇的混合液（V二氯甲烷：V甲醇=300：1），纯化产物为淡黄色粉末状的喜树碱类似物CPT-ss-OH（0.95g，产率90%）（喜树碱的高效液相色谱如图5所示，喜树碱类似物CPT-ss-OH的高效液相色谱如图6所示，1H NMR谱图如图7所示）；
喜树碱类似物CPT-ss-OH的结构式如下：
；
称取喜树碱类似物CPT-ss-OH（2mmol）、丁二酸酐（2.4mmol）、吡啶（1mmol）及50mL无水二氯甲烷于反应瓶中，在氮气保护下，于室温（25℃）反应2h，得到反应液；将反应液滴加至冰乙醚（0℃）中进行过滤洗涤，得到淡黄色粉末状的中间产物CPT-ss-COOH（0.89g，产率71%）（中间产物CPT-ss-COOH的1H NMR谱图如图8所示）；
中间产物CPT-ss-COOH的结构式如下：
；
称取1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（1.2mmol）、中间产物CPT-ss-COOH（1mmol）及N-羟基丁二酰亚胺（1.2mmol）、4-二甲氨基吡啶（0.5 mmol）及50mL二甲基亚砜于反应瓶中，超声促其分散形成混悬液后，在氮气保护下，于室温（25℃）反应0.5h，得到反应液；将溶于50mL二甲基亚砜的聚乙烯亚胺（1.1mmol）添加至到反应液中，在氮气保护下，于室温（25℃）反应12h，得到反应液；将反应液滴加至冰乙醚（0℃）中进行过滤洗涤，得到聚阳离子还原敏感性喜树碱前药PEI-ss-CPT，紫外法测得PEI-ss-CPT中喜树碱（CPT）的负载量为28%（聚阳离子还原敏感性喜树碱前药PEI-ss-CPT的1H NMR谱图如图9所示）；制得的聚阳离子还原敏感性喜树碱前药PEI-ss-CPT为混合物；
聚阳离子还原敏感性喜树碱前药PEI-ss-CPT的结构式如下：
；
式中，R1、R2、R3为-H或-CPT，x为大于1的整数；
或者，聚阳离子还原敏感性喜树碱前药PEI-ss-CPT的结构式如下：
；
式中，R4、R5、R6为-H或-CPT，y为大于1的整数；
步骤二：聚阴离子双靶向配体PBA-HA的合成
称取透明质酸（1mmol，透明质酸为混合物，图2中透明质酸结构式中的z为大于1的整数）、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（1.2mmol）、N-羟基丁二酰亚胺（1.2mmol）、4-二甲氨基吡啶（0.5mmol））及200mL二甲基亚砜于反应瓶中，于室温（25℃）、150rpm下搅拌反应1h后，加入溶于30mL二甲基亚砜的3-氨基苯硼酸（0.7mmol），在氮气保护下，于室温（25℃）反应12h，得到反应液；将反应液滴加至冰乙醚（0℃）中进行过滤洗涤，得到灰白粉末状的聚阴离子双靶向配体PBA-HA；制得的聚阴离子双靶向配体PBA-HA为混合物；
聚阴离子双靶向配体PBA-HA的结构式如下：
；
式中，R7、R8为-OH或-PBA，m为大于1的整数，n为大于1的整数；
步骤三：聚阴离子纳米金棒的合成
将四氯金酸水溶液（0.5mM，1mmol）与十六烷基三甲基溴化铵水溶液（0.2M，0.4mmol）混合，得到混合液；冰浴条件下（0℃），向混合液中滴加硼氢化钠水溶液（2.4mmol）后，在避光、室温（25℃）下反应4h，得到反应液；将反应液转移至截留分子量为2000的超滤管中，纯化水超滤，得到纳米金种；
将四氯金酸水溶液（0.5mM，1mmol）、十六烷基三甲基溴化铵水溶液（0.2M，0.2mol）和硝酸银水溶液（5mM，0.16mmol）混合，得到混合液；在氮气保护下，于避光、室温（25℃）、150rpm下在混合液滴加抗坏血酸水溶液（0.1M，1.2mmol）至反应液变澄清；在澄清的反应液中加入纳米金种（0.25mM，0.005mmol）后，在氮气保护下，于避光、室温（25℃）下反应4h，得到十六烷基三甲基溴化铵修饰的纳米金棒；
向十六烷基三甲基溴化铵修饰的纳米金棒（1mmol）中加入十二烷基硫醇（2×104mmol），得到反应体系；在反应体系中加入20mL丙酮，涡旋10s后水相澄清，取有机相，得到十二烷基硫醇修饰的纳米金棒；
在十二烷基硫醇修饰的纳米金棒（1mmol）中加入20mL甲苯与甲醇的混合液（V甲苯：V甲醇=1：5）进行稀释，得到稀释液；将稀释液离心弃上清；取沉淀收集并重悬于10mL甲苯中，超声促其分散形成混悬液后，向混悬液中滴加溶于10mL甲苯的11-巯基十一烷酸溶液（2×104mmol），于75℃反应15min，得到反应液；将反应液分别用甲苯和异丙醇洗涤三次，得到11-巯基十一烷酸修饰的纳米金棒（即聚阴离子纳米金棒）；
步骤四：肿瘤靶向治疗药物的组装
将含聚阳离子还原敏感性喜树碱前药PEI-ss-CPT（50mg）的6mL水溶液滴加至含聚阴离子纳米金棒（50mg）的TBE缓冲液（6mL）中，于避光、室温（25℃）、150rpm下反应1h，得到反应液；将反应液离心弃上清，重复三次，取沉淀；将含聚阴离子双靶向配体PBA-HA（50mg）的10mL水溶液滴加入沉淀中，于避光、室温（25℃）、150rpm下反应1h，得到反应液；将反应液离心弃上清，重复三次，取沉淀，得到双靶向配体的还原敏感喜树碱和纳米金棒联合治疗前药PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au。双靶向配体的还原敏感喜树碱和纳米金棒联合治疗前药PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au的透射电镜图如图10所示。电镜结果显示，双靶向配体的还原敏感喜树碱和纳米金棒联合治疗前药PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au具有良好的纳米尺度，且较为均一，符合纳米药物具有被动靶向所需的特质，即纳米粒径范围在5~500nm，能够通过被动靶向聚集在肿瘤组织。
对比例1：一种肿瘤靶向治疗药物及其制备方法
本对比例提供了一种肿瘤靶向治疗药物，所述肿瘤靶向治疗药物为：在实施例1的基础上，将聚阴离子双靶向配体PBA-HA替换为聚阴离子靶向配体透明质酸HA。将此肿瘤靶向治疗药物命名为单靶向配体的还原敏感喜树碱和纳米金棒联合治疗前药PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au。
所述肿瘤靶向治疗药物（即单靶向配体的还原敏感喜树碱和纳米金棒联合治疗前药PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au）的制备方法为：在实施例1的基础上，将聚阴离子双靶向配体PBA-HA（50mg）替换为聚阴离子靶向配体透明质酸HA（50mg）。
对比例2：一种肿瘤靶向治疗药物及其制备方法
本对比例提供了一种肿瘤靶向治疗药物，所述肿瘤靶向治疗药物为：在实施例1的基础上，将聚阳离子还原敏感性喜树碱前药PEI-ss-CPT替换为聚阳离子化合物聚乙烯亚胺PEI。将此肿瘤靶向治疗药物命名为双靶向配体的纳米金棒治疗前药PBA-HA@PEI@Au。
所述肿瘤靶向治疗药物（即双靶向配体的纳米金棒治疗前药PBA-HA@PEI@Au）的制备方法为：在实施例1的基础上，将聚阳离子还原敏感性喜树碱前药PEI-ss-CPT（50mg）替换为聚乙烯亚胺PEI（50mg）。
实验例1：肿瘤靶向治疗药物的稳定性实验
本实验例提供了肿瘤靶向治疗药物的稳定性实验，具体过程如下：
将实施例1制得的PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au在5℃水相环境（水相环境即去离子水）中储存14天后，利用透射电镜测定其储存前后的形貌和粒径的变化，以反应PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au的储存稳定性情况，测定结果见图11。
如图11所示，PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au在储存前后的粒径基本保持不变，证明在5℃低温条件下，PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au能够长时间保持稳定。
实验例2：肿瘤靶向治疗药物的还原敏感释放药物性能实验
本实验例提供了肿瘤靶向治疗药物的还原敏感释放药物性能实验，具体过程如下：
将实施例1制得的PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au分别置于二硫苏糖醇（DTT）浓度为20µM和10mM的磷酸缓冲液（pH 7.4、0.2M）中透析48h，透析过程中，使用高效液相色谱仪分别测定各组（20µM DTT组和10mMDTT组）透析袋外磷酸缓冲液的峰面积，并将峰面积与CPT标准曲线进行对照，通过对透析袋外测得的药物浓度进行累计，得到各组释药量，计算结果如图12所示；其中，CPT标准曲线的绘制过程为：参照文献“J. Control. Release 104(2005)313.”，先使用磷酸缓冲液（pH 7.4、0.2M）将游离CPT稀释至梯度浓度（0~100mM），得到梯度浓度的游离CPT溶液，再通过高效液相色谱仪分别检测梯度浓度的游离CPT溶液的峰面积，最后以游离CPT溶液的浓度为横坐标，以与游离CPT溶液对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
如图12所示，PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au的释药量与DTT浓度呈现出一定的依赖关系，在DTT浓度为10mM的磷酸缓冲液介质中的累计释药量远高于在DTT浓度为20µM的磷酸缓冲液介质中的释药量，证明BA-HA@PEI-ss-CPT@Au的药物释放的还原敏感性能。
实验例3：肿瘤靶向治疗药物的细胞吞噬行为实验
本实验例提供了肿瘤靶向治疗药物的细胞吞噬行为实验，具体过程如下：
将HepG2细胞以2×105个/孔的接种量接种于每孔添加有2mL培养基的六孔板中后，在六孔板中分别加入含相同喜树碱含量（50μM）的游离喜树碱和实施例1制得的联合治疗前药PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au，得到培养体系；将培养体系37℃加药培养4h后，先使用磷酸缓冲液（pH 7.4、0.2M）清洗三次，再使用胰酶（剂量0.5mL，能够覆盖HepG2细胞表面即可）37℃消化2min，最后离心收集细胞；在收集得到的细胞中加入三联液（剂量0.5mL，HepG2细胞能够全部浸入即可）37℃裂解5min，得到细胞裂解液；通过多功能酶标仪（Powerwave XS，USA）在激发波长为360nm的条件下检测细胞裂解液于发射波长为450nm下的荧光强度；将测得的荧光强度带入CPT标准曲线，得到各组细胞吞噬CPT的含量，并根据公式吞噬CPT百分比=（吞噬CPT量/CPT加入量）×100%计算各组细胞吞噬CPT的百分比，测定结果如图13所示；其中，CPT标准曲线的绘制过程为：参照文献“Eur J Pharm Biopharm. 2019 Nov;144:193-206.”，先使用磷酸缓冲液（pH 7.4、0.2M）将游离CPT稀释至梯度浓度（0~100nM），得到梯度浓度的游离CPT溶液，再通过多功能酶标仪在激发波长为360nm的条件下分别检测梯度浓度的游离CPT溶液于发射波长为450nm下的荧光强度，最后以游离CPT溶液的浓度为横坐标，以与游离CPT溶液对应的荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。
如图13所示，游离喜树碱组、PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au组吞噬CPT的百分比分别为20%和66%，可见，PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au在HepG2细胞上表现的细胞吞噬药物百分比显著强于游离喜树碱，证明PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au能增强肿瘤细胞对药物的内吞。
实验例4：肿瘤靶向治疗药物对HepG2细胞增殖抑制作用实验
本实验例提供了肿瘤靶向治疗药物对HepG2细胞增殖抑制作用实验，具体过程如下：
将HepG2细胞以5×103个/孔的接种量接种于每孔添加有0.2mL培养基的96孔板上后，将96孔板上的孔设为三组：游离喜树碱组、联合治疗前药组（无辐照）、联合治疗前药组（近红外辐照），三组分别加入同等喜树碱浓度（50μM）的游离喜树碱和实施例1制得的联合治疗前药PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au，得到培养体系；将培养体系37℃加药培养，其中，联合治疗前药组（近红外辐照）在培养12h后使用近红外辐照2min后继续培养12h，其余两组持续培养24h；结束培养后，三组采用MTT法测量并计算各组细胞相对活率，测定结果如图14所示（空白对照为未加药的孔）；
其中，细胞相对活率的测量及计算方法为：先使用酶标仪测定550nm处每孔中溶液的吸光度（OD），再根据公式细胞活率（%）=（OD实验组-OD空白组）/（OD对照组-OD空白组）×100%计算细胞相对活率；
式中，OD实验组代表用药物处理组的吸光度数值，OD对照组代表用不含药物的培养液处理组的吸光度数值，OD空白组代表未接种细胞且使用不含药物的培养液处理组的吸光度数值。
如图14所示，游离喜树碱组、联合治疗前药组（无辐照）、联合治疗前药组（近红外辐照）的细胞相对活率分别为64%、55%、38%，可见，与游离喜树碱组和联合治疗前药组（无辐照）相比，联合治疗前药组（近红外辐照）的PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au能在近红外辐照条件下发挥双重治疗作用，增强对肿瘤细胞增殖的抑制作用。
实验例5：肿瘤靶向治疗药物的细胞吞噬行为实验
本实验例提供了肿瘤靶向治疗药物的细胞吞噬行为实验，具体过程如下：
使用培养基将PBA配置成浓度为0.7mg/mL的PBA溶液；使用培养基将HA配置成浓度为10mg/mL的HA溶液；将HepG2细胞以2×105个/孔的接种量接种于每孔添加有2mL培养基的六孔板中后，取0.5mL PBA溶液和HA溶液分别添加至六孔板中，于37℃放置4h，得到PBA预饱和后的HepG2细胞（PBA预饱和后PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au组）和HA预饱和后的HepG2细胞（HA预饱和后PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au组）；以未经饱和的HepG2细胞作为PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au组，在PBA预饱和后PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au组、HA预饱和后PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au组和PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au组的六孔板中分别加入含相同喜树碱含量（50μM）的实施例1制得的联合治疗前药PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au，得到培养体系；将培养体系37℃加药培养4h后，先使用磷酸缓冲液（pH 7.4、0.2M）清洗三次，再使用胰酶（剂量0.5mL，能够覆盖HepG2细胞表面即可）37℃消化2min，最后离心收集细胞；在收集得到的细胞中加入三联液（剂量0.5mL，HepG2细胞能够全部浸入即可）37℃裂解5min，得到细胞裂解液；通过多功能酶标仪（Powerwave XS，USA）在激发波长为360nm的条件下检测细胞裂解液于发射波长为450nm下的荧光强度；将测得的荧光强度带入CPT标准曲线，得到各组细胞吞噬CPT的含量，并根据公式吞噬CPT百分比=（吞噬CPT量/CPT加入量）×100%计算各组细胞吞噬CPT的百分比，测定结果如图15所示；其中，CPT标准曲线的绘制过程为：参照文献“Eur J Pharm Biopharm. 2019 Nov;144:193-206.”，先使用磷酸缓冲液（pH 7.4、0.2M）将游离CPT稀释至梯度浓度（0~100nM），得到梯度浓度的游离CPT溶液，再通过多功能酶标仪在激发波长为360nm的条件下分别检测梯度浓度的游离CPT溶液于发射波长为450nm下的荧光强度，最后以游离CPT溶液的浓度为横坐标，以与游离CPT溶液对应的荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。
如图15所示，PBA预饱和后PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au组、HA预饱和后PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au组、未经受体饱和的PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au组吞噬CPT的百分比分别为66%、51%、44%，可见，PBA预饱和后PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au组和HA预饱和后PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au组在HepG2细胞上表现的细胞吞噬药物百分比显著弱于未经受体饱和的PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au，证明联合治疗前药PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au双靶向作用优于单靶向作用，能够增强肿瘤细胞对药物的内吞。
实验例6：肿瘤靶向治疗药物对HepG2细胞增殖抑制作用实验
本实验例提供了肿瘤靶向治疗药物对HepG2细胞增殖抑制作用实验，具体过程如下：
使用培养基将HA配置成浓度为10mg/mL的HA溶液；将HepG2细胞以5×103个/孔的接种量接种于每孔添加有0.2mL培养基的96孔板上后，取0.5 mL HA溶液添加至六孔板中，于37℃放置4h，得到HA预饱和后的HepG2细胞；在HA预饱和后的HepG2细胞中加入特定喜树碱浓度（50μM）的实施例1制得的联合治疗前药PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au，得到HA预饱和后PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au组，在未经饱和的HepG2细胞中分别加入同等喜树碱浓度（50μM）的游离喜树碱、实施例1制得的联合治疗前药PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au和对比例1制得的HA@PEI-ss-CPT@Au，得到游离喜树碱组、PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au组、HA@PEI-ss-CPT@Au组，在未经饱和的HepG2细胞中加入与PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au组同等纳米金量的对比例2制得的PBA-HA@PEI@Au，得到PBA-HA@PEI@Au组；将五组培养体系37℃加药培养12h后使用近红外辐照2min后继续培养12h；结束培养后，五组采用MTT法测量并计算各组细胞相对活率，测定结果如图16所示（空白对照为未加药的孔）；
其中，细胞相对活率的测量及计算方法为：先使用酶标仪测定550nm处每孔中溶液的吸光度（OD），再根据公式细胞活率（%）=（OD实验组-OD空白组）/（OD对照组-OD空白组）×100%计算细胞相对活率；
式中，OD实验组代表用药物处理组的吸光度数值，OD对照组代表用不含药物的培养液处理组的吸光度数值，OD空白组代表未接种细胞且使用不含药物的培养液处理组的吸光度数值。
如图16所示，游离喜树碱组、PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au组、HA@PEI-ss-CPT@Au组、HA预饱和后PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au组、PBA-HA@PEI@Au组的细胞相对活率分别为64%、38%、48%、45%、72%，可见，HA预处理后弱化透明质酸介导细胞内吞作用的HA预饱和后PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au组、无苯硼酸介导细胞内吞作用的HA@PEI-ss-CPT@Au组、无CPT作用的PBA-HA@PEI@Au组和游离喜树碱组的细胞抑制作用均弱于联合治疗前药PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au组，证明联合治疗前药PBA-HA@PEI-ss-CPT@Au能在近红外辐照条件下通过双靶向以及协同喜树碱和纳米金发挥双重治疗作用，增强对肿瘤细胞增殖的抑制作用。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种制备肿瘤靶向治疗药物的方法，其特征在于，所述肿瘤靶向治疗药物包括聚阴离子靶向配体、聚阳离子还原敏感性喜树碱前药以及聚阴离子纳米金棒；所述聚阴离子靶向配体为由苯硼酸和透明质酸缩合而成的聚阴离子双靶向配体；所述聚阳离子还原敏感性喜树碱前药由聚乙烯亚胺和CPT-ss-OH缩合而成；所述聚阴离子纳米金棒为表面修饰有11-巯基十一烷酸的纳米金棒；所述聚阴离子靶向配体和聚阳离子还原敏感性喜树碱前药通过静电效应在聚阴离子纳米金棒表面层层自组装；
所述CPT-ss-OH的结构式如下：
；
所述方法包含如下步骤：
步骤一：将CPT-ss-OH、丁二酸酐和吡啶于溶剂中混合后，于20~37℃下进行反应，得到CPT-ss-COOH；将CPT-ss-COOH、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶和聚乙烯亚胺于溶剂中混合后，于20~37℃下进行反应，得到聚阳离子还原敏感性喜树碱前药；所述步骤一中，CPT-ss-OH、丁二酸酐和吡啶的摩尔比为1：1~1.5：0.25-1，CPT-ss-COOH、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶和聚乙烯亚胺的摩尔比为1：1~1.5：1~1.5：0.25~1：1~1.5；
步骤二：将四氯金酸、十六烷基三甲基溴化铵和硼氢化钠于溶剂中混合后，于20~37℃下进行反应，得到纳米金种；将十六烷基三甲基溴化铵、硝酸银、四氯金酸和抗坏血酸于溶剂中混合后，于20~37℃下进行反应，得到反应液A；将纳米金种和反应液A混合后，于20~37℃下进行反应，得到十六烷基三甲基溴化铵修饰的纳米金棒；将十六烷基三甲基溴化铵修饰的纳米金棒与十二烷基硫醇于溶剂中混合后进行反应，得到十二烷基硫醇修饰的纳米金棒；将十二烷基硫醇修饰的纳米金棒与11-巯基十一烷酸于溶剂中混合后，于70~80℃下进行反应，得到聚阴离子纳米金棒；所述步骤二中，四氯金酸、十六烷基三甲基溴化铵和硼氢化钠的摩尔比为1：100~500：1~10，四氯金酸、十六烷基三甲基溴化铵、硝酸银、抗坏血酸和纳米金种的摩尔比为1：100~500：0.1~1：1~2：0.001~0.01，十六烷基三甲基溴化铵修饰的纳米金棒与十二烷基硫醇的摩尔比为1：1×104~5×104，十二烷基硫醇修饰的纳米金棒与11-巯基十一烷酸的摩尔比为1：1×104~5×104；
步骤三：将透明质酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶和3-氨基苯硼酸于溶剂中混合后，于20~37℃下进行反应，得到聚阴离子双靶向配体；所述步骤三中，透明质酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶和3-氨基苯硼酸的摩尔比为1：1~1.5：1~1.5：0.25~1：0.25~1；
步骤四：将聚阳离子还原敏感性喜树碱前药滴加至聚阴离子纳米金棒中，于避光、20~37℃的条件下进行反应，得到反应液B；将反应液B离心取沉淀后，将聚阴离子靶向配体滴加至沉淀中，于避光、20~37℃的条件下进行反应，得到反应液C；将反应液C离心取沉淀，得到肿瘤靶向治疗药物；所述步骤四中，聚阴离子纳米金棒、聚阳离子还原敏感性喜树碱前药和聚阴离子靶向配体的质量比为1：0.8~1：0.8~1。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤一中，CPT-ss-OH、丁二酸酐和吡啶的摩尔比为1：1.2：0.5，CPT-ss-COOH、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶和聚乙烯亚胺的摩尔比为1：1.2：1.2：0.5：1.1。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤二中，四氯金酸、十六烷基三甲基溴化铵和硼氢化钠的摩尔比为1：400：2.4，四氯金酸、十六烷基三甲基溴化铵、硝酸银、抗坏血酸和纳米金种的摩尔比为1：200：0.16：1.2：0.005，十六烷基三甲基溴化铵修饰的纳米金棒与十二烷基硫醇的摩尔比为1：2×104，十二烷基硫醇修饰的纳米金棒与11-巯基十一烷酸的摩尔比为1：2×104。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤三中，透明质酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶和3-氨基苯硼酸的摩尔比为1：1.2：1.2：0.5：0.7。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤四中，聚阴离子纳米金棒、聚阳离子还原敏感性喜树碱前药和聚阴离子靶向配体的质量比为1：1：1。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CPT-ss-OH的制备方法为：将喜树碱、三光气、4-二甲氨基吡啶和2,2’-二硫二乙醇于溶剂中混合后，于20~37℃下进行改性反应，得到CPT-ss-OH；所述喜树碱、三光气、4-二甲氨基吡啶与2,2’-二硫二乙醇的摩尔比为1：0.7~1：5~6：1.5~5。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述喜树碱、三光气、4-二甲氨基吡啶与2,2’-二硫二乙醇的摩尔比为1：0.7：6：5。
8.一种肿瘤靶向治疗药物，其特征在于，所述肿瘤靶向治疗药物由权利要求1~7任一项所述的方法制备而得。
9.权利要求1~7任一项所述的方法在制备肿瘤靶向治疗药物中的应用。
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