CN109675048B - 一种抗癌前药脂质体及青蒿素类脂质体纳米药物 - Google Patents

一种抗癌前药脂质体及青蒿素类脂质体纳米药物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种脂质体、其制备方法、以及利用脂质体制备的青蒿素类纳米药物。通过Boc‑谷氨酸和长链胺反应制备脂质体N,N’‑二‑长链烷基‑L‑谷氨酸二酰胺(LG)；以脂质体LG修饰含游离羧基的化合物原药；将LG修饰的药物用mPEG‑DSPE和线粒体靶向分子三苯基溴化膦(TPP)包裹组装成纳米药物。本发明所述纳米药物具有包载率高、肿瘤局部药物浓度高、全身性毒性小、药效高、进入细胞后释放出原药等优点。

Description

一种抗癌前药脂质体及青蒿素类脂质体纳米药物
技术领域
本发明涉及药物修饰领域，具体涉及一种用于修饰药物的脂质体、青蒿素药物的修饰方法及其用途，更具体涉及一种脂质体及其制备方法、利用所述脂质体修饰青蒿素药物的方法、以及包含脂质体修饰青蒿素药物的纳米粒子等。
背景技术
中国2015年估计有4292,000例癌症新发病例，2814,000例癌症死亡。在过去的几十年中，人们已经做出了很大的努力来治疗这些严重的疾病。在各种疗法中，化疗手段是目前临床上治疗癌症最有效的方式之一。虽然多种抗癌药物被开发出并应用于化疗，但常常会引起患者的不良副作用，导致身体和精神上的疼痛，且治疗效率很低。目前临床上常用的化疗药物包括阿霉素、紫杉醇、 10-羟基喜树碱、伊立替康等。
青蒿素(artemisinin，ART)是我国科学家20世纪70年代从植物黄花蒿(Artemisia annua L.)的叶和花蕾中提取的一种含有过氧基团、具有有效抗疟疾作用的倍半萜内脂类化合物。人们还发现该类化合物具有明显的抗肿瘤作用，对多种肿瘤细胞的生长具有抑制作用。其中青蒿素衍生物之一的青蒿琥酯(ART) 具有较强的抑制白血病、结肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和肾脏肿瘤等不同类型肿瘤细胞的作用。然而，青蒿素类似物与传统的癌症化学治疗剂相比，其效力要低，血浆半衰期短，并且需要高剂量和频繁给药才能有效治疗癌症。另外，ART水溶性差，在酸性条件下会降解，也带来相关的毒性风险。
由于大多数化疗药物是通过干扰癌细胞DNA的合成过程达到抗肿瘤的作用，因而它们往往存在骨髓抑制等副作用，并且目前对这些伴随的副作用缺乏有效的预防措施，限制了对肿瘤治疗的应用。因此寻找一种既能提升化疗药物的敏感性，同时增强对肿瘤细胞的抑制作用，又能降低其毒副作用及耐药性的抗肿瘤相关药物，成为亟待解决的问题，也一直是现代肿瘤学者研究的热点。
发明内容
为解决上述问题，纳米载药递送策略受到了很多关注。在体内，载药纳米粒可作为异物而被巨噬细胞吞噬，到达网状内皮系统分布集中的肝、脾等靶部位和连接有配基、抗体、酶底物所在的靶部位。纳米颗粒高度分散，表面积巨大，这有利于增加药物与吸收部位生物膜接触面积。纳米颗粒特殊的表面性能，使其在小肠中的滞留时间大大延长，并且纳米粒对装载的药物还具有保护作用，这些综合作用能明显提高药物的吸收和生物利用度。与一般药物的跨膜转运机制不同的是，纳米粒通过内吞等机制进入细胞，因此可以增加药物对生物膜的透过性，有利于药物透皮吸收与细胞内药效发挥。低分子量化疗药物通过非特异性扩散穿过健康和肿瘤组织的毛细血管壁，但通过纳米粒载体担载的药物只能渗入高渗透性肿瘤毛细血管床。载药纳米粒的靶向性在增加局部药物浓度的同时降低了全身其它部位的浓度，从而大大降低了药物的全身性毒性。为了提高纳米粒的疗效且更有效的到达肿瘤部位，在纳米粒的表面修饰上具有靶向作用的三苯基膦(TPP)、叶酸、RGD、LHRH多肽、转铁蛋白、适配体等其它常用靶向基元。另外，通过羧酸和氨基缩合变成酯后，其毒副作用往往会减低，使药物进入细胞内能够释放出原药，从而提高药效。
具体而言，本发明设计并成功制备出脂质体N,N’-二-十二烷基-L-谷氨酸二酰胺(LG-C12)，并进一步将其通过缩合的方式键合到青蒿琥酯(ART)上，提高了青蒿琥酯的疏水性，然后使用NH2-mPEG-DSPE键合上线粒体靶向分子三苯基溴化膦(TPP)的高分子包裹组装成纳米粒子，以提高药物对癌细胞的抑制作用。
第一方面，本发明提供一种用于制备抗癌前药的脂质体，其是由Boc-谷氨酸与两倍当量的长链胺形成的N,N’-二-长链烷基-L-谷氨酸二酰胺(LG)。
本发明所示的脂质体，其结构如式I所示：
Figure BDA0001938071390000021
其中，n为≥7的整数，优选7、11、17。
第二方面，本发明提供所述脂质体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将Boc保护的谷氨酸与长链胺进行酰胺缩合反应；
(2)过滤、洗涤、重结晶纯化；
(3)脱保护，得N,N’-二-长链烷基-L-谷氨酸二酰胺。
本发明所述脂质体的制备方法，其特征在于：
步骤(1)包括将Boc-谷氨酸和两倍当量的长链胺加入到反应瓶中，加入二氯甲烷溶解，再加入1.1倍当量的EDC和HOBt发生酰胺缩合；
步骤(3)包括用三氟乙酸脱Boc保护，洗涤干燥得到白色粉末N,N’-二-长链烷基-L-谷氨酸二酰胺(LG)。
第三方面，本发明提供一种以脂质体修饰的药物，其至少包括通过酰胺键共价连接的脂质体部分和药物部分。
本发明所述脂质体修饰的药物，其特征在于：所述药物部分衍生自由以下化合物组成的组：青蒿琥酯(Artesunate)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、培美曲塞(Pemetrexeddisodium)、氨基蝶呤(4-aminofolic acid)。
Figure BDA0001938071390000031
第四方面，本发明提供所述脂质体修饰的药物的制备方法，包括：
(1)原药的活化；
(2)活化的原药与脂质体发生酰胺缩合反应；
(3)洗涤、重结晶、冻干获得脂质体修饰的药物。
在一个实施例中，本发明所述的制备方法，包括：
(1)将具有游离羧基的原药以二氯甲烷溶解，加入2-3倍当量的EDC和 NHS进行活化；
(2)向活化后的原药中加入所述N,N’-二-长链烷基-L-谷氨酸二酰胺(LG) 进行酰胺缩合反应；
(3)反应结束后，经过洗涤、重结晶，冻干得到脂质体修饰药物。
第五方面，本发明还提供一种包含所述脂质体修饰药物的纳米粒子，其是通过以下方法制备：将mPEG-DSPE和脂质体修饰的药物混合，溶解于无水DMF 中，磁力搅拌并缓慢滴加二次水，透析过夜，离心取上清液即得包含脂质体修饰的药物的纳米粒子。
优选mPEG-DSPE和脂质体修饰药物混合过程中还加入了靶向基团，所述靶向基团包括三苯基膦(TPP)、叶酸、RGD、LHRH多肽、转铁蛋白、适配体等。
第六方面，本发明提供所述脂质体、所述脂质体修饰的药物、所述纳米粒子在以下方面的用途：
(1)制备治疗癌症的药物；
(2)制备线粒体靶向药物；
(3)制备毒副作用降低的前体药物。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：
(1)引入脂质体分子N,N’-二-长链烷基-L-谷氨酸二酰胺(LG)，提高了药物分子的包载率，提高药物的生物利用度。
(2)采用三苯基膦(TPP)修饰NH2-mPEG-DSPE，并与mPEG-DSPE混合制备了具有线粒体靶向的纳米药物，提高了药物的抗癌效果。增加局部药物浓度的同时降低了全身其他部位的浓度，从而大大降低了药物的全身性毒性。
(3)通过羧酸和氨基变成酯后其毒副作用往往会减低，使药物进入细胞内能够还原成原药，从而提高药效。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：
图1：脂质体N,N'-二-十二烷基-L-谷氨酸二酰胺(LGC12)的核磁表征
图2：脂质体LGC12的MALDI-TOF-MS质谱表征；
A：Boc保护的LGC12质谱图；B：Boc脱保护的LGC12质谱图
图3：LGC12修饰的青蒿琥酯(ART-LGC12)的核磁表征
图4：ART-LGC12的MALDI-TOF-MS质谱表征；
图5：含ART-LGC12的纳米粒制备条件优化
X轴为ART-LGC12与mPEG-DSPE的质量比；Y轴为直径(nm)/PDI
图6A：含ART-LGC12纳米粒的直径分布；
图6B：含ART-LGC12-TPP纳米粒的直径分布；
图7：含ART-LGC12纳米粒的TEM扫描电镜图
图8：含ART-LGC12纳米粒中ART的质量浓度和紫外吸收关系曲线
图9：ART-LGC12纳米粒、ART-LGC12-TPP纳米粒的细胞毒性试验
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1：脂质体N,N’-二-长链烷-L-谷氨酸二酰胺(LG)的制备和表征
将Boc-谷氨酸和两倍当量的长链胺(八、十二、十八胺)加入到反应瓶中，加入二氯甲烷溶解，再加入1.1倍当量的EDC和HOBt发生酰胺缩合，然后经过过滤、洗涤、重结晶得到N,N’-二-长链烷基-L-Boc-谷氨酸二酰胺，再用三氟乙酸脱Boc保护，洗涤干燥得到白色粉末N,N’-二-长链烷基-L-谷氨酸二酰胺(LG)。
反应步骤如下所示：
Figure BDA0001938071390000051
对制备的LGC12，进行核磁氢谱表征，结果如图1所示。核磁氢谱中的峰，全都成功归属，表明LGC12的成功合成。
对制备的LGC12，通过MALDI-TOF-MS进行表征，结果如图2所示。图2A 是Boc保护的LGC12的质谱图，其中604.1为Boc-LGC12+Na+,620.1为 Boc-LGC12+K+；图2B是Boc脱保护的质谱图，其中481.5为LGC12,503.6为 LGC12+Na+，全都成功归属，MALDI-TOF-MS质谱分析结果也表明成功合成了 LGC12。
实施例2：LGC12修饰药物的制备方法
以青蒿琥酯(ART)为例，详细阐述LGC12修饰药物的制备方法。将ART 加入反应瓶中，加入二氯甲烷溶解，再加入2-3倍当量的EDC和NHS活化2-4 小时，加入1倍当量的N,N’-二-十二烷基-L-谷氨酸二酰胺(LGC12)发生酰胺缩合反应，反应48小时，然后经过洗涤、重结晶，冻干得到LGC12修饰药物 (ART-LGC12)。
实施例3：LGC12修饰青蒿琥酯(ART)的结构表征
1、核磁共振波谱(NMR)
以四甲基硅烷(TMS)为内标，对实施例2制备的N,N’-二-十二烷谷氨酸二酰胺(LGC12)修饰的青蒿琥酯(ART)进行表征，氘代氯仿(CDCl3)为溶剂，采用400MHZ核磁共振仪器对其1H NMR进行扫描。
ART-LGC12的核磁氢谱分别如图3所示，图3表明ART-LGC12核磁氢谱中的峰，全都成功归属。
2、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)
为了进一步确认实施例2所合成的化合物，通过MALDI-TOF-MS，基质选择龙胆酸(DHB)测试了其质谱图。
ART-LGC12的MALDI-TOF-MS质谱图如图4所示。图4中870.5为 ART-LGC12+Na+，604.0为ART-LGC12脱去倍半萜内酯的质量。
核磁氢谱和质谱的实验结果证实，成功合成了LGC12修饰药物ART-LGC12。
实施例4：含LGC12修饰青蒿琥酯(ART)的纳米粒的制备及表征
用高分子包载实施例2制备的LGC12修饰药物，制备纳米粒。选用mPEG-DSPE、或以线粒体靶向基团三苯基膦(TPP)修饰的mPEG-DSPE作为包载分子，LGC12修饰药物和高分子按质量比为1:1,1:2,1:3,1:4,1:5,1:6，溶于1mL 无水DMF中，磁力搅拌并缓慢滴加5mL二次水，半小时后进行透析过夜(截留分子量3500)，离心取上清液即得到纳米粒子。通过动态光散射(DLS)来观测其粒径及zeta电位的变化。LGC12修饰药物ART-LGC12形成纳米粒子的条件优化结果分别如图5所示。
根据图5，ART-LGC12：mPEG-DSPE的最优比为1:4，
根据上述选取的最优条件(LGC12修饰药物和高分子的最优比)制备相应的纳米粒子，检测其粒径分布、进行TEM形貌观测。
最优条件下形成的纳米粒如图6所示，其中图6A是以mPEG-DSPE为包载分子制备的ART-LGC12纳米粒；图6B是以线粒体靶向基团三苯基膦(TPP)修饰的NH2-mPEG-DSPE作为包载分子制备的ART-LGC12-TPP纳米粒。纳米粒电镜图片如图7所示。上述结果表明，本申请制备的ART-LGC12纳米粒和 ART-LGC12-TPP纳米粒结构稳定、大小均匀。
实施例5：含ART-LGC12纳米粒中原药含量、担载率、包裹效率
1、方法
检测实施例4制备的纳米粒中ART的含量。通过紫外可见光谱(UV-Vis) 测定，先将样品在NaOH的乙醇溶液50℃处理半小时，测定溶液在292nm(ART) 处的紫外吸光度值，然后计算ART含量与紫外吸光度值的线性关系。先取纳米药物溶液1mL将其冻干，然后将冻干粉末样品用NaOH的乙醇溶液处理，测定在特征紫外吸收处的紫外吸光度值而计算得到ART含量；
ART的担载率及包裹效率通过如下公式计算：
担载率(％)＝[纳米粒中ART的含量/总纳米粒的质量]×100
包裹效率(％)＝[纳米粒中ART的含量/投入ART的质量]×100
2、结果
ART-LGC12纳米粒中青蒿琥酯的质量浓度和紫外吸收关系曲线，如图8所示。原药含量计算公式为Y＝1.973×X+0.02105；R2＝0.9996。测定在292nm处的紫外吸光度值而计算得到药物含量为448μM；担载率＝4.3％；包裹效率＝27.56％。
实施例6：含ART纳米粒的细胞毒性
检测实施例4制备的含ART的纳米粒对癌细胞的毒性。
1、方法
选取A549(人肺癌细胞)，A549DDP(人肺癌耐铂药细胞)，MCF7(人源乳腺癌细胞)，4T1(鼠源乳腺癌细胞)用于研究药物的细胞毒性问题。四种细胞均用DMEM(GIBCO)培养基培养。DMEM培养基中含有10％胎牛血清及1％青霉素链霉素混合液(100×)。
细胞毒性通过MTT法检测，具体步骤如下：
(1)待A549、A549DDP、MCF7和4T1细胞培养至对数期，用胰酶进行消化并计数。将细胞溶液稀释至5×104cells/mL；
(2)将预稀释的细胞接种到96孔板中，每孔100μL，然后放置培养箱中培养过夜；
(3)将ART、NPS(ART-LGC12)、NPS-TPP(ART-LGC12-TPP)分别按照一定的倍数稀释，加入到96孔板中，每孔加入10μL，使药物的最终ART浓度依次为100,50,25,12.5,1.25,0.125,0.0125μM。每个浓度设置四个复孔，培养时间为72h；
(4)将预配置好的10％MTT溶液用无酚红培养基稀释10倍加入到不同培养时间的96孔板中，每孔加入100μL，继续置于培养箱中培养4h,之后，每孔加入100μL SDS溶液，避光，在恒温培养箱中37℃放置12h；
(5)用酶标仪测定96孔板各孔在570nm处的吸光度OD值，选择背景波长为650nm，将三个复孔的OD值平均值作为目标样品的OD值，并计算细胞存活率：
Cell viability＝样品OD/空白对照组OD
2、结果
2.1含青蒿琥酯纳米粒的细胞毒性试验
采用MTT法测试NPS(ART-LGC12)，NPS-TPP(ART-LGC12-TPP)及ART的细胞毒性，考察时间为72h，ART-LGC12纳米粒的细胞毒性实验结果如图9所示。 IC50值如表1所示。
表1：NPS(ART-LGC12)、NPS-TPP(ART-LGC12-TPP)、ART对四种细胞的IC50 (μM)
Figure BDA0001938071390000091
根据上述三种药物NPS(ART-LGC12)，NPS-TPP(ART-LGC12-TPP)及ART 对四种细胞系的毒性作用，可知细胞毒性由强到弱依次为NPS-TPP (ART-LGC12-TPP)>NPS(ART-LGC12)>ART，说明高分子作为载体可以增强细胞对药物的内吞，且具有线粒体靶向的纳米粒能够进一步提高药物对癌细胞的毒性作用。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (5)

1.一种包含脂质修饰的药物的纳米粒子，所述包含脂质修饰的药物包括通过酰胺键共价连接的脂质部分和药物部分，所述脂质部分的结构式如式I所示；
所述药物部分为青蒿琥酯；
Figure FDA0002649891630000011
其中，n为7-17的整数；
所述纳米粒子通过以下方法制备：将mPEG-DSPE和所述脂质修饰的药物混合，溶解于无水DMF中，磁力搅拌并缓慢滴加二次水，透析过夜，离心取上清液即得包含脂质修饰的药物的纳米粒子。
2.如权利要求1所述的纳米粒子，其特征在于，所述n选自7、11或17。
3.如权利要求1或2所述的纳米粒子，其特征在于，所述脂质修饰的药物的制备方法包括：
(1)原药的活化；
(2)活化的原药与脂质发生酰胺缩合反应；
(3)洗涤、重结晶、冻干获得脂质修饰的药物。
4.如权利要求3所述的纳米粒子，其特征在于，所述脂质修饰的药物的制备方法包括：
(1)将具有游离羧基的原药以二氯甲烷溶解，加入2-3倍当量的EDC和NHS进行活化；
(2)向活化后的原药中加入N,N’-二-长链烷基-L-谷氨酸二酰胺进行酰胺缩合反应；
(3)反应结束后，经过洗涤、重结晶，冻干得到脂质修饰的药物。
5.权利要求1或2所述纳米粒子在以下方面的用途：
(1)制备治疗癌症的药物；
(2)制备线粒体靶向药物；
(3)制备毒副作用降低的前体药物。
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