CN102146338A - 一种基于金纳米棒聚合酶链反应自组装的拉曼传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于金纳米棒聚合酶链反应自组装的拉曼传感器的制备方法，属于纳米材料及核酸拉曼传感器制备技术领域。本发明主要的实施步骤为：（1）金纳米棒的制备，（2）金纳米棒的生长，（3）金纳米棒的定向修饰，（4）PCR组装过程，（5）基于金纳米棒自组装的核酸拉曼传感器的制备。本发明是基于金纳米棒端面-端面自组装的核酸拉曼传感器，这种自组装是基于聚合酶链反应进行的，通过金纳米棒端面的引物定向修饰，应用于PCR体系，经过PCR在金纳米粒子表面的扩增，将金棒进行可控的组装，并用于表面增强拉曼检测核酸的目的。
Description
技术领域
一种基于金纳米棒端面-端面自组装的核酸拉曼传感器的制备方法，这种自组装是基于聚合酶链反应进行的，属于纳米材料及核酸拉曼传感器制备技术领域。
背景技术
纳米材料由于尺寸小（1～100 nm），电子被局限于一个体积十分微小的空间，电子波函数受到限制，显示出许多奇异的特性，即它的光学、热学、电学、磁学、力学以及化学方面的性质和大块固体时相比将会有显著的不同。纳米材料的组装将会在单个纳米材料性质的基础上出现新的聚集体性质，纳米材料的组装是研究工作者长期以来一直关注的研究热点。以DNA为模板的纳米结构的组装是近几年发展起来的新兴研究领域，并在实际的医疗诊断和生物传感器等方面已经取得了相应的应用，因而吸引人们的广泛关注。由于DNA具有更完善和严密的分子识别功能，使得组装过程具有高度的选择性，由于双链DNA分子是由两条寡聚脱氧核苷酸单链通过碱基互补配对而形成的。用这种方法来实现不同种类及不同粒径的纳米粒子的组装已成为研究的热点，在制备特殊性质和要求的纳米器件等方面具有潜在的应用价值在纳米粒子的组装技术中，DNA分子作为一种组装的模板备受青睐。而基于金棒组装的DNA传感器是近年来发展起来的热点，这种技术首先要有可控的组装策略，从而引起金棒的光学如紫外，拉曼等信号与参与组装的DNA发生有规律的变化。这种变化关系可以用来作为一种目标检测的尺度。目前基于金棒组装的拉曼传感器的制备还缺少有效的方法，本发明填补了该领域的空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效的进行金纳米棒组装拉曼传感器的简便，可行的新型制备方法，这种金棒的自组装是基于PCR反应的可控自组装，即金纳米棒自组装包括端面-端面组装。
本发明的技术方案：一种基于金纳米棒聚合酶链反应自组装的拉曼传感器的制备方法，步骤为：
（1）金纳米棒的制备，金纳米棒的制备是利用金种子生长法。
金种子的合成：将2.5mL的0.0005M的氯金酸(HAuCl4)溶于2.5mL的0.2M的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）中，混合均匀，将0.3mL新配置、预冷的0.01M的硼氢化钠溶液快速加到上述溶液中，并强力混合2min，然后室温25℃放置2h，制得金种子，待用。
（2）金纳米棒的生长，生长溶液的配置：将0.15mL，0.004M的AgNO3，5mL，0.001M的HAuCl4溶液加到5mL，0.2M的CTAB溶液中，然后加入70μL的0.0788M的Vc，充分还原2min，加入12μL上述配置的金种子，充分搅拌20s后，于25℃静置，得金纳米棒，待用。
（3）金纳米棒的定向修饰。修饰方式为端面修饰，步骤（2）合成的金纳米棒，浓度2nM，进行10000r/min离心10min，离心沉淀物用0.005M的CTAB溶液重悬，重悬体积为原始体积的1/5，即相对于原始浓度进行5倍浓缩。以前端引物F或后端引物R︰金纳米棒以摩尔比80︰1的比例将F与R分别与浓缩后的金纳米棒进行金纳米棒的端面修饰，室温静置，修饰反应10h。修饰完的金纳米棒7000r/min离心10min，重悬于等体积的0.005M的CTAB溶液中，再次7000r/min离心10min，重悬于等体积的0.005M的CTAB溶液中，分别制备得到Au -F及Au -R修饰产物；
F为：5’-TGGCTGACCCTGATGAGTTCG-3’；
R为：5’-GGGCCATGATTACGCCAGTT-3’；
然后对Au-F及Au-R进行4-氨基苯硫醇（4-ATP）的修饰，引入拉曼讯号基团，修饰比例以4-ATP︰Au–F或Au-R摩尔比为80︰1，4-ATP的浓度为0.8μM，Au–F或Au-R浓度为10nM，反应8h，饰后的金纳米棒7000r/min离心10min，重悬于等体积的0.005M的CTAB溶液中，再离心一次，重悬于等体积的0.005M的CTAB溶液中，制得带拉曼讯号基团的Au–F-4-ATP，及Au –R-4-ATP待用；
（4）PCR组装过程
PCR：以λDNA为模板，采用制得的引物Au–F-4-ATP，及Au –R-4-ATP进行PCR。
PCR反应体系：dNTPs 1mL（购自上海生工），0.5mL的Taq DNA聚合酶（购自上海生工），λDNA模板质粒0.5mL（购自宝成生物工程有限公司），反应缓冲液（购自上海生工）5mL，分别取Au-F-4-ATP 4 mL和Au-R-4-ATP 4 mL，加灭菌水至总体积为50 mL；
扩增程序为：94℃ 预变性3 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1min，20个循环；72℃再延伸10 min；10℃保存，得PCR产物。
（5）基于金纳米棒自组装的核酸拉曼传感器的制备
分别配置0，0.61728ng/mL，1.852 ng/mL，5.5555 ng/mL，16.667 ng/mL，50 ng/mL的λDNA模板浓度，应用于金纳米棒PCR体系，进行扩增，产物用于进行核酸拉曼检测。
本发明的有益效果：本发明是基于金纳米棒端面-端面自组装的核酸拉曼传感器，这种自组装是基于聚合酶链反应进行的，通过金纳米棒端面的引物定向修饰，应用于PCR体系，经过PCR在金纳米粒子表面的扩增，将金棒进行可控的组装，并用于表面增强拉曼检测核酸的目的。
附图说明
图1基于金纳米棒组装的拉曼标准曲线。
具体实施方式
金纳米棒的制备，金纳米棒的制备是利用金种子生长法。
金种子的合成：将2.5mL的0.0005M的氯金酸(HAuCl4)溶于2.5mL的0.2M的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）中，混合均匀，将0.3mL新配置，预冷的0.01M的硼氢化钠溶液快速加到上述溶液中，并强力混合2min，然后室温25℃放置2h，待用。
金纳米棒的生长，生长溶液的配置：将0.15mL，0.004M的AgNO3，5mL、0.001M的HAuCl4溶液加到5mL、0.2M的CTAB中，然后加入70μL的0.0788M的Vc，充分还原2min，加入12μL上述配置的金种子，充分搅拌20s后，于25℃静置，待用。
金纳米棒的定向修饰。修饰方式为端面修饰，合成的金棒，浓度2nM，进行10000r/min离心10min，离心沉淀物用0.005M的CTAB溶液重悬，重悬体积为原始体积的1/5，即对相对于原始浓度进行5倍浓缩。将前端引物（F）与后端引物（R）分别与浓缩后的金棒以80︰1的比例，进行金棒的端面修饰，室温静置，修饰反应10h。修饰完的金棒离心两次，7000r/min离心10min，重悬于等体积的0.005M的CTAB溶液中。得到Au-F及Au-R修饰产物。前段引物的序列为：5’-TGGCTGACCCTGATGAGTTCG-3’；末端序列为：5’-GGGCCATGATTACGCCAGTT-3’。然后进行金棒的4-氨基苯硫醇（4-ATP）的修饰，修饰比例为80︰1，ATP的浓度为0.8μM，金棒浓度为10nM，反应8h，饰完的金棒离心两次，7000r/min离心10min，重悬于等体积的0.005M的CTAB溶液中。待用。
PCR组装过程
PCR：以λDNA为模板，采用制得的引物Au-F及Au-R进行PCR。
PCR反应体系：dNTPs 1mL（购自上海生工），0.5 mL的Taq DNA聚合酶（购自上海生工），λDNA模板质粒0.5mL（购自宝成生物工程有限公司），反应缓冲液（购自上海生工）5mL，分别取Au-F-4-ATP 4 mL和Au-R-4-ATP 4 mL，加灭菌水至总体积为50 mL；
扩增程序为：94℃ 预变性3 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1min，20个循环；72℃再延伸10 min；10℃保存，得PCR产物。
基于金棒自组装的核酸拉曼传感器的制备
分别配置0，0.61728ng/mL，1.852 ng/mL，5.5555 ng/mL，16.667 ng/mL，50 ng/mL的λDNA模板浓度，应用于金棒PCR体系，进行扩增，产物进行核酸拉曼检测。
F为：5’-TGGCTGACCCTGATGAGTTCG-3’
R为：5’-GGGCCATGATTACGCCAGTT-3’
Claims (1)
1.一种基于金纳米棒聚合酶链反应自组装的拉曼传感器的制备方法，其特征在于步骤为：
（1）金纳米棒的制备，金纳米棒的制备是利用金种子生长法；
金种子的合成：将2.5mL的0.0005M的氯金酸HAuCl4溶于2.5mL的0.2M的十六烷基三甲基溴化铵CTAB中，混合均匀，将0.3mL新配置、预冷的0.01M的硼氢化钠溶液快速加到上述溶液中，并强力混合2min，然后室温25℃放置2h，制得金种子，待用；
（2）金纳米棒的生长，生长溶液的配置：将0.15mL、0.004M的AgNO3，5mL、0.001M的HAuCl4溶液加到5mL、0.2M的CTAB溶液中，然后加入70μL的0.0788M的Vc，充分还原2min；加入12μL步骤（1）配制的金种子，充分搅拌20s后，于25℃静置，得金纳米棒，待用；
（3）金纳米棒的定向修饰，修饰方式为端面修饰，步骤（2）合成的金纳米棒，浓度2nM，进行10000r/min离心10min，离心沉淀物用0.005M的CTAB溶液重悬，重悬体积为原始体积的1/5，即相对于原始浓度进行5倍浓缩，以前端引物F或后端引物R︰金纳米棒以摩尔比80︰1的比例将F与R分别与浓缩后的金纳米棒进行金纳米棒的端面修饰，室温静置，修饰反应10h，修饰完的金纳米棒7000r/min离心10min，重悬于等体积的0.005M的CTAB溶液中，再次7000r/min离心10min，重悬于等体积的0.005M的CTAB溶液中，分别制备得到Au-F及Au-R产物；
F为：5’-TGGCTGACCCTGATGAGTTCG-3’；
R为：5’-GGGCCATGATTACGCCAGTT-3’；
然后对Au-F及Au-R进行4-氨基苯硫醇4-ATP的修饰，引入拉曼讯号基团，修饰比例以4-ATP︰Au–F或Au-R摩尔比为80︰1，4-ATP的浓度为0.8μM，Au–F或Au-R浓度为10nM，反应8h，饰后的金纳米棒7000r/min离心10min，重悬于等体积的0.005M的CTAB溶液中，再离心一次，重悬于等体积的0.005M的CTAB溶液中，制得带拉曼讯号基团的Au–F-4-ATP，及Au –R-4-ATP待用；
（4）PCR组装过程
PCR：以λDNA为模板，采用制得的引物Au–F-4-ATP，及Au –R-4-ATP进行PCR；
PCR反应体系：dNTPs 1mL，0.5 mL的Taq DNA聚合酶，λDNA模板质粒0.5mL，反应缓冲液5mL，分别取Au-F-4-ATP 4 mL和Au-R-4-ATP 4 mL，加灭菌水至总体积为50 mL；
扩增程序为：94℃ 预变性3 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1min，20个循环；72℃再延伸10 min；10℃保存，得PCR产物；
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