CN110878344A - 一种缩短pcr扩增时间的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种缩短PCR扩增时间的方法，属于生物技术领域。该方法包括以下步骤：将金属原子引入到PCR反应过程中，与PCR反应液一起进行扩增反应；其具体包括：将荧光探针嫁接到金属原子的表面，得到荧光探针修饰的金属原子，并将荧光探针修饰的金属原子代替荧光探针配制成PCR反应液进行扩增反应；或者将金属原子沉积在PCR反应腔体的表面上，得到沉积有金属原子的PCR反应腔体，并将PCR反应液分散在PCR反应腔体内进行扩增反应。本发明通过金属原子的等离子共振可以增强荧光强度，从而可以减少PCR观察荧光信号所需的循环数；同时，由于金属原子的光热效应，可以缩短PCR每个循环的变性和退火时间，从而可以缩短PCR每个循环的反应时间。

Description

一种缩短PCR扩增时间的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是一种缩短PCR扩增时间的方法。
背景技术
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种用于放大扩增特定的DN A片段的分子生物学技术。对任何一种PCR技术而言，PCR检测技术的效率都依赖于高效可靠的PCR循环，PCR反应循环由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成。
另外，实时荧光定量PCR(qPCR)是根据所发出的荧光信号来进行定性或定量计算，其通常需要经过足够多的PCR循环，才能得到满足荧光检测要求的荧光信号，这大大增加了PCR的扩增检测时间。另外，传统的qPCR孔板大多为96孔板或384孔板，反应体积为微升级别，其需要的循环时间也较长。
虽然，现有技术利用数字PCR(dPCR)系统，可以将反应的体积降至纳升到皮升级别，但是其还存在扩增时间较长的问题。此外，现有技术中利用PCR热循环系统的金属热板作为导热工具，通过提高金属热板的升降温速度来减少PCR每次循环的时间，但受升降温速度极限的限制，该方法还是存在PCR扩增时间较长的问题。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种缩短PCR扩增时间的方法，以解决上述背景技术中提出PCR扩增时间较长的问题。
为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
一种缩短PCR扩增时间的方法，其包括以下步骤：
将金属原子引入到PCR反应过程中，与PCR反应液一起进行扩增反应；
所述将金属原子引入到PCR反应过程中，与PCR反应液一起进行扩增反应的步骤，具体包括：
将荧光探针嫁接到金属原子的表面，得到荧光探针修饰的金属原子，并将荧光探针修饰的金属原子代替荧光探针配制成PCR反应液进行扩增反应；或者
将金属原子沉积在PCR反应腔体的表面上，得到沉积有金属原子的PCR反应腔体，并将PCR反应液分散在PCR反应腔体内进行扩增反应。
作为本发明实施例的一个优选方案，所述的金属原子为Au、Ag和Cu中的一种。需要说明的是，金属原子也可以选用Pt、Pd等，但不限于此。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述将荧光探针嫁接到金属原子的表面的步骤，具体包括：
将金属离子溶液与柠檬酸钠水溶液进行还原反应，得到金属粒子溶液；
分离上述金属粒子溶液，得到金属原子；
将金属原子分散到二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液中，得到分散液；
将上述分散液与荧光探针溶液进行混合，并添加缓冲液和氯化钠溶液进行搅拌，以将荧光探针嫁接到金属原子的表面。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述的金属原子为Au，所述的金属离子溶液为氯金酸溶液。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述氯金酸溶液中氯金酸与柠檬酸钠水溶液中柠檬酸钠的摩尔比为(250～350):1。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述分散液中金属原子与荧光探针溶液中探针的摩尔比为1:(50～100)。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述的缓冲液为TAE缓冲液。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液的摩尔浓度为2.5～4mmol/L。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述氯化钠溶液的摩尔浓度为2～4mol/L。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述将金属原子沉积在PCR反应腔体的表面上的方法包括原子层沉积方法、蒸发沉积方法和溅射沉积方法。
与现有技术相比，本发明实施例的有益效果是：
本发明实施例提供的一种缩短PCR扩增时间的方法，是利用将金属原子引入PCR反应过程中来实现的，其通过金属原子的等离子共振可以增强荧光强度，从而可以减少PCR观察荧光信号所需的循环数；同时，由于金属原子的光热效应，可以帮助PCR的反应体系快速升温，可以缩短PCR每个循环的变性和退火时间，从而可以缩短PCR每个循环的反应时间，以达到缩短PCR扩增时间的目的。
附图说明
图1为本发明实施例1得到的Au纳米粒子的透射电镜图。
图2为本发明实施例1提供的光照循环与PCR温度循环的关系图。
图3为本发明实施例1得到的荧光成像图。
图4为对比例1得到的荧光成像图。
图5为本发明实施例3得到的荧光成像图。
图6为对比例2得到的荧光成像图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，下述实施例中所涉及的设备和试剂未经特别注明的话，均是采用市售的设备和试剂。
实施例1
该实施例提供了一种缩短PCR扩增时间的方法，其包括以下步骤：
(1)在3mL浓度为40nmol/L的柠檬酸钠水溶液中加入30mL浓度为1mmol/L的氯金酸溶液，并置于25℃下进行反应1小时，然后在12000rpm下离心洗涤3次，得到柠檬酸钠保护的Au纳米粒子溶液，其电镜图如附图1所示，从图中可以看出，该Au纳米粒子的平均粒径在10nm左右，且尺寸分布均一。
(2)取15mL上述Au纳米粒子溶液，并向其中加入5mg的二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐(BSPP)进行搅拌24h后，再逐滴加入氯化钠溶液直到溶液变色，然后进行离心，倒出上清液后，再加入0.3mL浓度为2.5mmol/L的二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液，并用甲醇析出固体，此过程循环3次，即可得到Au粒子。
(3)将上述Au粒子分散到0.2mL浓度为2.5mmol/L二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液中，得到分散液。
(4)取13μL上述分散液与10μL的荧光探针溶液进行混合(其中，分散液中金属原子与荧光探针溶液中探针的摩尔比为1:50)，并添加3μL的10×TAE缓冲液搅拌24h后，再滴加2μL浓度为2mol/L的氯化钠溶液进行搅拌24h，然后，用200μL含有10mmol/L氯化镁的1×TAE缓冲液进行清洗4次，即可将荧光探针嫁接到金属原子的表面，得到荧光探针修饰的Au纳米粒子(Au-探针)。其中，荧光探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，为：(FAM)5'-TCCTTCTCAGTGTTTCTT-3'，但不限于此。
(5)取1μL浓度为300nmol/L的上述Au-探针、1μL的待扩增样品、1μL浓度为300nmol/L的引物对、8μL的PCR预混液(为臻准生物的市售产品)以及5μL水(不含核酸酶)进行混匀，得到PCR反应液。其中，引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2～3所示，分别为：F-5'-AGAGCGTCCCTGGCTTCTG-3'，R-5'-GAGAGCACCTCTCCACTAGAAAGG-3'，但不限于此。
(6)将上述PCR反应液分散进数字PCR芯片中，然后进行扩增反应，扩增程序如下表1所示。另外，在扩增反应上方，引入光照，光照波长可以是全光谱，也可以是金属的共振波长。光照循环与PCR温度循环的关系如附图2所示，即升温时打开光照，降温时关闭光照，通过金属原子的迅速散热，可以缩短降温时间，因此，通过该光照循环可以缩短PCR的循环时间。
表1
Figure BDA0002322007240000041
Figure BDA0002322007240000051
实施例2
该实施例提供了一种缩短PCR扩增时间的方法，其包括以下步骤：
(1)在3mL浓度为28nmol/L的柠檬酸钠水溶液中加入30mL浓度为1mmol/L的氯金酸溶液，并置于25℃下进行反应1小时，然后在12000rpm下离心洗涤3次，得到柠檬酸钠保护的Au纳米粒子溶液。
(2)取15mL上述Au纳米粒子溶液，并向其中加入4mg的二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐(BSPP)进行搅拌24h后，再逐滴加入氯化钠溶液直到溶液变色，然后进行离心，倒出上清液后，再加入0.3mL浓度为2.5mmol/L的二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液，并用甲醇析出固体，此过程循环3次，即可得到Au粒子。
(3)将上述Au粒子分散到0.2mL浓度为4mmol/L二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液中，得到分散液。
(4)取18μL上述分散液与10μL的荧光探针溶液进行混合(其中，分散液中金属原子与荧光探针溶液中探针的摩尔比为1:100)，并添加3μL的10×TAE缓冲液搅拌24h后，再滴加2μL浓度为4mol/L的氯化钠溶液进行搅拌24h，然后，用200μL含有10mmol/L氯化镁的1×TAE缓冲液进行清洗4次，即可将荧光探针嫁接到金属原子的表面，得到荧光探针修饰的Au纳米粒子(Au-探针)。其中，荧光探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，为：(FAM)5'-TCCTTCTCAGTGTTTCTT-3'，但不限于此。
(5)取1μL浓度为300nmol/L的上述Au-探针、1μL的待扩增样品、1μL浓度为300nmol/L的引物对、8μL的PCR预混液(为臻准生物的市售产品)以及5μL水(不含核酸酶)进行混匀，得到PCR反应液。其中，引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2～3所示，分别为：F-5'-AGAGCGTCCCTGGCTTCTG-3'，R-5'-GAGAGCACCTCTCCACTAGAAAGG-3'，但不限于此。
(6)将上述PCR反应液分散进数字PCR芯片中，然后进行扩增反应，扩增程序与实施例1相同。另外，在扩增反应上方，引入光照，光照波长可以是全光谱，也可以是金属的共振波长。光照循环与PCR温度循环的关系与实施例1相同，即升温时打开光照，降温时关闭光照，通过金属原子的迅速散热，可以缩短降温时间，因此，通过该光照循环可以缩短PCR的循环时间。
实施例3
该实施例提供了一种缩短PCR扩增时间的方法，其包括以下步骤：
(1)在PCR反应腔体(如数字PCR的微孔芯片等)表面，通过原子层沉积方式(可以采用市售的迈纳德沉积设备进行沉积)沉积金属Au原子，具体的沉积工艺如表2所示，沉积50个循环，Au膜厚度约为5nm。需要说明的是，沉积方式也可以采用蒸发沉积、溅射沉积等方式。
表2
Figure BDA0002322007240000061
(2)取1μL浓度为300nmol/L的荧光探针、1μL的待扩增样品、1μL浓度为300nmol/L的引物对、8μL的PCR预混液(为臻准生物的市售产品)以及5μL水(不含核酸酶)进行混匀，得到PCR反应液。其中，其中，荧光探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，为：(FAM)5'-TCCTTCTCAGTGTTTCTT-3'，但不限于此；引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2～3所示，分别为：F-5'-AGAGCGTCCCTGGCTTCTG-3'，R-5'-GAGAGCA CCTCTCCACTAGAAAGG-3'，但不限于此。
(3)将上述PCR反应液分散至上述沉积有Au的PCR反应腔体中，进行PCR扩增反应，扩增程序如下表3所示，并按照实施例1的光照与PCR温度循环的关系进行光照循环，即升温时打开光照，降温时关闭光照。
表3
Figure BDA0002322007240000071
实施例4
该实施例提供了一种缩短PCR扩增时间的方法，其包括以下步骤：
(1)在PCR反应腔体(如qPCR反应的84孔板)表面，通过原子层沉积方式(可以采用市售的迈纳德沉积设备进行沉积)沉积金属Ag原子，其中，沉积工艺与实施例3相同。
(2)取1μL浓度为300nmol/L的荧光探针、1μL的待扩增样品、1μL浓度为300nmol/L的引物对、8μL的PCR预混液(为臻准生物的市售产品)以及5μL水(不含核酸酶)进行混匀，得到PCR反应液。其中，其中，荧光探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，为：(FAM)5'-TCCTTCTCAGTGTTTCTT-3'，但不限于此；引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2～3所示，分别为：F-5'-AGAGCGTCCCTGGCTTCTG-3'，R-5'-GAGAGCA CCTCTCCACTAGAAAGG-3'，但不限于此。
(3)将上述PCR反应液分散至上述沉积有Au的PCR反应腔体中，进行PCR扩增反应，扩增程序与实施例3相同，并按照实施例1的光照与PCR温度循环的关系进行光照循环，即升温时打开光照，降温时关闭光照。
实施例5
该实施例提供了一种缩短PCR扩增时间的方法，其包括以下步骤：
(1)在PCR反应腔体(如qPCR反应的96孔板)表面，通过原子层沉积方式(可以采用市售的迈纳德沉积设备进行沉积)沉积金属Cu原子，其中，沉积工艺与实施例3相同。
(2)取1μL浓度为300nmol/L的荧光探针、1μL的待扩增样品、1μL浓度为300nmol/L的引物对、8μL的PCR预混液(为臻准生物的市售产品)以及5μL水(不含核酸酶)进行混匀，得到PCR反应液。其中，其中，荧光探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，为：(FAM)5'-TCCTTCTCAGTGTTTCTT-3'，但不限于此；引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2～3所示，分别为：F-5'-AGAGCGTCCCTGGCTTCTG-3'，R-5'-GAGAGCA CCTCTCCACTAGAAAGG-3'，但不限于此。
(3)将上述PCR反应液分散至上述沉积有Au的PCR反应腔体中，进行PCR扩增反应，扩增程序与实施例3相同，并按照实施例1的光照与PCR温度循环的关系进行光照循环，即升温时打开光照，降温时关闭光照。
对比例1
该对比例提供了一种传统的PCR扩增方法，其包括以下步骤：
(1)取1μL浓度为300nmol/L的荧光探针、1μL的待扩增样品、1μL浓度为300nmol/L的引物对、8μL的PCR预混液(为臻准生物的市售产品)以及5μL水(不含核酸酶)进行混匀，得到PCR反应液。其中，荧光探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，为：(F AM)5'-TCCTTCTCAGTGTTTCTT-3'；引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2～3所示，分别为：F-5'-AGAGCGTCCCTGGCTTCTG-3'，R-5'-GAGAGCACCTCTCCACTAGAAAG G-3'。
(2)将上述PCR反应液分散进数字PCR芯片中，然后进行扩增反应，扩增程序与实施例1相同。另外，在扩增反应上方，引入光照，光照波长可以是全光谱，也可以是金属的共振波长。光照循环与PCR温度循环的关系与实施例1相同，即升温时打开光照，降温时关闭光照。
对比例2
该对比例提供了一种传统的PCR扩增方法，其包括以下步骤：
(1)取1μL浓度为300nmol/L的荧光探针、1μL的待扩增样品、1μL浓度为300nmol/L的引物对、8μL的PCR预混液(为臻准生物的市售产品)以及5μL水(不含核酸酶)进行混匀，得到PCR反应液。其中，荧光探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，为：(F AM)5'-TCCTTCTCAGTGTTTCTT-3'；引物对的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2～3所示，分别为：F-5'-AGAGCGTCCCTGGCTTCTG-3'，R-5'-GAGAGCACCTCTCCACTAGAAAG G-3'。
(2)将上述PCR反应液分散进数字PCR芯片中，然后进行扩增反应，扩增程序与实施例3相同。另外，在扩增反应上方，引入光照，光照波长可以是全光谱，也可以是金属的共振波长。光照循环与PCR温度循环的关系与实施例1相同，即升温时打开光照，降温时关闭光照。
将实施例1和对比例1扩增后的数字PCR芯片放置于成像系统中进行荧光观察，得到的荧光成像图分别如附图3和附图4所示。从图中可以看出，实施例1得到的荧光成像中，阳性点的亮度明显要高于对比例1的，其说明通过使用荧光探针修饰的Au纳米粒子来代替普通荧光探针，可以有效提高荧光成像的亮度，即通过本发明实施例提供的方法可以在保证获得可检测的荧光情况下，缩短PCR扩增时间。
另外，将实施例3和对比例2扩增后的数字PCR芯片放置于成像系统中进行荧光观察，得到的荧光成像图分别如附图5和附图6所示。从图中可以看出，在进行相同时间的PCR循环情况下，实施例3获得荧光信号明显要强于对比例2的，因此，本发明实施例提供的方法，通过在数字PCR芯片等PCR反应腔体表面上沉积一层Au等金属原子后，可以在保证获得可检测的荧光情况下，缩短PCR扩增时间。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
序列表
<110> 臻准生物科技（上海）有限公司
<120> 一种缩短PCR扩增时间的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tccttctcag tgtttctt 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagcgtccc tggcttctg 19
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagagcacct ctccactaga aagg 24

Claims (10)

1.一种缩短PCR扩增时间的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将金属原子引入到PCR反应过程中，与PCR反应液一起进行扩增反应；
所述将金属原子引入到PCR反应过程中，与PCR反应液一起进行扩增反应的步骤，具体包括：
将荧光探针嫁接到金属原子的表面，得到荧光探针修饰的金属原子，并将荧光探针修饰的金属原子代替荧光探针配制成PCR反应液进行扩增反应；或者
将金属原子沉积在PCR反应腔体的表面上，得到沉积有金属原子的PCR反应腔体，并将PCR反应液分散在PCR反应腔体内进行扩增反应。
2.根据权利要求1所述的一种缩短PCR扩增时间的方法，其特征在于，所述的金属原子为Au、Ag和Cu中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种缩短PCR扩增时间的方法，其特征在于，所述将荧光探针嫁接到金属原子的表面的步骤，具体包括：
将金属离子溶液与柠檬酸钠水溶液进行还原反应，得到金属粒子溶液；
分离上述金属粒子溶液，得到金属原子；
将金属原子分散到二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液中，得到分散液；
将上述分散液与荧光探针溶液进行混合，并添加缓冲液和氯化钠溶液进行搅拌，以将荧光探针嫁接到金属原子的表面。
4.根据权利要求3所述的一种缩短PCR扩增时间的方法，其特征在于，所述的金属原子为Au，所述的金属离子溶液为氯金酸溶液。
5.根据权利要求4所述的一种缩短PCR扩增时间的方法，其特征在于，所述氯金酸溶液中氯金酸与柠檬酸钠水溶液中柠檬酸钠的摩尔比为(250~350):1。
6.根据权利要求3所述的一种缩短PCR扩增时间的方法，其特征在于，所述分散液中金属原子与荧光探针溶液中探针的摩尔比为1:(50~100)。
7.根据权利要求3所述的一种缩短PCR扩增时间的方法，其特征在于，所述的缓冲液为TAE缓冲液。
8.根据权利要求3所述的一种缩短PCR扩增时间的方法，其特征在于，所述二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液的摩尔浓度为2.5~4mmol/L。
9.根据权利要求3所述的一种缩短PCR扩增时间的方法，其特征在于，所述氯化钠溶液的摩尔浓度为2~4mol/L。
10.根据权利要求1所述的一种缩短PCR扩增时间的方法，其特征在于，所述将金属原子沉积在PCR反应腔体的表面上的方法包括原子层沉积方法、蒸发沉积方法和溅射沉积方法。
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