WO2015141856A1 - プローブ試薬および該プローブ試薬を用いたfish - Google Patents
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- C12Q1/6841—In situ hybridisation
Definitions
- the present invention relates to a probe reagent for FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) having a nucleic acid molecule having a reactive site that binds (hybridizes) to a gene on a chromosome and a phosphor-integrated nanoparticle, and FISH using the same .
- FISH Fluorescence In situ Hybridization
- Nanoparticles with integrated fluorescent dye (50-300 nm)” having biological recognition molecules are conventionally known (for example, Patent Document 1, paragraph [0035]). However, there is no description about solving the problem of genetic testing.
- a probe reagent for FISH Fluorescence In Situ Hybridization
- a BAC probe in which a plurality of low molecular weight dyes are bound to a nucleic acid sequence called a BAC (Bacterial Artificial Chromosome) clone has been used (for example, Patent Document 2, [ 0064]).
- a BAC probe Bacterial Artificial Chromosome
- Nick Translation reaction is known as a method for binding a low molecular dye, and in principle, a low molecular dye can be bonded to a site that is 1/4 of the number of nucleic acid sequences of a BAC clone.
- it was limited to bind a low molecular weight dye to a site of about 1/8 further improvement in sensitivity could not be expected in the genetic test by the FISH method using a conventional BAC probe.
- a probe reagent prepared from a BAC clone having a long DNA sequence of 80,000 to 1,000,000 bp was used (Patent Document 3).
- Patent Document 3 since such a long BAC clone is extracted after replication in E. coli, there is a problem of precision such as error generation, long and short lengths, impurities being mixed in, and the like.
- the present inventors have found that the binding ratio (labeling rate) of the low molecular weight fluorescent dye to the nucleic acid molecule. ) Has a limit, and attention was paid to the above problem that the target gene could not be detected due to insufficient brightness when detecting the fluorescence of the label. In addition, the inventors paid attention to the above-mentioned problem that false detection due to nonspecific adsorption occurs in FISH using a BAC probe.
- FISH probes having a short nucleic acid molecule having a base number of 5000 or less, particularly a short nucleic acid molecule having a base number of 4000 or less, or a short nucleic acid molecule having a base number of 500 or less are prepared.
- the target gene may not be detected due to insufficient fluorescence luminance.
- the present invention is a BAC probe having a labeling rate equal to or less than that of a conventional BAC probe, or a probe (eg, a probe derived from a BAC clone) having a labeling rate shorter than that of a BAC probe and having a labeling rate equal to or less than that of the conventional BAC probe.
- the object is to achieve a luminance higher than that of the BAC probe (Problem 1).
- the present invention as another aspect is Compared with the conventional BAC probe, it is a probe with a labeling rate that is shorter and equal to or less than that of the conventional BAC probe (for example, a probe derived from a BAC clone).
- An object of the present invention is to obtain the above-described probe that is unlikely to adversely affect hybridization (Problem 2). This is effective in the case of a BAC clone in which it is difficult to achieve a high labeling rate, and also effective in cases where only a short BAC clone is an option depending on the nucleic acid sequence to be detected.
- Another aspect of the present invention is that the FISH method stably suppresses non-specific adsorption, which tends to occur when a BAC probe prepared from a conventional long BAC clone is used.
- An object is to provide a probe reagent capable of obtaining a signal and to provide an FISH method using the probe reagent (Problem 3).
- the present inventors have found that the above-mentioned problem 1 can be solved by binding nanoparticles with integrated phosphors (hereinafter referred to as phosphor-integrated nanoparticles) to a predetermined BAC probe.
- the “bond” here includes not only a covalent bond but also a bond between biomolecules (eg, a bond between streptavidin and biotin).
- the present inventors bind phosphor-aggregated nanoparticles by a predetermined method at the end of a probe shorter than the BAC probe (eg, probe derived from BAC clone) and / or at 1 to 50 other than the end. Found that the above problems 2 and 3 could be solved.
- the present inventors performed a FISH hybridization treatment using a BAC probe with a low labeling rate or a probe with a labeling rate shorter and lower than that of the BAC probe.
- fluorescent staining of each hybridized nucleic acid molecule with phosphor-aggregated nanoparticles in which a plurality of phosphors are accumulated can prevent the fading of the phosphor, which is a more preferable embodiment of the present invention. As a result, the present invention has been completed.
- the probe reagent for in situ hybridization reflecting one aspect of the present invention comprises a phosphor-integrated nanoparticle formed by integrating phosphors and a nucleic acid having a predetermined nucleic acid sequence. It is a probe reagent for in situ hybridization in which molecules are bound.
- an in situ hybridization probe reagent reflecting one aspect of the present invention is capable of fluorescence with respect to a nucleic acid molecule having a predetermined nucleic acid sequence having a base number of 4000 or less. This is a probe reagent for in situ hybridization obtained by binding phosphor-integrated nanoparticles obtained by integrating the body by a nucleic acid end labeling method.
- a kit for a probe reagent for FISH reflecting one aspect of the present invention has a base sequence complementary to a sequence of a specific region on a chromosome.
- a probe reagent kit for FISH that separately comprises a nucleic acid molecule to which the biomolecules are linked and a phosphor-integrated nanoparticle to which a second biomolecule capable of specifically binding to the first biomolecule is linked is there.
- the first biomolecule and the second biomolecule may be directly bindable, or may be indirectly bindable via the third molecule / substance.
- the FISH probe reagent kit reflecting one aspect of the present invention has a sequence having a base number of 5000 or less complementary to the sequence of a specific region on a chromosome. Fluorescence in which the above-described nucleic acid molecule in which the first biomolecule is linked to the terminal end or 1 to 50 places other than the end and the second biomolecule capable of specifically binding to the first biomolecule are linked This is a probe reagent kit for FISH having separate body-integrated nanoparticles. At this time, the first biomolecule and the second biomolecule may be directly bindable, or may be indirectly bindable via the third molecule / substance.
- FISH reflecting one aspect of the present invention is FISH using the above probe reagent or kit.
- FISH reflecting one aspect of the present invention can be used to place a nucleic acid molecule having a BAC probe nucleic acid sequence and a plurality of first biomolecules linked on a chromosome. After performing hybridization on the sequence of a specific region, a plurality of phosphors linked with a second biomolecule capable of specifically binding to the first biomolecule are added to the hybridization reaction system, and the nucleic acid is added.
- FISH for fluorescently labeling molecules In order to achieve at least one of the above-described objects, the FISH reflecting one aspect of the present invention has a BAC probe sequence and the first biomolecule is at the end or 1 to 50 other than the end.
- Fluorescence in which a nucleic acid molecule having a base number of 5000 or less linked to is hybridized to a sequence of a specific region on a chromosome and then a second biomolecule capable of specifically binding to the first biomolecule is linked This is FISH in which a plurality of bodies are added to the hybridization reaction system to fluorescently label the nucleic acid molecules.
- a compound reflecting one aspect of the present invention is a compound used for the preparation of a probe reagent for in situ hybridization, and the phosphor is integrated.
- the phosphor-integrated nanoparticles and the nucleic acid molecule substrate are chemically bonded to each other.
- an in situ hybridization probe reagent reflecting one aspect of the present invention is a fluorescent nanoparticle (for example, 1 mol) per 1 mol of a nucleic acid molecule of a predetermined nucleic acid sequence. It is a probe reagent for in situ hybridization characterized in that 20000 mol or more of semiconductor nanoparticles etc. are bound.
- the probe reagent according to the present invention is a fluorescence in which a plurality of phosphors are integrated into a predetermined nucleic acid molecule derived from a BAC probe or a probe shorter than a BAC probe (eg, a probe derived from a BAC clone) to increase emission luminance.
- a BAC probe eg, a probe derived from a BAC clone
- This is a configuration in which body-integrated nanoparticles are combined. Therefore, even when the labeling rate is low, the detection accuracy of a specific gene can be increased when FISH is performed to stain a specific region of a chromosome, and a fluorescent signal with sufficient intensity for observation with a confocal microscope can be obtained.
- FIG. 1 is a diagram showing a manufacturing process for an example of a probe reagent according to the present invention.
- FIG. 1A is a diagram showing a manufacturing process for another example of the probe reagent according to the present invention.
- FIG. 2 is a diagram showing the FISH process using the probe reagent of FIG.
- FIG. 3 is a diagram showing another FISH process according to the present invention when a nucleic acid molecule bound to a specific region on a chromosome after FISH hybridization is fluorescently labeled with fluorescent aggregate nanoparticles.
- the FISH probe reagent according to the present invention is a probe reagent for in situ hybridization in which phosphor-integrated nanoparticles obtained by accumulating phosphors and nucleic acid molecules of a predetermined nucleic acid sequence are bound.
- the nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule having a sequence (probe sequence) including a part or all of a specific region on a chromosome.
- the nucleic acid includes naturally occurring nucleic acids such as DNA and RNA (mRNA, tRNA, miRNA, siRNA, non-coding-RNA and the like) and artificial nucleic acids such as PNA and LNA (or BNA: Bridged Nucleic Acid). Therefore, the nucleic acid molecule is not limited as long as it can form a complementary strand with the nucleic acid sequence on the chromosome.
- the nucleic acid molecule may be a natural nucleic acid, an artificial nucleic acid, or a nucleic acid molecule in which a natural nucleic acid and an artificial nucleic acid are linked.
- Biomarkers include diagnostic biomarkers, biomarkers that determine disease stages, disease prognostic biomarkers, and monitor biomarkers that are intended to see responses to therapeutic treatments.
- HER2, TOP2A, HER3, EGFR, P53, MET, etc. are mentioned as genes related to cancer growth and the response rate of molecular target drugs.
- the following are mentioned as a gene known as a cancer related gene.
- Tyrosine kinase-related genes include ALK, FLT3, AXL, FLT4 (VEGFR3, DDR1, FMS (CSF1R), DDR2, EGFR (ERBB1), HER4 (ERBB4), EML4-ALK, IGF1R, EPHA1, INSR, EPHA2, IRR (INSRR) ), EPHA3, KIT, EPHA4, LTK, EPHA5, MER (MERTK), EPHA6, MET, EPHA7, MUSK, EPHA8, NPM1-ALK, EPHB1, PDGFR ⁇ (PDGFRA), EPHB2, PDGFR ⁇ (PDGFRB), PD-L1, PD-L1 , LGR5, EPHB3, RET, EPHB4, RON (MST1R), FGFR1, ROS (ROS1), FGFR2, TIE2 (TEK), FGFR3, TRKA (NTR) K1), FGFR4, TRKB (NTRK2), FLT1 (VEGFR1), TRKC (NTRK3) and
- Liver cancer-related genes include Axin1, MALAT1, b-catenin, p16 INK4A, c-ERBB-2, p53, CTNNB1, RB1, Cyclin D1, SMAD2, EGFR, SMAD4, IGFR2, TCF1, and KRAS.
- genes related to kidney cancer include Alpha, PRCC, ASPSCR1, PSF, CLTC, TFE3, p54nrb / NONO, and TFEB. , AKAP10, NTRK1, AKAP9, RET, BRAF, TFG, ELE1, TPM3, H4 / D10S170, TPR and the like.
- Examples of ovarian cancer-related genes include AKT2, MDM2, BCL2, MYC, BRCA1, NCOA4, CDKN2A, p53, ERBB2, PIK3CA, GATA4, RB, HRAS, RET, KRAS, and RNASET2.
- Examples of prostate cancer-related genes include AR, KLK3, BRCA2, MYC, CDKN1B, NKX3.1, EZH2, p53, GSTP1, and PTEN.
- Examples of bone tumor-related genes include CDH11, COL12A1, CNBP, OMD, COL1A1, THRAP3, COL4A5, and USP6.
- the probe sequence is preferably designed to include a unique sequence in a specific region on the chromosome to be detected.
- the sequence of the BAC clone library of “Cancer cell lines BACS” containing the sequence of the cancer (original) gene is suitable.
- the probe sequence when detecting a normal structural gene, it is preferable not to include a gene sequence portion in which the copy number is polymorphic, such as indel, VNTR (Variable Number of Tandem Repeat), and microsatellite.
- the number of copies of a normal gene per cell (nucleus) is 1 to 2, so the number of copies estimated from the number of bright spots of the phosphor is 3 or more. Is abnormal in the chromosome to which the gene is amplified. Conversely, when the copy number is 0, it can be determined that an abnormality in the chromosome in which the gene is defective has occurred. If the polymorphic gene sequence as described above is included in the probe sequence, the number of bright spots of the phosphor will not match the copy number of the specific gene of interest, which will hinder the detection of the copy number as described above. Come on.
- a specific base for example, thymine (T)
- a biotin-labeled nucleotide for example, Biotin-16-dUTP in the above example
- the number of specific bases in the nucleic acid molecule is the number of bright spots and intensity of light emission when FISH is performed. Therefore, the probe sequence may be designed by determining a specific base in the nucleic acid molecule in consideration of the number of bright spots and the intensity of light emission.
- the phosphor-aggregated nanoparticle is bound to the nucleic acid molecule in a mode different from the above (for example, when the phosphor-aggregated nanoparticle is bound only to the 5 ′ end of the nucleic acid molecule), There is no need to consider the number of bases.
- nucleic acid molecules if the number of bases of the nucleic acid molecule is several tens of bases, submit the nucleic acid molecule sequence data including the probe sequence and request the nucleic acid synthesis contract service such as Funakoshi to obtain the nucleic acid molecule It is preferable to do.
- the number of bases of a nucleic acid molecule is large (for example, when it exceeds 1000 bases), it can be synthesized as described above.
- the nucleic acid molecule is correctly formed by sequencing the base sequence. For example, the following may be performed on the premise of confirming whether or not. Probes designed and created by various techniques are generally called DNA probes if the nucleic acid sequence is DNA, and RNA probes if the nucleic acid sequence is RNA.
- a primer is designed and synthesized so as to sandwich a probe sequence portion contained in the genomic DNA of the organism to be detected, and genomic DNA (or the above BAC clone library is used) using this primer set.
- PCR method using pfu DNA polymerase with high replication accuracy is performed.
- the PCR reaction solution is separated by electrophoresis, and a band corresponding to the length of the target nucleic acid molecule is cut out and eluted using a nucleic acid purification kit (kit such as MonoFas (registered trademark) DNA purification kit I).
- kit such as MonoFas (registered trademark) DNA purification kit I
- a plasmid containing a nucleic acid molecule sequence (BAC plasmid, etc.) is transformed into E. coli (E. coli HST08 Premium Electro-Cells (Takara Bio Inc.), etc.), cultured (amplified), and collected.
- the nucleic acid is extracted, and the portion corresponding to the nucleic acid molecule is excised with a predetermined restriction enzyme, and subjected to electrophoresis and nucleic acid purification as described above.
- a probe having a sequence that can be used as a probe is artificially produced using an artificial nucleic acid such as PNA or LNA (or BNA: Bridged Nucleic Acid). Nucleic acid molecules can also be obtained by synthesis.
- the phosphor-integrated nanoparticles are obtained by accumulating phosphors. By using such phosphor-integrated nanoparticles, the amount of fluorescence emitted per particle, that is, the brightness of a bright spot for labeling a predetermined biomolecule can be increased as compared with the phosphor itself.
- the term “phosphor” refers to a general substance that emits light in a process from an excited state to a ground state by being excited by irradiation with external X-rays, ultraviolet rays, or visible rays. Therefore, the “phosphor” in the present invention is not limited to the transition mode when returning from the excited state to the ground state, but is a substance that emits narrowly defined fluorescence that is light emission accompanying deactivation from the excited singlet. It may be a substance that emits phosphorescence, which is light emission accompanying deactivation from a triplet.
- the “phosphor” referred to in the present invention is not limited by the light emission lifetime after blocking the excitation light. Therefore, it may be a substance known as a phosphorescent substance such as zinc sulfide or strontium aluminate. Such phosphors can be broadly classified into organic phosphors (fluorescent dyes) and inorganic phosphors.
- organic phosphors examples include fluorescein dye molecules, rhodamine dye molecules, Alexa Fluor (registered trademark, manufactured by Invitrogen Corporation) dye molecules, BODIPY (registered trademark, manufactured by Invitrogen Corporation) dyes Molecule, cascade (registered trademark, Invitrogen) dye molecule, coumarin dye molecule, NBD (registered trademark) dye molecule, pyrene dye molecule, Texas Red (registered trademark) dye molecule, cyanine dye molecule, perylene dye Examples thereof include substances known as organic fluorescent dyes, such as dye molecules and oxazine dye molecules.
- inorganic phosphor examples include quantum dots containing II-VI group compounds, III-V group compounds, or group IV elements as components ("II-VI group quantum dots", " Or III-V quantum dots ”or“ IV quantum dots ”). You may use individually or what mixed multiple types. The quantum dots may be commercially available.
- CdSe CdS, CdS, CdTe, ZnSe, ZnS, ZnTe, InP, InN, InAs, InGaP, GaP, GaAs, Si, and Ge, but are not limited thereto.
- a quantum dot having the above quantum dot as a core and a shell provided thereon.
- the core is CdSe and the shell is ZnS
- CdSe / ZnS when the core is CdSe and the shell is ZnS, it is expressed as CdSe / ZnS.
- CdSe / ZnS, CdS / ZnS, InP / ZnS, InGaP / ZnS, Si / SiO 2 , Si / ZnS, Ge / GeO 2 , Ge / ZnS, and the like can be used, but are not limited thereto.
- Quantum dots may be subjected to surface treatment with an organic polymer or the like as necessary.
- organic polymer or the like as necessary. Examples thereof include CdSe / ZnS having a surface carboxy group (manufactured by Invitrogen), CdSe / ZnS having a surface amino group (manufactured by Invitrogen), and the like.
- the method for producing the phosphor-integrated nanoparticles in which the phosphor is integrated is not particularly limited, and can be produced by a known method. In general, a production method can be used in which phosphors are gathered together using a resin or silica as a base material (the phosphors are immobilized inside or on the surface of the base material).
- the particle diameter of the phosphor-integrated nanoparticles is not limited as long as the average particle diameter is within a range in which fluorescence observation is possible, but from the viewpoint of preferably performing fluorescence observation, the average particle diameter of the phosphor-integrated nanoparticles is 40 nm to 300 nm. Preferably there is.
- the average particle size of the produced phosphor-integrated nanoparticles can be measured by a method known in the art. For example, gas adsorption method, light scattering method, X-ray small angle scattering method (SAXS), transmission electron It can be measured by a method of measuring an average particle diameter by observing with a microscope (TEM) or a scanning electron microscope (SEM). When using a TEM, when the particle size distribution is wide, it is necessary to pay attention to whether or not the particles entering the field of view represent all the particles. In the adsorption method, the BET surface area is evaluated by N 2 adsorption or the like.
- Examples of a method for producing phosphor-integrated nanoparticles using organic phosphors include a method of forming resin particles having a diameter of nanometer order by fixing a fluorescent dye, which is a phosphor, inside or on the surface of a matrix made of resin. Can do.
- the method for preparing the phosphor-integrated nanoparticles is not particularly limited.
- a (co) monomer for synthesizing a resin (thermoplastic resin or thermosetting resin) that forms the matrix of the phosphor-integrated nanoparticles While (co) polymerizing the phosphor, a method of adding the phosphor and incorporating the phosphor into the inside or the surface of the (co) polymer can be used.
- thermoplastic resin for example, polystyrene, polyacrylonitrile, polyfuran, or a similar resin
- thermosetting resin for example, polyxylene, polylactic acid, glycidyl methacrylate, polymelamine, polyurea, polybenzoguanamine, polyamide, phenol resin, polysaccharide or similar resin
- Thermosetting resins, particularly melamine resins are preferred in that elution of the dye encapsulated in the dye resin can be suppressed by treatments such as dehydration, penetration, and encapsulation using an organic solvent such as xylene.
- polystyrene nanoparticles encapsulating an organic fluorescent dye can be obtained by a copolymerization method using an organic dye having a polymerizable functional group described in US Pat. No. 4,326,008 (1982), or US Pat. No. 5,326,692 (1992). ), And the method of impregnating polystyrene nanoparticles with a fluorescent organic dye is described.
- silica nanoparticles in which an organic phosphor is immobilized inside or on the surface of a matrix made of silica can also be produced.
- the method for synthesizing FITC-encapsulated silica nanoparticles described in Langmuir Vol. 8, Vol. 2921 (1992) can be referred to.
- Various fluorescent dye-containing silica nanoparticles can be synthesized by using a desired fluorescent dye instead of FITC.
- Examples of a method for producing phosphor-integrated nanoparticles using an inorganic phosphor include a method of forming silica nanoparticles in which quantum dots, which are phosphors, are fixed inside or on the surface of a matrix made of silica. This production method can be referred to the synthesis of CdTe-containing silica nanoparticles described in New Journal of Chemistry Vol. 33, p. 561 (2009).
- the silica nanoparticles are treated with a silane coupling agent to aminated the terminal, and the semiconductor nanoparticles as a phosphor having a carboxyl group terminal are formed on the surface of the silica beads.
- phosphors are accumulated by bonding with an amide bond to form phosphor-integrated nanoparticles.
- a reverse micelle method and a mixture of organoalkoxysilane and alkoxide having an organic functional group with good adsorptivity to semiconductor nanoparticles at the molecular end as a glass precursor are used.
- glass-like particles in which semiconductor nanoparticles are dispersed and fixed are formed to form phosphor-integrated nanoparticles.
- EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
- an aggregate in which an inorganic phosphor is immobilized inside or on the surface of a matrix made of resin can be made using the method of impregnating quantum nanoparticles into polystyrene nanoparticles described in Nature Biotechnology Vol. 19, p. 631 (2001).
- the binding between the nucleic acid molecule and the phosphor-integrated nanoparticles is not particularly limited as long as FISH does not hinder, and various bindings can be made.
- the binding between the nucleic acid molecule and the phosphor-integrated nanoparticle may be either a method in which the phosphor-integrated nanoparticle is directly bound to the nucleic acid molecule or a method in which the nucleic acid molecule is indirectly bound through binding between biomolecules.
- a hydroxyl group of phosphate bound to the ribose C5 position at the 5 ′ end of the nucleic acid molecule or a hydroxyl group bound to the C1 position of the ribose at the 3 ′ end of the nucleic acid molecule can be obtained using a known thiol group introduction reagent Examples include a method in which phosphor-assembled nanoparticles substituted with a thiol group (SH group) and labeled with maleimide are reacted to bond both.
- the binding at the 5 ′ end of the former is specifically performed as follows, for example.
- SH-GTP and Terminal transferase are added to a nucleic acid molecule and incubated at 37 ° C. for 30 minutes to introduce a thiol group at the 5 ′ end of the nucleic acid molecule.
- phosphorescent integrated nanoparticles labeled with maleimide are added to the solution of nucleic acid molecules and incubated at 65 ° C. for 30 minutes, whereby the nucleic acid molecules and the maleimide groups are coupled with each other through coupling of thiol groups and maleimide groups.
- the phosphor-integrated nanoparticles are linked.
- This binding can be suitably performed according to the protocol using a kit of “5 ′ EndTag (application trademark) Nucleic Acid Labeling System” manufactured by Vector Laboratories, for example.
- the latter binding at the 3 ′ end is carried out by the same reaction mechanism as the binding at the 5 ′ end, and can be suitably performed using a kit of “3 ′ End Tag DNA Labeling System” manufactured by Vector Laboratories.
- a nucleic acid molecule having an alkynyl group obtained by alkyne modification of DNA by nick translation or terminal modification and a phosphor-integrated nanoparticle having an azide group (N 3 ) in the presence of a copper salt.
- a method of bonding by azide-alkyne cycloaddition (a method using so-called click chemistry).
- azidation of the phosphor-aggregated nanoparticles can be performed using a known azidation reagent (diazo group transfer reagent).
- the binding between the nucleic acid molecule and the phosphor-integrated nanoparticles was performed using a protocol (Lumiprobe, “Protocol: Click-Chemistry Labeling of Oligonucleoline,” “Alkyne Phosphoramidite 5′-terminal” manufactured by Lumiprobe, Inc.). [Search Year / January 13, 2014], Internet, ⁇ URL;http://www.lumiprobe.com/protocols/click-chemistry-dna-labeling>).
- dUTP and phosphor-integrated nanoparticles are directly bonded.
- “Amino-11-dUTP” manufactured by Lumi Probe Co., Ltd. is first mixed with N-succinimidyl S-acetylthioacetate (SATA) and subjected to thiol group addition treatment, followed by filtration through a gel filtration column. To obtain a Thiol-11-dUTP solution.
- the phosphor-integrated nanoparticles having maleimide groups attached thereto and the Thiol-11-dUTP solution are mixed and reacted with EDTA in PBS to obtain phosphor-integrated nanoparticles to which dUTP is bound. be able to.
- the phosphor-integrated nanoparticles can be directly bound to the nucleic acid molecule.
- the method of indirectly binding is a method of binding a nucleic acid molecule and a phosphor-integrated nanoparticle via a bond between biomolecules (first and second biomolecules).
- biomolecules first and second biomolecules.
- streptavidin as a first biomolecule and biotin as a second biomolecule as a bond between biomolecules
- biotin as follows, for example. This is achieved by preparing a nucleic acid molecule and a phosphor-aggregated nanoparticle modified with streptavidin and binding them together.
- Examples of a method for preparing a nucleic acid molecule labeled with a first biomolecule include the following methods.
- First biomolecule such as biotin
- a method for preparing a nucleic acid molecule labeled with a first biomolecule include the following methods.
- First biomolecule such as biotin
- a specific base (for example, thymine (T)) of a nucleic acid molecule is replaced with a nucleotide (for example, Biotin-16-dUTP) labeled with a first biomolecule (for example, biotin) by nick translation.
- a method of binding phosphor-integrated nanoparticles having (strept) avidin to biotin of this nucleic acid molecule can be exemplified.
- the nick translation is performed according to a conventional method (for example, “cell engineering separate volume / experiment protocol series FISH experimental protocol”, Part 2, Chapter 2, Kenichi Matsubara et al., Shujunsha, 1994, etc.) Nucleotides (such as “biotin-16-dUTP” manufactured by Boehringer) can be used.
- Nucleotides such as “biotin-16-dUTP” manufactured by Boehringer
- the following methods (2-1) to (2-2) in which a first biomolecule (such as biotin) is introduced at the end (5 ′ end or 3 ′ end) of a nucleic acid molecule Can be illustrated.
- a second bond capable of binding to the first binding group by introducing a first binding group (eg, thiol group) to the 5 ′ end or 3 ′ end of the nucleic acid molecule using a kit or the like.
- a molecule having a group eg, maleimide group
- a molecule having a first biomolecule eg, biotin
- the probe (nucleic acid molecule) and the phosphor-integrated nanoparticle can be bound by reacting the nucleic acid molecule with a phosphor-integrated nanoparticle having a second biomolecule (eg, avidin).
- examples of the molecule include a linker of a hydrophilic polymer (eg, PEG) having a maleimide group at one end and biotin at the other end.
- a linker of a hydrophilic polymer eg, PEG
- the phosphor-integrated nanoparticles having streptavidin are bound to biotin at the other end of the linker, thereby indirectly fluorescence to the nucleic acid molecule.
- Body-integrated nanoparticles can be bound.
- kits are kits of “5 ′ EndTag (application trademark) Nucleic Acid Labeling System”.
- linker for example, cord PG2-BNML-10k, PG2-BNML-5k, PG2-BNML3k, PG2-BNML-2k, PG2-BNML-1k, etc. of Biotin PEG Maleimide (Nanocs) may be used. it can.
- the phosphor-integrated nanoparticles modified with the second biomolecule can be prepared, for example, as follows.
- a functional group is introduced into each of the phosphor-integrated nanoparticles and the second biomolecule by a reagent that introduces a functional group, and the second biomolecule and the phosphor-integrated nanoparticles are bonded through the bonding between the functional groups. .
- a linker may be interposed between these functional groups.
- functional group combinations include NHS ester group-amino group, thiol group-maleimide group combination, and the like.
- the linker include linkers such as EMCS (N- [Epsilon-Maleimidocaproyloxy] succinimide ester) (manufactured by Thermo Scientific).
- the labeling rate of the phosphor with respect to the nucleic acid molecule is represented by (number of phosphor molecules bound to the nucleic acid molecule / total number of bases of one molecule of the nucleic acid molecule) ⁇ 100 (%).
- the labeling rate is not particularly limited as long as the fluorescence signal can be observed with a fluorescence microscope in FISH without saturation, but the labeling rate is preferably 13.33% or less, more preferably 0. .46 to 13.33%.
- the labeling rate is 0.46% or less includes an example in which one phosphor-integrated nanoparticle is bonded to the end of the nucleic acid molecule. In this case, the lowest labeling rate is obtained.
- nucleic acid molecule is fluorescently labeled using a single phosphor-integrated nanoparticle as described above, from the viewpoint of increasing the reactivity of the nucleic acid molecule by reducing the use of phosphor-integrated nanoparticles that are not originally possessed by the nucleic acid molecule Is preferable.
- the “biotin labeling rate” described later is the same as the labeling rate of the phosphor with respect to the nucleic acid molecule.
- the biotin labeling rate in the present application is referred to as a high biotin labeling rate when the biotin labeling rate exceeds 8%, and the biotin labeling rate is referred to as a low biotin labeling rate.
- the biotin labeling rate can be confirmed by, for example, using “Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit” manufactured by Thermo Scientific, in a state where HABA is bound to the fluorescent streptavidin with the biotin of the BAC probe. This can be confirmed by using the HABA-avidin method to be substituted.
- the molar ratio of the binding between the nucleic acid molecule and the phosphor-integrated nanoparticle is not particularly limited as long as the fluorescence signal is not saturated and can be observed with a bright spot in a fluorescence microscope observation in FISH, but the nucleic acid molecule: the fluorescence
- a preferred molar ratio of the body-integrated nanoparticles is 1: 1 to 1: 5000, more preferably 1: 1 to 1: 2000, more preferably 1: 1 to 1: 550, and even more preferably 1: 1 to 1: 100. More preferably, it is 1: 1 to 1:40.
- At least one phosphor-integrated nanoparticle is required per molecule of nucleic acid, and 100 phosphors or phosphors per molecule of nucleic acid in order to be able to observe a fluorescent signal with sufficient luminance. It is sufficient that the integrated nanoparticles are bound. Even when a plurality of phosphors or phosphor-integrated nanoparticles are bonded per nucleic acid molecule, they are observed as one bright spot, and it can be determined that one copy of the gene to be detected exists. it can.
- the probe reagent having a nucleic acid molecule: phosphor-integrated nanoparticle (molar ratio) in the range of 1: 3 to 1: 5000 (eg, 1: 3 to 1: 550) is a guanine (in the base sequence of the nucleic acid molecule).
- the nucleic acid molecule is nick-translated including the nucleotide substrate (Biotin-16-dUTP in the above example) to which the first biomolecule (biotin or the like) is bound, thereby producing 3 to 5000 (above In the case of the example, a nucleic acid molecule having 3 to 550) first biomolecules (such as biotin) is formed, and a second biomolecule (such as streptavidin or the like) is formed with respect to the first biomolecule (such as biotin). ) It can be carried out by binding a fluorescent integrated nanoparticles.
- the nucleic acid molecule: phosphor accumulation may be performed in the same manner as described above by performing nick translation using a nucleotide substrate conjugated with phosphor-integrated nanoparticles instead of the nucleotide substrate to which the first biomolecule is bound.
- a probe reagent having nanoparticles (molar ratio) 1: 3 to 1: 5000 (in the above example, 1: 550) can be prepared.
- the number of specific bases in the nucleic acid molecule labeled with the first biomolecule can be adjusted by changing the substrate concentration during nick translation. Specifically, for example, if there are 300 thymines (T) in a nucleic acid molecule, and about 100 of them are to be replaced with Biotin-16-dUTP, the dUTP included in the nucleotide substrate used for nick translation The ratio of the substitution can be adjusted by appropriately adjusting the ratio of Biotin-16-dUTP.
- nucleotide substrate for labeling with biotin examples include the following.
- adenine (ATP) in a nucleic acid molecule and labeling with biotin Biotin-11-dATP, Biotin-14-dATP, Bio-7-dATP (Biotin-7-2'-deoxyadenosine-) is used as the nucleotide substrate.
- 5′-triphosphate), BIOTIN-N6-ATP, and the like can be used.
- cytosine CTP
- Biotin-14-dCTP Biotin-11-dCTP, or the like
- TTP thymine
- Biotin-16-dUTP Biotin-11-dUTP
- Biotin-aha-dUTP Biotin-dUTP
- guanine Biotin-11-dGTP or the like can be used as the nucleotide substrate.
- Confirmation of the molar ratio of the synthesized probe reagent nucleic acid molecule: phosphor-integrated nanoparticles is performed, for example, by subjecting the synthesized probe reagent to a gel filtration column to perform molecular weight fractionation, and for each fraction solution, phosphor-assembled nanoparticles.
- the fraction in which both the fluorescent aggregate nanoparticle and the nucleic acid molecule are present is a fraction of a molecular weight range that can be theoretically taken when the molar ratio of the probe reagent is 1: 3 to 1: 100. It can be confirmed by determining whether or not it is the image position.
- a desired DNA probe fraction of the molecular weight fraction may be collected.
- the molar ratio of the synthesized probe reagent nucleic acid molecule: phosphor-integrated nanoparticles can be calculated by a method different from the above. Specifically, when the binding between the nucleic acid molecule and the phosphor-integrated nanoparticle is performed using the binding of streptavidin biotin, the biotin labeling rate of the nucleic acid molecule is calculated by the HABA-avidin method as described above. : [Total number of bases of nucleic acid molecule ⁇ biotin labeling rate (%) / 100%].
- Probe reagent for ISH containing semiconductor nanoparticles Another probe reagent for in situ hybridization according to the present invention is characterized in that 20000 mol or more of semiconductor nanoparticles are bound to 1 mol of a nucleic acid molecule having a predetermined nucleic acid sequence.
- the semiconductor nanoparticles are smaller in particle size than one phosphor-integrated nanoparticle and have a lower light emission luminance than one particle. Therefore, unlike the phosphor-integrated nanoparticles, the semiconductor nanoparticle has one mole of nucleic acid molecule.
- a semiconductor nanoparticle bonded with at least 20000 mol or more as a FISH probe By using a semiconductor nanoparticle bonded with at least 20000 mol or more as a FISH probe, a bright spot can be observed not only with a confocal microscope but also with a fluorescence microscope when FISH is performed.
- the semiconductor nanoparticles have a particle size smaller than that of the phosphor-integrated nanoparticles, the semiconductor nanoparticles and the nucleic acid molecules are bonded within the range of the molar ratio of the bond.
- FISH FISH is performed using the obtained probe, there is an advantage that adverse effects on hybridization between the target nucleic acid molecule (eg, HER2 gene in a tissue section) and the probe can be suppressed to a low level.
- nucleic acid molecule As the nucleic acid molecule, the nucleic acid molecule described when the probe reagent having phosphor-integrated nanoparticles is described above can be used, and the description thereof is omitted.
- semiconductor nanoparticles for example, the above-described quantum dots can be used, and specifically, “Qdot (registered trademark)” (manufactured by Invitrogen) or the like can be used.
- the particle diameter of the semiconductor nanoparticles is not limited as long as the average particle diameter is within a range in which fluorescence observation can be performed with a fluorescence microscope when FISH is performed with a probe reagent bonded to a nucleic acid molecule within the range of the above binding molar ratio. 40 nm, which is smaller than the average particle size of the phosphor-integrated nanoparticles, from the viewpoint of not adversely affecting the hybridization between the nucleic acid molecule of the target and the target gene to be detected (eg, HER2 gene in the tissue section).
- the particle size is less than 10 to 20 nm.
- the binding between the nucleic acid molecule and the semiconductor nanoparticle is not particularly limited as long as FISH does not hinder, and various bindings can be made.
- the binding between the nucleic acid molecule and the semiconductor nanoparticle may be either a method in which the semiconductor nanoparticle is directly bonded to the nucleic acid molecule in the above molar ratio range or a method in which the nucleic acid molecule is indirectly bonded through the binding between biomolecules.
- Direct bonding method examples include, for example, nick translation for a nucleic acid molecule using a nucleic acid substrate having a first binding group (eg, maleimide), and introducing the first binding group into the nucleic acid molecule.
- a quantum dot having a second bonding group for example, a thiol group
- the nucleic acid substrate having a maleimide group for example, a product purchased by requesting commissioned synthesis from Gene Research Laboratories, Japan, etc. can be used.
- a nucleic acid molecule (particularly, the number of bases of nucleic acid 20,000 is used) using a nucleic acid substrate (eg, dUTP-biotin described above) having a first biomolecule (eg, biotin).
- a nucleic acid substrate eg, dUTP-biotin described above
- a first biomolecule eg, biotin
- the first biomolecule is introduced into the nucleic acid molecule
- the quantum dot having the second biomolecule eg, streptavidin, etc.
- the first biomolecule and the second biomolecule may be directly bindable, or may be bindable via the third molecule / substance.
- the molar ratio of the bond between the nucleic acid molecule and the semiconductor nanoparticle is such that at least 20000 mol of the semiconductor nanoparticle is bonded to 1 mol of the nucleic acid molecule, so that the probe reagent for FISH having the semiconductor nanoparticle is present.
- the FISH is performed using the above, it is possible to secure a luminance enough to observe a sufficient bright spot even with a fluorescence microscope.
- FISH Fluorescence in situ hybridization
- the specimen slide can be prepared, for example, by a method used for general histopathological diagnosis of tissues of subjects suspected of having cancer (human, dog, cat, etc.). First, a test subject's tissue is fixed using formalin or the like, dehydrated with alcohol, then subjected to xylene treatment, immersed in high temperature paraffin and embedded in paraffin to prepare a tissue sample. Subsequently, the tissue sample is cut into 3 to 4 ⁇ m sections and placed on a slide glass to form a specimen slide (see FIGS. 2 and 3).
- the tissue section on the specimen slide is immersed in a container containing xylene or other deparaffinizing agent to remove paraffin (see FIGS. 2 and 3).
- the temperature at this time is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
- the immersion time is preferably 3 minutes or longer and 30 minutes or shorter. If necessary, xylene may be exchanged during the immersion.
- the section is immersed in a container containing ethanol to remove xylene.
- the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
- the immersion time is preferably 3 minutes or longer and 30 minutes or shorter. Further, if necessary, ethanol may be exchanged during the immersion.
- the section is immersed in a container containing water to remove ethanol.
- the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature.
- the immersion time is preferably 3 minutes or longer and 30 minutes or shorter. Moreover, you may exchange water in the middle of immersion as needed.
- the probe reagent Prior to hybridization reaction of BAC probes or probes shorter than BAC probes (eg, probes derived from BAC clones), the probe reagent can be used efficiently for tissue sections such as heat treatment, acid treatment, enzyme treatment, and treatment with an activator. It is known to perform a pretreatment to make the above nucleic acid reachable. These processing conditions and combinations have different optimum conditions depending on the section type, thickness, slide adjustment conditions, and the like, and it is necessary to appropriately determine the procedure. Not all treatments need to be performed, for example there may be an option of not performing enzyme treatment.
- the activation process of the cell tissue which performs FISH is performed.
- the activation conditions are not particularly defined, but as the activation liquid, 0.01 M citrate buffer (pH 6.0), 1 mM EDTA solution (pH 8.0), 5% urea, 0.1 M Tris-HCl buffer, etc. are used. be able to.
- As the heating device an autoclave, a microwave, a pressure cooker, a water bath, or the like can be used.
- the temperature is not particularly limited, but can be performed at room temperature. The temperature can be 50 to 130 ° C., and the time can be 5 minutes to 30 minutes.
- the treatment with the reagent for removing the protein generally uses a reagent containing an enzyme or hydrochloric acid.
- the treatment for removing the protein of the cell membrane and the nuclear membrane is performed by the following procedure.
- the specimen slide is immersed in hydrochloric acid (about 0.2 mol / L) for a certain period of time. Then, it is immersed in water, and further washed by immersing it in a washing buffer (2 ⁇ SSC: standard sailline citrate). Next, it is immersed in a pretreatment liquid (for example, 1N NaSCN) for a certain time. Then, it is immersed in water, further immersed in a washing buffer and washed, and the same operation is repeated twice.
- hydrochloric acid about 0.2 mol / L
- a washing buffer 2 ⁇ SSC: standard sailline citrate
- a pretreatment liquid for example, 1N NaSCN
- the following procedure is performed in order to degrade cell membrane and nuclear membrane proteins, particularly collagen.
- the specimen slide is immersed in a protease solution for a certain time. Subsequently, it is immersed in a washing buffer and washed, and this operation is repeated twice. Thereafter, the specimen slide is dried by air drying or the like.
- proteinase, pepsin, proteinase K and the like are often used.
- a typical acid treatment is made with 0.02-0.2N HCl followed by a high temperature (eg, 70 ° C.) wash.
- the efficiency of deproteinization is determined by examining the combination of proteinase concentration and degradation time to optimize hybridization, i.e., the reaction with the target chromosome, and the morphological details are impaired. It is done with no condition setting. The optimum conditions vary depending on the tissue type and the fixing method. In addition, additional fixation after proteinase treatment is useful.
- ⁇ Fixed processing> In order to fix the specimen slide in each step of the pretreatment if necessary after the above enzyme treatment, for example, the following procedure is performed. First, the specimen slide is immersed in a formalin solution for a certain time. Subsequently, it is immersed in a washing buffer and washed, and this operation is repeated twice. Thereafter, the specimen slide is dried by air drying or the like.
- ⁇ DNA denaturation treatment After the above fixing treatment, for example, the following procedure is performed in order to denature the DNA present on the section (from double-stranded DNA to single-stranded DNA).
- a denaturing solution formamide / SSC solution or the like
- the specimen slide is taken out and immersed in several stages of ethanol (for example, 70% ethanol aqueous solution, 80% ethanol aqueous solution and 100% ethanol) with gradually increasing concentration in order to remove formamide. Thereafter, the specimen slide is dried by air drying or the like.
- Hybridization treatment using probe reagent> Using the probe reagents described above, as well as known FISH (eg, “Agilent FISH General Purpose Reagents Protocol”, “Clinical FISH Protocol—Visual Chromosome / Gene Diagnosis (Cell Engineering Separate Volume—Experimental Protocol Series”, etc.) A hybridization process can be performed (see FIGS. 2 and 3), where the term “hybridization” refers to the process of binding two DNAs or DNA and RNA complementary strands to form a double-stranded molecule, or It means a double-stranded molecule formed.
- a nucleic acid molecule having a first biomolecule such as biotin
- a second biomolecule that can specifically bind to the first biomolecule.
- Phosphor integrated nanoparticles may be added to the reaction system and fluorescently labeled in the reaction system (see FIG. 3).
- the nucleic acid molecule is chromosomally determined by the GC content of the probe sequence, the concentration of monovalent cation (M) present in the hybridization reaction system, and the formamide concentration (%) of the reaction system.
- M monovalent cation
- % formamide concentration
- DAPI nuclear staining reagent
- PBS phosphate buffered saline
- Specimen slides that have undergone FISH staining and nuclear staining are washed several times with PBS, air-dried or dehydrated, and then a mounting medium is dropped on the tissue section, covered with a cover glass, and dried. I do.
- the enclosed specimen slide prepared by the above processing becomes a preparation for performing pathological diagnosis and the like.
- the number of fluorescent bright spots or emission luminance is measured from a wide-field microscope image for the stained section.
- An excitation light source and a fluorescence detection optical filter corresponding to the absorption maximum wavelength and fluorescence wavelength of the fluorescent substance used are selected.
- the number of bright spots or emission luminance can be measured by using commercially available image analysis software, for example, all bright spot automatic measurement software G-Count manufactured by Zeonstrom Co., Ltd. Note that image analysis itself using a microscope is well known, and for example, a technique disclosed in Japanese Patent Laid-Open No. 9-197290 can be used.
- the field of view of the microscopic image is preferably 3 mm 2 or more, more preferably 30 mm 2 or more, and further preferably 300 mm 2 or more.
- the copy number of the target specific gene is evaluated. Specifically, for example, it can be evaluated that the copy number is normal when the copy number is 1 to 2, and the abnormality (proliferation) occurs when the copy number is 3 or more.
- a nucleic acid molecule eg, a BAC probe or a probe that is shorter than the BAC probe and has a labeling rate equal to or less than that (eg, a probe derived from a BAC clone)
- the BAC has a high labeling rate even if the labeling rate is equal to or lower than that of the conventional BAC probe.
- Luminous brightness can be increased more than that of the probe, and bright spots located deeper in the tissue section can be detected simultaneously. Further, the slide of the tissue section subjected to FISH can be maintained for a longer time in a state where the bright spot can be detected.
- the average particle diameter of the phosphor-integrated nanoparticles is 40 nm or more and 300 nm or less, bright spot observation can be suitably performed when FISH is performed. Further, if the average particle diameter of the phosphor-integrated nanoparticles is adjusted in the range of 40 nm or more and 300 nm, the emission luminance of the bright spot can be suitably adjusted.
- nucleic acid molecule and the phosphor-integrated nanoparticles or the phosphor are bound at a molar ratio of 1: 1 to 1: 5000 (particularly 1: 1 to 1:40),
- the influence of the phosphor-integrated nanoparticles labeled with nucleic acid molecules on hybridization is suppressed, and bright spot observation can be suitably performed when FISH is performed.
- the light emission luminance of the bright spot can be largely adjusted by this molar ratio.
- by adjusting the molar ratio and the average particle diameter of the phosphor-integrated nanoparticles it becomes easy to adjust the emission luminance of the bright spot to a desired emission luminance.
- phosphor-aggregated nanoparticles obtained by accumulating phosphors are bound to a nucleic acid molecule having a predetermined nucleic acid sequence having a base number of 5000 or less, particularly 4000 or less, by a nucleic acid end labeling method.
- the labeling rate is lower than when the entire nucleic acid molecule is labeled by the nick translation method (phosphor-integrated nanoparticles are present only at one or both ends of the nucleic acid molecule).
- nucleic acid molecules having a relatively small number of bases on hybridization it is possible to produce a probe that minimizes the influence of phosphor-integrated nanoparticles labeled with nucleic acid molecules having a relatively small number of bases on hybridization, and emits light that is equal to or higher than that of conventional BAC probes. Brightness can be increased.
- the labeling rate can be lowered by adjusting the amount of biotin-labeled nucleic acid substrate used. A nucleic acid molecule having a low labeling rate may be obtained.
- the FISH can be suitably performed from the same viewpoint as (5, 6) if the above-mentioned probe reagent has a labeling rate (%) of the phosphor with respect to the nucleic acid molecule of 13.33% or less.
- the phosphor-integrated nanoparticles are particles formed using a resin, it is easy to accumulate the phosphor by incorporating the phosphor while polymerizing the monomer when the resin particles are synthesized.
- the average luminance of the resin particles and the light emission luminance from the resin particles can be adjusted.
- the resin particles are particles formed using a thermosetting resin such as a melamine resin, it is difficult for the phosphors to elute from the resin particles, thereby suppressing the fading of the phosphor integrated nanoparticles. it can. As a result, the fading of the bright spot of the specimen slide can be suppressed.
- the first and second biomolecules are molecules that can specifically bind to each other, for example, streptavidin and biotin, the nucleic acid molecule and the phosphor-integrated nanoparticles or the fluorescence Since the binding to the body is performed by a very specific binding, fluorescent staining after the hybridization treatment can be suitably performed.
- the cell tissue itself stained by the FISH method is endogenous. Even if the first and second biomolecules are present, the probe reagent does not bind to them.
- BAC probes with a low labeling rate complementary to the sequence of a specific region on the chromosome (less than 150,000 bases, especially 4,000 bases or less) or shorter than BAC probes and the labeling rate
- a nucleic acid molecule having the sequence of a probe equal to or less than that (eg, a probe derived from a BAC clone) to which a first biomolecule is linked and a second biomolecule capable of specifically binding to the first biomolecule are linked.
- the hybridization process in FISH is performed using the nucleic acid molecule linked to the first biomolecule as a probe until the observation.
- the phosphor-aggregated nanoparticles or the phosphors linked to the second biomolecule are added to the hybridization reaction system to fluorescently stain the chromosome. It is possible. As a result, the phosphor can be stored in an environment in which it is difficult to fade as much as possible during the hybridization process, and can be added immediately before the observation, so that it is possible to suppress the decrease in the emission luminance of the bright spot as much as possible. Moreover, since hybridization is performed with the DNA-assembled nanoparticles or the DNA probe in which the phosphor is not bound to a nucleic acid molecule, there is also an advantage that the optimum conditions for hybridization are not easily changed.
- the first biomolecule is labeled at one or both ends of the nucleic acid molecule and / or 1 to 50 other than the end, the first biomolecule is bound to the entire nucleic acid molecule.
- the influence on the hybridization can be reduced as compared with the case where the above is performed.
- a probe reagent for in situ hybridization in which 20000 mol or more of fluorescent nanoparticles (eg, semiconductor nanoparticles, quantum dots (Q-dot, etc.)) are bound to 1 mol of nucleic acid molecules of a predetermined nucleic acid sequence.
- fluorescent nanoparticles eg, semiconductor nanoparticles, quantum dots (Q-dot, etc.
- Q-dot quantum dots
- a nucleic acid molecule was prepared as follows. For 1 ⁇ g (5 ⁇ L) of the HER2-DNA clone (about 150 kbp) purchased from GSP, according to the protocol of the kit for nick translation (product name “GSP-Nick Translation Kit” K-015, manufactured by GSP) The dTTP of the HER2 DNA clone (nucleic acid molecule) was replaced with biotin-labeled dUTP by the nick translation method as follows.
- the reaction was performed at 15 ° C. for 4 hours, and the reaction was stopped by heating at 70 ° C. for 10 minutes. 25 ⁇ L of distilled water was added to the centrifuge tube after the reaction.
- the biotin-labeled BAC probe reaction solution was purified by a microspin column for nucleic acid purification (“MicroSpin S-200HR Column” manufactured by GE Healthcare, product number “# 27-5120-01”).
- the HABA was bound to Q-dot streptavidin using “Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit” manufactured by Thermo Scientific.
- the ratio was 1: 20000.
- the Q-dot existing in the migrated gel was confirmed using excitation light of green laser light having a wavelength of 532 nm and an emission filter having a wavelength of 640 nm.
- the DNA stained with SYBR Green II was confirmed using excitation light of blue laser light having a wavelength of 488 nm and an emission filter having a wavelength of 530 nm green bandpass.
- Hybridization buffer (25% deionized formamide, 2 ⁇ SSC, 200 ng / ⁇ L salmon sperm DNA, 5 ⁇ Denhardt's solution, 50 mM sodium phosphate, pH 7.0, 1 mM EDTA) Diluted to a final concentration of 1-5 ng / ⁇ L. Free ligands (free streptavidin, biotin, and dATP substrates) were removed as needed using an S300 size spin column (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). If not used immediately, the DNA probe was stored frozen at -20 ° C.
- FISH The copy number of the HER2 gene was measured by FISH. As shown below, FISH includes deparaffinization, specimen slide pretreatment, enzyme treatment, specimen fixing treatment, probe preparation, specimen slide DNA denaturation treatment, hybridization treatment, slide glass washing treatment, and DAPI. The staining process was performed in this order.
- Deparaffinization was performed by treating a specimen slide of a HER2-positive stained control specimen (“HER2-FISH Control Slide Code PS-09006” manufactured by Pathology Laboratories) in the order of (1) to (4) below. .
- HER2-FISH Control Slide Code PS-09006 manufactured by Pathology Laboratories
- (1) Immerse in Hemo-De for 10 minutes at room temperature.
- (2) Immerse the specimen slide in new Hemo-De for 10 minutes at room temperature. Repeat the same operation three times.
- the specimen slide is immersed in 100% ethanol at room temperature for 5 minutes, washed twice, and dehydrated.
- the specimen slide is air-dried or dried on a slide warmer at 45 to 50 ° C.
- the specimen slide was pretreated in the following order (1) to (6) to remove proteins from the cell membrane and the nuclear membrane.
- (1) Treat the specimen slide with 0.2 mol / L HCl at room temperature for 20 minutes.
- (2) Immerse the specimen slide in purified water for 3 minutes.
- (3) The specimen slide is immersed in a washing buffer solution (2 ⁇ SSC: standard saline citrate) for 3 minutes.
- (4) The specimen slide is immersed in a pretreatment solution (1N NaSCN) at 80 ° C. for 30 minutes.
- (6) The specimen slide is immersed in a washing buffer solution (2 ⁇ SSC) for 5 minutes, and this immersion operation is repeated twice.
- the sample treatment that had been pretreated was subjected to enzyme treatment by performing the following treatments (1) to (4) in this order.
- (2) The specimen slide is immersed in a protease solution heated to 37 ° C. for 10 to 60 minutes. This immersion treatment is performed with 25 mg protease (2500-3000 Units / mg) [pepsin] / 1M NaCl [pH 2.0] in 50 mL at 37 ° C. for 60 minutes) in order to decompose cell membrane and nuclear membrane proteins, particularly collagen. It is desirable to process.
- (4) The specimen slide is air-dried or dried on a slide warmer at 45 to 50 ° C. for 2 to 5 minutes.
- specimen fixation As the specimen fixing process, the following processes (1) to (3) were performed on the specimen slide that had been pretreated.
- the specimen slide is immersed in 10% neutral buffered formalin (“4% paraformaldehyde / phosphate buffer” manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., product number 163-1004) at room temperature for 10 minutes.
- 10% neutral buffered formalin (“4% paraformaldehyde / phosphate buffer” manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., product number 163-1004)
- the specimen slide is air-dried or dried on a slide warmer at 45 to 50 ° C. for 2 to 5 minutes.
- DAPI staining was performed as follows. First, 10 ⁇ L of DAPI counterstain was added to the hybridization area of the specimen slide. Next, after hybridization treatment, DAPI staining (2 ⁇ g / mL PBS) is performed at 25 ° C. for 10 minutes in order to count the number of cells. The cell nucleus is stained, covered with a cover glass, and the specimen slide is covered until signal measurement. Stored protected from light. DAPI (4 ′, 6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochloride) used Molecular Probes (D1306).
- ⁇ Fluorescence microscope observation> In the fluorescence microscope observation, the section subjected to FISH as described above is subjected to fluorescence microscope observation (600 times) using a fluorescence microscope Zeiss imager (Camera: MRm monochrome / with cooling function, objective lens ⁇ 60 oil immersion). , Fluorescence measurement, fluorescence image (fluorescence still image) and number of bright spots were measured.
- a biotin-labeled BAC probe 25 ⁇ L (concentration 1 ⁇ g / 250 ⁇ L) and a solution containing 1.0 ⁇ L (50 nmol / 50 ⁇ L) of FITC-modified streptavidin (Streptavidin, FITC Conjugate (1 mg Funakoshi SA-5001) were mixed at room temperature. Then, a binding reaction was performed for 30 minutes to obtain a DNA probe (probe reagent B) for HER-2 detection.
- the FITC present in the electrophoresed gel was confirmed using excitation light of laser light having a wavelength of 488 nm and an emission filter having a wavelength of 530 nm.
- the HABA was bound to the above-mentioned HABA in a state where HABA was bound to streptavidin of FITC using “Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit” manufactured by Thermo Scientific.
- the HABA-avidin method for replacing the BAC probe with biotin it was 1: 20000.
- Qdot registered trademark, manufactured by Quantum Dot Corporation
- Example 2 [Preparation of BAC probe with biotin labeling rate of 1.33%]
- the amount of dTTP used was changed from 0.5 ⁇ L to 1.5 ⁇ L by biotin labeling by nick translation in Example 1, and the amount of Biotin-16-dUTP (Product No. 1093070, manufactured by Roche, 50 nmol / 50 ⁇ L) was changed to 1
- a solution of biotin-labeled 150,000 bases BAC probe (nucleic acid molecule) with a final concentration of 1 ⁇ g / 250 ⁇ L was obtained in the same manner as in Example 1 except that the amount was changed from 0.5 ⁇ L to 0.2 ⁇ L.
- Texas Red dye-encapsulated silica nanoparticles ⁇ Preparation of Texas Red dye-encapsulated silica nanoparticles> Texas Red dye 3.4 mg and 3-aminopropyltrimethoxysilane (3-aminopropyltrimethoxysilane, manufactured by Shin-Etsu Silicone Co., Ltd., KBM903) were mixed in DMF to obtain an organoalkoxysilane compound. 0.6 mL of the obtained organoalkoxysilane compound was mixed with 48 mL of ethanol, 0.6 mL of TEOS (tetraethoxysilane), 2 mL of water, and 1.4 mL of 28% aqueous ammonia for 3 hours.
- TEOS tetraethoxysilane
- the mixed solution prepared in the above step was centrifuged at 10,000 G for 20 minutes, and the supernatant was removed. Ethanol was added to disperse the sediment and centrifuged again. In the same procedure, washing with ethanol and pure water was performed twice. Through these operations, Texas Red dye silica nanoparticles were obtained. When an SEM observation was performed on 1000 of the obtained nanoparticles, the average particle size was 50 nm.
- the obtained phosphor-aggregated nanoparticles were adjusted to 3 nM using PBS (phosphate buffered saline) containing 2 mM of EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), and SM ( PEG) 12 (manufactured by Thermo Scientific, succinimidyl-[(N-maleidopropionamid) -dodecaethyleneglycol] ester) was mixed and allowed to react for 1 hour. The mixture was centrifuged at 10,000 G for 20 minutes, the supernatant was removed, PBS containing 2 mM of EDTA was added, the precipitate was dispersed, and centrifuged again. Washing by the same procedure was performed three times to obtain phosphor-integrated nanoparticles with a maleimide group at the end.
- PBS phosphate buffered saline
- EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
- SM PEG 12
- streptavidin manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
- streptavidin can be bound to phosphor-aggregated nanoparticles by performing a thiol group addition treatment using N-succinimidyl S-acetylthioacetate (SATA), followed by filtration through a gel filtration column.
- SATA N-succinimidyl S-acetylthioacetate
- the above phosphor-integrated nanoparticles and streptavidin were mixed in PBS containing 2 mM EDTA and reacted for 1 hour. 10 mM mercaptoethanol was added to stop the reaction. After the obtained solution was concentrated with a centrifugal filter, unreacted streptavidin and the like were removed using a purification gel filtration column, and streptavidin was bound to obtain phosphor-integrated nanoparticles encapsulating Texas® Red dye.
- Example 3 [Preparation of BAC probe with biotin labeling rate of 1.33%]
- the amount of dTTP used was changed from 0.5 ⁇ L to 1.5 ⁇ L by biotin labeling by nick translation in Example 1, and the amount of Biotin-16-dUTP (Product No. 1093070, manufactured by Roche, 50 nmol / 50 ⁇ L) was changed to 1
- a solution of biotin-labeled 150,000 bases BAC probe (nucleic acid molecule) with a final concentration of 1 ⁇ g / 250 ⁇ L was obtained in the same manner as in Example 1 except that the amount was changed from 0.5 ⁇ L to 0.2 ⁇ L.
- Emulgen (registered trademark) 430 polyoxyethylene oleyl ether, manufactured by Kao Corporation
- the mixture was centrifuged at 20000 G for 15 minutes in a centrifuge (Microcooled Centrifuge 3740 manufactured by Kubota Shoji Co., Ltd.), and after removing the supernatant, ultrapure water was added and ultrasonically irradiated to redisperse. Centrifugation, supernatant removal, and washing by redispersion in ultrapure water were repeated 5 times.
- the melamine resin itself contains many amino groups in the skeleton.
- the average particle size was 280 nm.
- phosphoric acid buffer physiological saline PBS
- EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
- concentration of the obtained phosphor-integrated nanoparticles was adjusted to 3 nM.
- SM (PEG) 12 Succinimidyl-[(N-maleoidopropionamid) -dodecaethyleneglycol] ester, manufactured by Thermo Scientific Co., Ltd.
- the mixture was reacted at 20 ° C. for 1 hour to obtain a mixed solution containing phosphor-integrated nanoparticles having a fluorescent dye with a maleimide at the end.
- the mixture was centrifuged at 10,000 G for 20 minutes, the supernatant was removed, PBS containing 2 mM EDTA was added to disperse the precipitate, and the mixture was centrifuged again.
- the above washing according to the same procedure was performed three times.
- streptavidin manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
- streptavidin and N-succimidyl S-acetylthioacetic acid are used to add a thiol group to the streptavidin and perform gel filtration.
- SATA N-succinimidyl S-acetylthioacetate
- Example 4 [Preparation of BAC probe with biotin labeling rate of 1.33%]
- the amount of dTTP used was changed from 0.5 ⁇ L to 1.5 ⁇ L by biotin labeling by nick translation in Example 1, and the amount of Biotin-16-dUTP (Product No. 1093070, manufactured by Roche, 50 nmol / 50 ⁇ L) was changed to 1
- a solution of biotin-labeled 150,000 bases BAC probe (nucleic acid molecule) with a final concentration of 1 ⁇ g / 250 ⁇ L was obtained in the same manner as in Example 1 except that the amount was changed from 0.5 ⁇ L to 0.2 ⁇ L.
- Texas Red dye silica nanoparticles were obtained in the same manner as in Example 2 except that the amount of 28% ammonia water used was changed from 1.4 mL to 2.6 mL. When an SEM observation was performed on 1000 of the obtained nanoparticles, the average particle size was 320 nm.
- fluorescent dye-encapsulated particles with a maleimide group were obtained in the same manner as in Example 2, while a streptavidin solution was prepared in the same manner as in Example 2, and both were treated as in Example 2.
- Streptavidin-bound Texas® Red dye-encapsulated silica nanoparticles (phosphor-integrated nanoparticles) were obtained.
- biotin-labeled BAC probe (nucleic acid molecule) 25 ⁇ L (concentration 1 ⁇ g / 250 ⁇ L) and a solution of phosphor-aggregated nanoparticles containing streptavidin are mixed and subjected to a binding reaction at room temperature for 30 minutes to detect HER-2 DNA probe (probe reagent G) was obtained.
- Example 2 With biotin labeling by nick translation in Example 1, the amount of dTTP used was changed from 0.5 ⁇ L to 1.5 ⁇ L, and the amount of Biotin-16-dUTP (Product No. 1093070, Roche, 50 nmol / 50 ⁇ L) was changed. A biotin-labeled BAC probe solution having a final concentration of 1 ⁇ g / 250 ⁇ L was obtained in the same manner as in Example 1 except that the amount was changed from 1.5 ⁇ L to 0.2 ⁇ L.
- Biotin-16-dUTP Product No. 1093070, Roche, 50 nmol / 50 ⁇ L
- Example 2 With biotin labeling by nick translation in Example 1, the amount of dTTP used was changed from 0.5 ⁇ L to 1.5 ⁇ L, and the amount of Biotin-16-dUTP (Product No. 1093070, Roche, 50 nmol / 50 ⁇ L) was changed. A biotin-labeled BAC probe solution having a final concentration of 1 ⁇ g / 250 ⁇ L was obtained in the same manner as in Example 1 except that the amount was changed from 1.5 ⁇ L to 0.2 ⁇ L.
- Biotin-16-dUTP Product No. 1093070, Roche, 50 nmol / 50 ⁇ L
- Example 3 Using 0.1 mg of the obtained phosphor-integrated nanoparticles, a mixed liquid containing phosphor-integrated nanoparticles having a fluorescent dye with a maleimide at the end was obtained in the same manner as in Example 3. Further, washing and the like were performed in the same manner as in Example 3.
- Example 1 As shown in Table 1, in the known example, Example 1, and Reference Example 1, since a probe reagent with a high biotin labeling rate (13.33%) was used, bright spots could be observed even with an optical microscope. In Comparative Examples 1 and 2, since a probe reagent having a low biotin labeling rate (1.33%) was used, bright spots could be observed with a confocal microscope, but bright spots could not be observed with an optical microscope.
- labels in Tables 1 to 5 are phosphor molecules that can bind to nucleic acid molecules (for example, phosphor-integrated nanoparticles having streptavidin if the nucleic acid molecules are labeled with biotin). Means.
- Qdot registered trademark, manufactured by Quantum Dot Corporation
- Qdot registered trademark, manufactured by Quantum Dot Corporation
- FISH, bright field observation, confocal fluorescence microscope observation, fluorescence microscope observation and the like were performed in the same manner as in Example 1. At this time, the number of bright spots was measured for the stained image of the cultured cell MCF7 in each of confocal fluorescence microscope observation and fluorescence microscope observation.
- the HABA was bound to Q-dot streptavidin using “Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit” manufactured by Thermo Scientific.
- the ratio was 1:40.
- the measurement of the bright spot at this time is performed by measuring the cells contained in the image itself (1600 pixels ⁇ 1200 pixels) taken with the objective lens ⁇ 60 (oil immersion) on the confocal microscope Zeiss LSM780 (manufactured by Carl Zeiss Microscopy GmbH). Went about.
- the cultured cell MCF7 is a cell known as HER2 low expression, and is almost equivalent to a normal cell, and therefore, usually two bright spots can be seen in one nucleus.
- Example 7 [Preparation of DNA probe with a biotin labeling rate of 13.33%]
- a 300-base cDNA nucleic acid molecule having a sequence related to the HER2 gene was prepared.
- 1 ⁇ g of this cDNA was used to obtain a biotin-labeled cDNA solution having a final concentration of 1 ⁇ g / 250 ⁇ L.
- the average particle diameter is 158 nm, which is slightly larger than that of Example 2, but the detection sensitivity of the bright spot is high even in the fluorescence microscope observation with the low detection sensitivity of the bright spot. Bright spots were detected with the same accuracy as confocal fluorescence microscope observation.
- Example 8 [Preparation of DNA probe with a biotin labeling rate of 13.33%]
- a 300 base nucleotide cDNA (nucleic acid molecule) having a sequence related to the HER2 gene was prepared.
- 1 ⁇ g of this cDNA was used to obtain a biotin-labeled cDNA solution having a final concentration of 1 ⁇ g / 250 ⁇ L.
- Example 8 although the average particle diameter is 280 nm, which is larger than that in Example 6 and Example 7, it is possible to detect a bright spot even in a fluorescence microscope observation with a low bright spot detection sensitivity. It was possible to detect bright spots with the same level of accuracy as confocal fluorescence microscopy.
- Example 9 [Preparation of probe with biotin labeling rate of 13.33%]
- a 300-base cDNA nucleic acid molecule having a sequence related to the HER2 gene was prepared.
- 1 ⁇ g of this cDNA was used to obtain a biotin-labeled cDNA solution having a final concentration of 1 ⁇ g / 250 ⁇ L.
- the average particle diameter is 320 nm, which is larger than that of Example 6, Example 7 and Example 7, but also in fluorescence microscope observation with low detection sensitivity of bright spots, The bright spot was detected with the same accuracy as the confocal fluorescence microscope observation with high bright spot detection sensitivity.
- Example 10 [Preparation of probe with biotin labeling rate of 1.67%]
- a 300-base cDNA (nucleic acid molecule) having a sequence related to the HER2 gene was prepared.
- the amount of dTTP used was changed from 0.5 ⁇ L to 1.5 ⁇ L by nick translation in Example 1, and Biotin-16-dUTP (Product No. 1093070, Roche, 50 nmol / 50 ⁇ L)
- the biotin-labeled cDNA was obtained at a final concentration of 1 ⁇ g / 250 ⁇ L in the same manner as in Example 1 except that the amount used was changed from 1.5 ⁇ L to 0.2 ⁇ L.
- Texas Red dye-encapsulated silica nanoparticles were prepared in the same manner as in Example 2 except that the amount of 28% aqueous ammonia was changed from 1.4 mL to 2.0 mL. When an SEM observation was performed on 1000 of the obtained particles, the average particle size was 160 nm.
- fluorescent dye-encapsulated particles with a maleimide group were obtained in the same manner as in Example 2, while a streptavidin solution was prepared in the same manner as in Example 2, and both were treated as in Example 2.
- Streptavidin-bound Texas® Red dye-encapsulated silica nanoparticles (phosphor-integrated nanoparticles) were obtained.
- the fluorescence molar ratio of cDNA: biotin (cDNA: phosphor integrated nanoparticle) binding molar ratio is 1: 5, but the detection sensitivity of the bright spot is low.
- the bright spot was detected with the same accuracy as the confocal fluorescence microscope observation with high bright spot detection sensitivity.
- Example 11 [Preparation of probe with biotin labeling rate of 1.67%]
- a 300-base cDNA nucleic acid molecule having a sequence related to the HER2 gene was prepared.
- the amount of dTTP used was changed from 0.5 ⁇ L to 1.5 ⁇ L by nick translation in Example 1, and Biotin-16-dUTP (Product No. 1093070, Roche, 50 nmol / 50 ⁇ L)
- the biotin-labeled cDNA was obtained at a final concentration of 1 ⁇ g / 250 ⁇ L in the same manner as in Example 1 except that the amount used was changed from 1.5 ⁇ L to 0.2 ⁇ L.
- Texas Red dye-encapsulated silica nanoparticles were prepared in the same manner as in Example 2 except that the amount of 28% ammonia water used was changed from 1.4 mL to 2.6 mL. When SEM observation was performed on 1000 of the obtained particles, the average particle size was 320 nm.
- fluorescent dye-encapsulated particles with a maleimide group were obtained in the same manner as in Example 2, while a streptavidin solution was prepared in the same manner as in Example 2, and both were treated as in Example 2.
- Streptavidin-bound Texas® Red dye-encapsulated silica nanoparticles (phosphor-integrated nanoparticles) were obtained.
- Example 12 [Preparation of BAC probe with biotin labeling rate of 0.33%]
- a NickTranslation reaction was performed to prepare a BAC probe.
- it was prepared without adding Biotin-d-UTP. The following biotin labeling was performed on the DNA (nucleic acid molecule) derived from the BAC clone.
- Texas Red dye-encapsulated silica nanoparticles were prepared in the same manner as in Example 2 except that the amount of 28% aqueous ammonia was changed from 1.4 mL to 2.0 mL. When an SEM observation was performed on 1000 of the obtained particles, the average particle size was 160 nm.
- fluorescent dye-encapsulated particles with a maleimide group were obtained in the same manner as in Example 2, while a streptavidin solution was prepared in the same manner as in Example 2, and both were treated as in Example 2.
- Streptavidin-bound Texas® Red dye-encapsulated silica nanoparticles (phosphor-integrated nanoparticles) were obtained.
- the binding molar ratio of the DNA derived from the BAC clone and biotin is 1:50, but the detection sensitivity of the bright spot is low.
- the bright spot was detected with the same accuracy as the confocal fluorescence microscope observation with high bright spot detection sensitivity.
- ⁇ Preparation of DNA probe in which fluorescent particles and BAC probe are combined 25 ⁇ L of cDNA probe with biotin labeled at the 5 ′ end (concentration: 1 ⁇ g / 250 ⁇ L) and 1.0 ⁇ L of Qdot (registered trademark, manufactured by Quantum Dot Corporation) having an average particle diameter of 15 nm surface-modified with streptavidin.
- the solution containing (50 nmol / 50 ⁇ L) was mixed and subjected to a binding reaction at room temperature for 30 minutes to obtain a DNA probe (probe reagent Ad2) for HER-2 detection.
- Example 13 [Preparation of BAC probe with biotin labeling rate of 6.67E-3%]
- Example 14 [Preparation of probe with biotin labeling rate of 0.33%] A solution (final concentration 1 ⁇ g / 250 ⁇ L) of DNA (probe reagent Ad4) labeled with phosphor-integrated nanoparticles in the same manner as in Example 13 except that the biotin-labeled nucleic acid molecule with 300 bases was used in Comparative Example 6. ) [Other observations] Confirmation of the DNA probe, storage of the DNA probe, FISH, bright field observation, confocal fluorescence microscope observation, fluorescence microscope observation, and the like were performed in the same manner. In the confirmation of the DNA probe, it was 1: 1 because it was labeled only at the 5 ′ end.
- HER2-FISH Control Slide Code PS-09006 manufactured by Pathology Laboratories
- a specimen slide of a HER2-positive stained control specimen (“HER2-FISH Control Slide Code PS-09006” manufactured by Pathology Laboratories) was used as a specimen slide.
- confocal fluorescence microscope observation, fluorescence microscope observation, etc. were performed. ⁇ Consideration of results>
- As a result of measuring the bright spot by confocal fluorescence microscope observation there were 19 cells with 1 bright spot, 28 cells with 2 bright spots, 2 cells with 3 bright spots, and 1 cell with 4 bright spots. It was. A bright spot could be observed in the fluorescence microscope.
- Example 15 [Preparation of a short-length DNA probe with a biotin labeling rate of 0.33%]
- a 300-base cDNA (nucleic acid molecule) having a sequence related to the HER2 gene was prepared.
- Biotin labeling at 5 'end> In the same manner as in Example 12, 2 ⁇ g of cDNA prepared as described above was used to obtain cDNA labeled with biotin at the 5 ′ end.
- Texas Red dye-encapsulated silica nanoparticles were prepared in the same manner as in Example 2 except that the amount of 28% ammonia water used was changed from 1.4 mL to 2.6 mL. When SEM observation was performed on 1000 of the obtained particles, the average particle size was 320 nm. From the obtained dye-encapsulated nanoparticles, phosphor-integrated nanoparticles with a maleimide group were obtained in the same manner as in Example 2. On the other hand, a streptavidin solution was prepared in the same manner as in Example 2.
- Streptavidin-bonded Texas Red dye-encapsulated silica nanoparticles were obtained.
- phosphor-integrated nanoparticles 320 nm, silica particles
- 25 ⁇ L of cDNA labeled with biotin at the 5 ′ end (concentration 1 ⁇ g / 250 ⁇ L) and a solution of phosphor-integrated nanoparticles containing streptavidin are mixed, and a binding reaction is performed at room temperature for 30 minutes to detect HER-2.
- DNA probe (probe reagent T) was obtained.
- the binding molar ratio of DNA to phosphor-integrated nanoparticles is 1: 1, and the average particle size is 320 m, which is larger than Example 12,
- the fluorescence microscope observation with low detection sensitivity it was possible to detect the bright spot with the same accuracy as the confocal fluorescence microscope observation with high bright spot detection sensitivity. However, many non-specific detections were observed.
- Example 16 [Preparation of a short-length DNA probe with a biotin labeling rate of 5%] Specify a specific region of human chromosome 17 (from 37844400 to 37885107) on the probe search site "HD-FISH" (URL: http://www.hdfish.eu/Find#probes.php) Thus, a unique sequence was searched, and the next unique sequence from the 3784th 479th to 37844696th existing in the specific region was searched and obtained. Based on this sequence data, a nucleic acid synthesis request was made to prepare a 20-base DNA (nucleic acid molecule) of the HER-2 gene-related sequence (5′-ACGCCTGATGGGGTTAATGAG-3 ′).
- 25 ⁇ L of the DNA labeled with biotin at the 5 ′ end (concentration: 1 ⁇ g / 250 ⁇ L) and a solution of phosphor-aggregated nanoparticles having streptavidin are mixed and subjected to a binding reaction at room temperature for 30 minutes to detect HER-2 DNA probe (probe reagent U) was obtained.
- Example 17 [Preparation of DNA probe with 5% biotin labeling]
- DNA nucleic acid molecule having 20 bases was prepared.
- Biotin labeling at 5 'end> Using 2 ⁇ g of the DNA prepared as described above, DNA whose 5 ′ end was labeled with biotin was obtained in the same manner as in Example 12.
- the average particle diameter is larger than that of Example 16, but, as in Example 16, even in fluorescence microscope observation with low detection sensitivity of the bright spot, It was possible to detect bright spots with the same accuracy as confocal fluorescence microscope observation with high detection sensitivity.
- Example 18 [Preparation of DNA probe with 5% biotin labeling] In the same manner as in Example 16, DNA (nucleic acid molecule) having 20 bases was prepared.
- Reference Example 4 Using the probe reagent obtained in Reference Example 1, in fluorescent microscope observation, bright spot observation was performed immediately after staining, and after 1 week, 1 month, and 2 months after staining, respectively, and a specimen slide for each time point The average number of bright spots of the cells (cultured cells SKBR3) was examined. This average number of bright spots is calculated as the average value of the number of bright spots per nucleus by measuring the number of bright spots contained in 50 nuclei of the cells.
- the average number of bright spots after staining was 18 immediately after staining, 15 after 1 week from staining, 8 after 1 month from staining, and 2 after 2 months from staining. That is, according to the probe reagent according to Reference Example 1, the number of bright spots that can be measured immediately after staining decreased with the passage of time, and the resistance to dye regression was low (see Table 4).
- TXR present in the electrophoresed gel was confirmed using excitation light of laser light having a wavelength of 590 nm and an emission filter having a wavelength of 615 nm.
- the HABA was bound to TXR streptavidin using “Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit” manufactured by Thermo Scientific.
- the HABA-avidin method for replacing the DNA with biotin it was 1: 20000.
- DNA probe storage, FISH, bright field observation, confocal fluorescence microscope observation, fluorescence microscope observation, and the like were performed in the same manner as in Comparative Example 3. Bright spots could be observed by confocal fluorescence microscope observation and fluorescence microscope observation.
- Example 19 [Preparation of DNA probe with biotin labeling rate of 1.67%]
- a 300-base cDNA nucleic acid molecule having a sequence related to the HER2 gene was prepared. Phosphor-aggregated nanoparticles were produced by the following method and directly bonded to this cDNA.
- a gel filtration column was prepared by mixing 1 ⁇ L of Lumiprobe “Amino-11-dUTP” with N-succinimidyl S-acetylthioacetate (SATA) and incubating at 5 ° C. for 1 hour as a thiol group addition treatment. Through filtration, a Thiol-11-dUTP solution capable of binding to phosphor-aggregated nanoparticles was obtained.
- the phosphor-integrated nanoparticles with a maleimide group at the end and Thiol-11-dUTP solution were mixed in PBS containing 2 mM EDTA and reacted at 5 ° C. for 1 hour. 10 mM mercaptoethanol was added to stop the reaction. After the obtained solution was concentrated with a centrifugal filter, unreacted substances were removed using a purification gel filtration column to obtain 1.0 ⁇ L of dUTP-bound TexasTRed dye-encapsulated melamine resin particle solution as phosphor-aggregated nanoparticles.
- the reaction was performed at 15 ° C. for 4 hours, and the reaction was stopped by heating at 70 ° C. for 10 minutes. 25 ⁇ L of distilled water was added to the centrifuge tube after the reaction.
- the biotin-labeled BAC probe reaction solution was purified by a microspin column for nucleic acid purification (“MicroSpin S-200HR Column” manufactured by GE Healthcare, product number “# 27-5120-01”).
- the binding molar ratio between the cDNA and the phosphor-integrated nanoparticles cannot be confirmed by the HABA-avidin method, and there is no evaluation system, but the same materials and reaction conditions as in Example 10 are used. Is estimated to be 1: 5.
- Example 20 Using the probe reagent obtained in Example 8, dye regression evaluation was performed in the same manner as in Reference Example 4 in fluorescence microscope observation.
- the average number of bright spots after staining was 25 immediately after staining, 25 after one week from staining, 26 after one month from staining, and 24 after two months from staining. That is, according to the probe reagent according to Example 20, the number of bright spots that can be measured immediately after staining did not decrease with time, and the dye resistance was high (see Table 4).
- Example 21 Using the probe reagent obtained in Example 9, dye regression evaluation was performed in the same manner as in Reference Example 4 in fluorescence microscope observation.
- Example 22 [Preparation of DNA probe with a biotin labeling rate of 13.33%] In the same manner as in Example 6, a 300-base cDNA (nucleic acid molecule) having a sequence related to the HER2 gene was prepared.
- FITC code P76012, manufactured by Takara Bio Inc.
- Emulgen (registered trademark) 430 polyoxyethylene oleyl ether, manufactured by Kao Corporation
- an emulsifier for emulsion polymerization was added to this solution.
- the solution was heated to 70 ° C. while stirring on a hot stirrer, and 0.15 g of melamine resin raw material Nicalak MX-035 (manufactured by Nippon Carbide Industries Co., Ltd.) was added to the solution.
- the mixture was centrifuged at 20000 G for 15 minutes in a centrifuge (Microcooled Centrifuge 3740 manufactured by Kubota Shoji Co., Ltd.), and after removing the supernatant, ultrapure water was added and ultrasonically irradiated to redisperse. Centrifugation, supernatant removal, and washing by redispersion in ultrapure water were repeated 5 times.
- the melamine resin itself contains many amino groups in the skeleton.
- the average particle diameter was 35 nm.
- phosphoric acid buffer physiological saline PBS
- EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
- concentration of the obtained phosphor-integrated nanoparticles was adjusted to 3 nM.
- SM (PEG) 12 Succinimidyl-[(N-maleoidopropionamid) -dodecaethyleneglycol] ester, manufactured by Thermo Scientific Co., Ltd.
- the mixture was reacted at 20 ° C. for 1 hour to obtain a mixed solution containing phosphor-integrated nanoparticles having a fluorescent dye with a maleimide at the end.
- the mixture was centrifuged at 10,000 G for 20 minutes, the supernatant was removed, PBS containing 2 mM EDTA was added to disperse the precipitate, and the mixture was centrifuged again.
- the above washing according to the same procedure was performed three times.
- streptavidin manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
- N-succimidyl S-acetylthioacetic acid N-succinimidyl S-acetylthioacetate, abbreviated as SATA
- SATA N-succinimidyl S-acetylthioacetate
- Example 23 [Preparation of DNA probe with a biotin labeling rate of 13.33%]
- a 300-base cDNA nucleic acid molecule having a sequence related to the HER2 gene was prepared.
- fluorescent dye-encapsulated particles having a maleimide group were obtained in the same manner as in Example 22, while a streptavidin solution was prepared in the same manner as in Example 22, and both were prepared in the same manner as in Example 22.
- Streptavidin-binding FITC dye-encapsulated melamine particles were obtained.
- Example 24 [Preparation of DNA probe with biotin labeling rate of 1.67%]
- a 300-base cDNA nucleic acid molecule having a sequence related to the HER2 gene was prepared.
- Example 2 With biotin labeling by nick translation in Example 1, the amount of dTTP used was changed from 0.5 ⁇ L to 1.5 ⁇ L, and the amount of Biotin-16-dUTP (Product No. 1093070, Roche, 50 nmol / 50 ⁇ L) A biotin-labeled cDNA solution having a final concentration of 1 ⁇ g / 250 ⁇ L was obtained in the same manner as in Example 1 except that the amount was changed from 1.5 ⁇ L to 0.2 ⁇ L.
- Biotin-16-dUTP Product No. 1093070, Roche, 50 nmol / 50 ⁇ L
- fluorescent dye-encapsulated particles having a maleimide group were obtained in the same manner as in Example 22, while a streptavidin solution was prepared in the same manner as in Example 22, and both were prepared in the same manner as in Example 22.
- Streptavidin-binding FITC dye-encapsulated melamine particles were obtained.
- the number of bright spots that can be measured immediately after staining did not decrease with the passage of time, and the dye resistance was high (see Table 3).
- Example 25 [Preparation of short-length DNA probe with biotin labeling rate of 13.33%]
- a 300-base cDNA (nucleic acid molecule) having a sequence related to the HER2 gene was prepared.
- Example 22 ⁇ Preparation of Streptavidin-labeled fluorescent dye-encapsulated polymelamine particles> Example 22 except that the amount of FITC (code P76012 manufactured by Takara Bio Inc.) was changed to 20.3 mg, and the amount of melamine resin raw material Nicarax MX-035 (manufactured by Nippon Carbide Industries, Ltd.) was changed to 0.81 g. Similarly, fluorescent dye-encapsulated polymelamine particles were prepared. In the obtained melamine particles, the melamine resin itself contains many amino groups in the skeleton. When an SEM observation was performed on 1000 of the obtained nanoparticles, the average particle size was 280 nm.
- fluorescent dye-encapsulated particles having a maleimide group were obtained in the same manner as in Example 22, while a streptavidin solution was prepared in the same manner as in Example 22, and both were prepared in the same manner as in Example 22.
- Streptavidin-binding FITC dye-encapsulated melamine particles were obtained.
- HER2-DNA clone having 200 bases was prepared by the method described in Bienko M_Nat Method 2013. That is, a HER2-selective sequence was found by database search, and a cDNA (nucleic acid molecule) having a base number of 200 was prepared from Forward primer (5′-ACGCCTGATGGGGTTAATGAG-3 ′) and Reverse primer (5′-agtagagaggcagggagcc-3 ′).
- Example 27 [Preparation of DNA probe with 5% biotin labeling]
- DNA nucleic acid molecule having 20 bases was prepared.
- Biotin labeling at 5 'end> In the same manner as in Example 12, 2 ⁇ g of the DNA prepared as described above was used to obtain DNA labeled with biotin at the 5 ′ end.
- 25 ⁇ L of the DNA labeled with biotin at the 5 ′ end (concentration 1 ⁇ g / 250 ⁇ L) and a solution containing phosphor-integrated nanoparticle-modified streptavidin are mixed, and a binding reaction is performed at room temperature for 30 minutes to detect HER-2 DNA probe (probe reagent A5) was obtained.
- Example 28 [Preparation of DNA probe with biotin labeling rate of 0.5%]
- a cDNA (nucleic acid molecule) having 200 bases was prepared in the same manner as in Example 26.
- ⁇ Preparation of Streptavidin-labeled fluorescent dye-encapsulated polymelamine particles> (Preparation of particles) The amount of SulfoRhodamine 101 (Sigma Aldrich) was changed from 20.3 mg to 14.4 mg, and the amount of melamine resin raw material Nicalak MX-035 (Nihon Carbide Industries, Ltd.) was changed from 0.81 g to 0.21 g. Except for the above, in the same manner as in Example 3, streptavidin-labeled fluorescent dye-encapsulated polymelamine particles were prepared.
- the average particle size was 158 nm.
- stacking nanoparticle which has the fluorescent dye which attached the maleimide to the terminal similarly to Example 3 was obtained. Cleaning and the like were performed in the same manner as in Example 3.
- Example 29 Hybridization was performed in FISH in the same manner as in Example 1 using the cDNA prepared before in Example 28 and labeled with biotin-labeled 5 ′ end (before binding to streptavidin of the phosphor-integrated nanoparticles). 50 ⁇ g of phosphor-aggregated nanoparticles bound to streptavidin prepared in Example 12 were added to the reaction system, and the cDNA in the reaction system after hybridization was fluorescently labeled. Other than that, similarly to Example 12, FISH, bright field observation, confocal fluorescence microscope observation, fluorescence microscope observation, and the like were performed.
- Example 30 Instead of a specimen slide of a HER positive staining control specimen (“HER2-FISH control slide Code PS-09006” manufactured by Pathology Laboratories) as a specimen slide, a tissue array of healthy persons (“FDA normal organ tissue microarray of human” manufactured by US Biomax) FISH, bright field observation, confocal fluorescence microscope observation, fluorescence microscope observation, and the like were performed in the same manner as in Example 24 using the product number FDA999b) and the probe reagent obtained in Example 24.
- HER2-FISH control slide Code PS-09006 manufactured by Pathology Laboratories
- FDA normal organ tissue microarray of human manufactured by US Biomax
- polymelamine particles with maleimide groups were obtained in the same manner as in Example 2, while a streptavidin solution was prepared in the same manner as in Example 2, and both were prepared in the same manner as in Example 2.
- Bound FITC dye-encapsulated melamine particles (phosphor-integrated nanoparticles) were obtained.
- Example 30 confocal fluorescence microscope observation and fluorescence microscope observation were performed.
- Example 32 [Preparation of DNA probe with biotin labeling rate of 0.21%] A 473-base cDNA (nucleic acid molecule) having an EGFR gene-related sequence was prepared in the same manner as in Example 31, and NickTranslation was performed in the same manner as in Example 31. However, NickTranslation was performed without adding Biotin-d-UTP, and the resulting DNA was biotinylated at the 5 ′ end in the same manner as in Example 12.
- the obtained liquid mixture containing phosphor-integrated nanoparticles having a fluorescent dye with a maleimide at the end was reacted to prepare a probe in which the phosphor-integrated nanoparticles were directly bonded to the 5 ′ end.
- the reaction solution of this probe was purified by a microspin column for nucleic acid purification (“MicroSpin S-200HR Column”, product number “# 27-5120-01” manufactured by GE Healthcare). To this solution, about 5.56 ⁇ L of 3M sodium acetate solution (pH 5.2) and 150 ⁇ L of 100% ethanol were added, and the mixture was allowed to stand at ⁇ 20 ° C. for 1 hour or longer.
- a precipitate was formed by centrifugation at 16000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. Furthermore, 500 ⁇ L of 70% ethanol was added and centrifuged at 16000 rpm for 1 minute at 4 ° C. to remove the supernatant. The precipitate was completely dissolved by adding 5 to 10 ⁇ L of distilled water to obtain a solution (final concentration 1 ⁇ g / 250 ⁇ L) of DNA (probe reagent A8) labeled with phosphor-integrated nanoparticles.
- Example 33 [Preparation of DNA probe with a labeling rate of 0.5%]
- the EGFR gene sequence number (Chromosome 7: 55,086,714-55,324,313) obtained by searching the gene database “e! Ensembl ASIA ” (http://asia.ensembl.org/index.html) is used as the probe search site “HD- FISH ”(URL: http://www.hdfish.eu/Find#probes.php) was input and searched, and 610 primer pairs of EGFR were found according to the method described in Bienko M_Nat Method 2013.
- Example 34 ⁇ Preparation of DNA probe with biotin labeling rate 5%> Specify a specific region of the human chromosome 7 (55086714th to 5543413) on the probe search site "HD-FISH" (URL: http://www.hdfish.eu/Find#probes.php) Thus, a unique sequence was searched, and the next unique sequence from the 55091671th to the 55091880th existing in the specific region was searched and obtained. Based on this sequence data, a request for nucleic acid synthesis was made, and a 20-base DNA (nucleic acid molecule) of the HER-2 gene-related sequence (5′-AGCTGGCCAGTTGAATTTG-3 ′) was prepared.
- the average particle size was 158 nm.
- stacking nanoparticle which has the fluorescent dye which attached the maleimide to the terminal similarly to Example 3 was obtained. Cleaning and the like were performed in the same manner as in Example 3.
- Example 30 confocal fluorescence microscope observation and fluorescence microscope observation were performed. (result) In the confocal microscope observation and the fluorescence microscope observation, only cells having two bright spots were observed, and the EGFR gene was properly detected even in the fluorescence microscope observation with lower detection sensitivity than the confocal microscope observation.
- Example 35 [Preparation of DNA probe with a labeling rate of 0.5%]
- the RET gene sequence number (Chromosome 10: 43584007-43585055) obtained by searching the gene database “e! Ensembl ASIA ” (http://asia.ensembl.org/index.html) is used as the probe search site “HD- FISH ”(http://www.hdfish.eu/Find#probes.php) was entered and searched, and 146 primer pairs of RET were found according to the method described in Bienko M_Nat Method 2013.
- a primer set of Forward primer (5′-TTCTGTGAGCATTTGCCTTG-3 ′) and Reverse primer (5′-CTCTTGACAATGTCCCCCTGG-3 ′), “Sprp made by Invitrogen” (2) Reverse transcription reaction using total RNA extracted from HT-29 cells as a template according to the protocol described in the product description of the reverse transcriptase, using (Registered Trademark II Reverse Transscriptase) and general commercially available PCR reagents.
- a 1048 base cDNA nucleic acid molecule having a sequence related to the RET gene was prepared.
- Example 36 [Preparation of DNA probe with a labeling rate of 0.49%]
- the MET gene sequence number (Chromosome 7: 116,312,444-116,438,440) obtained by searching the gene database “e! Ensembl ASIA ” (http://asia.ensembl.org/index.html) is used as the probe search site “HD- FISH ”(http://www.hdfish.eu/Find#probes.php), and 295 pairs of met proto-oncogene MET (MET) primer pairs according to the method described in Bienko M_Nat Method 2013 It was.
- FGFR2 selective sequences a primer set of forward primer (5′-ATGAGCTCTGCACACAGCCC-3 ′) and reverse primer (5′-TGAGTGGAGATGTGTCCCAGG-3 ′), “SuperScript (registered trademark) II Reverse Transtran TM” manufactured by Invitrogen , And a general commercial PCR reagent, and according to the protocol described in the product description of this reverse transcriptase, reverse transcription reaction was performed using total RNA extracted from HT-29 cells as a template, so that the MET gene-related sequence was A cDNA having 217 bases was prepared.
- a healthy human tissue array (“FDA normal organ tissue of human” product number FDA999b, manufactured by US Biomax) was used as a specimen slide.
- FDA normal organ tissue of human product number FDA999b, manufactured by US Biomax
- confocal fluorescence microscope observation and fluorescence microscope observation were performed. (result) In confocal microscopy and fluorescence microscopy, only cells with two bright spots were observed, and the FGFR2 gene was properly detected even in fluorescence microscopy with lower detection sensitivity than confocal microscopy.
- Example 38 [Preparation of DNA probe with biotin labeling rate of 0.21%]
- a 473-base cDNA (nucleic acid molecule) having an EGFR gene-related sequence was prepared in the same manner as in Example 31, and NickTranslation was performed in the same manner as in Example 31. However, NickTranslation was performed without adding Biotin-d-UTP, and the resulting DNA was biotinylated at the 5 ′ end in the same manner as in Example 12.
- reaction solution of this probe was purified by a microspin column for nucleic acid purification (“MicroSpin S-200HR Column” manufactured by GE Healthcare, product number “# 27-5120-01”).
- Example 38 Confirmation of DNA probe, storage of DNA probe, FISH, bright field observation, confocal fluorescence microscope, except that the final concentration in FISH of probe reagent F prepared in Example 3 was 5 ⁇ g / ⁇ L Observation and fluorescence microscope observation were performed. (result) Bright spots could be observed with a confocal fluorescence microscope and a fluorescence microscope, and the number of bright spots in the fluorescence microscope observation was 77 (Table 6).
- Example 39 Confirmation of DNA probe, storage of DNA probe, FISH, bright field observation, confocal fluorescence microscope, except that the final concentration of probe reagent F prepared in Example 3 in FISH was 1 ⁇ g / ⁇ L Observation and fluorescence microscope observation were performed. (result) Bright spots could be observed with a confocal fluorescence microscope and a fluorescence microscope, and the number of bright spots in the fluorescence microscope observation was 74 (Table 6).
- Example 40 Confirmation of DNA probe, storage of DNA probe, FISH, bright field observation, confocal, as in Example 3, except that the final concentration in FISH of probe reagent F prepared in Example 3 was 0.2 ⁇ g / ⁇ L Fluorescence microscope observation and fluorescence microscope observation were performed. (result) Bright spots could be observed with a confocal fluorescence microscope and a fluorescence microscope, and the number of bright spots in the fluorescence microscope observation was 62 (Table 6).
- Probes were made according to the method (PCR) described in the literature (Bienko M., Nat Method 2013, 122). Specifically, a database (www.hdfish.eu.) Described in the literature was accessed to display primer sequences that can hybridize to HER2. PCR was performed using the forward primer (5′-biotin-ACGCCTGATGGGTTAATGAG-3 ′) and the reverse primer (5′-aagtagaggcaggggagagcc-3 ′) according to the above document, and a DNA fragment having 217 bases was recovered.
- Streptavidin-labeled sulforhodamine 101-encapsulated melamine resin particles (phosphor-integrated nanoparticles) produced in Example 17 were used in Example 17 for the DNA fragment obtained by PCR and labeled with biotin at the 5 ′ end. By binding in the same manner, a DNA probe for detecting HER-2 (probe reagent X) having phosphor-integrated nanoparticles bound to the 5 ′ end was obtained.
- Example 42 DNA probe storage, FISH, bright field observation, confocal fluorescence microscope observation, and the like, except that the final concentration of probe reagent X prepared in Example 41 in FISH was 0.2 ⁇ g / ⁇ L. Fluorescence microscope observation etc. were performed. (result) Bright spots could be observed with a confocal fluorescence microscope and a fluorescence microscope, and the number of bright spots in the fluorescence microscope observation was 77 (Table 6).
- Example 43 DNA probe storage, FISH, bright field observation, confocal fluorescence microscope observation, and the like, except that the final concentration of probe reagent X prepared in Example 41 in FISH was 0.04 ⁇ g / ⁇ L. Fluorescence microscope observation etc. were performed. (result) Bright spots could be observed with a confocal fluorescence microscope and a fluorescence microscope, and the number of bright spots in the fluorescence microscope observation was 78 (Table 6).
- Probes were made according to the method (PCR) described in the literature (Bienko M., Nat Method 2013, 122). Specifically, a database (www.hdfish.eu.) Described in the literature was accessed to display primer sequences that can hybridize to HER2. PCR was performed using the forward primer (5'biotin-TGCTTCCaaccttggttttt) and the reverse primer (TGCAAGTGCaatacctgctc) according to the above document, and a DNA fragment of 3347 bases was recovered.
- PCR forward primer
- Streptavidin-labeled sulforhodamine 101-encapsulated melamine resin particles (phosphor-integrated nanoparticles) produced in Example 17 were used in Example 17 for the DNA fragment obtained by PCR and labeled with biotin at the 5 ′ end.
- a DNA probe probe reagent Y
- HER-2 phosphor-integrated nanoparticles were bound to the 5 ′ end was obtained.
- Example 45 DNA probe storage, FISH, bright field observation, confocal fluorescence microscope observation, and the like, except that the final concentration of probe reagent Y prepared in Example 44 in FISH was 0.2 ⁇ g / ⁇ L. Fluorescence microscope observation etc. were performed. (result) Bright spots could be observed with a confocal fluorescence microscope and a fluorescence microscope, and the number of bright spots in the fluorescence microscope observation was 77 (Table 6).
- Example 46 DNA probe storage, FISH, bright-field observation, confocal fluorescence microscope observation, and the like, except that the final concentration of probe reagent Y prepared in Example 46 in FISH was 0.04 ⁇ g / ⁇ L. Fluorescence microscope observation etc. were performed. (result) Bright spots could be observed with a confocal fluorescence microscope and a fluorescence microscope, and the number of bright spots in the fluorescence microscope observation was 79 (Table 6).
- Example 47 A DNA fragment having 20 bases was obtained by producing in the same manner as in Example 16, and then 5 'of the DNA fragment was labeled with biotin in the same manner as in Example 16. Next, the streptavidin-labeled sulforhodamine 101-encapsulated melamine resin particles (phosphor-integrated nanoparticles) produced in Example 17 were bound to the DNA fragment labeled with biotin at the 5 ′ end in the same manner as in Example 17. As a result, a DNA probe for detecting HER-2 (probe reagent Z) having phosphor-integrated nanoparticles bound to the 5 ′ end was obtained.
- Example 48 DNA probe storage, FISH, bright field observation, confocal fluorescence microscope observation, and the like, except that the final concentration in FISH of probe reagent Z prepared in Example 47 was 0.2 ⁇ g / ⁇ L. Fluorescence microscope observation etc. were performed. (result) Bright spots could be observed with a confocal fluorescence microscope and a fluorescence microscope, and the number of bright spots in the fluorescence microscope observation was 73 (Table 6).
- Example 49 DNA probe storage, FISH, bright field observation, confocal fluorescence microscope observation, and the like, except that the final concentration in FISH of the probe reagent Z prepared in Example 47 was 0.04 ⁇ g / ⁇ L. Fluorescence microscope observation etc. were performed. (result) Bright spots could be observed with a confocal fluorescence microscope and a fluorescence microscope, and the number of bright spots in the fluorescence microscope observation was 73 (Table 6).
- Example 50 A DNA fragment having 20 bases was obtained by producing in the same manner as in Example 16, and then 5 'of the DNA fragment was labeled with biotin in the same manner as in Example 16. Next, the streptavidin-labeled sulforhodamine 101-encapsulated melamine resin particles (phosphor-integrated nanoparticles) produced in Example 17 were bound to the DNA fragment labeled with biotin at the 5 ′ end in the same manner as in Example 17. As a result, a DNA probe for detecting HER-2 (probe reagent ZZ) having phosphor-integrated nanoparticles bound to the 5 ′ end was obtained.
- HER-2 probe reagent ZZ
- Example 38 the DNA probe (probe reagent ZZ) was confirmed in the same manner as in Example 27, and the final concentration of the prepared probe reagent ZZ-1 in FISH was 1.0 ⁇ g / ⁇ L. FISH, DNA probe storage, bright field observation, confocal fluorescence microscope observation, fluorescence microscope observation, and the like were performed.
- Example 51 DNA probe storage, FISH, bright-field observation, confocal fluorescence microscope observation, and the like, except that the final concentration of the probe reagent ZZ prepared in Example 50 in FISH was 0.2 ⁇ g / ⁇ L. Fluorescence microscope observation etc. were performed. (result) Bright spots could be observed with a confocal fluorescence microscope and a fluorescence microscope, and the number of bright spots in the fluorescence microscope observation was 60 (Table 6).
- Example 52 DNA probe storage, FISH, bright field observation, confocal fluorescence microscope observation, and the like, except that the final concentration in FISH of the probe reagent ZZ prepared in Example 50 was 0.04 ⁇ g / ⁇ L. Fluorescence microscope observation etc. were performed. (result) Bright spots could be observed with a confocal fluorescence microscope and a fluorescence microscope, and the number of bright spots in the fluorescence microscope observation was 48 (Table 6).
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Abstract
Description
また、発明者らは、BACプローブを用いたFISHでは非特異的吸着による誤検出が起きてしまうという上記問題に着目した。
また、たとえば塩基数5000以下の範囲、特に塩基数4000以下の短い核酸分子や塩基数500以下の短い核酸分子を有するFISH用のプローブを用意して、特定遺伝子の5000塩基配列領域に対してハイブリダイゼーションを実施した場合に、蛍光輝度が足りずに目的の遺伝子を検出できないケースがある。
さらに、別の側面としての本発明は、
従来のBACプローブと比べて、短く且つ同等以下の標識率のプローブ(例;BACクローン由来のプローブ)でありながら、従来のBACプローブと同等以上の輝度を達成しつつ、且つ、FISHでのハイブリダイゼーションに悪影響が及びにくい上記プローブを得ることを目的とする(課題2)。
高い標識率達成が困難なBACクローンの場合には有効であるとともに、検出対象とする核酸配列によっては短いBACクローンしか選択肢のない場合にも有効である。
さらに、本発明者らは、BACプローブと比べて短いプローブ(例;BACクローン由来のプローブ)の末端および/または末端以外の1~50か所に蛍光体集積ナノ粒子を所定の方法で結合させたときに上記課題2,3が解決できることを見出した。
さらに、本発明者らは、この蛍光シグナルを得る際に、標識率の少ないBACプローブ、またはBACプローブと比べて短く且つ同等以下の標識率のプローブを用いてFISHのハイブリダイゼーション処理を行った後、ハイブリダイズした各核酸分子に対して複数の蛍光体を集積した蛍光体集積ナノ粒子で蛍光染色することで、蛍光体の褪色を防止することができ、本発明のより好ましい実施形態とすることができることなどを見出し、本発明を完成させるに至った。
また、上述した目的の少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映したインサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬は、塩基数4000以下の所定の核酸配列の核酸分子に対して、蛍光体を集積してなる蛍光体集積ナノ粒子を核酸末端標識法により結合して得られるインサイチュハイブリダイゼイション用のプローブ試薬である。
また、上述した目的の少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映したFISHは、BACプローブの配列を有し第1の生体分子が末端または該末端以外の1~50か所に連結された塩基数5000以下の核酸分子を染色体上の特定領域の配列に対してハイブリダイゼーションを行った後に、第1の生体分子と特異的に結合可能な第2の生体分子が連結した蛍光体を前記ハイブリダイゼーションの反応系に複数添加して前記核酸分子を蛍光標識するFISHである。
上述した目的の少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映したインサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬は、所定の核酸配列の核酸分子1モルに対して、蛍光ナノ粒子(例;半導体ナノ粒子など)を20000モル以上結合したことを特徴とする、インサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬である。
《蛍光体集積ナノ粒子を有するFISH用のプローブ試薬》
本発明に係るFISHのプローブ試薬は、蛍光体を集積してなる蛍光体集積ナノ粒子、所定の核酸配列の核酸分子とが結合したインサイチュハイブリダイゼイション用のプローブ試薬である。
核酸分子は、染色体上の特定領域の一部または全部を含む配列(プローブ配列)を有する核酸分子である。核酸にはDNA、RNA(mRNA,tRNA,miRNA,siRNA,non-cording-RNAなど)等の天然に存在する核酸やPNA、LNA(又はBNA:Bridged Nucleic Acid)等の人工核酸が含まれる。したがって、核酸分子は、染色体上の核酸配列と相補鎖を形成できるものであれば制限がない。核酸分子は、天然の核酸、人工核酸、または天然の核酸と人工の核酸とが連結した核酸の分子であってもよい。
また、上述した核酸分子の入手方法とは異なり、PNA、LNA(又はBNA:Bridged Nucleic Acid)等の人工核酸を利用して、プローブとして使用可能な配列を有するプローブ(核酸分子)を人工的に合成することによって核酸分子を入手することもできる。
蛍光体集積ナノ粒子は、蛍光体を集積したものである。このような蛍光体集積ナノ粒子を用いることで、蛍光体自体と比較して、1粒子当たりの発する蛍光の量、すなわち所定の生体分子を標識する輝点の輝度を高めることができる。
本明細書において「蛍光体」とは、外部からのX線、紫外線または可視光線の照射を受けて励起し、励起状態から基底状態に到る過程において光を発光する物質一般を指す。したがって、本発明にいう「蛍光体」は、励起状態から基底状態に戻るときの遷移態様の如何を問うものでなく、励起一重項からの失活に伴う発光である狭義の蛍光を発する物質であってもよいし、三重項からの失活に伴う発光である燐光を発する物質であってもよい。
蛍光体としての使用可能な有機蛍光体の例としては、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Alexa Fluor(登録商標、インビトロジェン社製)系色素分子、BODIPY(登録商標、インビトロジェン社製)系色素分子、カスケード(登録商標、インビトロジェン社)系色素分子、クマリン系色素分子、NBD(登録商標)系色素分子、ピレン系色素分子、Texas Red(登録商標)系色素分子、シアニン系色素分子、ペリレン系色素分子、オキサジン系色素分子等、有機蛍光色素として知られている物質を挙げることができる。
蛍光体として使用可能な無機蛍光体の例としては、II-VI族化合物、III-V族化合物、又はIV族元素を成分として含有する量子ドット(それぞれ、「II-VI族量子ドット」、「III-V族量子ドット」、「IV族量子ドット」ともいう。)のいずれかを挙げることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。量子ドットは、市販されているものでもよい。
蛍光体を集積した蛍光体集積ナノ粒子の製造方法は、特に制限されず、公知の方法により製造することができる。一般的には、樹脂またはシリカを母体として蛍光体をまとめ上げる(当該母体の内部または表面に蛍光体を固定化する)製造方法を用いることができる。
蛍光体集積ナノ粒子の粒子径は、蛍光観察できる範囲の平均粒子径であれば制限がないが、好適に蛍光観察する観点から、前記蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径が40nm以上300nm以下であることが好ましい。
有機蛍光体を用いた蛍光体集積ナノ粒子の製造方法として、蛍光体である蛍光色素を樹脂からなる母体の内部または表面に固定した、直径がナノメートルオーダーの樹脂粒子を形成させる方法を挙げることができる。この蛍光体集積ナノ粒子の調製方法は特に限定されるものではないが、例えば、蛍光体集積ナノ粒子の母体をなす樹脂(熱可塑性樹脂または熱硬化性樹脂)を合成するための(コ)モノマーを(共)重合させながら、蛍光体を添加し、当該(共)重合体の内部または表面に当該蛍光体を取り込ませる方法を用いることができる。
無機蛍光体を用いた蛍光体集積ナノ粒子の製造方法として、蛍光体である量子ドットをシリカからなる母体の内部または表面に固定した、シリカナノ粒子を形成させる方法が挙げられる。この製造方法は、ニュー・ジャーナル・オブ・ケミストリー 33巻 561ページ(2009)に記載されているCdTe内包シリカナノ粒子の合成を参考にすることができる。
核酸分子と蛍光体集積ナノ粒子との結合は、FISHに支障がなければ特に制限なく、様々な結合とすることができる。この核酸分子と蛍光体集積ナノ粒子の結合は、核酸分子に蛍光体集積ナノ粒子を直接結合する方法、または生体分子同士の結合を介して間接的に結合する方法のいずれでもよい。
直接結合する方法の例としては、核酸分子の5'末端のリボースC5位に結合したリン酸の水酸基または核酸分子の3'末端のリボースのC1位に結合した水酸基を公知のチオール基導入試薬によりチオール基(SH基)に置換し、マレイミドで標識された蛍光体集積ナノ粒子を反応させて、両者を結合する方法が挙げられる。
間接的に結合する方法は、生体分子(第1,2の生体分子)同士の結合を介して核酸分子と蛍光体集積ナノ粒子とを結合させる方法である。生体分子同士の結合として、例えば第1の生体分子としてのストレプトアビジンと第2の生体分子としてのビオチンの結合を用いる場合、上記の間接的な結合は、例えば以下のようにしてビオチン標識された核酸分子と、ストレプトアビジンで修飾された蛍光体集積ナノ粒子とを調製し、両者を結合させることで達成される。
(1)ニックトランスレーション法
核酸分子の特定の塩基(例えばチミン(T))を第1の生体分子(ビオチン等)で標識されたヌクレオチド(例えばBiotin-16-dUTP)にニックトランスレーションにより置換し、この核酸分子のビオチンに対して、(ストレプト)アビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子を結合させる方法を例示できる。
この場合のニックトランスレーションは、常法(例えば、「細胞工学別冊・実験プロトコールシリーズ FISH実験プロトコール」、第2部、第2章、松原謙一他監修、秀潤社、1994等)に従って、ビオチン標識されたヌクレオチド(ベーリンガー社製「biotin-16-dUTP」等)を用いて行うことができる。
また、上記とは別の方法として、核酸分子の末端(5’末端または3’末端)に第1の生体分子(ビオチン等)を導入する以下(2-1)~(2-2)の方法を例示することができる。
(2-1)PCR法を利用する方法
鋳型からPCR法によりプロ―ブ(核酸分子)を調製する際に、PCR法で使用するプライマーとして、5’末端または3’末端の部分にビオチン-dNTP(Nはアデニンン(A),グアニン(G),シトシン(C),チミン(T),ウラシル(U)のいずれかである)を有するプライマーを使用することにより、5’末端または3’末端が第1の生体分子(例;ビオチン)標識されたプローブ(核酸分子)を調製することができ、このプローブに第2の生体分子(例;アビジン)を有する蛍光体集積ナノ粒子を反応させることにより、前記プローブ(核酸分子)と蛍光体集積ナノ粒子を1:1で結合させることができる。上記鋳型としては、BACクローンのものでもよいし、ヒト等のゲノムDNAを使用することもできる。
キット等により核酸分子の5’末端あるいは3’末端に第1結合基(例;チオール基)を導入し、この第1結合基と結合可能な第2結合基(例;マレイミド基)を有する分子であって第1の生体分子(例;ビオチン等)を有する分子を結合反応させることにより、核酸分子の5’末端または3’末端を第1の生体分子で標識することができる。この核酸分子に第2の生体分子(例;アビジン)を有する蛍光体集積ナノ粒子を反応させることにより、前記プローブ(核酸分子)と蛍光体集積ナノ粒子を結合させることができる。
上記リンカーとしては、例えば、Biotin PEG Maleimide(Nanocs社 )の、cord PG2-BNML-10k, PG2-BNML-5k, PG2-BNML3k, PG2-BNML-2k, PG2-BNML-1k等を使用することができる。
上記(2-1)PCR法を利用する方法に準じて、PCR法で使用するプライマーとして末端未標識プライマーを使用し、作成されたプローブ(核酸分子)に対して、「PlatinumBright Nucleic Acid Labeling Kit」(製品番号GLK-007,フナコシ社製)を反応することで、複数のビオチン標識をすることも可能である。
核酸分子に蛍光体集積ナノ粒子を複数結合させることにより、本発明に係る別のプローブ試薬を得る場合、この結合については、例えば上述したようにニックトランスレーションにより、核酸分子に含まれる複数の特定の塩基(例えばチミン(T))を第1の生体分子(ビオチン等)で標識し、このビオチンに対して第2の生体分子(ストレプトアビジン等)で標識された蛍光体(例えばストレプトアビジンで修飾された蛍光体集積ナノ粒子)を結合させることで行うことができる。
核酸分子に対する蛍光体の標識率は、(核酸分子に結合した蛍光体の分子数/該核酸分子1分子が有する全塩基数)×100(%)で表される。
前記核酸分子と前記蛍光体集積ナノ粒子との結合のモル比は、FISHにおける蛍光顕微鏡観察で蛍光シグナルがサチレーションせずに輝点観察できる範囲であれば特に限定されないが、前記核酸分子:前記蛍光体集積ナノ粒子の好ましいモル比は、1:1~1:5000、より好ましくは1:1~1:2000、より好ましくは1:1~1:550、さらに好ましくは1:1~1:100、さらに好ましくは1:1~1:40である。核酸分子1分子あたりに少なくとも1個の蛍光体集積ナノ粒子が必要であり、また十分な輝度の蛍光シグナルを観察できるようにするためには核酸分子1分子あたりに100個の蛍光体または蛍光体集積ナノ粒子が結合していれば十分である。なお、核酸分子1分子あたりに複数の蛍光体または蛍光体集積ナノ粒子が結合した場合でも、それらは1つの輝点として観察され、検出対象とする遺伝子1コピーが存在するものと判別することができる。
前記核酸分子:前記蛍光体集積ナノ粒子(モル比)=1:2のプローブ試薬は、上述したように核酸分子の5'末端および3'末端に蛍光体集積ナノ粒子を結合させることで作成することができる。
核酸分子中のアデニン(ATP)を置換してビオチン標識する場合は、上記ヌクレオチド基質として、Biotin-11-dATP 、Biotin-14-dATP 、Bio-7-dATP (Biotin-7-2'-deoxyadenosine-5'-triphosphate)、BIOTIN-N6-ATP等を使用することができる。
本発明に係る別のインサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬は、所定の核酸配列の核酸分子1モルに対して、半導体ナノ粒子を20000モル以上結合したことを特徴とする。
上記核酸分子としては、蛍光体集積ナノ粒子を有するプローブ試薬について前述した際に説明した核酸分子を使用することができるのでその説明を省略する。
上記半導体ナノ粒子としては、例えば、前述した量子ドットを使用することができ、具体的には「Qdot(登録商標)」(インビトロジェン社製)等を使用することができる。
上記半導体ナノ粒子の粒子径は、上記結合モル比の範囲で核酸分子と結合したプローブ試薬でFISHを行った際に蛍光顕微鏡で蛍光観察できる範囲の平均粒子径であれば制限がないが、プローブの核酸分子と検出対象であるターゲットの遺伝子(例;組織切片中のHER2遺伝子等)とのハイブリダイゼーションに悪影響を及ぼさないようにする観点から、蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径より小径の40nm未満のものであることが好ましく、10~20nmの半導体粒子がより好ましい。
核酸分子と半導体ナノ粒子との結合は、FISHに支障がなければ特に制限なく、様々な結合とすることができる。この核酸分子と半導体ナノ粒子の結合は、核酸分子に半導体ナノ粒子を上記モル比範囲で直接結合する方法、または生体分子同士の結合を介して間接的に結合する方法のいずれでもよい。
直接結合する方法の例としては、例えば、第1の結合基(例;マレイミド等)を有する核酸の基質を用いて核酸分子に対してニックトランスレーションを行い、核酸分子に第1結合基を導入し、第1結合基に結合可能な第2結合基(例;チオール基等)を有する量子ドットを反応させて結合する方法である。マレイミド基を有する核酸基質(マレイミド-dNTPs)は、例えば、日本(株)遺伝子研究所等により受託合成を依頼して購入したものを用いることができる。
直接結合する方法の例としては、例えば、第1生体分子(例;ビオチン等)を有する核酸の基質(例;上述したdUTP-ビオチン等)を用いて、核酸分子(特に核酸の塩基数2万以上のもの)に対してニックトランスレーションを行い、核酸分子に第1生体分子を導入し、第1生体分子に結合可能な第2生体分子(例;ストレプトアビジン等)を有する量子ドットを反応させて結合する方法である。このとき、第1の生体分子と第2の生体分子は直接的に結合可能であってもよく、第3の分子・物質を介して結合可能であってもよい。
前記核酸分子と前記半導体ナノ粒子との結合のモル比は、前記核酸分子1モルに対して、少なくとも、前記半導体ナノ粒子を20000モル以上結合させることにより、半導体ナノ粒子を有するFISH用のプローブ試薬を用いてFISHを行った際に蛍光顕微鏡でも十分な輝点を観察できる程度の輝度を確保することができる。
〔染色方法〕
以下、FISHについて述べる。FISHは特に限定されず、公知の方法を用いることができる。以下の記載は、本発明における実施形態の一例である。
検体スライドは、例えばがんが疑われる被験者(ヒト、イヌ、ネコ等)の組織について一般的な病理組織診断に用いる方法で調製することができる。まず、被験者の組織を、ホルマリン等を用いて固定し、アルコールで脱水処理した後、キシレン処理を行い、高温のパラフィン中に浸しパラフィン包埋を行い、組織試料を作製する。続いて、上記組織試料を3~4μmの切片にし、スライドガラス上に載置したものを検体スライドとする(図2、3参照)。
キシレンまたはその他の脱パラフィン剤を入れた容器に検体スライド上の組織切片を浸漬させ、パラフィンを除去する(図2、3参照)。このときの温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。次いで、エタノールを入れた容器に該切片を浸漬させ、キシレンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。次いで、水を入れた容器に該切片を浸漬させ、エタノールを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
BACプローブまたはBACプローブと比べて短いプローブ(例;BACクローン由来のプローブ)をハイブリダイゼーション反応する前に、加熱処理、酸処理、酵素処理、活性剤による処理など、プローブ試薬が効率的に組織切片上の核酸に到達できるようにするための前処理を施すことが知られている。これらの処理条件や組合せは、切片の種類・厚さ・スライド調整条件などにより、最適条件が異なるので、適宜手順を決定する必要がある。すべての処理を必ず実施する必要があるわけではなく、例えば酵素処理を実施しないという選択肢もありうる。
上記の酵素処理の後など必要であれば前処理の各ステップで、検体スライドを固定するため、例えば以下のような手順の処理を行う。まず、検体スライドをホルマリン溶液に一定時間浸漬する。次いで、洗浄緩衝液に浸漬して洗浄し、この操作を2回繰り返す。その後、検体スライドを風乾等により乾燥させる。
上記の固定処理の後、切片上に存在するDNAを変性する(二本鎖DNAから一本鎖DNAにする)ため、例えば以下のような手順の処理を行う。まず、検体スライドを変性溶液(ホルムアミド/SSC溶液等)に72℃程度で所定の時間、浸漬する。その後、検体スライドを取り出し、ホルムアミドを除去するため、濃度を徐々に高めた数段階のエタノール(例えば70%エタノール水溶液、80%エタノール水溶液および100%エタノール)に浸漬する。その後、検体スライドを風乾等により乾燥させる。
上述したプローブ試薬を用いて、公知のFISH(例えば「アジレントFISH General PurposeReagentsプロトコル」や、「臨床FISHプロトコール―目で見る染色体・遺伝子診断法 (細胞工学別冊―実験プロトコールシリーズ」等)と同様に、ハイブリダイゼーション処理を行うことができる(図2、3参照)。ここで、用語「ハイブリダイゼーション」は、二本鎖分子の形成のための二本のDNA又はDNAとRNA相補鎖の結合過程、または形成された2本鎖の分子を意味する。
ハイブリダイゼーション処理の後、通常はさらに、細胞数をカウントするための核染色処理を行う。核染色試薬としてはDAPIが一般的であるが、これ以外にもHoechst 33258、Hoechst 33342などのビスベンズイミド誘導体やその他の核染色試薬を用いてもよい。例えば、核染色試薬としてDAPIを用いる場合は、次のような手順で核染色を行うことができる。まず、ハイブリダイゼーション処理を行った検体スライドを脱イオン水、リン酸液緩衝生理食塩水(PBS)で順次洗浄する。次いで、DAPI染色試薬(2μg/PBS)に一定時間浸漬する。
FISHによる染色処理および核染色処理を終えた検体スライドは、PBSで数回洗浄し、風乾または脱水処理を行った後、組織切片上に封入剤を滴下し、カバーガラスを被せ、乾燥させる封入処理を行う。以上の処理により作製された封入済みの検体スライドが、病理診断等を行うためのプレパラートとなる。
染色した上記切片に対し蛍光顕微鏡を用いて、広視野の顕微鏡画像から蛍光の輝点の数又は発光輝度を計測する。用いた蛍光物質の吸収極大波長及び蛍光波長に対応した励起光源及び蛍光検出用光学フィルターを選択する。輝点数又は発光輝度の計測は、市販の画像解析ソフト、例えば、株式会社ジーオングストローム社製の全輝点自動計測ソフトG-Countを用いて行うことができる。なお、顕微鏡を使用した画像解析自体は周知であり、例えば、特開平9-197290に開示される手法を用いることができる。顕微鏡画像の視野は、3mm2以上であることが好ましく、30mm2以上であることがさらに好ましく、300mm2以上であることがさらに好ましい。顕微鏡画像から計測された輝点数、及び/又は発光輝度に基づいて、目的とする特定の遺伝子のコピー数を評価する。具体的には、例えば、コピー数が1~2つであれば正常であり、3つ以上であれば異常(増殖)が生じていると評価することができる。
(1)本発明に係るプローブ試薬によれば、核酸分子(例;BACプローブ、またはBACプローブと比べてより短く且つ標識率が同等以下のプローブ(例;BACクローン由来のプローブ))に対し、蛍光体を集積して発光輝度を高めた蛍光体集積ナノ粒子を結合させ標識した構成であるので、標識率が従来のBACプローブと同等以下のものであっても、従来の標識率の高いBACプローブ以上に発光輝度を高めることができ、組織切片のより深層に位置する輝点をも同時に検出することが可能となる。また、FISHを行った組織切片のスライドについて、輝点の検出が可能な状態でより長く維持することが可能となる。
なお、ビオチン標識した核酸基質を用いるニックトランスレーション法により核酸分子をビオチン標識する際に、ビオチン標識した核酸基質の使用量を調節することで標識率を下げることができるので、このような方法で上記標識率が低い核酸分子を得るようにしてもよい。
〔ビオチン標識率13.3%のBACプローブの調製〕
CellBiochemBiophys.2006;45(1)59の記載の方法に従って、以下のように核酸分子を調製した。GSP社から購入したHER2-DNAクローン(約150kbp)1μg(5μL)に対して、ニックトランスレーション用のキット(製品名「GSP-ニックトランスレーションキット」K-015、GSP社製)のプロトコールに従い、以下のようにニックトランスレーション法により、HER2のDNAクローン(核酸分子)のdTTPをビオチン標識dUTPで置換した。
まず、下記の試薬を遠心チューブ内で混合した。
・10×NickBuffer(Tris-HCl[pH7.2]、MgSO4、DTT)・・・2.5μL
・BSA(Nuclease-free BSA)・・・1.5μL
・dNTP mix(dATP、dCTP、dCTP)・・・5μL
・dTTP・・・0.5μL、
・Biotin-16-dUTP(製品番号1093070、Roche社製、50nmol/50μL)・・・1.5μL
・純水(Nuclease free water)・・・3μL
・上記HER2-DNAクローン約150kbp 1μgの水溶液・・・5μL
・DNA PоlymeraseI(Tris-HCl[pH7.5]、EDTA、DTT、glycerоl)・・・1μL
・DNaseI・・・5μL
上記ニックトランスレーションによりビオチン標識したBACプローブ25μL(濃度1μg/250μL)、ストレプトアビジンで表面修飾された平均粒子径15nmのQdot(登録商標、Quantum Dot Corporation社製)を1.0μL(50nmol/50μL)含む溶液を混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬A)を得た。
このDNAプローブの確認は、0.5%のTBEを含む2%アガロースゲルで0.5%の変性バッファーTris-Borate-EDTA(TBE)中で電気泳動を行う電気泳動シフトアッセイにより行った。一本鎖のDNAを、SYBR GreenII(Molecular Probes, Eugene,OR)によりカウンター染色した。そして、Q-dоtとDNAの移動パターンを、「MultiImager FX System」(Bio-Rad,Hercules,CA)を使用して、以下のように決定した。
上述のように得られたDNAプローブをハイブリダイゼーション緩衝液(25%脱イオン化したホルムアミド、2×SSC、200ng/μLサケ精子DNA、5×デンハルト溶液、50mMのリン酸ナトリウム、pH7.0、1mMEDTA)に終濃度1~5ng/μLとなるように希釈した。必要に応じて、S300サイズのスピンカラム(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)により遊離のリガンド(遊離しているストレプトアビジン、ビオチン、およびdATPの基質)を除去した。直ぐに使用しない場合、DNAプローブを-20℃で冷凍保存した。
FISHによりHER2遺伝子のコピー数を測定した。FISHは以下に示すように、脱パラフィン処理、検体スライドの前処理、酵素処理、検体の固定処理、プローブの準備、検体スライドのDNAの変性処理、ハイブリダイゼーション処理、スライドグラスの洗浄処理、およびDAPI染色処理をこの順で行うことで実施した。
HER2陽性染色対照標本の検体スライド(パソロジー研究所社製「HER2-FISHコントロールスライド Code PS-09006」)を、以下の(1)~(4)の順で処理することで脱パラフィン処理を行った。(1)ヘモディー(Hemo-De)に常温で10分間浸漬する。(2)検体スライドを新しいHemo-Deに常温10分間浸漬する。同じ操作を3回繰り返す。(3)検体スライドを100%エタノールで常温で5分間浸漬し、2回洗浄し、脱水処理を行う。(4)検体スライドを風乾または45~50℃のスライドウォーマー上で乾燥させる。
DNAプローブの到達性を向上させるために、上記検体スライドに対し以下の(1)~(6)の順で前処理を行い、細胞膜及び核膜の蛋白質の除去を行った。(1)検体スライドを0.2mоl/L HClで室温、20分間処理する。(2)検体スライドを精製水に3分間浸漬する。(3)検体スライドを洗浄緩衝液(2xSSC:standard sailine citrate)に3分間浸漬する。(4)検体スライドを80℃の前処理溶液(1N NaSCN)に30分間浸漬する。(5)検体スライドを精製水に1分間浸漬する。(6)検体スライドを洗浄緩衝液(2xSSC)に5分間浸漬し、この浸漬操作を2回繰り返す。
前処理を行った検体スライドに対して、以下の(1)~(4)の処理をこの順で行うことで酵素処理を行った。(1)前処理した検体スライドを取り出し、ペーパータオルにスライドグラスの下端をつけて余分な洗浄緩衝液を取り除く。(2)検体スライドを37℃に加温したプロテアーゼ溶液に10~60分間浸漬する。この浸漬処理は、細胞膜及び核膜のタンパク質、特にコラーゲンの分解をするために、25mg プロテアーゼ(2500-3000Units/mg)[ペプシン]/1M NaCl[pH2.0]50mLで37℃、60分間)で処理することが望ましい。(3)検体スライドを洗浄緩衝液に5分間浸漬する。この操作を2回繰り返す。(4)検体スライドを風乾または45~50℃のスライドウォーマー上で2~5分間乾燥させる。
検体の固定処理として、前処理を行った検体スライドに対して以下の(1)~(3)の処理を行った。(1)検体スライドを10%中性緩衝ホルマリン(和光純薬社製「4%パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液」、製品番号163-20145)に常温で10分間浸漬する。(2)検体スライドを洗浄緩衝液に5分間浸漬する。これと同じ操作を2回繰り返す。(3)検体スライドを風乾または45~50℃のスライドウォーマー上で2~5分間乾燥させる。
冷凍保存しておいたDNAプローブ(プローブ試薬A)の溶液を室温に戻し、正確な容量を採液可能なピペッティング操作ができる程度まで溶液の粘度を十分にさげて、ボルテックスミキサー等で溶液を混和した。
検体スライド上のDNAの変性処理として、検体の固定処理を行った検体スライドに対して以下の(1)~(8)の処理を行った。(1)検体スライドの作成前に水で湿らせたペーパータオルを底に敷いた湿潤箱(気密性の容器であり、その側面をペーパータオルでテーピングしたもの)を37℃インキュベータ内に載置して予備加熱する。(2)変性溶液(70% ホルムアミド/SSC[150mM NaCl、15mMクエン酸ナトリウム])のpHが常温でpH7.0~8.0であることを確かめる。変性溶液をコプリンジャーに入れ、溶液が72℃±1℃になるまで温浴槽で加温する(72±1℃の温浴槽に少なくとも30分間置く)。(3)ハイブリダイゼーション領域がどの部分か分かるように、検体スライドの裏側に領域を囲むようにダイアモンドペン等でマークする。(4)検体スライドを72±1℃の変性溶液の入ったコプリンジャー中に浸漬し、検体スライドのDNAを変性する。(5)ピンセットを使って、検体スライドを変性溶液から取り出し、すぐに常温の70%エタノール中に入れる。ホルムアミドを除くためにスライドを振盪する。検体スライドを1分間浸漬する。(6)検体スライドを70%エタノールから取り出し、85%エタノール中に入れ、ホルムアミドを除くためにスライドを振盪する。検体を1分間浸漬する。100%エタノールで同じ操作を2回繰り返す。(7)ペーパータオルに検体スライドグラスの下端をつけてエタノールを取り除き、ペーパータオルでスライドグラスの裏側を拭く。(8)検体スライドをドライヤーで風乾または45~50℃のスライドウォーマーで2~5分間乾燥させる。
上記変性処理を行った検体スライドに対して以下の(1)~(3)の処理をこの順で行うことで、検体スライドに対して上述したように調製したDNAプローブ10μL(10~50ng)を用いてハイブリダイゼーション処理を行った。(1)検体スライドのハイブリダイゼーション領域に調製した上記DNAプローブを10μL添加し、すぐに、22mm×22mmのカバーグラスをプローブの上に被せ均一にプローブを広げる。ハイブリダイゼーション領域に気泡が入らないようにする。(2)ペーパーボンドでカバーグラスをシールする。(3)前もって加温した湿潤箱に検体スライドを入れて蓋をして37℃のインキュベータで14~18時間ハイブリダイゼーションを行う。
上記ハイブリダイゼーション処理を行った検体スライドに対して以下の(1)~(6)の処理をこの順で行うことで、検体スライドの洗浄処理を行った。(1)ポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液(2×SSC/0.3%NP-40)をコプリンジャーに入れる。ポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液が72℃±1℃になるまで温浴槽で予備加熱をする(72℃±1℃の温浴槽に少なくとも30分間置く)。(2)ポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液を入れたコプリンジャーをもうひとつ用意し、常温に維持する。(3)ピンセットでペーパーボンドのシールを取り除く。(4)検体スライドをポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液の中に入れる。カバーグラスは自然に溶液中で剥がれるのを待つ。(5)溶液から検体スライドを取り出し、余分な溶液を取り去り、72±1℃に加温したポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液に2分間浸す。ここで、73℃を超える温度や処理時間として2分を超えないようにするのが望ましい。(6)コプリンジャーから検体スライドを取り出し、遮光下(締め切った引出や締め切ったキャビネットの棚等)で風乾する。
DAPI染色は以下のように行った。まず、10μLのDAPI対比染色液を検体スライドのハイブリダイゼーション領域に添加した。次に、ハイブリダイゼーション処理した後、細胞数をカウントするためにDAPI染色(2μg/mLPBS)を25℃、10分間行うことで細胞核を染色し、カバーガラスを被せて、シグナルの計測まで検体スライドを遮光して保存した。DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) はMolecular Probes社(D1306)を使用した。
<明視野観察>
上記で作製した検体スライドについて、光学顕微鏡(カールツァイス社製「Imager」)を用いて第一の免疫染色の染色画像を取得した。
上記作製しFISHを行った検体スライドについて、共焦点顕微鏡Zeiss LSM780(カールツァイスマイクロスコピー GmbH社製)を用いてハイブリダイズしたDNAプローブのQ-dоtを励起し、Q-dоtからの蛍光を測定波長655nmで検出して、蛍光の測定、蛍光画像(蛍光静止画像)および輝点数の計測を取得した。なお、焦点深度を3.6μm、3.15μm、および2.7μmと変更してそれぞれ撮像を行った。
蛍光顕微鏡観察は、上述のようにFISHを行った切片を、蛍光顕微鏡Zeiss imager(Camera:MRmモノクロ・冷却機能付、対物レンズ×60油浸)を用いて、蛍光顕微鏡観察(600倍)を行い、蛍光の測定、蛍光画像(蛍光静止画像)および輝点数の計測を行った。
蛍光顕微鏡観察において、検体スライドの断面に対する深さ方向にピントを合わせていくことで、深い位置の輝点が確認された。
〔ビオチン標識率13.3%のBACプローブの調製〕
上述した実施例1と同様の手順で、最終濃度1μg/250μLのビオチン標識された塩基数15万のBACプローブ(核酸分子)の溶液を得た。
上述のようにビオチン標識したBACプローブ25μL(濃度1μg/250μL)、FITC修飾ストレプトアビジン(Streptavidin,FITC Conjugate(1mgフナコシ SA-5001)を1.0μL(50nmol/50μL)含む溶液を混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬B)を得た。
このDNAプローブの確認は、0.5%のTBEを含む2%アガロースゲルで0.5%の変性バッファーTris-Borate-EDTA(TBE)中で電気泳動を行う電気泳動シフトアッセイにより行った。一本鎖のDNAを、SYBR GreenII(Molecular Probes, Eugene,OR)によりカウンター染色した。そして、DNAの移動パターンを、「MultiImager FX System」(Bio-Rad,Hercules,CA)を使用して、以下のように決定した。
また、BACプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、FITCのストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記BACプローブのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、1:20000であった。
<FISH>
実施例1と同様にFISHを行った。
上記で作製した検体スライドについて、光学顕微鏡(カールツァイス社製「Imager」)を用いて第一の免疫染色の染色画像を取得した。
上記作製しFISHを行った検体スライドについて、共焦点顕微鏡Zeiss LSM780(カールツァイスマイクロスコピー GmbH社製)を用いてハイブリダイズしたDNAプローブのFITCを488nmで励起し、FITCからの蛍光を測定波長530nmで検出して、蛍光の測定、蛍光画像(蛍光静止画像)および輝点数の計測を取得した。なお、焦点深度を5.95μm、4.95μm、および4.5μmと変更してそれぞれ撮像を行った。
蛍光顕微鏡観察は、実施例1と同様に行った。
<結果考察>
蛍光顕微鏡観察において輝点が確認された。
〔ビオチン標識率1.33%のBACプローブの調製〕
ニックトランスレーションによるビオチン標識でdTTPの使用量を0.5μLから1.5μLに変更し、Biotin-16-dUTP(製品番号1093070、Roche社製、50nmol/50μL)の使用量を1.5μLから0.2μLに変更したこと以外は、実施例1と同様に最終濃度1μg/250μLのビオチン標識された塩基数15万のBACプローブ(核酸分子)の溶液を得た。
上述のようにビオチン標識したBACプローブ25μL(濃度1μg/250μL)、ストレプトアビジンで表面が標識された平均粒子径15nmのQdot(登録商標、Quantum Dot Corporation社製)を1.0μL(50nmol/50μL)含む溶液を混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬C)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例1と同様に行った。なお、BACプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、Q-dоtのストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記BACプローブのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、1:2000であった。
<結果考察>
蛍光顕微鏡観察において、輝点が観察されなかった。
〔ビオチン標識率1.33%のBACプローブの調製〕
dTTPの使用量を0.5μLから1.5μLに変更し、Biotin-16-dUTP(製品番号1093070、Roche社製、50nmol/50μL)の使用量を1.5μLから0.2μLに変更したこと以外は、実施例1と同様に最終濃度1μg/250μLのビオチン標識された塩基数15万のBACプローブ(核酸分子)の溶液を得た。
上述のようにビオチン標識したBACプローブ25μL(濃度1μg/250μL)、FITC修飾ストレプトアビジン(フナコシ社製「Streptavidin,FITC Conjugate(1mg、SA-5001)」)を1.0μL(50nmol/50μL)含む溶液を混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬D)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例1と同様に行った。
<結果考察>
蛍光顕微鏡観察において、輝点が観察されなかった。
〔ビオチン標識率1.33%のBACプローブの調製〕
実施例1のニックトランスレーションによるビオチン標識でdTTPの使用量を0.5μLから1.5μLに変更し、Biotin-16-dUTP(製品番号1093070、Roche社製、50nmol/50μL)の使用量を1.5μLから0.2μLに変更したこと以外は、実施例1と同様に最終濃度1μg/250μLのビオチン標識された塩基数15万のBACプローブ(核酸分子)の溶液を得た。
Texas Red色素3.4mgと3-アミノプロピルトリメトキシシラン(3-aminopropyltrimetoxysilane、信越シリコーン社製、KBM903)3μLとをDMF中で混合し、オルガノアルコキシシラン化合物を得た。得られたオルガノアルコキシシラン化合物0.6mLを、48mLのエタノール、0.6mLのTEOS(テトラエトキシシラン)、2mLの水、1.4mLの28%アンモニア水と3時間混合した。上記工程で作製した混合液を10000Gで20分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を2回ずつ行なった。これらの操作により、Texas Red色素シリカナノ粒子を得た。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径50nmであった。
上述のようにビオチン標識したBACプローブ25μL(濃度1μg/250μL)と、上記ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を含む溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬E)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例1と同様に行った。なお、BACプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記BACプローブのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、1:2000であった。
蛍光顕微鏡観察において、深さ方向にピントを合わせることなく、深い位置の輝点が視認することができた。
〔ビオチン標識率1.33%のBACプローブの調製〕
実施例1のニックトランスレーションによるビオチン標識でdTTPの使用量を0.5μLから1.5μLに変更し、Biotin-16-dUTP(製品番号1093070、Roche社製、50nmol/50μL)の使用量を1.5μLから0.2μLに変更したこと以外は、実施例1と同様に最終濃度1μg/250μLのビオチン標識された塩基数15万のBACプローブ(核酸分子)の溶液を得た。
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)20.3mgを水22mLに加えて溶解した。その後、この溶液に乳化重合用乳化剤のエマルゲン(登録商標)430(ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王社製)の5%水溶液を2mL加えた。この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら70℃まで昇温させた後、この溶液にメラミン樹脂原料ニカラックMX-035(日本カーバイド工業社製)を0.81g加えた。
一方、ストレプトアビジン(和光純薬工業社製)とN-スクシミジル Sアセチルチオ酢酸(N-succinimidyl S-acetylthioacetate、略称:SATA)を用いて、ストレプトアビジンに対してチオール基の付加処理を行い、ゲル濾過を行って蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンを別途用意した。
上記蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンを、2mMのEDTAを含有したPBS中で混合後、室温で1時間反応させて、両者を結合させる反応を行った。反応後、10mMメルカプトエタノールを添加して反応を停止させた。得られた溶液をφ=0.65μmの遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲル濾過カラムを用いて未反応のストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
上述のようにビオチン標識したBACプローブ(核酸分子)25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬F)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例1と同様に行った。なお、BACプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記BACプローブのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、1:2000であった。
蛍光顕微鏡観察において、深さ方向にピントを合わせることなく、深い位置の輝点が視認することができた。
〔ビオチン標識率1.33%のBACプローブの調製〕
実施例1のニックトランスレーションによるビオチン標識でdTTPの使用量を0.5μLから1.5μLに変更し、Biotin-16-dUTP(製品番号1093070、Roche社製、50nmol/50μL)の使用量を1.5μLから0.2μLに変更したこと以外は、実施例1と同様に最終濃度1μg/250μLのビオチン標識された塩基数15万のBACプローブ(核酸分子)の溶液を得た。
28%アンモニア水の使用量を1.4mLから2.6mLに変更したこと以外は、実施例2と同様にして、Texas Red色素シリカナノ粒子を得た。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径320nmであった。
上述のようにビオチン標識したBACプローブ(核酸分子)25μL(濃度1μg/250μL)、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液を混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬G)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例1と同様に行った。なお、上記BACプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記BACプローブのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、1:2000であった。
蛍光顕微鏡観察において、深さ方向にピントを合わせることなく、深い位置の輝点が視認することができた。
〔ビオチン標識率9.62%のBACプローブの調製〕
GSP社から購入したBACプローブとしてのHER2-DNAクローン(CEN17q11.2/520kb、塩基数約520kbp)1μg(5μL)に対して、ニックトランスレーション用のキット(製品名「GSP-ニックトランスレーションキット」K-015、GSP社製)のプロトコールに従い、ニックトランスレーション法により、実施例1と同様にBACプローブ(核酸分子)のdTTPをビオチン標識した。
上述のようにビオチン標識したBACプローブ25μL(濃度1μg/250μL)、FITC修飾ストレプトアビジン(Streptavidin,FITC Conjugate(1mgフナコシ SA-5001))を1.0μL(50nmol/50μL)含む溶液を混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬H)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例1と同様に行った。なお、BACプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、FITCのストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記BACプローブのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、1:50000であった。
<結果考察>
蛍光顕微鏡観察において、深さ方向にピントを合わせることで、深い位置の輝点が観察された。
〔ビオチン標識率0.96%のBACプローブの調製〕
GSP社から購入したBACプローブとしてのHER2-DNAクローン(CEN17q11.2/520kb、塩基数約520kbp)1μg(5μL)に対して、ニックトランスレーション用のキット(製品名「GSP-ニックトランスレーションキット」K-015、GSP社製)のプロトコールに従い、以下のようにニックトランスレーション法により、BACプローブ(核酸分子)のdTTPをビオチン標識した。
上述のようにビオチン標識したBACプローブ25μL(濃度1μg/250μL)、FITC修飾ストレプトアビジン(Streptavidin,FITC Conjugate(1mgフナコシ SA-5001))を1.0μL(50nmol/50μL)含む溶液を混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬I)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例1と同様に行った。なお、BACプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、FITCのストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記BACプローブのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、1:5000であった。
<結果考察>
蛍光顕微鏡観察において、輝点が観察できなかった。
〔ビオチン標識率0.96%のBACプローブの調製〕
GSP社から購入したBACプローブとしてのHER2-DNAクローン(CEN17q11.2/520kb、塩基数約520kbp)1μg(5μL)に対して、ニックトランスレーション用のキット(製品名「GSP-ニックトランスレーションキット」K-015、GSP社製)のプロトコールに従い、以下のようにニックトランスレーション法により、BACプローブ(核酸分子)のdTTPをビオチン標識した。
実施例3の蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製で、SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を、14.4mgから5.25mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX-035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.65gから0.21gに変更したこと以外は同様にして蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。作製した粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径40nmであった。
ストレプトアビジンの調製および樹脂粒子とストレプトアビジンの結合は、実施例3と同様に行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬J)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例1と同様に行った。なお、BACプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記BACプローブのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、1:5000であった。
蛍光顕微鏡観察において、深さ方向にピントを合わせることなく、深い位置の輝点が視認することができた。
《総合結果・考察》
〔ビオチン標識率1.33%のBACプローブの調製〕
ニックトランスレーションによるビオチン標識でdTTPの使用量を0.5μLから1.5μLに変更し、Biotin-16-dUTP(製品番号1093070、Roche社製、50nmol/50μL)の使用量を1.5μLから0.2μLに変更したこと以外は、実施例1と同様に最終濃度1μg/250μLのビオチン標識された塩基数15万のBACプローブ(核酸分子)の溶液を得た。
上述のようにビオチン標識したBACプローブ25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンで表面修飾された平均粒子径15nmのQdot(登録商標、Quantum Dot Corporation社製)を1.0μL(50nmol/50μL)含む溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬K)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例1と同様に行った。なお、BACプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、Q-dоtのストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記BACプローブのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、1:2000であった。
<結果考察>
蛍光顕微鏡観察において、輝点が観察されなかった。
〔ビオチン標識率13.33%のDNAプローブの調製〕
Applied Biosystems 392 DNA/RNA synthesizer(Foster City,CA)を用いてプライマー(フォワード:5'-CGGGAGATCCCTGACCTGCTGGAA-3'、リバース:5'-CTGCTGGGGTACCAGATACTCCTC-3')を作製した。
得られたcDNA1μgを用いて、実施例1と同様にニックトランスレーションを行い、最終濃度1μg/250μLのビオチン標識されたcDNAの溶液を得た。
上述のようにビオチン標識した上記cDNA25μL(終濃度1μg/250μL)、ストレプトアビジンで表面修飾された平均粒子径15nmのQdot(登録商標、Quantum Dot Corporation社製)を1.0μL(50nmol/50μL)含む溶液を調製混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用の塩基数300bpのDNAプローブ(プローブ試薬L)を得た。
このDNAプローブの確認は、実施例1で0.5%のTBEを含む2%アガロースゲルの代わりに0.5%のTBEを含む10%ポリアクリルアミドゲルを用いたこと以外は実施例1と同様にDNAプローブの確認を行った。
FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例1と同様に行った。この際に、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、それぞれ培養細胞MCF7の染色像について輝点数を計測した。なお、上記cDNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、Q-dоtのストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記cDNAのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、1:40であった。
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が20個、輝点数2の細胞が29個、輝点数3の細胞が1個、輝点数4の細胞は0個であった。また、蛍光顕微鏡観察において、輝点が観察できなかった。
〔ビオチン標識率13.33%のDNAプローブの調製〕
Applied Biosystems 392 DNA/RNA synthesizer(Foster City,CA)を用いてプライマー(フォワード:5'-CGGGAGATCCCTGACCTGCTGGAA-3'、リバース:5'-CTGCTGGGGTACCAGATACTCCTC-3')を作製した。
得られたcDNA1μgを用いて、実施例1と同様にニックトランスレーションを行い、最終濃度1μg/250μLのビオチン標識されたcDNAの溶液を得た。
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから5.25mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX-035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.21gに変更したこと以外は、実施例3と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径40nmであった。また、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
一方、実施例3と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
上述のようにビオチン標識したcDNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジン修飾の蛍光体集積ナノ粒子を含む溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬M)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記cDNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記cDNAのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、1:40であった。
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が21個、輝点数2の細胞が29個、輝点数3の細胞が0個、輝点数4の細胞は0個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が21個、輝点数2の細胞が29個、輝点数3の細胞が0個、輝点数4の細胞は0個であった。
〔ビオチン標識率13.33%のDNAプローブの調製〕
実施例6と同様にして、HER2遺伝子関連の配列を有する塩基数300のcDNA(核酸分子)を調製した。このcDNA1μgを、実施例1でのニックトランスレーションと同様にして最終濃度1μg/250μLのビオチン標識されたcDNA溶液を得た。
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから14.4mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX-035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.21gに変更したこと以外は、実施例3と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径158nmであった。
また、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
一方、実施例3と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
上述のようにビオチン標識したcDNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬N)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記cDNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記cDNAのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、1:40であった。
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が19個、輝点数2の細胞が29個、輝点数3の細胞が2個、輝点数4の細胞は0個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が21個、輝点数2の細胞が29個、輝点数3の細胞が1個、輝点数4の細胞は0個であった。
〔ビオチン標識率13.33%のDNAプローブの調製〕
実施例6と同様にして、HER2遺伝子関連の配列を有する塩基数300cDNA(核酸分子)を調製した。このcDNA1μgを、実施例1でのニックトランスレーションと同様にして最終濃度1μg/250μLのビオチン標識されたcDNAの溶液を得た。
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX-035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gに変更したこと以外は、実施例3と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径280nmであった。
また、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
一方、実施例3と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
上述のようにビオチン標識したcDNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬O)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が21個、輝点数2の細胞が29個、輝点数3の細胞が0個、輝点数4の細胞は0個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が21個、輝点数2の細胞が29個、輝点数3の細胞が0個、輝点数4の細胞は0個であった。
〔ビオチン標識率13.33%のプローブの調製〕
実施例6と同様にして、HER2遺伝子関連の配列を有する塩基数300のcDNA(核酸分子)を調製した。このcDNA1μgを、実施例1でのニックトランスレーションと同様にして最終濃度1μg/250μLのビオチン標識されたcDNAの溶液を得た。
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから21.4mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX-035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.86gに変更したこと以外は、実施例3と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径320nmであった。
また、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
一方、実施例3と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
上述のようにビオチン標識したcDNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬P)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記cDNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記cDNAのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、1:40であった。
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が43個、輝点数2の細胞が7個、輝点数3の細胞が0個、輝点数4の細胞は0個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が44個、輝点数2の細胞が6個、輝点数3の細胞が0個、輝点数4の細胞は0個であった。
〔ビオチン標識率1.67%のプローブの調製〕
実施例6と同様にして、HER2遺伝子関連の配列を有する塩基数300のcDNA(核酸分子)を調製した。
28%アンモニア水の使用量を1.4mLから2.0mLに変更したこと以外は、実施例2と同様にTexas Red色素内包シリカナノ粒子の調製を行った。得られた粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径160nmであった。
上述のようにビオチン標識したcDNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬Q)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記cDNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記cDNAのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、1:5であった。
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が19個、輝点数2の細胞が29個、輝点数3の細胞が2個、輝点数4の細胞は0個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が20個、輝点数2の細胞が29個、輝点数3の細胞が1個、輝点数4の細胞は0個であった。
〔ビオチン標識率1.67%のプローブの調製〕
実施例6と同様に、HER2遺伝子関連の配列を有する塩基数300のcDNA(核酸分子)を調製した。
28%アンモニア水の使用量を1.4mLから2.6mLに変更したこと以外は、実施例2と同様にTexas Red色素内包シリカナノ粒子の調製を行った。得られた粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径320nmであった。
上述のようにビオチン標識した上記cDNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬R)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記cDNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記cDNAのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、1:5であった。
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が40個、輝点数2の細胞が10個、輝点数3の細胞が0個、輝点数4の細胞は0個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が44個、輝点数2の細胞が6個、輝点数3の細胞が0個、輝点数4の細胞は0個であった。
〔ビオチン標識率0.33%のBACプローブの調製〕
比較例3と同様に、HER2遺伝子関連の配列を有するBACクローンを用いて、NickTransration反応を実施して、BACプローブを作成した。ただし、比較例3と異なり、Biotin-d-UTPは添加せずに調製した。得られたBACクローン由来のDNA(核酸分子)に対して、以下のビオチン標識を行った。
上記のように調製したDNA2μgを、VECTOR LABORATORIES社製の「5'EndTag(TM) Nucleic Acid Labeling System、(カタログNo.MB-9001)」のキットおよびプロトコールを用いて、以下のようにBACクローン由来のDNAの5'末端をビオチン標識した。
・上記DNA2μg(/超純水8μL)
・Universal reaction buffer・・・1μL
・アルカリフォスファターゼ・・・1μL
さらに、上記混合液中に以下のものを混合して、37℃で30分間インキュベートした。
・Universal reaction buffer・・・2μL
・ATPγS・・・1μL
・T4 polynucleotide kinase・・・2μL
28%アンモニア水の使用量を1.4mLから2.0mLに変更したこと以外は、実施例2と同様にTexas Red色素内包シリカナノ粒子の調製を行った。得られた粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径160nmであった。
上述のように5'末端をビオチン標識したBACクローン由来のDNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬S)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記DNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記DNAのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、1:50であった。
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が19個、輝点数2の細胞が29個、輝点数3の細胞が2個、輝点数4の細胞は0個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が25個、輝点数2の細胞が24個、輝点数3の細胞が1個、輝点数4の細胞は0個であった。
〔ビオチン標識率6.67E-3%のBACプローブの調製〕
実施例1と同じGSP社から購入したHER2-DNAクローン(約150kbp)について実施例12と同様に5'末端をビオチン標識した。
<蛍光粒子と上記BACプローブとが結合したDNAプローブ調製>
上述のように5’末端をビオチン標識したBACプローブ25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンで表面修飾された平均粒子径15nmのQdot(登録商標、Quantum Dot Corporation社製)を1.0μL(50nmol/50μL)含む溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬Ad1)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例1と同様に行った。なお、BACプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、Q-dоtのストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記BACプローブのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、1:1であった。
<結果考察>
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が12個、輝点数2の細胞が13個、輝点数3の細胞が15個、輝点数4の細胞は10個であった。蛍光顕微鏡観察において、輝点が観察されなかった。
〔ビオチン標識率0.33%のプローブの調製〕
比較例4と同様にHER2遺伝子関連の配列を有する塩基数300のcDNA(核酸分子)を調製した後、実施例12と同様に前記cDNAの5'末端をビオチン標識した。
上述のように5’末端をビオチン標識したcDNAのプローブ25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンで表面修飾された平均粒子径15nmのQdot(登録商標、Quantum Dot Corporation社製)を1.0μL(50nmol/50μL)含む溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬Ad2)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例1と同様に行った。なお、BACプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、Q-dоtのストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記BACプローブのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、1:1であった。
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が21個、輝点数2の細胞が27個、輝点数3の細胞が2個、輝点数4の細胞は0個であった。蛍光顕微鏡観察において、輝点が観察されなかった。
〔ビオチン標識率6.67E-3%のBACプローブの調製〕
実施例1と同じGSP社から購入したHER2-DNAクローン(約150kbp)について実施例12と同様に5'末端をビオチン標識した。
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を14.4mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX-035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.21gに変更したこと以外は、実施例3と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子(蛍光体集積ナノ粒子を)の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径158nmであった。
さらに、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
上記のように調製したDNA2μgを、VECTOR LABORATORIES社製の「5'EndTag(TM) Nucleic Acid Labeling System、(カタログNo.MB-9001)」のキットおよびプロトコールを用いて、以下のように核酸分子の5'末端をリン酸からチオリン酸に変換した。
以下のものを遠心チューブで混合して、37℃で30分間インキュベートした。
・上記核酸分子2μg(/超純水8μL)
・Universal reaction buffer・・・1μL
・アルカリフォスファターゼ・・・1μL
さらに、上記混合液中に以下のものを混合して、37℃で30分間インキュベートした。
・Universal reaction buffer・・・2μL
・ATPγS・・・1μL
・T4 polynucleotide kinase・・・2μL
次に、上記で得られた末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を反応して、5'末端に直接蛍光体集積ナノ粒子が結合したプローブを作成した。
このプローブの反応溶液を核酸精製用マイクロスピンカラム(GEヘルスケア社製「MicroSpin S-200HR Column」、製品番号「#27-5120-01」)により精製した。
この溶液に対して、3M酢酸ナトリウム溶液(pH5.2)を約5.56μL、100%エタノールを150μL添加し、-20℃で1時間以上静置した。4℃で16000rpmで10分間遠心して沈殿を形成した。さらに、70%エタノールを500μL添加して、4℃、16000rpmで1分間遠心し上澄みを除去した。沈殿物に5~10μLの蒸留水を添加して完全に溶解させ、蛍光体集積ナノ粒子で標識されたDNA(プローブ試薬Ad3)の溶液(最終濃度1μg/250μL)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を同様に行った。
なお、DNAプローブの確認において、5'末端にのみ標識されたので、1:1であった。また、検体スライドとしてHER2陽性染色対照標本の検体スライド(パソロジー研究所社製「HER2-FISHコントロールスライド Code PS-09006」)を用いた。また、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
<結果考察>
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が21個、輝点数2の細胞が26個、輝点数3の細胞が9個、輝点数4の細胞は4個であった。蛍光顕微鏡観察において、輝点が観察することができた。
〔ビオチン標識率0.33%のプローブの調製〕
比較例6でビオチン標識した塩基数300の核酸分子を用いたこと以外は、実施例13と同様にして蛍光体集積ナノ粒子で標識されたDNA(プローブ試薬Ad4)の溶液(最終濃度1μg/250μL)を得た。
〔その他の観察等〕
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を同様に行った。
なお、DNAプローブの確認において、5'末端にのみ標識されたので、1:1であった。また、検体スライドとしてHER2陽性染色対照標本の検体スライド(パソロジー研究所社製「HER2-FISHコントロールスライド Code PS-09006」)を用いた。また、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
<結果考察>
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が19個、輝点数2の細胞が28個、輝点数3の細胞が2個、輝点数4の細胞は1個であった。蛍光顕微鏡観察において、輝点が観察することができた。
〔ビオチン標識率0.33%の短鎖長のDNAプローブの調製〕
実施例10と同様に、HER2遺伝子関連の配列を有する塩基数300のcDNA(核酸分子)を調製した。
<5’末端のビオチン標識>
上記のように調製したcDNA2μgを、実施例12と同様にして、5’末端がビオチンで標識されたcDNAを得た。
28%アンモニア水の使用量を1.4mLから2.6mLに変更したこと以外は、実施例2と同様にTexas Red色素内包シリカナノ粒子の調製を行った。得られた粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径320nmであった。
得られた色素内包ナノ粒子から実施例2と同様にマレイミド基が付いた蛍光体集積ナノ粒子を得る一方で、実施例2と同様にストレプトアビジン溶液の調製を行い、両者から実施例2と同様にストレプトアビジン結合Texas Red色素内包シリカナノ粒子(蛍光体集積ナノ粒子)を得た。
<蛍光体集積ナノ粒子(320nm、シリカ粒子)が核酸分子の5’末端に結合したDNAプローブ調製>
上述のように5’末端をビオチン標識したcDNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬T)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記cDNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記cDNAのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、約1:1であった。
。
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が40個、輝点数2の細胞が10個、輝点数3の細胞が0個、輝点数4の細胞は0個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が44個、輝点数2の細胞が6個、輝点数3の細胞が0個、輝点数4の細胞は0個であった。
すなわち、本実施例15に係るプローブ試薬によれば、DNAと蛍光体集積ナノ粒子の結合モル比が1:1であり、平均粒子径320mと実施例12より大径であるが、輝点の検出感度が低い蛍光顕微鏡観察において、輝点の検出感度が高い共焦点蛍光顕微鏡観察と同程度の精度で輝点検出することができた。しかし、非特異的な検出が多くみられた。
〔ビオチン標識率5%の短鎖長のDNAプローブの調製〕
プローブ検索サイト「HD-FISH」(URL:http://www.hdfish.eu/Find#probes.php)で、ヒト第17番目の染色体の特定の領域(第37844400番目~第37885107番目)を指定してユニークな配列を検索し、該特定の領域に存在する第37844479番目~第37844696番目の次のユニークな配列を検索して入手した。この配列データを元にして核酸合成の依頼をしてHER-2遺伝子関連の配列(5’-ACGCCTGATGGGTTAATGAG-3’)の塩基数20のDNA(核酸分子)を調製した。
上記のように調製したDNA4μgを用いて、実施例12と同様に、5’末端がビオチンで標識されたDNAを得た。
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから5.25mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX-035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.21gに変更したこと以外は、実施例3と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径40nmであった。また、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
一方、実施例3と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
上述のように5’末端をビオチン標識した上記DNA25μL(濃度1μg/250μL)、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬U)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共え点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記DNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記DNAのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、約1:1であった。
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が18個、輝点数2の細胞が31個、輝点数3の細胞が1個、輝点数4の細胞は0個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が20個、輝点数2の細胞が30個、輝点数3の細胞が0個、輝点数4の細胞は0個であった。
すなわち、本実施例16に係るプローブ試薬によれば、20塩基という非常に短い核酸分子であり、かつ、DNA:ビオチン(DNA:蛍光体集積ナノ粒子)の結合モル比が1:1であり輝点が検出できないと予測される条件であるのにもかかわらず、驚くべきことに、輝点の検出感度が低い蛍光顕微鏡観察においても、輝点の検出感度が高い共焦点蛍光顕微鏡観察と同程度の精度で輝点検出することができた。
〔ビオチン標識率5%のDNAプローブの調製〕
実施例16と同様に塩基数20のDNA(核酸分子)を調製した。
<5’末端のビオチン標識>
上記のように調製したDNA2μgを用いて、実施例12と同様に、5’末端がビオチンで標識されたDNAを得た。
スルホローダミン101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから14.4mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX-035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.65gに変更したこと以外は、実施例3と同様にストレプトアビジンで標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径158nmであった。また、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
一方、実施例3と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
上述のように5’末端をビオチン標識した上記DNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬V)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記DNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記DNAのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、約1:1であった。
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が20個、輝点数2の細胞が29個、輝点数3の細胞が1個、輝点数4の細胞は0個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が29個、輝点数2の細胞が21個、輝点数3の細胞が0個、輝点数4の細胞は0個であった。
すなわち、本実施例17に係るプローブ試薬によれば、平均粒子径が実施例16より大径であるが、実施例16と同様、輝点の検出感度が低い蛍光顕微鏡観察においても、輝点の検出感度が高い共焦点蛍光顕微鏡観察と同程度の精度で輝点検出することができた。
〔ビオチン標識率5%のDNAプローブの調製〕
実施例16と同様に塩基数20のDNA(核酸分子)を調製した。
上記のように調製したDNA2μgを用いて、実施例12と同様に、5’末端がビオチンで標識されたDNAを得た。
実施例7と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径280nmであった。また、実施例7と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例7と同様に行った。
一方、実施例7と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
上述のように5’末端をビオチン標識した上記DNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬W)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記DNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記DNAのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、約1:1であった。
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が21個、輝点数2の細胞が29個、輝点数3の細胞が0個、輝点数4の細胞は0個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が20個、輝点数2の細胞が30個、輝点数3の細胞が0個、輝点数4の細胞は0個であった。
すなわち、本実施例18に係るプローブ試薬によれば、平均粒子径が実施例16,17より大径であるが、実施例16等と同様に、輝点の検出感度が低い蛍光顕微鏡観察においても、輝点の検出感度が高い共焦点蛍光顕微鏡観察と同程度の精度で輝点検出することができた。
参考例1で得られたプローブ試薬を用いて、蛍光顕微鏡観察において、染色の直後、染色からそれぞれ1週間後、1か月後、2か月後に輝点観察を行い、それら時点ごとに検体スライドの細胞(培養細胞SKBR3)の平均輝点数を調べた。この平均輝点数は、前記細胞の核50個に含まれる輝点数を計測し、核1個当たりの輝点数の平均値として算出したものである。
染色後の平均輝点数は、染色直後では18個、染色から1週間後では15個、染色から1か月後では8個、染色から2箇月後では2個であった。すなわち、参考例1に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少していき、耐色素退行性が低いものであった(表4参照)。
〔ビオチン標識率13.33%のBACプローブの調製〕
上述した実施例1と同様の手順で、最終濃度1μg/250μLのビオチン標識された塩基数15万のBACプローブ(核酸分子)の溶液を得た。購入したストレプトアビジン化TXR(フナコシ社製「Streptavidin, Texas Red Conjugate(製品番号SA-5006)」)を1.0μL(50nmol/50μL)含む溶液を混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬X)を得た。
このDNAプローブの確認は、0.5%のTBEを含む2%アガロースゲルで0.5%の変性バッファーTris-Borate-EDTA(TBE)中で電気泳動を行う電気泳動シフトアッセイにより行った。一本鎖のDNAを、SYBR GreenII(Molecular Probes, Eugene,OR)によりカウンター染色した。そして、DNAの移動パターンを、「MultiImager FX System」(Bio-Rad,Hercules,CA)を使用して、以下のように決定した。
DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察で、輝点を観察することができた。
上述した蛍光顕微鏡観察において、参考例4と同様に色素退行評価を行った。
<結果考察>
共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では20個、染色から1週間後では15個、染色から1か月後では9個、染色から2箇月後では3個であった。
すなわち、参考例5に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少していき、耐色素退行性が低いものであった(表4参照)。
〔ビオチン標識率1.67%のDNAプローブの調製〕
実施例6と同様にして、HER2遺伝子関連の配列を有する塩基数300のcDNA(核酸分子)を調製した。このcDNAに対して、蛍光体集積ナノ粒子を以下の方法で作製した上で直接結合させた。
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから5.25mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX-035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.21gに変更したこと以外は、実施例3と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径40nmであった。
ルミプローブ社製「Amino-11-dUTP」1μLと、N-succinimidyl S-acetylthioacetate(SATA)とを混合してチオール基付加処理として5℃で1時間インキュベートして反応を行った後、ゲルろ過カラムによるろ過を行い、蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なThiol-11-dUTP溶液を得た。
まず、下記の試薬を遠心チューブ内で混合した。
・10×NickBuffer(Tris-HCl[pH7.2]、MgSO4、DTT)
・・・2.5μL、
・BSA(Nuclease-free BSA)・・・1.5μL
・dNTP mix(dATP、dCTP、dCTP)・・・5μL
・dTTP・・・1.5μL、
・dUTP結合Texas Red色素内包メラミン樹脂粒子・・0.2μL
・純水(Nuclease free water)・・・3μL
・上記cDNA1μgの水溶液・・・5μL
・DNA PоlymeraseI(Tris-HCl[pH7.5]、EDTA、DTT、glycerоl)・・・1μL
・DNaseI・・・5μL
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。
上述した蛍光顕微鏡観察において、参考例4と同様に色素退行評価を行った。
<結果考察>
共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では26個、染色から1週間後では27個、染色から1か月後では24個、染色から2箇月後では24個であった。すなわち、実施例19に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少せずに、耐色素退行性が高いものであった(表4参照)。
実施例8で得られたプローブ試薬を用いて、蛍光顕微鏡観察において、参考例4と同様に色素退行評価を行った。
染色後の平均輝点数は、染色直後では25個、染色から1週間後では25個、染色から1か月後では26個、染色から2箇月後では24個であった。すなわち、実施例20に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少せずに、耐色素退行性が高いものであった(表4参照)。
実施例9で得られたプローブ試薬を用いて、蛍光顕微鏡観察において、参考例4と同様に色素退行評価を行った。
染色後の平均輝点数は、染色直後では11個、染色から1週間後では11個、染色から1か月後では11個、染色から2箇月後では10個であった。すなわち、実施例21に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少せずに、耐色素退行性が高いものであった(表4参照)。
〔ビオチン標識率13.33%のDNAプローブの調製〕
実施例6と同様に、HER2遺伝子関連の配列を有する塩基数300のcDNA(核酸分子)を調製した。
上記のように調製したcDNA1μgを、実施例1と同様にしてニックトランスレーションを行い、最終濃度1μg/250μLのビオチン標識されたcDNAの溶液を得た。
FITC(コードP76012 タカラバイオ社製)4.1mgを水22mLに加えて溶解した。その後、この溶液に乳化重合用乳化剤のエマルゲン(登録商標)430(ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王社製)の5%水溶液を2mL加えた。この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら70℃まで昇温させた後、この溶液にメラミン樹脂原料ニカラックMX-035(日本カーバイド工業社製)を0.15g加えた。
一方、ストレプトアビジン(和光純薬工業社製)とN-スクシミジル Sアセチルチオ酢酸(N-succinimidyl S-acetylthioacetate、略称:SATA)を用いて、ストレプトアビジンに対してチオール基の付加処理を行い、ゲル濾過を行って蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンを別途用意した。
上記蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンを、2mMのEDTAを含有したPBS中で混合後、室温で1時間反応させて、両者を結合させる反応を行った。反応後、10mMメルカプトエタノールを添加して反応を停止させた。得られた溶液をφ=0.65μmの遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲル濾過カラムを用いて未反応のストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
上述のようにビオチン標識したcDNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬Z)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記cDNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記cDNAのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、1:40であった。
上述した蛍光顕微鏡観察において、染色の直後、染色からそれぞれ1週間後、1か月後、2か月後に輝点観察を行い、それら時点ごとに検体スライドの細胞(培養細胞SKBR3)の平均輝点数を調べた。この平均輝点数は、前記細胞の核50個に含まれる輝点数を計測し、核1個当たりの輝点数の平均値として算出して得たものである。
共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では15個、染色から1週間後では16個、染色から1か月後では15個、染色から2箇月後では13個であった。すなわち、実施例22に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少せず、耐色素退行性が高いものであった(表4参照)。
〔ビオチン標識率13.33%のDNAプローブの調製〕
実施例6と同様に、HER2遺伝子関連の配列を有する塩基数300のcDNA(核酸分子)を調製した。
上記のように調製したcDNAのcDNA1μgを、実施例1と同様に、ニックトランスレーション法によりビオチン標識した。
FITC(コードP76012 タカラバイオ社製)の使用量を5.25mg、メラミン樹脂原料ニカラックMX-035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.21gに変更したことを除いて、実施例22と同様に蛍光色素内包ポリメラミン粒子を作製した。得られたメラミン粒子はメラミン樹脂自体が骨格に多くのアミノ基を含む。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径40nmであった。
上述のようにビオチン標識した上記cDNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬A1)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。
上述した蛍光顕微鏡観察において、参考例4と同様に色素退行評価を行った。
<結果考察>
共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では26個、染色から1週間後では25個、染色から1か月後では26個、染色から2箇月後では25個であった。
〔ビオチン標識率1.67%のDNAプローブの調製〕
実施例6と同様に、HER2遺伝子関連の配列を有する塩基数300のcDNA(核酸分子)を調製した。
FITC(コード P76012 タカラバイオ社製)の使用量を14.4mg、メラミン樹脂原料ニカラックMX-035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.65gに変更したことを除いて、実施例22と同様に蛍光色素内包ポリメラミン粒子を作製した。得られたメラミン粒子はメラミン樹脂自体が骨格に多くのアミノ基を含む。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径158nmであった。
上述のようにビオチン標識した上記cDNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液を混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬A2)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記cDNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記cDNAのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、1:5であった。
上述した蛍光顕微鏡観察において、参考例4と同様に色素退行評価を行った。
(結果考察)
共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では27個、染色から1週間後では24個、染色から1か月後では25個、染色から2箇月後では25個であった。
〔ビオチン標識率13.33%の短鎖長のDNAプローブの調製〕
実施例6と同様に、HER2遺伝子関連の配列を有する塩基数300のcDNA(核酸分子)を調製した。
FITC(コード P76012 タカラバイオ社製)の使用量を20.3mg、メラミン樹脂原料ニカラックMX-035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gに変更したことを除いて、実施例22と同様に蛍光色素内包ポリメラミン粒子を作製した。得られたメラミン粒子はメラミン樹脂自体が骨格に多くのアミノ基を含む。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径280nmであった。
上述のようにビオチン標識した上記cDNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンで修飾された蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬A3)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記cDNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記cDNAのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、1:40であった。
上述した蛍光顕微鏡観察において、参考例4と同様に色素退行評価を行った。
<結果考察>
共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では24個、染色から1週間後では24個、染色から1か月後では22個、染色から2箇月後では21個であった。すなわち、実施例25に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少せず、耐色素退行性が高いものであった(表3参照)。
〔ビオチン標識率0.5%のDNAプローブの調製〕
Bienko M_Nat Method 2013に記載の方法で、塩基数200のHER2-DNAクローンを作成した。すなわちデータベース検索によりHER2選択的な配列を見つけ出し、Forword primer(5’-ACGCCTGATGGGTTAATGAG-3’)およびReverse primer(5’-aagtagaggcagggagagcc-3’)から塩基数200のcDNA(核酸分子)を調製した。
上記のように調製したcDNA2μgを、実施例12と同様にして処理することで、5’末端がビオチンで標識されたcDNAを得た。
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから14.4mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX-035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.21gに変更したこと以外は、実施例3と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径158nmであった。
また、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
一方、実施例3と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
上述のように5’末端をビオチン標識したcDNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬A4)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記cDNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記cDNAのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、約1:1であった。
上述した蛍光顕微鏡観察において、参考例4と同様に色素退行評価を行った。
(結果考察)共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では27個、染色から1週間後では27個、染色から1か月後では25個、染色から2箇月後では25個であった。すなわち、実施例26に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少せず、耐色素退行性が高いものであった(表4参照)。
〔ビオチン標識率5%のDNAプローブの調製〕
実施例16と同様に塩基数20のDNA(核酸分子)を調製した。
<5’末端のビオチン標識>
上記のように調製したDNA2μgを、実施例12と同様に、5’末端がビオチンで標識されたDNAを得た。
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから14.4mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX-035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.21gに変更したこと以外は、実施例3と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径158nmであった。
また、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
一方、実施例3と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
上述のように5’末端をビオチン標識した上記DNA25μL(濃度1μg/250μL)、蛍光体集積ナノ粒子修飾ストレプトアビジンを含む溶液を混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬A5)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記DNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記cDNAのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、約1:1であった。
<色素退行評価>
上述した蛍光顕微鏡観察において、参考例4と同様に色素退行評価を行った。
共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では26個、染色から1週間後では25個、染色から1か月後では26個、染色から2箇月後では26個であった。すなわち、実施例27に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少せず、耐色素退行性が高いものであった(表4参照)。
〔ビオチン標識率0.5%のDNAプローブの調製〕
実施例26と同様に、塩基数200のcDNA(核酸分子)を作成した。
<ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製>
(粒子の調製)
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから14.4mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX-035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.21gに変更したこと以外は、実施例3と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径158nmであった。
また、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
上記のように調製したcDNAの核酸分子2μgを、VECTOR LABORATORIES社製の「5’EndTag(TM) Nucleic Acid Labeling System、(カタログNo.MB-9001)」のキットおよびプロトコールを用いて、以下のように核酸分子の5’末端をリン酸からチオリン酸に変換して、
以下のものを遠心チューブで混合して、37℃で30分間インキュベートした。
・cDNAの核酸分子2μg(/超純水8μL)
・Universal reaction buffer・・・1μL
・アルカリフォスファターゼ・・・1μL
さらに、上記混合液中に以下のものを混合して、37℃で30分間インキュベートした。
・Universal reaction buffer・・・2μL
・ATPγS・・・1μL
・T4 polynucleotide kinase・・・2μL
次に、上記で得られた末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を反応して、5’末端に直接蛍光体集積ナノ粒子が結合したプローブを作成した。
このプローブの反応溶液を核酸精製用マイクロスピンカラム(GEヘルスケア社製「MicroSpin S-200HR Column」、製品番号「#27-5120-01」)により精製した。
この溶液に対して、3M酢酸ナトリウム溶液(pH5.2)を約5.56μL、100%エタノールを150μL添加し、-20℃で1時間以上静置した。4℃で16000rpmで10分間遠心して沈殿を形成した。さらに、70%エタノールを500μL添加して、4℃、16000rpmで1分間遠心し上澄みを除去した。沈殿物に5~10μLの蒸留水を添加して完全に溶解させ、蛍光体集積ナノ粒子で標識されたcDNA(プローブ試薬A6)の溶液(最終濃度1μg/250μL)を得た。
上述した蛍光顕微鏡観察において、参考例4と同様に色素退行評価を行った。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では24個、染色から1週間後では24個、染色から1か月後では24個、染色から2箇月後では22個であった。すなわち、実施例28に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少せず、耐色素退行性が高いものであった。
実施例28で作成した5’末端がビオチン標識されたcDNA(蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンと結合する前もの)を用いて、FISHにおいて、実施例1と同様にハイブリダイゼーションを行い、さらに、同実施例12で作成したストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子50μgを反応系に加えて、ハイブリダイゼーション後の反応系内の上記cDNAを蛍光標識した。それ以外は、実施例12と同様にFISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
上述した蛍光顕微鏡観察において、参考例4と同様に色素退行評価を行った。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では26個、染色から1週間後では25個、染色から1か月後では24個、染色から2箇月後では25個であった。すなわち、ハイブリダイゼーション後に蛍光体集積ナノ粒子を反応系に添加して、ハイブリダイゼーション後の反応系内で蛍光標識する方法をとっても、染色することが可能であり、また、同様に色素退行の防止効果が得られた(表4参照)。
検体スライドとしてHER陽性染色対照標本の検体スライド(パソロジー研究所社製「HER2-FISHコントロールスライド Code PS-09006」)の代わりに、健常人の組織アレイ(USBiomax社製「FDA normal organ tissue microarray of human」製品番号FDA999b)を用い、実施例24で得られたプローブ試薬でもって実施例24と同様にFISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
共焦点顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、輝点数2個の細胞のみが観察され、共焦点顕微鏡観察より検出感度の低い蛍光顕微鏡観察においてもHER2遺伝子が適正に検出された。
〔ビオチン標識率8.46%のDNAプローブ調製〕
Applied Biosystems 392 DNA/RNA synthesizer(Foster City,CA)を用いてプライマーA(5'-TCTCAGCAACATGTCGATGG-3')と、プライマーB(5'-TCGCACTTCTTACACTTGCG-3')を作製した(Clin.Cancer Res.2000;6:1439-1444参照)。
得られたcDNA1μgを用いて、実施例1と同様にニックトランスレーションを行い、最終濃度1μg/250μLのビオチン標識されたDNAの溶液を得た。
FITC(コード P76012 タカラバイオ社製)の使用量を5.25mg、メラミン樹脂原料ニカラックMX-035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.21gに変更したことを除いて、実施例22と同様に蛍光色素FITCを内包したポリメラミン粒子を作製した。得られたポリメラミン粒子はメラミン樹脂自体が骨格に多くのアミノ基を含む。得られたポリメラミン粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径40nmであった。
上記のようにビオチン標識したDNA25μL(濃度1μg/250μL)、蛍光体集積ナノ粒子修飾ストレプトアビジンを含む溶液を混合して、室温で30分間結合反応を行い、EGFR検出用のDNAプローブ(プローブ試薬A7)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。
共焦点顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、輝点数2個の細胞のみが観察され、共焦点顕微鏡観察より検出感度の低い蛍光顕微鏡観察においてもEGFR遺伝子が適正に検出された。
〔ビオチン標識率0.21%のDNAプローブ調製〕
EGFR遺伝子関連の配列を有する塩基数473のcDNA(核酸分子)を実施例31と同様に調製し、実施例31と同様にNickTranslationを実施した。ただし、Biotin-d-UTPは添加しないでNickTranslationを行い、得られたDNAに対して実施例12と同様に5’末端をビオチン化した。
(粒子の調製)
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから14.4mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX-035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.21gに変更したこと以外は、実施例1と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子(蛍光体集積ナノ粒子を)の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径158nmであった。
さらに、実施例1と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例1と同様に行った。
上記のように調製したDNA2μgを、VECTOR LABORATORIES社製の「5’EndTag(TM) Nucleic Acid Labeling System、(カタログNo.MB-9001)」のキットおよびプロトコールを用いて、以下のように核酸分子の5’末端をリン酸からチオリン酸に変換した。
以下のものを遠心チューブで混合して、37℃で30分間インキュベートした。
・cDNAの核酸分子2μg(/超純水8μL)
・Universal reaction buffer・・・1μL
・アルカリフォスファターゼ・・・1μL
さらに、上記混合液中に以下のものを混合して、37℃で30分間インキュベートした。
・Universal reaction buffer・・・2μL
・ATPγS・・・1μL
・T4 polynucleotide kinase・・・2μL
このプローブの反応溶液を核酸精製用マイクロスピンカラム(GEヘルスケア社製「MicroSpin S-200HR Column」、製品番号「#27-5120-01」)により精製した。
この溶液に対して、3M酢酸ナトリウム溶液(pH5.2)を約5.56μL、100%エタノールを150μL添加し、-20℃で1時間以上静置した。4℃で16000rpmで10分間遠心して沈殿を形成した。さらに、70%エタノールを500μL添加して、4℃、16000rpmで1分間遠心し上澄みを除去した。沈殿物に5~10μLの蒸留水を添加して完全に溶解させ、蛍光体集積ナノ粒子で標識されたDNA(プローブ試薬A8)の溶液(最終濃度1μg/250μL)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例20と同様に行った。
なお、DNAプローブの確認において、5'末端にのみ標識されたので、1:1であった。また、検体スライドとして健常人の組織アレイ(USBiomax社製「FDA normal organ tissue microarray of human」製品番号FDA999b)を用いた。実施例31と同様に共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
共焦点顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、輝点数2個の細胞のみが観察され、共焦点顕微鏡観察より検出感度の低い蛍光顕微鏡観察においてもEGFR遺伝子が適正に検出された。
〔標識率0.5%のDNAプローブの調製〕
遺伝子データベース「e!EnsemblASIA」(http://asia.ensembl.org/index.html)の検索で得られたEGFRの遺伝子配列番号(Chromosome 7: 55,086,714-55,324,313)を、プローブ検索サイト「HD-FISH」(URL:http://www.hdfish.eu/Find#probes.php)で入力・検索して、Bienko M_Nat Method 2013に記載の方法に従いEGFRのプライマーペアを610組、見出した。
EGFR選択的な配列の中から、Forword primer(5’-CGGAGTCCAAGTGTCCTTTC-3’)および Reverse primer(5’-CCTTCTATGCAAAGGGCAAA-3’)のプライマーのセット、Invitrogen社製「SuperScript(登録商標) II Reverse Transcriptase」、および一般的な市販のPCR試薬を用い、この逆転写酵素の製品説明書にあるプロトコールに従って、HT-29細胞から抽出したtotal RNAを鋳型として逆転写反応することにより、EGFR遺伝子関連の配列を有する塩基数473bpのcDNA(核酸分子)を作成した。
<ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製>
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから14.4mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX-035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.21gに変更したこと以外は、実施例7と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子(蛍光体集積ナノ粒子を)の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径158nmであった。
さらに、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
上記のように調製したcDNAの核酸分子2μgを、VECTOR LABORATORIES社製の「5’EndTag(TM) Nucleic Acid Labeling System、(カタログNo.MB-9001)」のキットおよびプロトコールを用いて、以下のように核酸分子の5’末端をリン酸からチオリン酸に変換して、
以下のものを遠心チューブで混合して、37℃で30分間インキュベートした。
・cDNAの核酸分子2μg(/超純水8μL)
・Universal reaction buffer・・・1μL
・アルカリフォスファターゼ・・・1μL
さらに、上記混合液中に以下のものを混合して、37℃で30分間インキュベートした。
・Universal reaction buffer・・・2μL
・ATPγS・・・1μL
・T4 polynucleotide kinase・・・2μL
次に、上記で得られた末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を反応して、5’末端に直接蛍光体集積ナノ粒子が結合したプローブを作成した。
このプローブの反応溶液を核酸精製用マイクロスピンカラム(GEヘルスケア社製「MicroSpin S-200HR Column」、製品番号「#27-5120-01」)により精製した。
この溶液に対して、3M酢酸ナトリウム溶液(pH5.2)を約5.56μL、100%エタノールを150μL添加し、-20℃で1時間以上静置した。4℃で16000rpmで10分間遠心して沈殿を形成した。さらに、70%エタノールを500μL添加して、4℃、16000rpmで1分間遠心し上澄みを除去した。沈殿物に5~10μLの蒸留水を添加して完全に溶解させ、蛍光体集積ナノ粒子で標識されたcDNA(プローブ試薬A8)の溶液(最終濃度1μg/250μL)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例4と同様に行った。
なお、DNAプローブの確認において、5'末端にのみ標識されたので、約1:1であった。また、検体スライドとして健常人の組織アレイ(USBiomax社製「FDA normal organ tissue microarray of human」製品番号FDA999b)を用いた。実施例30と同様に共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、輝点数2個の細胞のみが観察され、共焦点顕微鏡観察より検出感度の低い蛍光顕微鏡観察においてもEGFR遺伝子が適正に検出された。
<ビオチン標識率5%のDNAプローブの調製>
プローブ検索サイト「HD-FISH」(URL:http://www.hdfish.eu/Find#probes.php)で、ヒト第7番目の染色体の特定の領域(第55086714番目~第55324313番目)を指定してユニークな配列を検索し、該特定の領域に存在する第55091671番目~第55091880番目の次のユニークな配列を検索して入手した。この配列データを元にして核酸合成の依頼をしてHER-2遺伝子関連の配列(5’-AGCTGGCCAGTTTGAATTTG-3’)の塩基数20のDNA(核酸分子)を調製した。
上記のように調製したDNA4μgを、実施例12と同様にして、5’末端がビオチンで標識されたDNAを得た。
<ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製>
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから14.4mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX-035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.21gに変更したこと以外は、実施例7と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径158nmであった。
また、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
一方、実施例3と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
上記のようにビオチン標識したDNA溶液25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンで修飾した蛍光体集積ナノ粒子を含む溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、EGFR検出用のDNAプローブ(プローブ試薬A9)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例4と同様に行った。
なお、上記DNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記DNAのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、約1:1であった。
また、検体スライドとして健常人の組織アレイ(USBiomax社製「FDA normal organ tissue microarray of human」製品番号FDA999b)を用いた。実施例30と同様に共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、輝点数2個の細胞のみが観察され、共焦点顕微鏡観察より検出感度の低い蛍光顕微鏡観察においてもEGFR遺伝子が適正に検出された。
〔標識率0.5%のDNAプローブの調製〕
遺伝子データベース「e!EnsemblASIA」(http://asia.ensembl.org/index.html)の検索で得られたRETの遺伝子配列番号(Chromosome 10: 43584007- 43585055)を、プローブ検索サイト「HD-FISH」(http://www.hdfish.eu/Find#probes.php)に入力・検索して、Bienko M_Nat Method 2013に記載の方法に従いRETのプライマーペアを146組、見出した。
検索して得られたRET選択的な配列の組み合わせの中から、Forword primer(5’-TTCTGTGAGCATTTGCTTGG-3’)および Reverse primer(5’-CTCTTGACAATGTCCCCTGG-3’)のプライマーのセット、Invitrogen社製「SuperScript(登録商標) II Reverse Transcriptase」、および一般的な市販のPCR試薬を用い、この逆転写酵素の製品説明書にあるプロトコールに従って、HT-29細胞から抽出したtotal RNAを鋳型として逆転写反応することにより、RET遺伝子関連の配列を有する塩基数1048のcDNA(核酸分子)を作成した。
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから14.4mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX-035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.21gに変更したこと以外は、実施例3と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径158nmであった。
また、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
上記のように調製したcDNA40μgを、実施例12と同様にして、5’末端がビオチンで標識されたcDNAを得た。
<蛍光体集積ナノ粒子と上記cDNAとが結合したDNAプローブ調製>
上記のようにビオチン標識したcDNAの溶液25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンで修飾した蛍光体集積ナノ粒子を含む溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、RET検出用のDNAプローブ(プローブ試薬A10)を得た。
なお、上記cDNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記cDNAのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、約1:1であった。
また、検体スライドとして健常人の組織アレイ(USBiomax社製「FDA normal organ tissue microarray of human」製品番号FDA999b)を用いた。実施例30と同様に共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、輝点数2個の細胞のみが観察され、共焦点顕微鏡観察より検出感度の低い蛍光顕微鏡観察においてもRET遺伝子が適正に検出された。
〔標識率0.49%のDNAプローブの調製〕
遺伝子データベース「e!EnsemblASIA」(http://asia.ensembl.org/index.html)の検索で得られたMETの遺伝子配列番号(Chromosome 7: 116,312,444-116,438,440)を、プローブ検索サイト「HD-FISH」(http://www.hdfish.eu/Find#probes.php)に入力して、Bienko M_Nat Method 2013に記載の方法に従いmet proto-oncogene MET(MET)のプライマーのペアを295組、見出した。
METに選択的な配列の中から、Forword primer(5’-TCACAGCAGCAATTCCCATA-3’)および Reverse primer(5’-CCAGCATTTCAGAAGAGGTTTT-3’)のプライマーのセット、Invitrogen社製「SuperScript(登録商標) II Reverse Transcriptase」、および一般的な市販のPCR試薬を用い、この逆転写酵素の製品説明書にあるプロトコールに従って、HT-29細胞から抽出したtotal RNAを鋳型として逆転写反応することにより、MET遺伝子関連の配列を有する塩基数205のcDNA(核酸分子)を作成した。
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから14.4mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX-035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.21gに変更したこと以外は、実施例3と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径158nmであった。
また、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
上記のように調製したcDNAの核酸分子2μgから、実施例34と同様にして得られた5'末端チオリン酸プローブと、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液とを反応して、5’末端に直接蛍光体集積ナノ粒子が結合したプローブを作成した。
以下のものを遠心チューブで混合して、37℃で30分間インキュベートした。
・cDNAの核酸分子2μg(/超純水8μL)
・Universal reaction buffer・・・1μL
・アルカリフォスファターゼ・・・1μL
さらに、上記混合液中に以下のものを混合して、37℃で30分間インキュベートした。
・Universal reaction buffer・・・2μL
・ATPγS・・・1μL
・T4 polynucleotide kinase・・・2μL
次に、上記で得られた末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を反応して、5’末端に直接蛍光体集積ナノ粒子が結合したプローブを作成した。
そのプローブの反応溶液を核酸精製用マイクロスピンカラム(GEヘルスケア社製「MicroSpin S-200HR Column」、製品番号「#27-5120-01」)により精製した。
この溶液に対して、3M酢酸ナトリウム溶液(pH5.2)を約5.56μL、100%エタノールを150μL添加し、-20℃で1時間以上静置した。4℃で16000rpmで10分間遠心して沈殿を形成した。さらに、70%エタノールを500μL添加して、4℃、16000rpmで1分間遠心し上澄みを除去した。沈殿物に5~10μLの蒸留水を添加して完全に溶解させ、蛍光体集積ナノ粒子で標識されたcDNA(プローブ試薬A11)の溶液(最終濃度1μg/250μL)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例4と同様に行った。
なお、DNAプローブの確認において、cDNAと蛍光体集積ナノ粒子との結合モル比については、5'末端にのみ標識されたので、約1:1であった。また、検体スライドとして健常人の組織アレイ(USBiomax社製「FDA normal organ tissue microarray of human」製品番号FDA999b)を用いた。実施例30と同様に共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、輝点数2個の細胞のみが観察され、共焦点顕微鏡観察より検出感度の低い蛍光顕微鏡観察においてもMET遺伝子が適正に検出された。
<標識率0.46%のDNAプローブの調製>
遺伝子データベース「e!EnsemblASIA」(http://asia.ensembl.org/index.html)の検索で得られたFGFR2の遺伝子配列番号(Chromosome 7: 55,086,714-55,324,313)を、プローブ検索サイト「HD-FISH」(http://www.hdfish.eu/Find#probes.php)に入力して、Bienko M_Nat Method 2013に記載の方法に従いFGFR2のプライマーペアを280組、見出した。
FGFR2選択的な配列の中から、フォワードプライマー(5’-ATGAGTCACTGCACACAGCC-3’)および リバースプライマー(5’-TGAGTGAGATGTGGTCCAGG-3’)のプライマーのセット、Invitrogen社製「SuperScript(登録商標) II Reverse Transcriptase」、および一般的な市販のPCR試薬を用い、この逆転写酵素の製品説明書にあるプロトコールに従って、HT-29細胞から抽出したtotal RNAを鋳型として逆転写反応することにより、MET遺伝子関連の配列を有する塩基数217のcDNAを作成した。
実施例7と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径280nmであった。
また、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
上記のように調製したcDNAの核酸分子2μgを、実施例12と同様にして、5’末端がビオチンで標識された核酸分子を得た後、DNAプローブ(プローブ試薬A12)を得た。
<その他の観察等>
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、DNAプローブの確認において、HABA-アビジン法を用いて確認したところ、約1:1であった。また、検体スライドとして健常人の組織アレイ(USBiomax社製「FDA normal organ tissue microarray of human」製品番号FDA999b)を用いた。実施例30と同様に共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、輝点数2個の細胞のみが観察され、共焦点顕微鏡観察より検出感度の低い蛍光顕微鏡観察においてもFGFR2遺伝子が適正に検出された
〔ビオチン標識率0.21%のDNAプローブ調製〕
EGFR遺伝子関連の配列を有する塩基数473のcDNA(核酸分子)を実施例31と同様に調製し、実施例31と同様にNickTranslationを実施した。ただし、Biotin-d-UTPは添加しないでNickTranslationを行い、得られたDNAに対して実施例12と同様に5'末端をビオチン化した。
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから14.4mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX-035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.21gに変更したこと以外は、実施例7と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子(蛍光体集積ナノ粒子を)の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径158nmであった。
さらに、実施例7と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例7と同様に行った。
上記のように調製したDNA2μgを、VECTOR LABORATORIES社製の「5'EndTag(TM) Nucleic Acid Labeling System、(カタログNo.MB-9001)」のキットおよびプロトコールを用いて、以下のように核酸分子の5'末端をリン酸からチオリン酸に変換した。
・cDNAの核酸分子2μg(/超純水8μL)
・Universal reaction buffer・・・1μL
・アルカリフォスファターゼ・・・1μL
さらに、上記混合液中に以下のものを混合して、37℃で30分間インキュベートした。
・Universal reaction buffer・・・2μL
・ATPγS・・・1μL
・T4 polynucleotide kinase・・・2μL
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例31と同様に行った。
共焦点顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、輝点数2個の細胞のみが観察され、共焦点顕微鏡観察より検出感度の低い蛍光顕微鏡観察においてもEGFR遺伝子が適正に検出された。
実施例3で作製したプローブ試薬FのFISHにおける終濃度を5μg/μLにしたこと以外は、実施例3と同様にDNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は77であった(表6)。
実施例3で作製したプローブ試薬FのFISHにおける終濃度を1μg/μLにしたこと以外は、実施例3と同様にDNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は74であった(表6)。
実施例3で作製したプローブ試薬FのFISHにおける終濃度を0.2μg/μLにしたこと以外は、実施例3と同様にDNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は62であった(表6)。
文献(Bienko M., Nat Method 2013, 122)に記載されている方法(PCR)に従って、プローブを作成した。具体的には、文献に記載されているデータベース(www.hdfish.eu.)にアクセスし、HER2にハイブリダイズ可能なプライマー配列を表示させた。forwardプライマー(5'-biotin-ACGCCTGATGGGTTAATGAG-3')とreverseプライマー(5'-aagtagaggcagggagagcc-3')とを用いて上記文献に従ってPCRを行い、塩基数217のDNA断片を回収した。
上記PCRに得られた5’末端がビオチン標識されたDNA断片に対して、実施例17で製造したストレプトアビジン標識されたスルホローダミン101内包メラミン樹脂粒子(蛍光体集積ナノ粒子)を実施例17と同様に結合させることにより、5’末端に蛍光体集積ナノ粒子が結合したHER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬X)を得た。
比較例4と同様に上記DNAプローブ(プローブ試薬X)の確認を行い、作製したプローブ試薬XのFISHにおける終濃度を1.0μg/μLにしたこと以外は、実施例38と同様に、FISH、DNAプローブの保存、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
なお、上記DNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記DNAのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、約1:1であった。
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は78であった(表6)。
実施例41で作製したプローブ試薬XのFISHにおける終濃度を0.2μg/μLにしたこと以外は、実施例41と同様に、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は77であった(表6)。
実施例41で作製したプローブ試薬XのFISHにおける終濃度を0.04μg/μLにしたこと以外は、実施例41と同様に、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は78であった(表6)。
文献(Bienko M., Nat Method 2013, 122)に記載されている方法(PCR)に従って、プローブを作成した。具体的には、文献に記載されているデータベース(www.hdfish.eu.)にアクセスし、HER2にハイブリダイズ可能なプライマー配列を表示させた。forwardプライマー(5'biotin-TGCTTCCaaccttggttttt)とreverseプライマー(TGCAAGTGCaatacctgctc)を用いて上記文献に従ってPCRを行い、塩基数3347のDNA断片を回収した。
上記PCRに得られた5’末端がビオチン標識されたDNA断片に対して、実施例17で製造したストレプトアビジン標識されたスルホローダミン101内包メラミン樹脂粒子(蛍光体集積ナノ粒子)を実施例17と同様に結合させることにより、5’末端に蛍光体集積ナノ粒子が結合したHER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬Y)を得た。
実施例1と同様に上記DNAプローブ(プローブ試薬Y)の確認を行い、作製したプローブ試薬YのFISHにおける終濃度を1.0μg/μLにしたこと以外は、実施例38と同様に、FISH、DNAプローブの保存、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
なお、上記DNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記DNAのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、約1:1であった。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は80であった(表6)。
実施例44で作製したプローブ試薬YのFISHにおける終濃度を0.2μg/μLにしたこと以外は、実施例44と同様に、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は77であった(表6)。
実施例46で作製したプローブ試薬YのFISHにおける終濃度を0.04μg/μLにしたこと以外は、実施例44と同様に、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は79であった(表6)。
実施例16と同様にして製造することにより、塩基数20のDNA断片を得た後、DNA断片の5’を実施例16と同様にしてビオチン標識を行った。
次に、5’末端がビオチン標識されたDNA断片に対して、実施例17で製造したストレプトアビジン標識されたスルホローダミン101内包メラミン樹脂粒子(蛍光体集積ナノ粒子)を実施例17と同様に結合させることにより、5’末端に蛍光体集積ナノ粒子が結合したHER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬Z)を得た。
比較例4と同様に上記DNAプローブ(プローブ試薬Z)の確認を行い、作製したプローブ試薬Z-1のFISHにおける終濃度を1.0μg/μLにしたこと以外は、実施例38と同様に、FISH、DNAプローブの保存、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
なお、上記DNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記DNAのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、約1:1であった。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は73であった(表6)。
実施例47で作製したプローブ試薬ZのFISHにおける終濃度を0.2μg/μLにしたこと以外は、実施例47と同様に、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は73であった(表6)。
実施例47で作製したプローブ試薬ZのFISHにおける終濃度を0.04μg/μLにしたこと以外は、実施例47と同様に、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は73であった(表6)。
実施例16と同様にして製造することにより、塩基数20のDNA断片を得た後、DNA断片の5’を実施例16と同様にしてビオチン標識を行った。
次に、5’末端がビオチン標識されたDNA断片に対して、実施例17で製造したストレプトアビジン標識されたスルホローダミン101内包メラミン樹脂粒子(蛍光体集積ナノ粒子)を実施例17と同様に結合させることにより、5’末端に蛍光体集積ナノ粒子が結合したHER-2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬ZZ)を得た。
<その他の観察等>
実施例27と同様に上記DNAプローブ(プローブ試薬ZZ)の確認を行い、作製したプローブ試薬ZZ-1のFISHにおける終濃度を1.0μg/μLにしたこと以外は、実施例38と同様に、FISH、DNAプローブの保存、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
なお、上記DNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記DNAのビオチンで置換させるHABA-アビジン法を使用して行った結果、約1:1であった。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は62であった(表6)。
実施例50で作製したプローブ試薬ZZのFISHにおける終濃度を0.2μg/μLにしたこと以外は、実施例50と同様に、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は60であった(表6)。
[実施例52]
実施例50で作製したプローブ試薬ZZのFISHにおける終濃度を0.04μg/μLにしたこと以外は、実施例50と同様に、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は48であった(表6)。
Claims (20)
- 蛍光体を集積してなる蛍光体集積ナノ粒子と所定の核酸配列の核酸分子とが結合したインサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬。
- 前記蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径が300nm以下である請求項1に記載のプローブ試薬。
- 前記核酸分子と前記蛍光体集積ナノ粒子とがモル比1:1~1:5000で結合している請求項1または2のいずれかに記載のプローブ試薬。
- 前記核酸分子と前記蛍光体集積ナノ粒子とがモル比1:1~1:40で結合している請求項1~3のいずれか一項に記載のプローブ試薬。
- 塩基数5000以下の所定の核酸配列の核酸分子に対して、蛍光体を集積してなる蛍光体集積ナノ粒子を結合して得られる請求項1に記載のインサイチュハイブリダイゼイション用のプローブ試薬。
- 塩基数5000以下の所定の核酸配列の核酸分子に対して、蛍光体を集積してなる蛍光体集積ナノ粒子を核酸末端標識法またはニックトランスレーション法を利用する方法により結合して得られる請求項5に記載のインサイチュハイブリダイゼイション用のプローブ試薬。
- 核酸分子に対する蛍光体の標識率(%)が13.33%以下である請求項1~6のいずれか一項に記載のプローブ試薬。
- 前記蛍光体集積ナノ粒子が、樹脂を母材とする樹脂粒子、またはシリカを母材とする粒子であり、前記集積がされた色素が低分子蛍光色素あるいは量子ドットである請求項1~7のいずれか一項に記載のプローブ試薬。
- 前記樹脂がメラミン樹脂である請求項1~8に記載のプローブ試薬。
- 前記核酸分子に第1の生体分子が連結されており、前記蛍光体集積ナノ粒子に第2の生体分子が連結されており、第1の生体分子と第2の生体分子との特異的な結合を介して前記核酸分子と前記蛍光体集積ナノ粒子とが結合している、請求項1~9のいずれか一項に記載のプローブ試薬。
- 第1,2の生体分子がストレプトアビジンまたはビオチンである請求項10に記載のプローブ試薬。
- 前記核酸分子の塩基に蛍光体集積ナノ粒子が直接結合している、請求項1~9のいずれかに一項記載のプローブ試薬。
- 染色体上の特定領域の配列と相補的な塩基数150000未満の配列を有し第1の生体分子が連結された核酸分子と、第1の生体分子と特異的に結合可能な第2の生体分子が連結された蛍光体集積ナノ粒子とを分けて有するFISH用のプローブ試薬のキット。
- 染色体上の特定領域の配列と相補的な塩基数5000以下の配列を有し末端および/または末端以外の1~50ヵ所に第1の生体分子が連結された核酸分子と、第1の生体分子と特異的に結合可能な第2の生体分子が連結された蛍光体集積ナノ粒子とを分けて有するFISH用のプローブ試薬のキット。
- 請求項1~14のいずれか一項に記載のプローブ試薬またはキットを用いるFISH。
- 請求項13または14に記載の核酸分子を用いてハイブリダイゼーションを行った後に、請求項13または14の蛍光体集積ナノ粒子を前記ハイブリダイゼーションの反応系に加えて、第1の生体分子と第2の生体分子との特異的な結合を前記ハイブリダイゼーションの後に行う、請求項15に記載のFISH。
- BACプローブの配列を有し第1の生体分子が複数連結された核酸分子を染色体上の特定領域の配列に対してハイブリダイゼーションを行った後に、第1の生体分子と特異的に結合可能な第2の生体分子が連結した蛍光体を前記ハイブリダイゼーションの反応系に複数添加して前記核酸分子を蛍光標識するFISH。
- BACプローブの配列を有し第1の生体分子が末端および/または末端以外の1~50ヵ所に連結された塩基数5000以下の核酸分子を染色体上の特定領域の配列に対してハイブリダイゼーションを行った後に、第1の生体分子と特異的に結合可能な第2の生体分子が連結した蛍光体を前記ハイブリダイゼーションの反応系に複数添加して前記核酸分子を蛍光標識するFISH。
- インサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬の調製に用いられる化合物であって、蛍光体を集積してなる蛍光体集積ナノ粒子と核酸分子の基質とが結合した化合物。
- 所定の核酸配列の核酸分子1モルに対して、蛍光ナノ粒子を20000モル以上結合したことを特徴とする、インサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬。
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