CN110734964A - 一种适用于细菌fish检测的杂交缓冲液体系及其原位杂交方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子杂交检测技术领域，具体涉及一种适用于细菌FISH检测的杂交缓冲液体系及其原位杂交方法。所述杂交缓冲液中各组分的配比为：15％去离子甲酰胺、2×SSC、0.5M EDTA、5×Denhardt、50mMNaH2PO4。本发明所述杂交缓冲液特别适用于细菌类FISH检测，使用本发明所述杂交液进行FISH杂交具有结果特异性高、结果背景低、使用方便、成本低等优点。
Description
技术领域
本发明属于分子杂交检测技术领域，具体涉及一种适用于细菌FISH检测的杂交缓冲液体系及其原位杂交方法。
背景技术
FISH实验是通过碱基互补配对的力学原理，将特异的带有标签的探针序列与目的基因片段互补配对，再通过荧光或者化学反应显示结合点的位置以及数量。
核苷酸探针是原位杂交中检测组织细胞中RNA的一种通用型工具，通常有cRNA，cDNA以及寡核苷酸探针。其中寡核苷酸探针的合成较其他两种更加简单便捷，成本低。特异性的寡核苷酸探针，需要在特定的杂交环境下，控制探针只和靶序列结合。这里就需要杂交液这一工具，并配合杂交温度，利用的是碱基互补配对中退火杂交温度的原理。
绝大部分细菌rRNA序列内都有其特异的一段核酸序列，这段序列即可作为一段特异探针，且由于rRNA在组织内量多且聚集，末端标记荧光素的方式合成的寡核苷酸探针，可达到检测目的。目前文献资料中的应用于细菌FISH的杂交液，普遍含有硫酸葡聚糖，二硫苏糖醇，鲑鱼精DNA等成分，产品成分较多，且效果欠佳。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种适用于细菌FISH检测的杂交缓冲液体系及其原位杂交方法。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：
一种适用于细菌FISH检测的杂交缓冲液，各组分配方包括：去离子甲酰胺、SSC、EDTA、Denhardt、NaH2PO4和DEPC水。
上述方案中，所述杂交缓冲液中各组分的配比为：15％(体积比)去离子甲酰胺、2×SSC、0.5M EDTA、5×Denhardt、50mM NaH2PO4。
适用于细菌FISH检测的荧光原位杂交方法，包括如下步骤：
(1)组织切片预处理，包括：组织切片固定、脱蜡、水洗、通透、消化；
(2)预杂交：向经步骤(1)预处理后的组织切片滴加所述杂交缓冲液，37℃孵育1小时，倾倒去除杂交缓冲液；
(3)杂交：在组织切片上滴加含标记的寡核苷酸探针的杂交液缓冲液，盖上盖玻片，37℃杂交过夜；
(4)洗涤：用SSC洗脱液洗去杂交液；
(5)复染细胞核及封片，在荧光显微镜下观察荧光信号，采集图像。
上述方案中，所述组织切片脱蜡至水洗的具体过程为：依次将组织切片放入二甲苯Ⅰ15min，二甲苯Ⅱ15min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，85％酒精(体积浓度)5min，75％酒精(体积浓度)5min，DEPC水洗。
上述方案中，所述组织切片通透的具体过程为：将组织切片置于1×修复液中90℃、5～10分钟，随后自然冷却；所述修复液为DEPC和水按1:19稀释所得。
上述方案中，所述组织切片消化的的具体过程为：滴加蛋白酶K工作液消化15～20min。
上述方案中，步骤(4)所述洗涤的具体过程为：2×SSC，37℃洗10min；1×SSC，37℃洗2×5min；0.5×SSC室温洗10min。
本发明所述杂交缓冲液各组分协同作用，其中，去离子甲酰胺可以降低探针与目标结合的退火温度，避免杂交温度过高，破坏组织结构；2×SSC可以保持杂交液的一个杂交缓冲系统，使探针与靶基因更容易的结合；EDTA和NaH2PO4的作用是保护DNA或RNA不被降解，Denhardt的作用是封闭掉一些非特异性结合位点，防止探针与组织内其他物质产生非特异性结合；在相同的细菌类FISH探针和实验条件下，使用本发明所述杂交液进行FISH杂交相比较使用其他牌杂交液的效果存在较大区别，主要表现在：结果背景低(其他牌杂交液结果背景深)，荧光信号强(其他牌杂交液荧光信号弱)，特异性高。
本发明的有益效果：本发明所述杂交缓冲液特别适用于细菌类FISH检测，使用本发明所述杂交液进行FISH杂交具有结果特异性高、结果背景低、使用方便、成本低等优点。
附图说明
图1为实施例1中采用本申请所述杂交缓冲液(a)与采用其他牌杂交缓冲液(b)进行FISH杂交的结果图。
图2为实施例2中采用本申请所述杂交缓冲液进行FISH杂交的结果图。
图3为实施例3中采用本申请所述杂交缓冲液进行FISH杂交的结果图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
杂交缓冲液中各组分的配比为：15％去离子甲酰胺、2×SSC、0.5M EDTA、5×Denhardt、50mMNaH2PO4。
采用所述杂交缓冲液进行细菌FISH原位杂交的方法，包括如下步骤：
(1)组织切片固定、脱蜡至水洗：将肠道组织切片使用4％多聚甲醛固定，然后依次将组织切片放入二甲苯Ⅰ15min，二甲苯Ⅱ15min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，85％(体积浓度)酒精5min，75％(体积浓度)酒精5min，DEPC水洗；
(2)通透及消化：根据组织固定时间长短，将切片置于1×修复液(修复液：DEPC和水按1:19稀释)中90℃、5～10分钟，自然冷却；后基因笔画圈，根据不同组织不同指标特性，滴加蛋白酶K工作液(蛋白酶K用PBS按照1:4稀释)37℃消化15～20min，纯水冲洗后PBS洗3次×5min(消化条件可根据实际实验情况进行适当调整，时间相应延长或缩减)；
(3)预杂交：滴加预杂交液(杂交缓冲液)，37℃孵育1h；
(4)杂交：倾去预杂交液，滴加含探针EUB338的杂交缓冲液50ul，盖上盖玻片，37℃杂交过夜，湿盒内加入少量约50ul 2×SSC，以防干片；所述探针的序列为：5’-cy3-GCA GCCACC CGT AGG TGT-3’；
(5)杂交后洗涤：洗去杂交液，2×SSC，37℃洗10min，1×SSC，37℃洗2×5min，0.5×SSC室温洗10min，若非特异杂交体较多，可以增加甲酰胺洗涤(20*SSC用纯水稀释)；
(6)复染细胞核：滴加DAPI，室温8min，后纯水冲洗；
(7)滴加适量抗荧光淬灭封片剂，盖玻片封片；
(8)显微镜检，图像采集分析。
本实施例中使用的探针为EUB338，(总菌)探针序列：5’-cy3-GCA GCC ACC CGTAGG TGT-3’，荧光显微的观察结果如图1(a)所示，从图1(a)中可以看出，红色荧光信号亮点即为信号位置，背景清晰、干净。
使用吉马生物EUB338荧光原位杂交试剂盒，成分：20％(体积比)甲酰胺，4×SSC，5×denhardt，5％硫酸葡聚糖，50mmol/L DTT。采用上述方法进行细菌FISH原位杂交，探针仍为EUB338，(总菌)探针序列：5’-cy3-GCA GCC ACC CGT AGG TGT-3’，荧光显微的观察结果如图1(b)所示，从图1(b)可以看出，红色亮点为信号位置，但背景中还存在暗淡模糊的红色，该暗淡模糊红色为背景。从图1(a)和图1(b)的比较可以看出，采用本申请所述杂交缓冲液进行细菌FISH原位杂交获得的荧光显微观察结果：结果特异性高、结果背景低。
实施例2
杂交缓冲液中各组分的配比为：15％去离子甲酰胺、2×SSC、0.5M EDTA、5×Denhardt、50mMNaH2PO4。
采用所述杂交缓冲液进行细菌FISH原位杂交的方法，包括如下步骤：
(1)组织切片固定、脱蜡至水洗：将肺组织切片使用4％多聚甲醛固定，然后依次将组织切片放入二甲苯Ⅰ15min，二甲苯Ⅱ15min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，85％(体积浓度)酒精5min，75％(体积浓度)酒精5min，DEPC水洗；
(2)通透及消化：根据组织固定时间长短，将切片置于1×修复液(修复液：DEPC和水按1:19稀释)中90℃、5～10分钟，自然冷却；后基因笔画圈，根据不同组织不同指标特性，滴加蛋白酶K工作液(蛋白酶K用PBS按照1:4稀释)37℃消化15～20min，纯水冲洗后PBS洗3次×5min(消化条件可根据实际实验情况进行适当调整，时间相应延长或缩减)；
(3)预杂交：滴加预杂交液(杂交缓冲液)，37℃孵育1h；
(4)杂交：倾去预杂交液，滴加含探针legpen1.(嗜肺性军团病杆菌)的杂交缓冲液50ul，盖上盖玻片，37℃杂交过夜，湿盒内加入少量约50ul 2×SSC，以防干片；所述探针legpen1的探针序列：5'-ATC TGA CCG TCC CAG GTT-3'；
(5)杂交后洗涤：洗去杂交液，2×SSC，37℃洗10min，1×SSC，37℃洗2×5min，0.5×SSC室温洗10min，若非特异杂交体较多，可以增加甲酰胺洗涤(20*SSC用纯水稀释)；
(6)复染细胞核：滴加DAPI，室温8min，后纯水冲洗；
(7)滴加适量抗荧光淬灭封片剂，盖玻片封片；
(8)显微镜检，图像采集分析。
本实施例中使用的探针为legpen1.(嗜肺性军团病杆菌)，)探针序列：5'-ATC TGACCG TCC CAG GTT-3'，荧光显微的观察结果如图2所示，从图2中可以看出，绿色荧光信号亮点即为信号位置，背景清晰、干净。
实施例3
杂交缓冲液中各组分的配比为：15％去离子甲酰胺、2×SSC、0.5M EDTA、5×Denhardt、50mMNaH2PO4。
采用所述杂交缓冲液进行细菌FISH原位杂交的方法，包括如下步骤：
(1)组织切片固定、脱蜡至水洗：将肺组织切片使用4％多聚甲醛固定，然后依次将组织切片放入二甲苯Ⅰ15min，二甲苯Ⅱ15min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，85％(体积浓度)酒精5min，75％(体积浓度)酒精5min，DEPC水洗；
(2)通透及消化：根据组织固定时间长短，将切片置于1×修复液(修复液：DEPC和水按1:19稀释)中90℃、5～10分钟，自然冷却；后基因笔画圈，根据不同组织不同指标特性，滴加蛋白酶K工作液(蛋白酶K用PBS按照1:4稀释)37℃消化15～20min，纯水冲洗后PBS洗3次×5min(消化条件可根据实际实验情况进行适当调整，时间相应延长或缩减)；
(3)预杂交：滴加预杂交液(杂交缓冲液)，37℃孵育1h；
(4)杂交：倾去预杂交液，滴加含探针an.ke(金花无菌杆菌)的杂交缓冲液50ul，盖上盖玻片，37℃杂交过夜，湿盒内加入少量约50ul 2×SSC，以防干片；所述探针an.ke的探针序列为：5’-CTCCCCAGC ACA ACG AGC AGC AAA T-3’；
(5)杂交后洗涤：洗去杂交液，2×SSC，37℃洗10min，1×SSC，37℃洗2×5min，0.5×SSC室温洗10min，若非特异杂交体较多，可以增加甲酰胺洗涤(20*SSC用纯水稀释)；
(6)复染细胞核：滴加DAPI，室温8min，后纯水冲洗；
(7)滴加适量抗荧光淬灭封片剂，盖玻片封片；
(8)显微镜检，图像采集分析。
本实施例中使用的探针为an.ke(金花无菌杆菌)，探针序列：5’-CTC CCC AGC ACAACG AGC AGC AAA T-3’，荧光显微的观察结果如图3所示，从图3中可以看出，红色荧光信号亮点即为信号位置，背景清晰、干净。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种适用于细菌FISH检测的杂交缓冲液，其特征在于，各组分配方包括：去离子甲酰胺、SSC、EDTA、Denhardt、NaH2PO4 和DEPC水。
2.根据权利要求1所述的适用于细菌FISH检测的杂交缓冲液，其特征在于，所述杂交缓冲液中各组分的配比为：15%去离子甲酰胺、2×SSC、0.5M EDTA、5×Denhardt、50mMNaH2PO4。
3.权利要求1~2任一所述适用于细菌FISH检测的荧光原位杂交方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）组织切片预处理，包括：组织切片固定、脱蜡、水洗、通透、消化；
（2）预杂交：向经步骤（1）预处理后的组织切片滴加所述杂交缓冲液，37℃孵育1小时，倾倒去除杂交缓冲液；
（3）杂交：在组织切片上滴加含标记的寡核苷酸探针的杂交液缓冲液，盖上盖玻片，37℃杂交过夜；
（4）洗涤：用SSC洗脱液洗去杂交液；
（5）复染细胞核及封片，在荧光显微镜下观察荧光信号，采集图像。
4.根据权利要求1所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，所述组织切片脱蜡至水洗的具体过程为：依次将组织切片放入二甲苯Ⅰ15min，二甲苯Ⅱ15min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，85%酒精（体积浓度）5min，75%酒精（体积浓度）5min，DEPC水洗。
5.根据权利要求1所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，所述组织切片通透的具体过程为：将组织切片置于1×修复液中90℃、5~10分钟，随后自然冷却；所述修复液为DEPC和水按1:19稀释所得。
6.根据权利要求1所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，所述组织切片消化的的具体过程为：滴加蛋白酶K工作液消化15~20min。
7.根据权利要求1所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，步骤（4）所述洗涤的具体过程为：2×SSC，37℃洗10min；1×SSC，37℃洗2×5min；0.5×SSC室温洗10min。
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-
2019
- 2019-09-17 CN CN201910876521.6A patent/CN110734964A/zh active Pending
Patent Citations (4)
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