JPWO2015141856A1 - プローブ試薬および該プローブ試薬を用いたfish - Google Patents
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Abstract
Description
また、発明者らは、BACプローブを用いたFISHでは非特異的吸着による誤検出が起きてしまうという上記問題に着目した。
また、たとえば塩基数5000以下の範囲、特に塩基数4000以下の短い核酸分子や塩基数500以下の短い核酸分子を有するFISH用のプローブを用意して、特定遺伝子の5000塩基配列領域に対してハイブリダイゼーションを実施した場合に、蛍光輝度が足りずに目的の遺伝子を検出できないケースがある。
さらに、別の側面としての本発明は、
従来のBACプローブと比べて、短く且つ同等以下の標識率のプローブ(例;BACクローン由来のプローブ)でありながら、従来のBACプローブと同等以上の輝度を達成しつつ、且つ、FISHでのハイブリダイゼーションに悪影響が及びにくい上記プローブを得ることを目的とする(課題2)。
高い標識率達成が困難なBACクローンの場合には有効であるとともに、検出対象とする核酸配列によっては短いBACクローンしか選択肢のない場合にも有効である。
さらに、本発明者らは、BACプローブと比べて短いプローブ(例;BACクローン由来のプローブ)の末端および/または末端以外の1〜50か所に蛍光体集積ナノ粒子を所定の方法で結合させたときに上記課題2,3が解決できることを見出した。
さらに、本発明者らは、この蛍光シグナルを得る際に、標識率の少ないBACプローブ、またはBACプローブと比べて短く且つ同等以下の標識率のプローブを用いてFISHのハイブリダイゼーション処理を行った後、ハイブリダイズした各核酸分子に対して複数の蛍光体を集積した蛍光体集積ナノ粒子で蛍光染色することで、蛍光体の褪色を防止することができ、本発明のより好ましい実施形態とすることができることなどを見出し、本発明を完成させるに至った。
また、上述した目的の少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映したインサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬は、塩基数4000以下の所定の核酸配列の核酸分子に対して、蛍光体を集積してなる蛍光体集積ナノ粒子を核酸末端標識法により結合して得られるインサイチュハイブリダイゼイション用のプローブ試薬である。
また、上述した目的の少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映したFISHは、BACプローブの配列を有し第1の生体分子が末端または該末端以外の1〜50か所に連結された塩基数5000以下の核酸分子を染色体上の特定領域の配列に対してハイブリダイゼーションを行った後に、第1の生体分子と特異的に結合可能な第2の生体分子が連結した蛍光体を前記ハイブリダイゼーションの反応系に複数添加して前記核酸分子を蛍光標識するFISHである。
上述した目的の少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映したインサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬は、所定の核酸配列の核酸分子1モルに対して、蛍光ナノ粒子(例;半導体ナノ粒子など)を20000モル以上結合したことを特徴とする、インサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬である。
《蛍光体集積ナノ粒子を有するFISH用のプローブ試薬》
本発明に係るFISHのプローブ試薬は、蛍光体を集積してなる蛍光体集積ナノ粒子、所定の核酸配列の核酸分子とが結合したインサイチュハイブリダイゼイション用のプローブ試薬である。
核酸分子は、染色体上の特定領域の一部または全部を含む配列(プローブ配列)を有する核酸分子である。核酸にはDNA、RNA(mRNA,tRNA,miRNA,siRNA,non−cording−RNAなど)等の天然に存在する核酸やPNA、LNA(又はBNA:Bridged Nucleic Acid)等の人工核酸が含まれる。したがって、核酸分子は、染色体上の核酸配列と相補鎖を形成できるものであれば制限がない。核酸分子は、天然の核酸、人工核酸、または天然の核酸と人工の核酸とが連結した核酸の分子であってもよい。
また、上述した核酸分子の入手方法とは異なり、PNA、LNA(又はBNA:Bridged Nucleic Acid)等の人工核酸を利用して、プローブとして使用可能な配列を有するプローブ(核酸分子)を人工的に合成することによって核酸分子を入手することもできる。
蛍光体集積ナノ粒子は、蛍光体を集積したものである。このような蛍光体集積ナノ粒子を用いることで、蛍光体自体と比較して、1粒子当たりの発する蛍光の量、すなわち所定の生体分子を標識する輝点の輝度を高めることができる。
本明細書において「蛍光体」とは、外部からのX線、紫外線または可視光線の照射を受けて励起し、励起状態から基底状態に到る過程において光を発光する物質一般を指す。したがって、本発明にいう「蛍光体」は、励起状態から基底状態に戻るときの遷移態様の如何を問うものでなく、励起一重項からの失活に伴う発光である狭義の蛍光を発する物質であってもよいし、三重項からの失活に伴う発光である燐光を発する物質であってもよい。
蛍光体としての使用可能な有機蛍光体の例としては、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Alexa Fluor(登録商標、インビトロジェン社製)系色素分子、BODIPY(登録商標、インビトロジェン社製)系色素分子、カスケード(登録商標、インビトロジェン社)系色素分子、クマリン系色素分子、NBD(登録商標)系色素分子、ピレン系色素分子、Texas Red(登録商標)系色素分子、シアニン系色素分子、ペリレン系色素分子、オキサジン系色素分子等、有機蛍光色素として知られている物質を挙げることができる。
蛍光体として使用可能な無機蛍光体の例としては、II−VI族化合物、III−V族化合物、又はIV族元素を成分として含有する量子ドット(それぞれ、「II−VI族量子ドット」、「III−V族量子ドット」、「IV族量子ドット」ともいう。)のいずれかを挙げることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。量子ドットは、市販されているものでもよい。
蛍光体を集積した蛍光体集積ナノ粒子の製造方法は、特に制限されず、公知の方法により製造することができる。一般的には、樹脂またはシリカを母体として蛍光体をまとめ上げる(当該母体の内部または表面に蛍光体を固定化する)製造方法を用いることができる。
蛍光体集積ナノ粒子の粒子径は、蛍光観察できる範囲の平均粒子径であれば制限がないが、好適に蛍光観察する観点から、前記蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径が40nm以上300nm以下であることが好ましい。
有機蛍光体を用いた蛍光体集積ナノ粒子の製造方法として、蛍光体である蛍光色素を樹脂からなる母体の内部または表面に固定した、直径がナノメートルオーダーの樹脂粒子を形成させる方法を挙げることができる。この蛍光体集積ナノ粒子の調製方法は特に限定されるものではないが、例えば、蛍光体集積ナノ粒子の母体をなす樹脂(熱可塑性樹脂または熱硬化性樹脂)を合成するための(コ)モノマーを(共)重合させながら、蛍光体を添加し、当該(共)重合体の内部または表面に当該蛍光体を取り込ませる方法を用いることができる。
無機蛍光体を用いた蛍光体集積ナノ粒子の製造方法として、蛍光体である量子ドットをシリカからなる母体の内部または表面に固定した、シリカナノ粒子を形成させる方法が挙げられる。この製造方法は、ニュー・ジャーナル・オブ・ケミストリー 33巻 561ページ(2009)に記載されているCdTe内包シリカナノ粒子の合成を参考にすることができる。
核酸分子と蛍光体集積ナノ粒子との結合は、FISHに支障がなければ特に制限なく、様々な結合とすることができる。この核酸分子と蛍光体集積ナノ粒子の結合は、核酸分子に蛍光体集積ナノ粒子を直接結合する方法、または生体分子同士の結合を介して間接的に結合する方法のいずれでもよい。
直接結合する方法の例としては、核酸分子の5'末端のリボースC5位に結合したリン酸の水酸基または核酸分子の3'末端のリボースのC1位に結合した水酸基を公知のチオール基導入試薬によりチオール基(SH基)に置換し、マレイミドで標識された蛍光体集積ナノ粒子を反応させて、両者を結合する方法が挙げられる。
間接的に結合する方法は、生体分子(第1,2の生体分子)同士の結合を介して核酸分子と蛍光体集積ナノ粒子とを結合させる方法である。生体分子同士の結合として、例えば第1の生体分子としてのストレプトアビジンと第2の生体分子としてのビオチンの結合を用いる場合、上記の間接的な結合は、例えば以下のようにしてビオチン標識された核酸分子と、ストレプトアビジンで修飾された蛍光体集積ナノ粒子とを調製し、両者を結合させることで達成される。
(1)ニックトランスレーション法
核酸分子の特定の塩基(例えばチミン(T))を第1の生体分子(ビオチン等)で標識されたヌクレオチド(例えばBiotin−16−dUTP)にニックトランスレーションにより置換し、この核酸分子のビオチンに対して、(ストレプト)アビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子を結合させる方法を例示できる。
この場合のニックトランスレーションは、常法(例えば、「細胞工学別冊・実験プロトコールシリーズ FISH実験プロトコール」、第2部、第2章、松原謙一他監修、秀潤社、1994等)に従って、ビオチン標識されたヌクレオチド(ベーリンガー社製「biotin−16−dUTP」等)を用いて行うことができる。
また、上記とは別の方法として、核酸分子の末端(5’末端または3’末端)に第1の生体分子(ビオチン等)を導入する以下(2−1)〜(2−2)の方法を例示することができる。
(2−1)PCR法を利用する方法
鋳型からPCR法によりプロ―ブ(核酸分子)を調製する際に、PCR法で使用するプライマーとして、5’末端または3’末端の部分にビオチン−dNTP(Nはアデニンン(A),グアニン(G),シトシン(C),チミン(T),ウラシル(U)のいずれかである)を有するプライマーを使用することにより、5’末端または3’末端が第1の生体分子(例;ビオチン)標識されたプローブ(核酸分子)を調製することができ、このプローブに第2の生体分子(例;アビジン)を有する蛍光体集積ナノ粒子を反応させることにより、前記プローブ(核酸分子)と蛍光体集積ナノ粒子を1:1で結合させることができる。上記鋳型としては、BACクローンのものでもよいし、ヒト等のゲノムDNAを使用することもできる。
キット等により核酸分子の5’末端あるいは3’末端に第1結合基(例;チオール基)を導入し、この第1結合基と結合可能な第2結合基(例;マレイミド基)を有する分子であって第1の生体分子(例;ビオチン等)を有する分子を結合反応させることにより、核酸分子の5’末端または3’末端を第1の生体分子で標識することができる。この核酸分子に第2の生体分子(例;アビジン)を有する蛍光体集積ナノ粒子を反応させることにより、前記プローブ(核酸分子)と蛍光体集積ナノ粒子を結合させることができる。
上記リンカーとしては、例えば、Biotin PEG Maleimide(Nanocs社 )の、cord PG2-BNML-10k, PG2-BNML-5k, PG2-BNML3k, PG2-BNML-2k, PG2-BNML-1k等を使用することができる。
上記(2−1)PCR法を利用する方法に準じて、PCR法で使用するプライマーとして末端未標識プライマーを使用し、作成されたプローブ(核酸分子)に対して、「PlatinumBright Nucleic Acid Labeling Kit」(製品番号GLK-007,フナコシ社製)を反応することで、複数のビオチン標識をすることも可能である。
核酸分子に蛍光体集積ナノ粒子を複数結合させることにより、本発明に係る別のプローブ試薬を得る場合、この結合については、例えば上述したようにニックトランスレーションにより、核酸分子に含まれる複数の特定の塩基(例えばチミン(T))を第1の生体分子(ビオチン等)で標識し、このビオチンに対して第2の生体分子(ストレプトアビジン等)で標識された蛍光体(例えばストレプトアビジンで修飾された蛍光体集積ナノ粒子)を結合させることで行うことができる。
核酸分子に対する蛍光体の標識率は、(核酸分子に結合した蛍光体の分子数/該核酸分子1分子が有する全塩基数)×100(%)で表される。
前記核酸分子と前記蛍光体集積ナノ粒子との結合のモル比は、FISHにおける蛍光顕微鏡観察で蛍光シグナルがサチレーションせずに輝点観察できる範囲であれば特に限定されないが、前記核酸分子:前記蛍光体集積ナノ粒子の好ましいモル比は、1:1〜1:5000、より好ましくは1:1〜1:2000、より好ましくは1:1〜1:550、さらに好ましくは1:1〜1:100、さらに好ましくは1:1〜1:40である。核酸分子1分子あたりに少なくとも1個の蛍光体集積ナノ粒子が必要であり、また十分な輝度の蛍光シグナルを観察できるようにするためには核酸分子1分子あたりに100個の蛍光体または蛍光体集積ナノ粒子が結合していれば十分である。なお、核酸分子1分子あたりに複数の蛍光体または蛍光体集積ナノ粒子が結合した場合でも、それらは1つの輝点として観察され、検出対象とする遺伝子1コピーが存在するものと判別することができる。
前記核酸分子:前記蛍光体集積ナノ粒子(モル比)=1:2のプローブ試薬は、上述したように核酸分子の5'末端および3'末端に蛍光体集積ナノ粒子を結合させることで作成することができる。
核酸分子中のアデニン(ATP)を置換してビオチン標識する場合は、上記ヌクレオチド基質として、Biotin−11−dATP 、Biotin−14−dATP 、Bio−7−dATP (Biotin−7−2'−deoxyadenosine−5'−triphosphate)、BIOTIN-N6−ATP等を使用することができる。
本発明に係る別のインサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬は、所定の核酸配列の核酸分子1モルに対して、半導体ナノ粒子を20000モル以上結合したことを特徴とする。
上記核酸分子としては、蛍光体集積ナノ粒子を有するプローブ試薬について前述した際に説明した核酸分子を使用することができるのでその説明を省略する。
上記半導体ナノ粒子としては、例えば、前述した量子ドットを使用することができ、具体的には「Qdot(登録商標)」(インビトロジェン社製)等を使用することができる。
上記半導体ナノ粒子の粒子径は、上記結合モル比の範囲で核酸分子と結合したプローブ試薬でFISHを行った際に蛍光顕微鏡で蛍光観察できる範囲の平均粒子径であれば制限がないが、プローブの核酸分子と検出対象であるターゲットの遺伝子(例;組織切片中のHER2遺伝子等)とのハイブリダイゼーションに悪影響を及ぼさないようにする観点から、蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径より小径の40nm未満のものであることが好ましく、10〜20nmの半導体粒子がより好ましい。
核酸分子と半導体ナノ粒子との結合は、FISHに支障がなければ特に制限なく、様々な結合とすることができる。この核酸分子と半導体ナノ粒子の結合は、核酸分子に半導体ナノ粒子を上記モル比範囲で直接結合する方法、または生体分子同士の結合を介して間接的に結合する方法のいずれでもよい。
直接結合する方法の例としては、例えば、第1の結合基(例;マレイミド等)を有する核酸の基質を用いて核酸分子に対してニックトランスレーションを行い、核酸分子に第1結合基を導入し、第1結合基に結合可能な第2結合基(例;チオール基等)を有する量子ドットを反応させて結合する方法である。マレイミド基を有する核酸基質(マレイミド−dNTPs)は、例えば、日本(株)遺伝子研究所等により受託合成を依頼して購入したものを用いることができる。
直接結合する方法の例としては、例えば、第1生体分子(例;ビオチン等)を有する核酸の基質(例;上述したdUTP−ビオチン等)を用いて、核酸分子(特に核酸の塩基数2万以上のもの)に対してニックトランスレーションを行い、核酸分子に第1生体分子を導入し、第1生体分子に結合可能な第2生体分子(例;ストレプトアビジン等)を有する量子ドットを反応させて結合する方法である。このとき、第1の生体分子と第2の生体分子は直接的に結合可能であってもよく、第3の分子・物質を介して結合可能であってもよい。
前記核酸分子と前記半導体ナノ粒子との結合のモル比は、前記核酸分子1モルに対して、少なくとも、前記半導体ナノ粒子を20000モル以上結合させることにより、半導体ナノ粒子を有するFISH用のプローブ試薬を用いてFISHを行った際に蛍光顕微鏡でも十分な輝点を観察できる程度の輝度を確保することができる。
〔染色方法〕
以下、FISHについて述べる。FISHは特に限定されず、公知の方法を用いることができる。以下の記載は、本発明における実施形態の一例である。
検体スライドは、例えばがんが疑われる被験者(ヒト、イヌ、ネコ等)の組織について一般的な病理組織診断に用いる方法で調製することができる。まず、被験者の組織を、ホルマリン等を用いて固定し、アルコールで脱水処理した後、キシレン処理を行い、高温のパラフィン中に浸しパラフィン包埋を行い、組織試料を作製する。続いて、上記組織試料を3〜4μmの切片にし、スライドガラス上に載置したものを検体スライドとする(図2、3参照)。
キシレンまたはその他の脱パラフィン剤を入れた容器に検体スライド上の組織切片を浸漬させ、パラフィンを除去する(図2、3参照)。このときの温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。次いで、エタノールを入れた容器に該切片を浸漬させ、キシレンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。次いで、水を入れた容器に該切片を浸漬させ、エタノールを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
BACプローブまたはBACプローブと比べて短いプローブ(例;BACクローン由来のプローブ)をハイブリダイゼーション反応する前に、加熱処理、酸処理、酵素処理、活性剤による処理など、プローブ試薬が効率的に組織切片上の核酸に到達できるようにするための前処理を施すことが知られている。これらの処理条件や組合せは、切片の種類・厚さ・スライド調整条件などにより、最適条件が異なるので、適宜手順を決定する必要がある。すべての処理を必ず実施する必要があるわけではなく、例えば酵素処理を実施しないという選択肢もありうる。
上記の酵素処理の後など必要であれば前処理の各ステップで、検体スライドを固定するため、例えば以下のような手順の処理を行う。まず、検体スライドをホルマリン溶液に一定時間浸漬する。次いで、洗浄緩衝液に浸漬して洗浄し、この操作を2回繰り返す。その後、検体スライドを風乾等により乾燥させる。
上記の固定処理の後、切片上に存在するDNAを変性する(二本鎖DNAから一本鎖DNAにする)ため、例えば以下のような手順の処理を行う。まず、検体スライドを変性溶液(ホルムアミド/SSC溶液等)に72℃程度で所定の時間、浸漬する。その後、検体スライドを取り出し、ホルムアミドを除去するため、濃度を徐々に高めた数段階のエタノール(例えば70%エタノール水溶液、80%エタノール水溶液および100%エタノール)に浸漬する。その後、検体スライドを風乾等により乾燥させる。
上述したプローブ試薬を用いて、公知のFISH(例えば「アジレントFISH General PurposeReagentsプロトコル」や、「臨床FISHプロトコール―目で見る染色体・遺伝子診断法 (細胞工学別冊―実験プロトコールシリーズ」等)と同様に、ハイブリダイゼーション処理を行うことができる(図2、3参照)。ここで、用語「ハイブリダイゼーション」は、二本鎖分子の形成のための二本のDNA又はDNAとRNA相補鎖の結合過程、または形成された2本鎖の分子を意味する。
ハイブリダイゼーション処理の後、通常はさらに、細胞数をカウントするための核染色処理を行う。核染色試薬としてはDAPIが一般的であるが、これ以外にもHoechst 33258、Hoechst 33342などのビスベンズイミド誘導体やその他の核染色試薬を用いてもよい。例えば、核染色試薬としてDAPIを用いる場合は、次のような手順で核染色を行うことができる。まず、ハイブリダイゼーション処理を行った検体スライドを脱イオン水、リン酸液緩衝生理食塩水(PBS)で順次洗浄する。次いで、DAPI染色試薬(2μg/PBS)に一定時間浸漬する。
FISHによる染色処理および核染色処理を終えた検体スライドは、PBSで数回洗浄し、風乾または脱水処理を行った後、組織切片上に封入剤を滴下し、カバーガラスを被せ、乾燥させる封入処理を行う。以上の処理により作製された封入済みの検体スライドが、病理診断等を行うためのプレパラートとなる。
染色した上記切片に対し蛍光顕微鏡を用いて、広視野の顕微鏡画像から蛍光の輝点の数又は発光輝度を計測する。用いた蛍光物質の吸収極大波長及び蛍光波長に対応した励起光源及び蛍光検出用光学フィルターを選択する。輝点数又は発光輝度の計測は、市販の画像解析ソフト、例えば、株式会社ジーオングストローム社製の全輝点自動計測ソフトG−Countを用いて行うことができる。なお、顕微鏡を使用した画像解析自体は周知であり、例えば、特開平9−197290に開示される手法を用いることができる。顕微鏡画像の視野は、3mm2以上であることが好ましく、30mm2以上であることがさらに好ましく、300mm2以上であることがさらに好ましい。顕微鏡画像から計測された輝点数、及び/又は発光輝度に基づいて、目的とする特定の遺伝子のコピー数を評価する。具体的には、例えば、コピー数が1〜2つであれば正常であり、3つ以上であれば異常(増殖)が生じていると評価することができる。
(1)本発明に係るプローブ試薬によれば、核酸分子(例;BACプローブ、またはBACプローブと比べてより短く且つ標識率が同等以下のプローブ(例;BACクローン由来のプローブ))に対し、蛍光体を集積して発光輝度を高めた蛍光体集積ナノ粒子を結合させ標識した構成であるので、標識率が従来のBACプローブと同等以下のものであっても、従来の標識率の高いBACプローブ以上に発光輝度を高めることができ、組織切片のより深層に位置する輝点をも同時に検出することが可能となる。また、FISHを行った組織切片のスライドについて、輝点の検出が可能な状態でより長く維持することが可能となる。
なお、ビオチン標識した核酸基質を用いるニックトランスレーション法により核酸分子をビオチン標識する際に、ビオチン標識した核酸基質の使用量を調節することで標識率を下げることができるので、このような方法で上記標識率が低い核酸分子を得るようにしてもよい。
〔ビオチン標識率13.3%のBACプローブの調製〕
CellBiochemBiophys.2006;45(1)59の記載の方法に従って、以下のように核酸分子を調製した。GSP社から購入したHER2−DNAクローン(約150kbp)1μg(5μL)に対して、ニックトランスレーション用のキット(製品名「GSP−ニックトランスレーションキット」K−015、GSP社製)のプロトコールに従い、以下のようにニックトランスレーション法により、HER2のDNAクローン(核酸分子)のdTTPをビオチン標識dUTPで置換した。
まず、下記の試薬を遠心チューブ内で混合した。
・10×NickBuffer(Tris−HCl[pH7.2]、MgSO4、DTT)・・・2.5μL
・BSA(Nuclease−free BSA)・・・1.5μL
・dNTP mix(dATP、dCTP、dCTP)・・・5μL
・dTTP・・・0.5μL、
・Biotin−16−dUTP(製品番号1093070、Roche社製、50nmol/50μL)・・・1.5μL
・純水(Nuclease free water)・・・3μL
・上記HER2−DNAクローン約150kbp 1μgの水溶液・・・5μL
・DNA PоlymeraseI(Tris−HCl[pH7.5]、EDTA、DTT、glycerоl)・・・1μL
・DNaseI・・・5μL
上記ニックトランスレーションによりビオチン標識したBACプローブ25μL(濃度1μg/250μL)、ストレプトアビジンで表面修飾された平均粒子径15nmのQdot(登録商標、Quantum Dot Corporation社製)を1.0μL(50nmol/50μL)含む溶液を混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬A)を得た。
このDNAプローブの確認は、0.5%のTBEを含む2%アガロースゲルで0.5%の変性バッファーTris−Borate−EDTA(TBE)中で電気泳動を行う電気泳動シフトアッセイにより行った。一本鎖のDNAを、SYBR GreenII(Molecular Probes, Eugene,OR)によりカウンター染色した。そして、Q−dоtとDNAの移動パターンを、「MultiImager FX System」(Bio−Rad,Hercules,CA)を使用して、以下のように決定した。
上述のように得られたDNAプローブをハイブリダイゼーション緩衝液(25%脱イオン化したホルムアミド、2×SSC、200ng/μLサケ精子DNA、5×デンハルト溶液、50mMのリン酸ナトリウム、pH7.0、1mMEDTA)に終濃度1〜5ng/μLとなるように希釈した。必要に応じて、S300サイズのスピンカラム(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)により遊離のリガンド(遊離しているストレプトアビジン、ビオチン、およびdATPの基質)を除去した。直ぐに使用しない場合、DNAプローブを−20℃で冷凍保存した。
FISHによりHER2遺伝子のコピー数を測定した。FISHは以下に示すように、脱パラフィン処理、検体スライドの前処理、酵素処理、検体の固定処理、プローブの準備、検体スライドのDNAの変性処理、ハイブリダイゼーション処理、スライドグラスの洗浄処理、およびDAPI染色処理をこの順で行うことで実施した。
HER2陽性染色対照標本の検体スライド(パソロジー研究所社製「HER2−FISHコントロールスライド Code PS−09006」)を、以下の(1)〜(4)の順で処理することで脱パラフィン処理を行った。(1)ヘモディー(Hemo−De)に常温で10分間浸漬する。(2)検体スライドを新しいHemo−Deに常温10分間浸漬する。同じ操作を3回繰り返す。(3)検体スライドを100%エタノールで常温で5分間浸漬し、2回洗浄し、脱水処理を行う。(4)検体スライドを風乾または45〜50℃のスライドウォーマー上で乾燥させる。
DNAプローブの到達性を向上させるために、上記検体スライドに対し以下の(1)〜(6)の順で前処理を行い、細胞膜及び核膜の蛋白質の除去を行った。(1)検体スライドを0.2mоl/L HClで室温、20分間処理する。(2)検体スライドを精製水に3分間浸漬する。(3)検体スライドを洗浄緩衝液(2xSSC:standard sailine citrate)に3分間浸漬する。(4)検体スライドを80℃の前処理溶液(1N NaSCN)に30分間浸漬する。(5)検体スライドを精製水に1分間浸漬する。(6)検体スライドを洗浄緩衝液(2xSSC)に5分間浸漬し、この浸漬操作を2回繰り返す。
前処理を行った検体スライドに対して、以下の(1)〜(4)の処理をこの順で行うことで酵素処理を行った。(1)前処理した検体スライドを取り出し、ペーパータオルにスライドグラスの下端をつけて余分な洗浄緩衝液を取り除く。(2)検体スライドを37℃に加温したプロテアーゼ溶液に10〜60分間浸漬する。この浸漬処理は、細胞膜及び核膜のタンパク質、特にコラーゲンの分解をするために、25mg プロテアーゼ(2500−3000Units/mg)[ペプシン]/1M NaCl[pH2.0]50mLで37℃、60分間)で処理することが望ましい。(3)検体スライドを洗浄緩衝液に5分間浸漬する。この操作を2回繰り返す。(4)検体スライドを風乾または45〜50℃のスライドウォーマー上で2〜5分間乾燥させる。
検体の固定処理として、前処理を行った検体スライドに対して以下の(1)〜(3)の処理を行った。(1)検体スライドを10%中性緩衝ホルマリン(和光純薬社製「4%パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液」、製品番号163−20145)に常温で10分間浸漬する。(2)検体スライドを洗浄緩衝液に5分間浸漬する。これと同じ操作を2回繰り返す。(3)検体スライドを風乾または45〜50℃のスライドウォーマー上で2〜5分間乾燥させる。
冷凍保存しておいたDNAプローブ(プローブ試薬A)の溶液を室温に戻し、正確な容量を採液可能なピペッティング操作ができる程度まで溶液の粘度を十分にさげて、ボルテックスミキサー等で溶液を混和した。
検体スライド上のDNAの変性処理として、検体の固定処理を行った検体スライドに対して以下の(1)〜(8)の処理を行った。(1)検体スライドの作成前に水で湿らせたペーパータオルを底に敷いた湿潤箱(気密性の容器であり、その側面をペーパータオルでテーピングしたもの)を37℃インキュベータ内に載置して予備加熱する。(2)変性溶液(70% ホルムアミド/SSC[150mM NaCl、15mMクエン酸ナトリウム])のpHが常温でpH7.0〜8.0であることを確かめる。変性溶液をコプリンジャーに入れ、溶液が72℃±1℃になるまで温浴槽で加温する(72±1℃の温浴槽に少なくとも30分間置く)。(3)ハイブリダイゼーション領域がどの部分か分かるように、検体スライドの裏側に領域を囲むようにダイアモンドペン等でマークする。(4)検体スライドを72±1℃の変性溶液の入ったコプリンジャー中に浸漬し、検体スライドのDNAを変性する。(5)ピンセットを使って、検体スライドを変性溶液から取り出し、すぐに常温の70%エタノール中に入れる。ホルムアミドを除くためにスライドを振盪する。検体スライドを1分間浸漬する。(6)検体スライドを70%エタノールから取り出し、85%エタノール中に入れ、ホルムアミドを除くためにスライドを振盪する。検体を1分間浸漬する。100%エタノールで同じ操作を2回繰り返す。(7)ペーパータオルに検体スライドグラスの下端をつけてエタノールを取り除き、ペーパータオルでスライドグラスの裏側を拭く。(8)検体スライドをドライヤーで風乾または45〜50℃のスライドウォーマーで2〜5分間乾燥させる。
上記変性処理を行った検体スライドに対して以下の(1)〜(3)の処理をこの順で行うことで、検体スライドに対して上述したように調製したDNAプローブ10μL(10〜50ng)を用いてハイブリダイゼーション処理を行った。(1)検体スライドのハイブリダイゼーション領域に調製した上記DNAプローブを10μL添加し、すぐに、22mm×22mmのカバーグラスをプローブの上に被せ均一にプローブを広げる。ハイブリダイゼーション領域に気泡が入らないようにする。(2)ペーパーボンドでカバーグラスをシールする。(3)前もって加温した湿潤箱に検体スライドを入れて蓋をして37℃のインキュベータで14〜18時間ハイブリダイゼーションを行う。
上記ハイブリダイゼーション処理を行った検体スライドに対して以下の(1)〜(6)の処理をこの順で行うことで、検体スライドの洗浄処理を行った。(1)ポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液(2×SSC/0.3%NP−40)をコプリンジャーに入れる。ポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液が72℃±1℃になるまで温浴槽で予備加熱をする(72℃±1℃の温浴槽に少なくとも30分間置く)。(2)ポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液を入れたコプリンジャーをもうひとつ用意し、常温に維持する。(3)ピンセットでペーパーボンドのシールを取り除く。(4)検体スライドをポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液の中に入れる。カバーグラスは自然に溶液中で剥がれるのを待つ。(5)溶液から検体スライドを取り出し、余分な溶液を取り去り、72±1℃に加温したポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液に2分間浸す。ここで、73℃を超える温度や処理時間として2分を超えないようにするのが望ましい。(6)コプリンジャーから検体スライドを取り出し、遮光下(締め切った引出や締め切ったキャビネットの棚等)で風乾する。
DAPI染色は以下のように行った。まず、10μLのDAPI対比染色液を検体スライドのハイブリダイゼーション領域に添加した。次に、ハイブリダイゼーション処理した後、細胞数をカウントするためにDAPI染色(2μg/mLPBS)を25℃、10分間行うことで細胞核を染色し、カバーガラスを被せて、シグナルの計測まで検体スライドを遮光して保存した。DAPI (4',6−Diamidino−2−Phenylindole, Dihydrochloride) はMolecular Probes社(D1306)を使用した。
<明視野観察>
上記で作製した検体スライドについて、光学顕微鏡(カールツァイス社製「Imager」)を用いて第一の免疫染色の染色画像を取得した。
上記作製しFISHを行った検体スライドについて、共焦点顕微鏡Zeiss LSM780(カールツァイスマイクロスコピー GmbH社製)を用いてハイブリダイズしたDNAプローブのQ−dоtを励起し、Q−dоtからの蛍光を測定波長655nmで検出して、蛍光の測定、蛍光画像(蛍光静止画像)および輝点数の計測を取得した。なお、焦点深度を3.6μm、3.15μm、および2.7μmと変更してそれぞれ撮像を行った。
蛍光顕微鏡観察は、上述のようにFISHを行った切片を、蛍光顕微鏡Zeiss imager(Camera:MRmモノクロ・冷却機能付、対物レンズ×60油浸)を用いて、蛍光顕微鏡観察(600倍)を行い、蛍光の測定、蛍光画像(蛍光静止画像)および輝点数の計測を行った。
蛍光顕微鏡観察において、検体スライドの断面に対する深さ方向にピントを合わせていくことで、深い位置の輝点が確認された。
〔ビオチン標識率13.3%のBACプローブの調製〕
上述した実施例1と同様の手順で、最終濃度1μg/250μLのビオチン標識された塩基数15万のBACプローブ(核酸分子)の溶液を得た。
上述のようにビオチン標識したBACプローブ25μL(濃度1μg/250μL)、FITC修飾ストレプトアビジン(Streptavidin,FITC Conjugate(1mgフナコシ SA−5001)を1.0μL(50nmol/50μL)含む溶液を混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬B)を得た。
このDNAプローブの確認は、0.5%のTBEを含む2%アガロースゲルで0.5%の変性バッファーTris−Borate−EDTA(TBE)中で電気泳動を行う電気泳動シフトアッセイにより行った。一本鎖のDNAを、SYBR GreenII(Molecular Probes, Eugene,OR)によりカウンター染色した。そして、DNAの移動パターンを、「MultiImager FX System」(Bio−Rad,Hercules,CA)を使用して、以下のように決定した。
また、BACプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、FITCのストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記BACプローブのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、1:20000であった。
<FISH>
実施例1と同様にFISHを行った。
上記で作製した検体スライドについて、光学顕微鏡(カールツァイス社製「Imager」)を用いて第一の免疫染色の染色画像を取得した。
上記作製しFISHを行った検体スライドについて、共焦点顕微鏡Zeiss LSM780(カールツァイスマイクロスコピー GmbH社製)を用いてハイブリダイズしたDNAプローブのFITCを488nmで励起し、FITCからの蛍光を測定波長530nmで検出して、蛍光の測定、蛍光画像(蛍光静止画像)および輝点数の計測を取得した。なお、焦点深度を5.95μm、4.95μm、および4.5μmと変更してそれぞれ撮像を行った。
蛍光顕微鏡観察は、実施例1と同様に行った。
<結果考察>
蛍光顕微鏡観察において輝点が確認された。
〔ビオチン標識率1.33%のBACプローブの調製〕
ニックトランスレーションによるビオチン標識でdTTPの使用量を0.5μLから1.5μLに変更し、Biotin−16−dUTP(製品番号1093070、Roche社製、50nmol/50μL)の使用量を1.5μLから0.2μLに変更したこと以外は、実施例1と同様に最終濃度1μg/250μLのビオチン標識された塩基数15万のBACプローブ(核酸分子)の溶液を得た。
上述のようにビオチン標識したBACプローブ25μL(濃度1μg/250μL)、ストレプトアビジンで表面が標識された平均粒子径15nmのQdot(登録商標、Quantum Dot Corporation社製)を1.0μL(50nmol/50μL)含む溶液を混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬C)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例1と同様に行った。なお、BACプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、Q−dоtのストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記BACプローブのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、1:2000であった。
<結果考察>
蛍光顕微鏡観察において、輝点が観察されなかった。
〔ビオチン標識率1.33%のBACプローブの調製〕
dTTPの使用量を0.5μLから1.5μLに変更し、Biotin−16−dUTP(製品番号1093070、Roche社製、50nmol/50μL)の使用量を1.5μLから0.2μLに変更したこと以外は、実施例1と同様に最終濃度1μg/250μLのビオチン標識された塩基数15万のBACプローブ(核酸分子)の溶液を得た。
上述のようにビオチン標識したBACプローブ25μL(濃度1μg/250μL)、FITC修飾ストレプトアビジン(フナコシ社製「Streptavidin,FITC Conjugate(1mg、SA−5001)」)を1.0μL(50nmol/50μL)含む溶液を混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬D)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例1と同様に行った。
<結果考察>
蛍光顕微鏡観察において、輝点が観察されなかった。
〔ビオチン標識率1.33%のBACプローブの調製〕
実施例1のニックトランスレーションによるビオチン標識でdTTPの使用量を0.5μLから1.5μLに変更し、Biotin−16−dUTP(製品番号1093070、Roche社製、50nmol/50μL)の使用量を1.5μLから0.2μLに変更したこと以外は、実施例1と同様に最終濃度1μg/250μLのビオチン標識された塩基数15万のBACプローブ(核酸分子)の溶液を得た。
Texas Red色素3.4mgと3−アミノプロピルトリメトキシシラン(3−aminopropyltrimetoxysilane、信越シリコーン社製、KBM903)3μLとをDMF中で混合し、オルガノアルコキシシラン化合物を得た。得られたオルガノアルコキシシラン化合物0.6mLを、48mLのエタノール、0.6mLのTEOS(テトラエトキシシラン)、2mLの水、1.4mLの28%アンモニア水と3時間混合した。上記工程で作製した混合液を10000Gで20分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を2回ずつ行なった。これらの操作により、Texas Red色素シリカナノ粒子を得た。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径50nmであった。
上述のようにビオチン標識したBACプローブ25μL(濃度1μg/250μL)と、上記ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を含む溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬E)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例1と同様に行った。なお、BACプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記BACプローブのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、1:2000であった。
蛍光顕微鏡観察において、深さ方向にピントを合わせることなく、深い位置の輝点が視認することができた。
〔ビオチン標識率1.33%のBACプローブの調製〕
実施例1のニックトランスレーションによるビオチン標識でdTTPの使用量を0.5μLから1.5μLに変更し、Biotin−16−dUTP(製品番号1093070、Roche社製、50nmol/50μL)の使用量を1.5μLから0.2μLに変更したこと以外は、実施例1と同様に最終濃度1μg/250μLのビオチン標識された塩基数15万のBACプローブ(核酸分子)の溶液を得た。
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)20.3mgを水22mLに加えて溶解した。その後、この溶液に乳化重合用乳化剤のエマルゲン(登録商標)430(ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王社製)の5%水溶液を2mL加えた。この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら70℃まで昇温させた後、この溶液にメラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)を0.81g加えた。
一方、ストレプトアビジン(和光純薬工業社製)とN−スクシミジル Sアセチルチオ酢酸(N−succinimidyl S−acetylthioacetate、略称:SATA)を用いて、ストレプトアビジンに対してチオール基の付加処理を行い、ゲル濾過を行って蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンを別途用意した。
上記蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンを、2mMのEDTAを含有したPBS中で混合後、室温で1時間反応させて、両者を結合させる反応を行った。反応後、10mMメルカプトエタノールを添加して反応を停止させた。得られた溶液をφ=0.65μmの遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲル濾過カラムを用いて未反応のストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
上述のようにビオチン標識したBACプローブ(核酸分子)25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬F)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例1と同様に行った。なお、BACプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記BACプローブのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、1:2000であった。
蛍光顕微鏡観察において、深さ方向にピントを合わせることなく、深い位置の輝点が視認することができた。
〔ビオチン標識率1.33%のBACプローブの調製〕
実施例1のニックトランスレーションによるビオチン標識でdTTPの使用量を0.5μLから1.5μLに変更し、Biotin−16−dUTP(製品番号1093070、Roche社製、50nmol/50μL)の使用量を1.5μLから0.2μLに変更したこと以外は、実施例1と同様に最終濃度1μg/250μLのビオチン標識された塩基数15万のBACプローブ(核酸分子)の溶液を得た。
28%アンモニア水の使用量を1.4mLから2.6mLに変更したこと以外は、実施例2と同様にして、Texas Red色素シリカナノ粒子を得た。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径320nmであった。
上述のようにビオチン標識したBACプローブ(核酸分子)25μL(濃度1μg/250μL)、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液を混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬G)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例1と同様に行った。なお、上記BACプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記BACプローブのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、1:2000であった。
蛍光顕微鏡観察において、深さ方向にピントを合わせることなく、深い位置の輝点が視認することができた。
〔ビオチン標識率9.62%のBACプローブの調製〕
GSP社から購入したBACプローブとしてのHER2−DNAクローン(CEN17q11.2/520kb、塩基数約520kbp)1μg(5μL)に対して、ニックトランスレーション用のキット(製品名「GSP−ニックトランスレーションキット」K−015、GSP社製)のプロトコールに従い、ニックトランスレーション法により、実施例1と同様にBACプローブ(核酸分子)のdTTPをビオチン標識した。
上述のようにビオチン標識したBACプローブ25μL(濃度1μg/250μL)、FITC修飾ストレプトアビジン(Streptavidin,FITC Conjugate(1mgフナコシ SA−5001))を1.0μL(50nmol/50μL)含む溶液を混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬H)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例1と同様に行った。なお、BACプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、FITCのストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記BACプローブのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、1:50000であった。
<結果考察>
蛍光顕微鏡観察において、深さ方向にピントを合わせることで、深い位置の輝点が観察された。
〔ビオチン標識率0.96%のBACプローブの調製〕
GSP社から購入したBACプローブとしてのHER2−DNAクローン(CEN17q11.2/520kb、塩基数約520kbp)1μg(5μL)に対して、ニックトランスレーション用のキット(製品名「GSP−ニックトランスレーションキット」K−015、GSP社製)のプロトコールに従い、以下のようにニックトランスレーション法により、BACプローブ(核酸分子)のdTTPをビオチン標識した。
上述のようにビオチン標識したBACプローブ25μL(濃度1μg/250μL)、FITC修飾ストレプトアビジン(Streptavidin,FITC Conjugate(1mgフナコシ SA−5001))を1.0μL(50nmol/50μL)含む溶液を混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬I)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例1と同様に行った。なお、BACプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、FITCのストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記BACプローブのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、1:5000であった。
<結果考察>
蛍光顕微鏡観察において、輝点が観察できなかった。
〔ビオチン標識率0.96%のBACプローブの調製〕
GSP社から購入したBACプローブとしてのHER2−DNAクローン(CEN17q11.2/520kb、塩基数約520kbp)1μg(5μL)に対して、ニックトランスレーション用のキット(製品名「GSP−ニックトランスレーションキット」K−015、GSP社製)のプロトコールに従い、以下のようにニックトランスレーション法により、BACプローブ(核酸分子)のdTTPをビオチン標識した。
実施例3の蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製で、SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を、14.4mgから5.25mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.65gから0.21gに変更したこと以外は同様にして蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。作製した粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径40nmであった。
ストレプトアビジンの調製および樹脂粒子とストレプトアビジンの結合は、実施例3と同様に行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬J)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例1と同様に行った。なお、BACプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記BACプローブのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、1:5000であった。
蛍光顕微鏡観察において、深さ方向にピントを合わせることなく、深い位置の輝点が視認することができた。
《総合結果・考察》
〔ビオチン標識率1.33%のBACプローブの調製〕
ニックトランスレーションによるビオチン標識でdTTPの使用量を0.5μLから1.5μLに変更し、Biotin−16−dUTP(製品番号1093070、Roche社製、50nmol/50μL)の使用量を1.5μLから0.2μLに変更したこと以外は、実施例1と同様に最終濃度1μg/250μLのビオチン標識された塩基数15万のBACプローブ(核酸分子)の溶液を得た。
上述のようにビオチン標識したBACプローブ25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンで表面修飾された平均粒子径15nmのQdot(登録商標、Quantum Dot Corporation社製)を1.0μL(50nmol/50μL)含む溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬K)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例1と同様に行った。なお、BACプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、Q−dоtのストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記BACプローブのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、1:2000であった。
<結果考察>
蛍光顕微鏡観察において、輝点が観察されなかった。
〔ビオチン標識率13.33%のDNAプローブの調製〕
Applied Biosystems 392 DNA/RNA synthesizer(Foster City,CA)を用いてプライマー(フォワード:5'−CGGGAGATCCCTGACCTGCTGGAA−3'、リバース:5'−CTGCTGGGGTACCAGATACTCCTC−3')を作製した。
得られたcDNA1μgを用いて、実施例1と同様にニックトランスレーションを行い、最終濃度1μg/250μLのビオチン標識されたcDNAの溶液を得た。
上述のようにビオチン標識した上記cDNA25μL(終濃度1μg/250μL)、ストレプトアビジンで表面修飾された平均粒子径15nmのQdot(登録商標、Quantum Dot Corporation社製)を1.0μL(50nmol/50μL)含む溶液を調製混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用の塩基数300bpのDNAプローブ(プローブ試薬L)を得た。
このDNAプローブの確認は、実施例1で0.5%のTBEを含む2%アガロースゲルの代わりに0.5%のTBEを含む10%ポリアクリルアミドゲルを用いたこと以外は実施例1と同様にDNAプローブの確認を行った。
FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例1と同様に行った。この際に、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、それぞれ培養細胞MCF7の染色像について輝点数を計測した。なお、上記cDNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、Q−dоtのストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記cDNAのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、1:40であった。
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が20個、輝点数2の細胞が29個、輝点数3の細胞が1個、輝点数4の細胞は0個であった。また、蛍光顕微鏡観察において、輝点が観察できなかった。
〔ビオチン標識率13.33%のDNAプローブの調製〕
Applied Biosystems 392 DNA/RNA synthesizer(Foster City,CA)を用いてプライマー(フォワード:5'−CGGGAGATCCCTGACCTGCTGGAA−3'、リバース:5'−CTGCTGGGGTACCAGATACTCCTC−3')を作製した。
得られたcDNA1μgを用いて、実施例1と同様にニックトランスレーションを行い、最終濃度1μg/250μLのビオチン標識されたcDNAの溶液を得た。
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから5.25mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.21gに変更したこと以外は、実施例3と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径40nmであった。また、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
一方、実施例3と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
上述のようにビオチン標識したcDNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジン修飾の蛍光体集積ナノ粒子を含む溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬M)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記cDNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記cDNAのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、1:40であった。
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が21個、輝点数2の細胞が29個、輝点数3の細胞が0個、輝点数4の細胞は0個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が21個、輝点数2の細胞が29個、輝点数3の細胞が0個、輝点数4の細胞は0個であった。
〔ビオチン標識率13.33%のDNAプローブの調製〕
実施例6と同様にして、HER2遺伝子関連の配列を有する塩基数300のcDNA(核酸分子)を調製した。このcDNA1μgを、実施例1でのニックトランスレーションと同様にして最終濃度1μg/250μLのビオチン標識されたcDNA溶液を得た。
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから14.4mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.21gに変更したこと以外は、実施例3と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径158nmであった。
また、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
一方、実施例3と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
上述のようにビオチン標識したcDNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬N)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記cDNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記cDNAのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、1:40であった。
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が19個、輝点数2の細胞が29個、輝点数3の細胞が2個、輝点数4の細胞は0個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が21個、輝点数2の細胞が29個、輝点数3の細胞が1個、輝点数4の細胞は0個であった。
〔ビオチン標識率13.33%のDNAプローブの調製〕
実施例6と同様にして、HER2遺伝子関連の配列を有する塩基数300cDNA(核酸分子)を調製した。このcDNA1μgを、実施例1でのニックトランスレーションと同様にして最終濃度1μg/250μLのビオチン標識されたcDNAの溶液を得た。
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gに変更したこと以外は、実施例3と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径280nmであった。
また、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
一方、実施例3と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
上述のようにビオチン標識したcDNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬O)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が21個、輝点数2の細胞が29個、輝点数3の細胞が0個、輝点数4の細胞は0個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が21個、輝点数2の細胞が29個、輝点数3の細胞が0個、輝点数4の細胞は0個であった。
〔ビオチン標識率13.33%のプローブの調製〕
実施例6と同様にして、HER2遺伝子関連の配列を有する塩基数300のcDNA(核酸分子)を調製した。このcDNA1μgを、実施例1でのニックトランスレーションと同様にして最終濃度1μg/250μLのビオチン標識されたcDNAの溶液を得た。
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから21.4mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.86gに変更したこと以外は、実施例3と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径320nmであった。
また、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
一方、実施例3と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
上述のようにビオチン標識したcDNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬P)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記cDNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記cDNAのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、1:40であった。
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が43個、輝点数2の細胞が7個、輝点数3の細胞が0個、輝点数4の細胞は0個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が44個、輝点数2の細胞が6個、輝点数3の細胞が0個、輝点数4の細胞は0個であった。
〔ビオチン標識率1.67%のプローブの調製〕
実施例6と同様にして、HER2遺伝子関連の配列を有する塩基数300のcDNA(核酸分子)を調製した。
28%アンモニア水の使用量を1.4mLから2.0mLに変更したこと以外は、実施例2と同様にTexas Red色素内包シリカナノ粒子の調製を行った。得られた粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径160nmであった。
上述のようにビオチン標識したcDNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬Q)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記cDNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記cDNAのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、1:5であった。
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が19個、輝点数2の細胞が29個、輝点数3の細胞が2個、輝点数4の細胞は0個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が20個、輝点数2の細胞が29個、輝点数3の細胞が1個、輝点数4の細胞は0個であった。
〔ビオチン標識率1.67%のプローブの調製〕
実施例6と同様に、HER2遺伝子関連の配列を有する塩基数300のcDNA(核酸分子)を調製した。
28%アンモニア水の使用量を1.4mLから2.6mLに変更したこと以外は、実施例2と同様にTexas Red色素内包シリカナノ粒子の調製を行った。得られた粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径320nmであった。
上述のようにビオチン標識した上記cDNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬R)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記cDNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記cDNAのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、1:5であった。
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が40個、輝点数2の細胞が10個、輝点数3の細胞が0個、輝点数4の細胞は0個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が44個、輝点数2の細胞が6個、輝点数3の細胞が0個、輝点数4の細胞は0個であった。
〔ビオチン標識率0.33%のBACプローブの調製〕
比較例3と同様に、HER2遺伝子関連の配列を有するBACクローンを用いて、NickTransration反応を実施して、BACプローブを作成した。ただし、比較例3と異なり、Biotin−d−UTPは添加せずに調製した。得られたBACクローン由来のDNA(核酸分子)に対して、以下のビオチン標識を行った。
上記のように調製したDNA2μgを、VECTOR LABORATORIES社製の「5'EndTag(TM) Nucleic Acid Labeling System、(カタログNo.MB−9001)」のキットおよびプロトコールを用いて、以下のようにBACクローン由来のDNAの5'末端をビオチン標識した。
・上記DNA2μg(/超純水8μL)
・Universal reaction buffer・・・1μL
・アルカリフォスファターゼ・・・1μL
さらに、上記混合液中に以下のものを混合して、37℃で30分間インキュベートした。
・Universal reaction buffer・・・2μL
・ATPγS・・・1μL
・T4 polynucleotide kinase・・・2μL
28%アンモニア水の使用量を1.4mLから2.0mLに変更したこと以外は、実施例2と同様にTexas Red色素内包シリカナノ粒子の調製を行った。得られた粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径160nmであった。
上述のように5'末端をビオチン標識したBACクローン由来のDNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬S)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記DNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記DNAのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、1:50であった。
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が19個、輝点数2の細胞が29個、輝点数3の細胞が2個、輝点数4の細胞は0個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が25個、輝点数2の細胞が24個、輝点数3の細胞が1個、輝点数4の細胞は0個であった。
〔ビオチン標識率6.67E−3%のBACプローブの調製〕
実施例1と同じGSP社から購入したHER2−DNAクローン(約150kbp)について実施例12と同様に5'末端をビオチン標識した。
<蛍光粒子と上記BACプローブとが結合したDNAプローブ調製>
上述のように5’末端をビオチン標識したBACプローブ25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンで表面修飾された平均粒子径15nmのQdot(登録商標、Quantum Dot Corporation社製)を1.0μL(50nmol/50μL)含む溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬Ad1)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例1と同様に行った。なお、BACプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、Q−dоtのストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記BACプローブのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、1:1であった。
<結果考察>
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が12個、輝点数2の細胞が13個、輝点数3の細胞が15個、輝点数4の細胞は10個であった。蛍光顕微鏡観察において、輝点が観察されなかった。
〔ビオチン標識率0.33%のプローブの調製〕
比較例4と同様にHER2遺伝子関連の配列を有する塩基数300のcDNA(核酸分子)を調製した後、実施例12と同様に前記cDNAの5'末端をビオチン標識した。
上述のように5’末端をビオチン標識したcDNAのプローブ25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンで表面修飾された平均粒子径15nmのQdot(登録商標、Quantum Dot Corporation社製)を1.0μL(50nmol/50μL)含む溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬Ad2)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例1と同様に行った。なお、BACプローブとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、Q−dоtのストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記BACプローブのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、1:1であった。
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が21個、輝点数2の細胞が27個、輝点数3の細胞が2個、輝点数4の細胞は0個であった。蛍光顕微鏡観察において、輝点が観察されなかった。
〔ビオチン標識率6.67E−3%のBACプローブの調製〕
実施例1と同じGSP社から購入したHER2−DNAクローン(約150kbp)について実施例12と同様に5'末端をビオチン標識した。
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を14.4mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.21gに変更したこと以外は、実施例3と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子(蛍光体集積ナノ粒子を)の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径158nmであった。
さらに、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
上記のように調製したDNA2μgを、VECTOR LABORATORIES社製の「5'EndTag(TM) Nucleic Acid Labeling System、(カタログNo.MB−9001)」のキットおよびプロトコールを用いて、以下のように核酸分子の5'末端をリン酸からチオリン酸に変換した。
以下のものを遠心チューブで混合して、37℃で30分間インキュベートした。
・上記核酸分子2μg(/超純水8μL)
・Universal reaction buffer・・・1μL
・アルカリフォスファターゼ・・・1μL
さらに、上記混合液中に以下のものを混合して、37℃で30分間インキュベートした。
・Universal reaction buffer・・・2μL
・ATPγS・・・1μL
・T4 polynucleotide kinase・・・2μL
次に、上記で得られた末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を反応して、5'末端に直接蛍光体集積ナノ粒子が結合したプローブを作成した。
このプローブの反応溶液を核酸精製用マイクロスピンカラム(GEヘルスケア社製「MicroSpin S−200HR Column」、製品番号「#27−5120−01」)により精製した。
この溶液に対して、3M酢酸ナトリウム溶液(pH5.2)を約5.56μL、100%エタノールを150μL添加し、−20℃で1時間以上静置した。4℃で16000rpmで10分間遠心して沈殿を形成した。さらに、70%エタノールを500μL添加して、4℃、16000rpmで1分間遠心し上澄みを除去した。沈殿物に5〜10μLの蒸留水を添加して完全に溶解させ、蛍光体集積ナノ粒子で標識されたDNA(プローブ試薬Ad3)の溶液(最終濃度1μg/250μL)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を同様に行った。
なお、DNAプローブの確認において、5'末端にのみ標識されたので、1:1であった。また、検体スライドとしてHER2陽性染色対照標本の検体スライド(パソロジー研究所社製「HER2−FISHコントロールスライド Code PS−09006」)を用いた。また、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
<結果考察>
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が21個、輝点数2の細胞が26個、輝点数3の細胞が9個、輝点数4の細胞は4個であった。蛍光顕微鏡観察において、輝点が観察することができた。
〔ビオチン標識率0.33%のプローブの調製〕
比較例6でビオチン標識した塩基数300の核酸分子を用いたこと以外は、実施例13と同様にして蛍光体集積ナノ粒子で標識されたDNA(プローブ試薬Ad4)の溶液(最終濃度1μg/250μL)を得た。
〔その他の観察等〕
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を同様に行った。
なお、DNAプローブの確認において、5'末端にのみ標識されたので、1:1であった。また、検体スライドとしてHER2陽性染色対照標本の検体スライド(パソロジー研究所社製「HER2−FISHコントロールスライド Code PS−09006」)を用いた。また、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
<結果考察>
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が19個、輝点数2の細胞が28個、輝点数3の細胞が2個、輝点数4の細胞は1個であった。蛍光顕微鏡観察において、輝点が観察することができた。
〔ビオチン標識率0.33%の短鎖長のDNAプローブの調製〕
実施例10と同様に、HER2遺伝子関連の配列を有する塩基数300のcDNA(核酸分子)を調製した。
<5’末端のビオチン標識>
上記のように調製したcDNA2μgを、実施例12と同様にして、5’末端がビオチンで標識されたcDNAを得た。
28%アンモニア水の使用量を1.4mLから2.6mLに変更したこと以外は、実施例2と同様にTexas Red色素内包シリカナノ粒子の調製を行った。得られた粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径320nmであった。
得られた色素内包ナノ粒子から実施例2と同様にマレイミド基が付いた蛍光体集積ナノ粒子を得る一方で、実施例2と同様にストレプトアビジン溶液の調製を行い、両者から実施例2と同様にストレプトアビジン結合Texas Red色素内包シリカナノ粒子(蛍光体集積ナノ粒子)を得た。
<蛍光体集積ナノ粒子(320nm、シリカ粒子)が核酸分子の5’末端に結合したDNAプローブ調製>
上述のように5’末端をビオチン標識したcDNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬T)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記cDNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記cDNAのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、約1:1であった。
。
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が40個、輝点数2の細胞が10個、輝点数3の細胞が0個、輝点数4の細胞は0個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が44個、輝点数2の細胞が6個、輝点数3の細胞が0個、輝点数4の細胞は0個であった。
すなわち、本実施例15に係るプローブ試薬によれば、DNAと蛍光体集積ナノ粒子の結合モル比が1:1であり、平均粒子径320mと実施例12より大径であるが、輝点の検出感度が低い蛍光顕微鏡観察において、輝点の検出感度が高い共焦点蛍光顕微鏡観察と同程度の精度で輝点検出することができた。しかし、非特異的な検出が多くみられた。
〔ビオチン標識率5%の短鎖長のDNAプローブの調製〕
プローブ検索サイト「HD−FISH」(URL:http://www.hdfish.eu/Find#probes.php)で、ヒト第17番目の染色体の特定の領域(第37844400番目〜第37885107番目)を指定してユニークな配列を検索し、該特定の領域に存在する第37844479番目〜第37844696番目の次のユニークな配列を検索して入手した。この配列データを元にして核酸合成の依頼をしてHER−2遺伝子関連の配列(5’−ACGCCTGATGGGTTAATGAG−3’)の塩基数20のDNA(核酸分子)を調製した。
上記のように調製したDNA4μgを用いて、実施例12と同様に、5’末端がビオチンで標識されたDNAを得た。
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから5.25mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.21gに変更したこと以外は、実施例3と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径40nmであった。また、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
一方、実施例3と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
上述のように5’末端をビオチン標識した上記DNA25μL(濃度1μg/250μL)、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬U)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共え点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記DNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記DNAのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、約1:1であった。
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が18個、輝点数2の細胞が31個、輝点数3の細胞が1個、輝点数4の細胞は0個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が20個、輝点数2の細胞が30個、輝点数3の細胞が0個、輝点数4の細胞は0個であった。
すなわち、本実施例16に係るプローブ試薬によれば、20塩基という非常に短い核酸分子であり、かつ、DNA:ビオチン(DNA:蛍光体集積ナノ粒子)の結合モル比が1:1であり輝点が検出できないと予測される条件であるのにもかかわらず、驚くべきことに、輝点の検出感度が低い蛍光顕微鏡観察においても、輝点の検出感度が高い共焦点蛍光顕微鏡観察と同程度の精度で輝点検出することができた。
〔ビオチン標識率5%のDNAプローブの調製〕
実施例16と同様に塩基数20のDNA(核酸分子)を調製した。
<5’末端のビオチン標識>
上記のように調製したDNA2μgを用いて、実施例12と同様に、5’末端がビオチンで標識されたDNAを得た。
スルホローダミン101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから14.4mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.65gに変更したこと以外は、実施例3と同様にストレプトアビジンで標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径158nmであった。また、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
一方、実施例3と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
上述のように5’末端をビオチン標識した上記DNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬V)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記DNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記DNAのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、約1:1であった。
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が20個、輝点数2の細胞が29個、輝点数3の細胞が1個、輝点数4の細胞は0個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が29個、輝点数2の細胞が21個、輝点数3の細胞が0個、輝点数4の細胞は0個であった。
すなわち、本実施例17に係るプローブ試薬によれば、平均粒子径が実施例16より大径であるが、実施例16と同様、輝点の検出感度が低い蛍光顕微鏡観察においても、輝点の検出感度が高い共焦点蛍光顕微鏡観察と同程度の精度で輝点検出することができた。
〔ビオチン標識率5%のDNAプローブの調製〕
実施例16と同様に塩基数20のDNA(核酸分子)を調製した。
上記のように調製したDNA2μgを用いて、実施例12と同様に、5’末端がビオチンで標識されたDNAを得た。
実施例7と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径280nmであった。また、実施例7と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例7と同様に行った。
一方、実施例7と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
上述のように5’末端をビオチン標識した上記DNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬W)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記DNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記DNAのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、約1:1であった。
共焦点蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が21個、輝点数2の細胞が29個、輝点数3の細胞が0個、輝点数4の細胞は0個であった。また、蛍光顕微鏡観察で輝点を計測した結果、輝点数1の細胞が20個、輝点数2の細胞が30個、輝点数3の細胞が0個、輝点数4の細胞は0個であった。
すなわち、本実施例18に係るプローブ試薬によれば、平均粒子径が実施例16,17より大径であるが、実施例16等と同様に、輝点の検出感度が低い蛍光顕微鏡観察においても、輝点の検出感度が高い共焦点蛍光顕微鏡観察と同程度の精度で輝点検出することができた。
参考例1で得られたプローブ試薬を用いて、蛍光顕微鏡観察において、染色の直後、染色からそれぞれ1週間後、1か月後、2か月後に輝点観察を行い、それら時点ごとに検体スライドの細胞(培養細胞SKBR3)の平均輝点数を調べた。この平均輝点数は、前記細胞の核50個に含まれる輝点数を計測し、核1個当たりの輝点数の平均値として算出したものである。
染色後の平均輝点数は、染色直後では18個、染色から1週間後では15個、染色から1か月後では8個、染色から2箇月後では2個であった。すなわち、参考例1に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少していき、耐色素退行性が低いものであった(表4参照)。
〔ビオチン標識率13.33%のBACプローブの調製〕
上述した実施例1と同様の手順で、最終濃度1μg/250μLのビオチン標識された塩基数15万のBACプローブ(核酸分子)の溶液を得た。購入したストレプトアビジン化TXR(フナコシ社製「Streptavidin, Texas Red Conjugate(製品番号SA-5006)」)を1.0μL(50nmol/50μL)含む溶液を混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬X)を得た。
このDNAプローブの確認は、0.5%のTBEを含む2%アガロースゲルで0.5%の変性バッファーTris−Borate−EDTA(TBE)中で電気泳動を行う電気泳動シフトアッセイにより行った。一本鎖のDNAを、SYBR GreenII(Molecular Probes, Eugene,OR)によりカウンター染色した。そして、DNAの移動パターンを、「MultiImager FX System」(Bio−Rad,Hercules,CA)を使用して、以下のように決定した。
DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察で、輝点を観察することができた。
上述した蛍光顕微鏡観察において、参考例4と同様に色素退行評価を行った。
<結果考察>
共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では20個、染色から1週間後では15個、染色から1か月後では9個、染色から2箇月後では3個であった。
すなわち、参考例5に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少していき、耐色素退行性が低いものであった(表4参照)。
〔ビオチン標識率1.67%のDNAプローブの調製〕
実施例6と同様にして、HER2遺伝子関連の配列を有する塩基数300のcDNA(核酸分子)を調製した。このcDNAに対して、蛍光体集積ナノ粒子を以下の方法で作製した上で直接結合させた。
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから5.25mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.21gに変更したこと以外は、実施例3と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径40nmであった。
ルミプローブ社製「Amino−11−dUTP」1μLと、N−succinimidyl S−acetylthioacetate(SATA)とを混合してチオール基付加処理として5℃で1時間インキュベートして反応を行った後、ゲルろ過カラムによるろ過を行い、蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なThiol−11−dUTP溶液を得た。
まず、下記の試薬を遠心チューブ内で混合した。
・10×NickBuffer(Tris−HCl[pH7.2]、MgSO4、DTT)
・・・2.5μL、
・BSA(Nuclease−free BSA)・・・1.5μL
・dNTP mix(dATP、dCTP、dCTP)・・・5μL
・dTTP・・・1.5μL、
・dUTP結合Texas Red色素内包メラミン樹脂粒子・・0.2μL
・純水(Nuclease free water)・・・3μL
・上記cDNA1μgの水溶液・・・5μL
・DNA PоlymeraseI(Tris−HCl[pH7.5]、EDTA、DTT、glycerоl)・・・1μL
・DNaseI・・・5μL
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。
上述した蛍光顕微鏡観察において、参考例4と同様に色素退行評価を行った。
<結果考察>
共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では26個、染色から1週間後では27個、染色から1か月後では24個、染色から2箇月後では24個であった。すなわち、実施例19に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少せずに、耐色素退行性が高いものであった(表4参照)。
実施例8で得られたプローブ試薬を用いて、蛍光顕微鏡観察において、参考例4と同様に色素退行評価を行った。
染色後の平均輝点数は、染色直後では25個、染色から1週間後では25個、染色から1か月後では26個、染色から2箇月後では24個であった。すなわち、実施例20に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少せずに、耐色素退行性が高いものであった(表4参照)。
実施例9で得られたプローブ試薬を用いて、蛍光顕微鏡観察において、参考例4と同様に色素退行評価を行った。
染色後の平均輝点数は、染色直後では11個、染色から1週間後では11個、染色から1か月後では11個、染色から2箇月後では10個であった。すなわち、実施例21に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少せずに、耐色素退行性が高いものであった(表4参照)。
〔ビオチン標識率13.33%のDNAプローブの調製〕
実施例6と同様に、HER2遺伝子関連の配列を有する塩基数300のcDNA(核酸分子)を調製した。
上記のように調製したcDNA1μgを、実施例1と同様にしてニックトランスレーションを行い、最終濃度1μg/250μLのビオチン標識されたcDNAの溶液を得た。
FITC(コードP76012 タカラバイオ社製)4.1mgを水22mLに加えて溶解した。その後、この溶液に乳化重合用乳化剤のエマルゲン(登録商標)430(ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王社製)の5%水溶液を2mL加えた。この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら70℃まで昇温させた後、この溶液にメラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)を0.15g加えた。
一方、ストレプトアビジン(和光純薬工業社製)とN−スクシミジル Sアセチルチオ酢酸(N−succinimidyl S−acetylthioacetate、略称:SATA)を用いて、ストレプトアビジンに対してチオール基の付加処理を行い、ゲル濾過を行って蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンを別途用意した。
上記蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンを、2mMのEDTAを含有したPBS中で混合後、室温で1時間反応させて、両者を結合させる反応を行った。反応後、10mMメルカプトエタノールを添加して反応を停止させた。得られた溶液をφ=0.65μmの遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲル濾過カラムを用いて未反応のストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
上述のようにビオチン標識したcDNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬Z)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記cDNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記cDNAのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、1:40であった。
上述した蛍光顕微鏡観察において、染色の直後、染色からそれぞれ1週間後、1か月後、2か月後に輝点観察を行い、それら時点ごとに検体スライドの細胞(培養細胞SKBR3)の平均輝点数を調べた。この平均輝点数は、前記細胞の核50個に含まれる輝点数を計測し、核1個当たりの輝点数の平均値として算出して得たものである。
共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では15個、染色から1週間後では16個、染色から1か月後では15個、染色から2箇月後では13個であった。すなわち、実施例22に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少せず、耐色素退行性が高いものであった(表4参照)。
〔ビオチン標識率13.33%のDNAプローブの調製〕
実施例6と同様に、HER2遺伝子関連の配列を有する塩基数300のcDNA(核酸分子)を調製した。
上記のように調製したcDNAのcDNA1μgを、実施例1と同様に、ニックトランスレーション法によりビオチン標識した。
FITC(コードP76012 タカラバイオ社製)の使用量を5.25mg、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.21gに変更したことを除いて、実施例22と同様に蛍光色素内包ポリメラミン粒子を作製した。得られたメラミン粒子はメラミン樹脂自体が骨格に多くのアミノ基を含む。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径40nmであった。
上述のようにビオチン標識した上記cDNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬A1)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。
上述した蛍光顕微鏡観察において、参考例4と同様に色素退行評価を行った。
<結果考察>
共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では26個、染色から1週間後では25個、染色から1か月後では26個、染色から2箇月後では25個であった。
〔ビオチン標識率1.67%のDNAプローブの調製〕
実施例6と同様に、HER2遺伝子関連の配列を有する塩基数300のcDNA(核酸分子)を調製した。
FITC(コード P76012 タカラバイオ社製)の使用量を14.4mg、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.65gに変更したことを除いて、実施例22と同様に蛍光色素内包ポリメラミン粒子を作製した。得られたメラミン粒子はメラミン樹脂自体が骨格に多くのアミノ基を含む。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径158nmであった。
上述のようにビオチン標識した上記cDNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液を混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬A2)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記cDNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記cDNAのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、1:5であった。
上述した蛍光顕微鏡観察において、参考例4と同様に色素退行評価を行った。
(結果考察)
共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では27個、染色から1週間後では24個、染色から1か月後では25個、染色から2箇月後では25個であった。
〔ビオチン標識率13.33%の短鎖長のDNAプローブの調製〕
実施例6と同様に、HER2遺伝子関連の配列を有する塩基数300のcDNA(核酸分子)を調製した。
FITC(コード P76012 タカラバイオ社製)の使用量を20.3mg、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gに変更したことを除いて、実施例22と同様に蛍光色素内包ポリメラミン粒子を作製した。得られたメラミン粒子はメラミン樹脂自体が骨格に多くのアミノ基を含む。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径280nmであった。
上述のようにビオチン標識した上記cDNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンで修飾された蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬A3)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記cDNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記cDNAのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、1:40であった。
上述した蛍光顕微鏡観察において、参考例4と同様に色素退行評価を行った。
<結果考察>
共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では24個、染色から1週間後では24個、染色から1か月後では22個、染色から2箇月後では21個であった。すなわち、実施例25に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少せず、耐色素退行性が高いものであった(表3参照)。
〔ビオチン標識率0.5%のDNAプローブの調製〕
Bienko M_Nat Method 2013に記載の方法で、塩基数200のHER2−DNAクローンを作成した。すなわちデータベース検索によりHER2選択的な配列を見つけ出し、Forword primer(5’−ACGCCTGATGGGTTAATGAG−3’)およびReverse primer(5’−aagtagaggcagggagagcc−3’)から塩基数200のcDNA(核酸分子)を調製した。
上記のように調製したcDNA2μgを、実施例12と同様にして処理することで、5’末端がビオチンで標識されたcDNAを得た。
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから14.4mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.21gに変更したこと以外は、実施例3と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径158nmであった。
また、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
一方、実施例3と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
上述のように5’末端をビオチン標識したcDNA25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンを有する蛍光体集積ナノ粒子の溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬A4)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記cDNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記cDNAのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、約1:1であった。
上述した蛍光顕微鏡観察において、参考例4と同様に色素退行評価を行った。
(結果考察)共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では27個、染色から1週間後では27個、染色から1か月後では25個、染色から2箇月後では25個であった。すなわち、実施例26に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少せず、耐色素退行性が高いものであった(表4参照)。
〔ビオチン標識率5%のDNAプローブの調製〕
実施例16と同様に塩基数20のDNA(核酸分子)を調製した。
<5’末端のビオチン標識>
上記のように調製したDNA2μgを、実施例12と同様に、5’末端がビオチンで標識されたDNAを得た。
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから14.4mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.21gに変更したこと以外は、実施例3と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径158nmであった。
また、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
一方、実施例3と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
上述のように5’末端をビオチン標識した上記DNA25μL(濃度1μg/250μL)、蛍光体集積ナノ粒子修飾ストレプトアビジンを含む溶液を混合して、室温で30分間結合反応を行い、HER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬A5)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、上記DNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記cDNAのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、約1:1であった。
<色素退行評価>
上述した蛍光顕微鏡観察において、参考例4と同様に色素退行評価を行った。
共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では26個、染色から1週間後では25個、染色から1か月後では26個、染色から2箇月後では26個であった。すなわち、実施例27に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少せず、耐色素退行性が高いものであった(表4参照)。
〔ビオチン標識率0.5%のDNAプローブの調製〕
実施例26と同様に、塩基数200のcDNA(核酸分子)を作成した。
<ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製>
(粒子の調製)
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから14.4mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.21gに変更したこと以外は、実施例3と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径158nmであった。
また、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
上記のように調製したcDNAの核酸分子2μgを、VECTOR LABORATORIES社製の「5’EndTag(TM) Nucleic Acid Labeling System、(カタログNo.MB−9001)」のキットおよびプロトコールを用いて、以下のように核酸分子の5’末端をリン酸からチオリン酸に変換して、
以下のものを遠心チューブで混合して、37℃で30分間インキュベートした。
・cDNAの核酸分子2μg(/超純水8μL)
・Universal reaction buffer・・・1μL
・アルカリフォスファターゼ・・・1μL
さらに、上記混合液中に以下のものを混合して、37℃で30分間インキュベートした。
・Universal reaction buffer・・・2μL
・ATPγS・・・1μL
・T4 polynucleotide kinase・・・2μL
次に、上記で得られた末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を反応して、5’末端に直接蛍光体集積ナノ粒子が結合したプローブを作成した。
このプローブの反応溶液を核酸精製用マイクロスピンカラム(GEヘルスケア社製「MicroSpin S−200HR Column」、製品番号「#27−5120−01」)により精製した。
この溶液に対して、3M酢酸ナトリウム溶液(pH5.2)を約5.56μL、100%エタノールを150μL添加し、−20℃で1時間以上静置した。4℃で16000rpmで10分間遠心して沈殿を形成した。さらに、70%エタノールを500μL添加して、4℃、16000rpmで1分間遠心し上澄みを除去した。沈殿物に5〜10μLの蒸留水を添加して完全に溶解させ、蛍光体集積ナノ粒子で標識されたcDNA(プローブ試薬A6)の溶液(最終濃度1μg/250μL)を得た。
上述した蛍光顕微鏡観察において、参考例4と同様に色素退行評価を行った。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では24個、染色から1週間後では24個、染色から1か月後では24個、染色から2箇月後では22個であった。すなわち、実施例28に係るプローブ試薬によれば、染色直後に計測可能な輝点数が、時間の経過とともに減少せず、耐色素退行性が高いものであった。
実施例28で作成した5’末端がビオチン標識されたcDNA(蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンと結合する前もの)を用いて、FISHにおいて、実施例1と同様にハイブリダイゼーションを行い、さらに、同実施例12で作成したストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子50μgを反応系に加えて、ハイブリダイゼーション後の反応系内の上記cDNAを蛍光標識した。それ以外は、実施例12と同様にFISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
上述した蛍光顕微鏡観察において、参考例4と同様に色素退行評価を行った。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において輝点を観察することができた。また、染色後の平均輝点数は、染色直後では26個、染色から1週間後では25個、染色から1か月後では24個、染色から2箇月後では25個であった。すなわち、ハイブリダイゼーション後に蛍光体集積ナノ粒子を反応系に添加して、ハイブリダイゼーション後の反応系内で蛍光標識する方法をとっても、染色することが可能であり、また、同様に色素退行の防止効果が得られた(表4参照)。
検体スライドとしてHER陽性染色対照標本の検体スライド(パソロジー研究所社製「HER2−FISHコントロールスライド Code PS−09006」)の代わりに、健常人の組織アレイ(USBiomax社製「FDA normal organ tissue microarray of human」製品番号FDA999b)を用い、実施例24で得られたプローブ試薬でもって実施例24と同様にFISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
共焦点顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、輝点数2個の細胞のみが観察され、共焦点顕微鏡観察より検出感度の低い蛍光顕微鏡観察においてもHER2遺伝子が適正に検出された。
〔ビオチン標識率8.46%のDNAプローブ調製〕
Applied Biosystems 392 DNA/RNA synthesizer(Foster City,CA)を用いてプライマーA(5'−TCTCAGCAACATGTCGATGG−3')と、プライマーB(5'−TCGCACTTCTTACACTTGCG−3')を作製した(Clin.Cancer Res.2000;6:1439−1444参照)。
得られたcDNA1μgを用いて、実施例1と同様にニックトランスレーションを行い、最終濃度1μg/250μLのビオチン標識されたDNAの溶液を得た。
FITC(コード P76012 タカラバイオ社製)の使用量を5.25mg、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.21gに変更したことを除いて、実施例22と同様に蛍光色素FITCを内包したポリメラミン粒子を作製した。得られたポリメラミン粒子はメラミン樹脂自体が骨格に多くのアミノ基を含む。得られたポリメラミン粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径40nmであった。
上記のようにビオチン標識したDNA25μL(濃度1μg/250μL)、蛍光体集積ナノ粒子修飾ストレプトアビジンを含む溶液を混合して、室温で30分間結合反応を行い、EGFR検出用のDNAプローブ(プローブ試薬A7)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。
共焦点顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、輝点数2個の細胞のみが観察され、共焦点顕微鏡観察より検出感度の低い蛍光顕微鏡観察においてもEGFR遺伝子が適正に検出された。
〔ビオチン標識率0.21%のDNAプローブ調製〕
EGFR遺伝子関連の配列を有する塩基数473のcDNA(核酸分子)を実施例31と同様に調製し、実施例31と同様にNickTranslationを実施した。ただし、Biotin−d−UTPは添加しないでNickTranslationを行い、得られたDNAに対して実施例12と同様に5’末端をビオチン化した。
(粒子の調製)
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから14.4mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.21gに変更したこと以外は、実施例1と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子(蛍光体集積ナノ粒子を)の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径158nmであった。
さらに、実施例1と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例1と同様に行った。
上記のように調製したDNA2μgを、VECTOR LABORATORIES社製の「5’EndTag(TM) Nucleic Acid Labeling System、(カタログNo.MB−9001)」のキットおよびプロトコールを用いて、以下のように核酸分子の5’末端をリン酸からチオリン酸に変換した。
以下のものを遠心チューブで混合して、37℃で30分間インキュベートした。
・cDNAの核酸分子2μg(/超純水8μL)
・Universal reaction buffer・・・1μL
・アルカリフォスファターゼ・・・1μL
さらに、上記混合液中に以下のものを混合して、37℃で30分間インキュベートした。
・Universal reaction buffer・・・2μL
・ATPγS・・・1μL
・T4 polynucleotide kinase・・・2μL
このプローブの反応溶液を核酸精製用マイクロスピンカラム(GEヘルスケア社製「MicroSpin S−200HR Column」、製品番号「#27−5120−01」)により精製した。
この溶液に対して、3M酢酸ナトリウム溶液(pH5.2)を約5.56μL、100%エタノールを150μL添加し、−20℃で1時間以上静置した。4℃で16000rpmで10分間遠心して沈殿を形成した。さらに、70%エタノールを500μL添加して、4℃、16000rpmで1分間遠心し上澄みを除去した。沈殿物に5〜10μLの蒸留水を添加して完全に溶解させ、蛍光体集積ナノ粒子で標識されたDNA(プローブ試薬A8)の溶液(最終濃度1μg/250μL)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例20と同様に行った。
なお、DNAプローブの確認において、5'末端にのみ標識されたので、1:1であった。また、検体スライドとして健常人の組織アレイ(USBiomax社製「FDA normal organ tissue microarray of human」製品番号FDA999b)を用いた。実施例31と同様に共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
共焦点顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、輝点数2個の細胞のみが観察され、共焦点顕微鏡観察より検出感度の低い蛍光顕微鏡観察においてもEGFR遺伝子が適正に検出された。
〔標識率0.5%のDNAプローブの調製〕
遺伝子データベース「e!EnsemblASIA」(http://asia.ensembl.org/index.html)の検索で得られたEGFRの遺伝子配列番号(Chromosome 7: 55,086,714-55,324,313)を、プローブ検索サイト「HD−FISH」(URL:http://www.hdfish.eu/Find#probes.php)で入力・検索して、Bienko M_Nat Method 2013に記載の方法に従いEGFRのプライマーペアを610組、見出した。
EGFR選択的な配列の中から、Forword primer(5’−CGGAGTCCAAGTGTCCTTTC−3’)および Reverse primer(5’−CCTTCTATGCAAAGGGCAAA−3’)のプライマーのセット、Invitrogen社製「SuperScript(登録商標) II Reverse Transcriptase」、および一般的な市販のPCR試薬を用い、この逆転写酵素の製品説明書にあるプロトコールに従って、HT−29細胞から抽出したtotal RNAを鋳型として逆転写反応することにより、EGFR遺伝子関連の配列を有する塩基数473bpのcDNA(核酸分子)を作成した。
<ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製>
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから14.4mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.21gに変更したこと以外は、実施例7と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子(蛍光体集積ナノ粒子を)の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径158nmであった。
さらに、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
上記のように調製したcDNAの核酸分子2μgを、VECTOR LABORATORIES社製の「5’EndTag(TM) Nucleic Acid Labeling System、(カタログNo.MB−9001)」のキットおよびプロトコールを用いて、以下のように核酸分子の5’末端をリン酸からチオリン酸に変換して、
以下のものを遠心チューブで混合して、37℃で30分間インキュベートした。
・cDNAの核酸分子2μg(/超純水8μL)
・Universal reaction buffer・・・1μL
・アルカリフォスファターゼ・・・1μL
さらに、上記混合液中に以下のものを混合して、37℃で30分間インキュベートした。
・Universal reaction buffer・・・2μL
・ATPγS・・・1μL
・T4 polynucleotide kinase・・・2μL
次に、上記で得られた末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を反応して、5’末端に直接蛍光体集積ナノ粒子が結合したプローブを作成した。
このプローブの反応溶液を核酸精製用マイクロスピンカラム(GEヘルスケア社製「MicroSpin S−200HR Column」、製品番号「#27−5120−01」)により精製した。
この溶液に対して、3M酢酸ナトリウム溶液(pH5.2)を約5.56μL、100%エタノールを150μL添加し、−20℃で1時間以上静置した。4℃で16000rpmで10分間遠心して沈殿を形成した。さらに、70%エタノールを500μL添加して、4℃、16000rpmで1分間遠心し上澄みを除去した。沈殿物に5〜10μLの蒸留水を添加して完全に溶解させ、蛍光体集積ナノ粒子で標識されたcDNA(プローブ試薬A8)の溶液(最終濃度1μg/250μL)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例4と同様に行った。
なお、DNAプローブの確認において、5'末端にのみ標識されたので、約1:1であった。また、検体スライドとして健常人の組織アレイ(USBiomax社製「FDA normal organ tissue microarray of human」製品番号FDA999b)を用いた。実施例30と同様に共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、輝点数2個の細胞のみが観察され、共焦点顕微鏡観察より検出感度の低い蛍光顕微鏡観察においてもEGFR遺伝子が適正に検出された。
<ビオチン標識率5%のDNAプローブの調製>
プローブ検索サイト「HD−FISH」(URL:http://www.hdfish.eu/Find#probes.php)で、ヒト第7番目の染色体の特定の領域(第55086714番目〜第55324313番目)を指定してユニークな配列を検索し、該特定の領域に存在する第55091671番目〜第55091880番目の次のユニークな配列を検索して入手した。この配列データを元にして核酸合成の依頼をしてHER−2遺伝子関連の配列(5’−AGCTGGCCAGTTTGAATTTG−3’)の塩基数20のDNA(核酸分子)を調製した。
上記のように調製したDNA4μgを、実施例12と同様にして、5’末端がビオチンで標識されたDNAを得た。
<ストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製>
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから14.4mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.21gに変更したこと以外は、実施例7と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径158nmであった。
また、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
一方、実施例3と同様に蛍光体集積ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンの調製、および、蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとの結合を行い、ストレプトアビジンが結合した蛍光体集積ナノ粒子を得た。
上記のようにビオチン標識したDNA溶液25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンで修飾した蛍光体集積ナノ粒子を含む溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、EGFR検出用のDNAプローブ(プローブ試薬A9)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例4と同様に行った。
なお、上記DNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記DNAのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、約1:1であった。
また、検体スライドとして健常人の組織アレイ(USBiomax社製「FDA normal organ tissue microarray of human」製品番号FDA999b)を用いた。実施例30と同様に共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、輝点数2個の細胞のみが観察され、共焦点顕微鏡観察より検出感度の低い蛍光顕微鏡観察においてもEGFR遺伝子が適正に検出された。
〔標識率0.5%のDNAプローブの調製〕
遺伝子データベース「e!EnsemblASIA」(http://asia.ensembl.org/index.html)の検索で得られたRETの遺伝子配列番号(Chromosome 10: 43584007- 43585055)を、プローブ検索サイト「HD−FISH」(http://www.hdfish.eu/Find#probes.php)に入力・検索して、Bienko M_Nat Method 2013に記載の方法に従いRETのプライマーペアを146組、見出した。
検索して得られたRET選択的な配列の組み合わせの中から、Forword primer(5’−TTCTGTGAGCATTTGCTTGG−3’)および Reverse primer(5’−CTCTTGACAATGTCCCCTGG−3’)のプライマーのセット、Invitrogen社製「SuperScript(登録商標) II Reverse Transcriptase」、および一般的な市販のPCR試薬を用い、この逆転写酵素の製品説明書にあるプロトコールに従って、HT−29細胞から抽出したtotal RNAを鋳型として逆転写反応することにより、RET遺伝子関連の配列を有する塩基数1048のcDNA(核酸分子)を作成した。
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから14.4mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.21gに変更したこと以外は、実施例3と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径158nmであった。
また、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
上記のように調製したcDNA40μgを、実施例12と同様にして、5’末端がビオチンで標識されたcDNAを得た。
<蛍光体集積ナノ粒子と上記cDNAとが結合したDNAプローブ調製>
上記のようにビオチン標識したcDNAの溶液25μL(濃度1μg/250μL)と、ストレプトアビジンで修飾した蛍光体集積ナノ粒子を含む溶液とを混合して、室温で30分間結合反応を行い、RET検出用のDNAプローブ(プローブ試薬A10)を得た。
なお、上記cDNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記cDNAのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、約1:1であった。
また、検体スライドとして健常人の組織アレイ(USBiomax社製「FDA normal organ tissue microarray of human」製品番号FDA999b)を用いた。実施例30と同様に共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、輝点数2個の細胞のみが観察され、共焦点顕微鏡観察より検出感度の低い蛍光顕微鏡観察においてもRET遺伝子が適正に検出された。
〔標識率0.49%のDNAプローブの調製〕
遺伝子データベース「e!EnsemblASIA」(http://asia.ensembl.org/index.html)の検索で得られたMETの遺伝子配列番号(Chromosome 7: 116,312,444-116,438,440)を、プローブ検索サイト「HD−FISH」(http://www.hdfish.eu/Find#probes.php)に入力して、Bienko M_Nat Method 2013に記載の方法に従いmet proto−oncogene MET(MET)のプライマーのペアを295組、見出した。
METに選択的な配列の中から、Forword primer(5’−TCACAGCAGCAATTCCCATA−3’)および Reverse primer(5’−CCAGCATTTCAGAAGAGGTTTT−3’)のプライマーのセット、Invitrogen社製「SuperScript(登録商標) II Reverse Transcriptase」、および一般的な市販のPCR試薬を用い、この逆転写酵素の製品説明書にあるプロトコールに従って、HT−29細胞から抽出したtotal RNAを鋳型として逆転写反応することにより、MET遺伝子関連の配列を有する塩基数205のcDNA(核酸分子)を作成した。
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから14.4mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.21gに変更したこと以外は、実施例3と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径158nmであった。
また、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
上記のように調製したcDNAの核酸分子2μgから、実施例34と同様にして得られた5'末端チオリン酸プローブと、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液とを反応して、5’末端に直接蛍光体集積ナノ粒子が結合したプローブを作成した。
以下のものを遠心チューブで混合して、37℃で30分間インキュベートした。
・cDNAの核酸分子2μg(/超純水8μL)
・Universal reaction buffer・・・1μL
・アルカリフォスファターゼ・・・1μL
さらに、上記混合液中に以下のものを混合して、37℃で30分間インキュベートした。
・Universal reaction buffer・・・2μL
・ATPγS・・・1μL
・T4 polynucleotide kinase・・・2μL
次に、上記で得られた末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を反応して、5’末端に直接蛍光体集積ナノ粒子が結合したプローブを作成した。
そのプローブの反応溶液を核酸精製用マイクロスピンカラム(GEヘルスケア社製「MicroSpin S−200HR Column」、製品番号「#27−5120−01」)により精製した。
この溶液に対して、3M酢酸ナトリウム溶液(pH5.2)を約5.56μL、100%エタノールを150μL添加し、−20℃で1時間以上静置した。4℃で16000rpmで10分間遠心して沈殿を形成した。さらに、70%エタノールを500μL添加して、4℃、16000rpmで1分間遠心し上澄みを除去した。沈殿物に5〜10μLの蒸留水を添加して完全に溶解させ、蛍光体集積ナノ粒子で標識されたcDNA(プローブ試薬A11)の溶液(最終濃度1μg/250μL)を得た。
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例4と同様に行った。
なお、DNAプローブの確認において、cDNAと蛍光体集積ナノ粒子との結合モル比については、5'末端にのみ標識されたので、約1:1であった。また、検体スライドとして健常人の組織アレイ(USBiomax社製「FDA normal organ tissue microarray of human」製品番号FDA999b)を用いた。実施例30と同様に共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、輝点数2個の細胞のみが観察され、共焦点顕微鏡観察より検出感度の低い蛍光顕微鏡観察においてもMET遺伝子が適正に検出された。
<標識率0.46%のDNAプローブの調製>
遺伝子データベース「e!EnsemblASIA」(http://asia.ensembl.org/index.html)の検索で得られたFGFR2の遺伝子配列番号(Chromosome 7: 55,086,714-55,324,313)を、プローブ検索サイト「HD−FISH」(http://www.hdfish.eu/Find#probes.php)に入力して、Bienko M_Nat Method 2013に記載の方法に従いFGFR2のプライマーペアを280組、見出した。
FGFR2選択的な配列の中から、フォワードプライマー(5’−ATGAGTCACTGCACACAGCC−3’)および リバースプライマー(5’−TGAGTGAGATGTGGTCCAGG−3’)のプライマーのセット、Invitrogen社製「SuperScript(登録商標) II Reverse Transcriptase」、および一般的な市販のPCR試薬を用い、この逆転写酵素の製品説明書にあるプロトコールに従って、HT−29細胞から抽出したtotal RNAを鋳型として逆転写反応することにより、MET遺伝子関連の配列を有する塩基数217のcDNAを作成した。
実施例7と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径280nmであった。
また、実施例3と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例3と同様に行った。
上記のように調製したcDNAの核酸分子2μgを、実施例12と同様にして、5’末端がビオチンで標識された核酸分子を得た後、DNAプローブ(プローブ試薬A12)を得た。
<その他の観察等>
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を比較例3と同様に行った。なお、DNAプローブの確認において、HABA−アビジン法を用いて確認したところ、約1:1であった。また、検体スライドとして健常人の組織アレイ(USBiomax社製「FDA normal organ tissue microarray of human」製品番号FDA999b)を用いた。実施例30と同様に共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、輝点数2個の細胞のみが観察され、共焦点顕微鏡観察より検出感度の低い蛍光顕微鏡観察においてもFGFR2遺伝子が適正に検出された
〔ビオチン標識率0.21%のDNAプローブ調製〕
EGFR遺伝子関連の配列を有する塩基数473のcDNA(核酸分子)を実施例31と同様に調製し、実施例31と同様にNickTranslationを実施した。ただし、Biotin−d−UTPは添加しないでNickTranslationを行い、得られたDNAに対して実施例12と同様に5'末端をビオチン化した。
SulfoRhodamine101(シグマアルドリッチ社製)の使用量を20.3mgから14.4mgに変更し、メラミン樹脂原料ニカラックMX−035(日本カーバイド工業社製)の使用量を0.81gから0.21gに変更したこと以外は、実施例7と同様にストレプトアビジン標識された蛍光色素内包ポリメラミン粒子(蛍光体集積ナノ粒子を)の作製を行った。得られたナノ粒子の1000個についてSEM観察を行ったところ、平均粒子径158nmであった。
さらに、実施例7と同様に、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する蛍光体集積ナノ粒子を含む混合液を得た。なお、洗浄等も実施例7と同様に行った。
上記のように調製したDNA2μgを、VECTOR LABORATORIES社製の「5'EndTag(TM) Nucleic Acid Labeling System、(カタログNo.MB−9001)」のキットおよびプロトコールを用いて、以下のように核酸分子の5'末端をリン酸からチオリン酸に変換した。
・cDNAの核酸分子2μg(/超純水8μL)
・Universal reaction buffer・・・1μL
・アルカリフォスファターゼ・・・1μL
さらに、上記混合液中に以下のものを混合して、37℃で30分間インキュベートした。
・Universal reaction buffer・・・2μL
・ATPγS・・・1μL
・T4 polynucleotide kinase・・・2μL
DNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を実施例31と同様に行った。
共焦点顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察において、輝点数2個の細胞のみが観察され、共焦点顕微鏡観察より検出感度の低い蛍光顕微鏡観察においてもEGFR遺伝子が適正に検出された。
実施例3で作製したプローブ試薬FのFISHにおける終濃度を5μg/μLにしたこと以外は、実施例3と同様にDNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は77であった(表6)。
実施例3で作製したプローブ試薬FのFISHにおける終濃度を1μg/μLにしたこと以外は、実施例3と同様にDNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は74であった(表6)。
実施例3で作製したプローブ試薬FのFISHにおける終濃度を0.2μg/μLにしたこと以外は、実施例3と同様にDNAプローブの確認、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は62であった(表6)。
文献(Bienko M., Nat Method 2013, 122)に記載されている方法(PCR)に従って、プローブを作成した。具体的には、文献に記載されているデータベース(www.hdfish.eu.)にアクセスし、HER2にハイブリダイズ可能なプライマー配列を表示させた。forwardプライマー(5'-biotin-ACGCCTGATGGGTTAATGAG-3')とreverseプライマー(5'-aagtagaggcagggagagcc-3')とを用いて上記文献に従ってPCRを行い、塩基数217のDNA断片を回収した。
上記PCRに得られた5’末端がビオチン標識されたDNA断片に対して、実施例17で製造したストレプトアビジン標識されたスルホローダミン101内包メラミン樹脂粒子(蛍光体集積ナノ粒子)を実施例17と同様に結合させることにより、5’末端に蛍光体集積ナノ粒子が結合したHER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬X)を得た。
比較例4と同様に上記DNAプローブ(プローブ試薬X)の確認を行い、作製したプローブ試薬XのFISHにおける終濃度を1.0μg/μLにしたこと以外は、実施例38と同様に、FISH、DNAプローブの保存、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
なお、上記DNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記DNAのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、約1:1であった。
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は78であった(表6)。
実施例41で作製したプローブ試薬XのFISHにおける終濃度を0.2μg/μLにしたこと以外は、実施例41と同様に、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は77であった(表6)。
実施例41で作製したプローブ試薬XのFISHにおける終濃度を0.04μg/μLにしたこと以外は、実施例41と同様に、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は78であった(表6)。
文献(Bienko M., Nat Method 2013, 122)に記載されている方法(PCR)に従って、プローブを作成した。具体的には、文献に記載されているデータベース(www.hdfish.eu.)にアクセスし、HER2にハイブリダイズ可能なプライマー配列を表示させた。forwardプライマー(5'biotin-TGCTTCCaaccttggttttt)とreverseプライマー(TGCAAGTGCaatacctgctc)を用いて上記文献に従ってPCRを行い、塩基数3347のDNA断片を回収した。
上記PCRに得られた5’末端がビオチン標識されたDNA断片に対して、実施例17で製造したストレプトアビジン標識されたスルホローダミン101内包メラミン樹脂粒子(蛍光体集積ナノ粒子)を実施例17と同様に結合させることにより、5’末端に蛍光体集積ナノ粒子が結合したHER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬Y)を得た。
実施例1と同様に上記DNAプローブ(プローブ試薬Y)の確認を行い、作製したプローブ試薬YのFISHにおける終濃度を1.0μg/μLにしたこと以外は、実施例38と同様に、FISH、DNAプローブの保存、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
なお、上記DNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記DNAのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、約1:1であった。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は80であった(表6)。
実施例44で作製したプローブ試薬YのFISHにおける終濃度を0.2μg/μLにしたこと以外は、実施例44と同様に、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は77であった(表6)。
実施例46で作製したプローブ試薬YのFISHにおける終濃度を0.04μg/μLにしたこと以外は、実施例44と同様に、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は79であった(表6)。
実施例16と同様にして製造することにより、塩基数20のDNA断片を得た後、DNA断片の5’を実施例16と同様にしてビオチン標識を行った。
次に、5’末端がビオチン標識されたDNA断片に対して、実施例17で製造したストレプトアビジン標識されたスルホローダミン101内包メラミン樹脂粒子(蛍光体集積ナノ粒子)を実施例17と同様に結合させることにより、5’末端に蛍光体集積ナノ粒子が結合したHER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬Z)を得た。
比較例4と同様に上記DNAプローブ(プローブ試薬Z)の確認を行い、作製したプローブ試薬Z−1のFISHにおける終濃度を1.0μg/μLにしたこと以外は、実施例38と同様に、FISH、DNAプローブの保存、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
なお、上記DNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記DNAのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、約1:1であった。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は73であった(表6)。
実施例47で作製したプローブ試薬ZのFISHにおける終濃度を0.2μg/μLにしたこと以外は、実施例47と同様に、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は73であった(表6)。
実施例47で作製したプローブ試薬ZのFISHにおける終濃度を0.04μg/μLにしたこと以外は、実施例47と同様に、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は73であった(表6)。
実施例16と同様にして製造することにより、塩基数20のDNA断片を得た後、DNA断片の5’を実施例16と同様にしてビオチン標識を行った。
次に、5’末端がビオチン標識されたDNA断片に対して、実施例17で製造したストレプトアビジン標識されたスルホローダミン101内包メラミン樹脂粒子(蛍光体集積ナノ粒子)を実施例17と同様に結合させることにより、5’末端に蛍光体集積ナノ粒子が結合したHER−2検出用のDNAプローブ(プローブ試薬ZZ)を得た。
<その他の観察等>
実施例27と同様に上記DNAプローブ(プローブ試薬ZZ)の確認を行い、作製したプローブ試薬ZZ−1のFISHにおける終濃度を1.0μg/μLにしたこと以外は、実施例38と同様に、FISH、DNAプローブの保存、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
なお、上記DNAとビオチンの結合モル比の確認については、サーモサイエンティフィック社製「Thermo Scientific Pierce Biotin Quantitation Kit」を用いて、蛍光体集積ナノ粒子のストレプトアビジンにHABAを結合させた状態で、該HABAを上記DNAのビオチンで置換させるHABA−アビジン法を使用して行った結果、約1:1であった。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は62であった(表6)。
実施例50で作製したプローブ試薬ZZのFISHにおける終濃度を0.2μg/μLにしたこと以外は、実施例50と同様に、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は60であった(表6)。
[実施例52]
実施例50で作製したプローブ試薬ZZのFISHにおける終濃度を0.04μg/μLにしたこと以外は、実施例50と同様に、DNAプローブの保存、FISH、明視野観察、共焦点蛍光顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察等を行った。
(結果)
共焦点蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡で輝点を観察することができ、蛍光顕微鏡観察における輝点数は48であった(表6)。
Claims (20)
- 蛍光体を集積してなる蛍光体集積ナノ粒子と所定の核酸配列の核酸分子とが結合したインサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬。
- 前記蛍光体集積ナノ粒子の平均粒子径が300nm以下である請求項1に記載のプローブ試薬。
- 前記核酸分子と前記蛍光体集積ナノ粒子とがモル比1:1〜1:5000で結合している請求項1または2のいずれかに記載のプローブ試薬。
- 前記核酸分子と前記蛍光体集積ナノ粒子とがモル比1:1〜1:40で結合している請求項1〜3のいずれか一項に記載のプローブ試薬。
- 塩基数5000以下の所定の核酸配列の核酸分子に対して、蛍光体を集積してなる蛍光体集積ナノ粒子を結合して得られる請求項1に記載のインサイチュハイブリダイゼイション用のプローブ試薬。
- 塩基数5000以下の所定の核酸配列の核酸分子に対して、蛍光体を集積してなる蛍光体集積ナノ粒子を核酸末端標識法またはニックトランスレーション法を利用する方法により結合して得られる請求項5に記載のインサイチュハイブリダイゼイション用のプローブ試薬。
- 核酸分子に対する蛍光体の標識率(%)が13.33%以下である請求項1〜6のいずれか一項に記載のプローブ試薬。
- 前記蛍光体集積ナノ粒子が、樹脂を母材とする樹脂粒子、またはシリカを母材とする粒子であり、前記集積がされた色素が低分子蛍光色素あるいは量子ドットである請求項1〜7のいずれか一項に記載のプローブ試薬。
- 前記樹脂がメラミン樹脂である請求項1〜8に記載のプローブ試薬。
- 前記核酸分子に第1の生体分子が連結されており、前記蛍光体集積ナノ粒子に第2の生体分子が連結されており、第1の生体分子と第2の生体分子との特異的な結合を介して前記核酸分子と前記蛍光体集積ナノ粒子とが結合している、請求項1〜9のいずれか一項に記載のプローブ試薬。
- 第1,2の生体分子がストレプトアビジンまたはビオチンである請求項10に記載のプローブ試薬。
- 前記核酸分子の塩基に蛍光体集積ナノ粒子が直接結合している、請求項1〜9のいずれかに一項記載のプローブ試薬。
- 染色体上の特定領域の配列と相補的な塩基数150000未満の配列を有し第1の生体分子が連結された核酸分子と、第1の生体分子と特異的に結合可能な第2の生体分子が連結された蛍光体集積ナノ粒子とを分けて有するFISH用のプローブ試薬のキット。
- 染色体上の特定領域の配列と相補的な塩基数5000以下の配列を有し末端および/または末端以外の1〜50ヵ所に第1の生体分子が連結された核酸分子と、第1の生体分子と特異的に結合可能な第2の生体分子が連結された蛍光体集積ナノ粒子とを分けて有するFISH用のプローブ試薬のキット。
- 請求項1〜14のいずれか一項に記載のプローブ試薬またはキットを用いるFISH。
- 請求項13または14に記載の核酸分子を用いてハイブリダイゼーションを行った後に、請求項13または14の蛍光体集積ナノ粒子を前記ハイブリダイゼーションの反応系に加えて、第1の生体分子と第2の生体分子との特異的な結合を前記ハイブリダイゼーションの後に行う、請求項15に記載のFISH。
- BACプローブの配列を有し第1の生体分子が複数連結された核酸分子を染色体上の特定領域の配列に対してハイブリダイゼーションを行った後に、第1の生体分子と特異的に結合可能な第2の生体分子が連結した蛍光体を前記ハイブリダイゼーションの反応系に複数添加して前記核酸分子を蛍光標識するFISH。
- BACプローブの配列を有し第1の生体分子が末端および/または末端以外の1〜50ヵ所に連結された塩基数5000以下の核酸分子を染色体上の特定領域の配列に対してハイブリダイゼーションを行った後に、第1の生体分子と特異的に結合可能な第2の生体分子が連結した蛍光体を前記ハイブリダイゼーションの反応系に複数添加して前記核酸分子を蛍光標識するFISH。
- インサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬の調製に用いられる化合物であって、蛍光体を集積してなる蛍光体集積ナノ粒子と核酸分子の基質とが結合した化合物。
- 所定の核酸配列の核酸分子1モルに対して、蛍光ナノ粒子を20000モル以上結合したことを特徴とする、インサイチュハイブリダイゼイション用プローブ試薬。
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