JP6910145B2 - プライマー伸長によるスライドガラス上での染色 - Google Patents
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Description
本発明は、国防総省によって授与された契約W81XWH−12−1−0591ならびに国立衛生研究所によって授与された契約GM104148及びHHSN268201000034Cのもとで政府の支援によってなされた。政府は本発明の特定の権利を有する。
本特許出願は、その特許出願が全体として参照によって本明細書に組み入れられる2014年6月23日に出願された米国仮出願第62/015,799号及び2014年12月4日に出願された米国本出願番号14/560,921号の利益を主張する。
本明細書で特に定義されない限り、本明細書で使用されている専門用語及び科学用語はすべて、本発明が属する当該技術の当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものに類似するまたはそれらと同等である任意の方法及び材料を本発明の実践及び試験で使用することができるが、好ましい方法及び材料が記載されている。
一部の実施形態では、方法は、平面試料における相補性部位に特異的に結合する捕捉剤を用いて標識された平面試料(例えば、顕微鏡スライドガラスのような平面的な表面に載置されたFFPE切片)を作製することを含む。平面試料における部位に抗体及び/または核酸を結合する方法は周知である。これらの実施形態では、標識された試料における捕捉剤は、第1の鎖及び第2の鎖を含む二本鎖核酸(例えば、一緒にハイブリッド形成する2つのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成するRCA産物)に結合され、捕捉剤は、二本鎖核酸の第1の鎖によって(例えば、5’末端、3’末端またはその間のどこかによって)二本鎖核酸に(共有結合でまたはビオチンを介した非共有結合で)結合され、鎖の一方の3’末端または5’末端(例えば、第1の鎖の3’末端、第2の鎖の3’末端、第1の鎖の5’末端、または第2の鎖の任意の5’末端)は他方の鎖を鋳型として用いて伸長可能である。場合によっては、第1の鎖の3’末端は、第2の鎖の5’末端と比較して陥凹している場合があり、それによってオーバーハングを定義することができる。他の場合では、第1の鎖の5’末端は第2の鎖の3’末端と比較して陥凹している場合があり、それによってオーバーハングを定義することができる。多くの実施形態では、捕捉剤は平面試料に架橋され、それによってその後の工程中に捕捉剤が解離するのを防ぐ。所望であれば、種々の他の化学物質を用いて捕捉剤を平面試料に架橋することができるが、この架橋工程はアミン−アミン架橋剤(例えば、ホルムアルデヒド、ジスクシンイミイルタレート、または類似の作用の別の試薬)を用いて実施することができる。本方法は、鎖の一方の伸長可能な末端(例えば、3’末端)にヌクレオチドまたはより短いオリゴヌクレオチド(例えば、2〜10塩基の)を付加することによって生成される蛍光シグナルを読み取ることを含む。この工程は、平面試料とポリメラーゼ及びヌクレオチドミックス、リガーゼ及び標識されたオリゴヌクレオチド、またはその2つの組み合わせとを接触させ、それによって1つまたは複数のヌクレオチド及び/または標識されたオリゴヌクレオチドを伸長可能な末端に付加すること、及び伸長可能な末端に1つまたは複数のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを付加することによって生成される蛍光シグナルを読み取ることによって実施されてもよい。
dUTP−SS−Cy5:
この例では、蛍光シグナルは、プライマーの3’末端に付加される(すなわち、ポリメラーゼによって付加される、または蛍光ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドである場合、ライゲーションされる)蛍光ヌクレオチドによって生成されてもよい。この方法は、付加された蛍光ヌクレオチドからのシグナルを読み取ること、またはプライマーに付加されている2つの蛍光ヌクレオチド間のエネルギー移動によって生成されるFRETシグナルを読み取ることを含んでもよい。
以下でさらに詳細に記載されている「可逆的ターミネータ」及び「欠落塩基」のアプローチと呼ばれる2つの異なるアプローチを用いて特別に設計されたオリゴヌクレオチドを用いて多重化を実施することができる。これらの方法は双方とも、異なる相補性部位を認識する複数の(例えば、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも50、少なくとも100、最大150以上)の捕捉剤を含む組成物に依存するが、この場合、捕捉剤のそれぞれは、第1の鎖及び第2の鎖を含む二本鎖核酸(例えば、オリゴヌクレオチド)に結合され、捕捉剤は第1の鎖の(例えば、5’末端)によって二本鎖核酸に結合され、二本鎖核酸のそれぞれにおける鎖の一方の3’末端は鋳型として他方の鎖を用いて伸長可能であり、鋳型は捕捉剤のそれぞれに対して異なる。そのような組成物の例は図3及び図4にて説明されており、鋳型はオーバーハングである。図3及び図4にて示される一般的な原理はRCA産物を含む二本鎖核酸に拡大することができる。図3は、DNA二本鎖におけるポリメラーゼの存在全体を増やすために5’末端での無作為組成物の短いストレッチが後に続く式3’−N4nN1/N2/N3−5’によって定義される鋳型(例えば、オーバーハング)を有する捕捉剤の集団を示し、式中、N1、N2、N3、及びN4はG、A、T、及びCから選択される異なるヌクレオチドであり、nは0、1以上である。一方、図4は、DNA二本鎖におけるポリメラーゼの存在全体を増やすために5’末端での無作為ヌクレオチドの短いストレッチ(例えば、1〜5の残基)が任意で後に続く式3’−YN1/N2−5’によって定義されるオーバーハングを有する捕捉剤の集団を示し、式中、Yは塩基N3及びN4で構成される長さn(nは0、1以上である)のヌクレオチド配列であり、オーバーハングの開始から数えてヌクレオチドN3は奇数の位置にあり、ヌクレオチドN4は偶数の位置にあり、N1、N2、N3、及びN4はG、A、T、及びCから選択される異なるヌクレオチドである。図3、4、及び5で説明されるように、第1の鎖の配列は捕捉剤のそれぞれに対して同一であり、第2の鎖の配列は捕捉剤のそれぞれに対して異なる。これらの実施形態では、異なる第2の鎖によって異なる捕捉剤間でオーバーハングが異なるものになる。
本発明のこの実施態様は、可逆的ターミネータ、すなわち、組み込みの後に脱保護することができる鎖ターミネータヌクレオチドに依存し、それによってさらなるヌクレオチドがそのヌクレオチドに付加されるのを可能になる。
本方法のこの実施態様は、「欠落した」塩基の設計に依存するものであり、この場合、各サイクルでは、2つの標識されたヌクレオチド及び1つの非標識のヌクレオチドが反応に付加され、「欠落塩基」は1超のヌクレオチドによってプライマーが伸長するのを妨げる。
この方法では、ニックトランスレーションによるプライマーの伸長によって、上の鎖のプライマーから下流に位置付けられるように下の鎖のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する蛍光で標識された「検出器」オリゴヌクレオチドから消光剤を除去する。この方法の原理は図7にて説明されている。この方法の多重化版は図8に示されている。
この実施態様では、本方法は、蛍光色素分子で標識された塩基によるプライマー伸長によって抗体の染色を提供すること、またはさもなければ、プライマー伸長によってプライマーに付加された第1の蛍光ヌクレオチドとオリゴヌクレオチド図10に存在する第2のヌクレオチドとの間でのエネルギー移動によって生成されるFRETシグナルを読み取ることを含む。この方法の原理は図9Aにて説明されている。多重化は、二本鎖を融解することによりまたはエキソヌクレアーゼにより伸長が刺激するオリゴヌクレオチドを除去し、かつ異なる抗体で伸長可能である別のプライマーオリゴヌクレオチドを再アニーリングすることによって達成される。この方法の多重化版は図9Bにて示される。特定の実施形態では、多重化された実施態様は、(a)平面試料を複数の捕捉剤とインキュベートすることと、(b)捕捉剤を平面試料に架橋することと、(c)複数の捕捉剤の第1のセットのオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成するプライマーを伸長し(例えば、第1のプライマーの3’末端が第1の集団のオリゴヌクレオチドのみとアニーリングする)、それによって第1のセットの蛍光シグナルを生成すること(その工程は、ポリメラーゼを用いて標識されたヌクレオチドを付加すること、ならびに/または試料と標識されたオリゴヌクレオチド及びリガーゼと、を接触させることによって実施することができる)と、(d)蛍光顕微鏡を用いて第1のセットの蛍光シグナルを読み取ることと、(e)蛍光を不活化することと、(f)複数の捕捉剤の第2のセットのオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成するプライマーを伸長し(例えば、第1のプライマーの3’末端が第2の集団のオリゴヌクレオチドのみとアニーリングする)、それによって第2のセットの蛍光シグナルを生成すること(その工程は、ポリメラーゼを用いて標識されたヌクレオチドを付加すること、ならびに/または試料と標識されたオリゴヌクレオチド及びリガーゼとを接触させることによって実施することができる)と、(g)蛍光顕微鏡を用いて第2のセットの蛍光シグナルを読み取ることと、(h)工程(d)及び工程(g)の画像生成物を比較することと、を含んでもよい。
図16にて模式的に説明されているように、ローリングサークル増幅を用いてシグナルが増幅されてもよい。これらの実施形態では、オリゴヌクレオチドに結合されている捕捉剤は、パドロックプローブの末端がライゲーション可能に隣接するようにオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成するパドロックプローブとハイブリッド形成される。この実施形態では、ライゲーションの後、オリゴヌクレオチドによってプライムされているローリングサークル増幅によってパドロックプローブ(ここでは環化されている)をコピーすることができる。この反応によって、捕捉剤に結合される縦一列での同じ配列のいくつかの(多くの場合、数百または数千)コピーを含有するパドロックプローブのコンカテマーが生じる。ローリングサークル増幅の産物(抗体に結合される)は、上述及び図示の方法を用いて検出することができ、検出される配列は反復されるため、シグナルが増幅される。これらの実施形態では、(i)捕捉剤は、第1の鎖(すなわち、RCA産物)及び第2の鎖(検出オリゴヌクレオチドを含む)を含む二本鎖核酸に結合される。そのような方法を用いて単一分子を検出することができる。
本明細書に記載されている方法及び組成物には、任意の平面試料の分析のための多種多様な応用で一般的な用途が見いだされる(例えば、組織切片、細胞のシート、遠心した細胞、電気泳動ゲルのブロット、ウエスタンブロット、ドットブロット、ELISA、抗体マイクロアレイ、核酸マイクロアレイ等の分析にて)。
例えば、細菌、酵母、植物、ならびに例えば、魚類、鳥類、爬虫類、両生類及び哺乳類のような動物に由来する細胞及び生物が主題の方法で使用されてもよい。特定の実施形態では、哺乳類細胞、すなわち、マウス、ウサギ、霊長類、もしくはヒトに由来する細胞、または培養されたその派生物が使用されてもよい。
本発明はまた、本開示の方法を実施するように構成されるコンピュータシステムも提供する。本システムは、本明細書に記載されている方法を実施するようにプログラムされるコンピュータサーバー(「サーバー」)を含むことができる。図21は、ユーザーが試料の画像を検出し、解析し、かつ処理するのを可能にするように適応させたシステム1600を示す。システム1600には、本明細書に記載されている例示的な方法を実施するようにプログラムされる中央コンピュータサーバー1601が含まれる。サーバー1601には、単一コアのプロセッサ、複数コアのプロセッサ、または並行処理のための複数のプロセッサであり得る中央処理ユニット(CPU、また「プロセッサ」)1605が含まれる。サーバー1601にはまた、メモリ1610(例えば、ランダムアクセスメモリ、読み取り専用メモリ、フラッシュメモリ)、電子保存ユニット1615(例えば、ハードディスク)、1つまたは複数の他のシステムと通信するための通信インターフェース1620(例えば、ネットワークアダプタ)、ならびにキャッシュ、他のメモリ、データ保存、及び/または電子表示アダプタを含んでもよい周辺デバイス1625が含まれる。メモリ1610、保存ユニット1615、インターフェース1620、及び周辺デバイス1625は、マザーボードのような通信バス(実線)を介してプロセッサ1605と通信する。保存ユニット1615はデータを保存するためのデータ保存ユニットであり得る。サーバー1601は通信インターフェース1620によってコンピュータネットワーク(「ネットワーク」)1630に操作可能に連結される。ネットワーク1630は、インターネット、イントラネット及び/もしくはエクストラネット、インターネットと通信するイントラネット及び/もしくはエクストラネット、電気通信、またはデータネットワークであることができる。ネットワーク1630は、場合によっては、サーバー1601によって、ピアツーピアのネットワークを実施することができ、それによってサーバー1601に連結されたデバイスがクライアントまたはサーバーとして挙動することができるようになる。顕微鏡は、周辺デバイス1625または遠隔コンピュータシステム1640であり得る。
一部の態様では、本明細書の開示はキットを提供する。本キットは本開示の方法を実施するための任意の数の組成物を含むことができ、そのそれぞれは本明細書に記載されている。例えば、キットは少なくとも1つの捕捉剤を含んでもよい。捕捉剤は、抗体、アプタマー、またはオリゴヌクレオチドプローブであり得る。捕捉剤は、所望の標的に特異的に結合するように特注することができる。例えば、ユーザーは、キットに含む1つまたは複数の捕捉剤を特注してもよい。場合によっては、捕捉剤は別々に販売されている場合がある。捕捉剤は対象とする標的分子に特異的に結合することができる。追加としてまたは代替として、パネルとして捕捉剤を注文することができる(すなわち、捕捉剤を予め選択する)。パネルは特定の型の疾患(例えば、癌)または特定の亜型の疾患(例えば、結腸癌)について特異的であることができる。本開示のキットは、1つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含むこともできる。本明細書に記載されているように、オリゴヌクレオチドは第1の鎖及び第2の鎖を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチドとして、または二本鎖オリゴヌクレオチドとして提供され得る。後者の場合、キットは、オリゴヌクレオチドの第1の鎖及び第2の鎖をアニーリングして二本鎖オリゴヌクレオチドを作製するための試薬及び/または指示書を含むことができる。一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドを捕捉剤にコンジュゲートすることができ、または非コンジュゲートで提供することができる。後者の場合、二本鎖オリゴヌクレオチドを捕捉剤にコンジュゲートするために試薬をキットに含むことができる(例えば、クリック反応を行うための試薬)。場合によっては、キットは複数のオリゴヌクレオチドを提供してもよく、この場合、第1の鎖のそれぞれは同一であり、第2の鎖のそれぞれは異なる。キットはさらに、本明細書に開示されているヌクレオチド混合物を含むことができる。ヌクレオチド混合物は、蛍光ヌクレオチド、非標識のヌクレオチド、可逆的ターミネータヌクレオチド等の任意の組み合わせを含むことができる。一般に、キットで提供されるヌクレオチド混合物は提供されるオリゴヌクレオチドと適合することになる。キットはさらに、、プライマー伸長を行うためのポリメラーゼ、シグナル(例えば、TCEP)を不活化するための試薬、ブロッキング溶液(例えば、ヨードアセトアミド溶液)、及び本明細書の方法を実施するのに好適な任意の緩衝液または溶液を限定せずに含むことができる。キットは、固定剤(例えば、ホルムアルデヒド)のような標識用試料を調製するための任意の試薬または試料包埋用試薬(すなわち、パラフィンワックス)を含むことができる。キットはさらに、試験試料と比較するための対照試料を含むことができる。対照試料は健常な試料または疾患試料であり得る。対照試料は、検査中の組織もしくは細胞の型に、または試験される疾患と照合することができる。場合によっては、対照試料は陽性対照または陰性対照であってもよい。
平面試料を分析する方法が提供される。特定の実施形態では、本方法は、(a)捕捉剤が平面試料における相補性部位に特異的に結合する条件下で捕捉剤と平面試料をインキュベートすることであって、(i)捕捉剤が第1の鎖及び第2の鎖を含む二本鎖オリゴヌクレオチドに結合され、(ii)捕捉剤が第1の鎖の5’末端によって二本鎖オリゴヌクレオチドに結合され、(iii)第1の鎖の3’末端が第2の鎖の5’末端に対して陥凹し、それによってオーバーハングが作製される、インキュベートすること、(b)捕捉剤を平面試料に架橋すること、(c)平面試料とポリメラーゼ及びヌクレオチドミックスとを接触させ、それによって1つまたは複数のヌクレオチドをオーバーハングに付加すること、ならびに/または平面試料と、その一部が標識されてもよい、または標識されなくてもよい短いオリゴヌクレオチドの混合物及びDNAリガーゼとを接触させること、(d)蛍光顕微鏡を用いて、オーバーハングに1つまたは複数のヌクレオチドを付加することによって生成される蛍光シグナルを読み取り、それによって平面試料に捕捉剤が結合するパターンを示す画像を作製することを含む。一部の実施形態では、試料が読み取られた後、この方法は、蛍光部分を除去し、付加された蛍光ヌクレオチドを脱保護し、それによって本方法を反復させることに関与してもよい。
材料及び方法
2%ホルムアルデヒドで固定し、透過処理し、−80℃でメタノールにて保存された脾臓細胞をメタノールから遠心分離し、緩衝液4(10mMのTris &.5,10mMのMgCl2,150mMのNaCl,0.1%のトリトンX100)に再浮遊させ、回転体で5分間洗浄した。ab−オリゴヌクレオチドの複合体の非特異的な結合をブロッキングするために、細胞をさらに遠心分離し、1mLのPBS、0.5%BSA(SM)に再浮遊させ、追加の0.5MのNaCl(0.9mLのSM+100uLの5MのNaCl)に至るまで補完した。20uLの剪断したssDNA(10mg/mL)、50uLのマウスIgG(10mg/mL)、及び20uLの0.5MのEDTAをさらに1mLの細胞に加え、その混合物を回転体上で30分間インキュベートした。染色のために、予め作製した抗体/オリゴヌクレオチド複合体(0.2ugのCD45−146複合体をチューブ当たり1uLの特異的なオリゴヌクレオチド(147等)と40Cで30分間アニーリングした)と共に細胞を30の250uLのチューブ(PCR小片チューブの選択は本事項に好都合である)に再分配し、回転させて1時間インキュベートした。細胞を2回洗浄し(PBS、0.1%トリトン、0.5Mの塩、5mMのEDTA)で2回洗浄し、ポリリジン処理したガラス製のカバースリップ上に載置し、10分間静置し/付着させ、さらに5mMのBS3を含むPBS(4mL当たり7.4mg)、0.1%トリトン、0.5MのNaCl、5mMのEDTAで1時間固定した。
プライマー伸長によるインサイチュでの染色の可能性を検討するために、浮遊液における(図11)またはスライドガラス上に不動化した(図12)マウスの脾臓細胞にてCD4の発現を視覚化した。Tリンパ細胞を視覚化するために、脾臓細胞を従来のTcrB−Ax488抗体で共染色した。(図11A)のように、オリゴヌクレオチド二本鎖にコンジュゲートされたCD4抗体で双方の試料を染色した。TcrB陽性T細胞をサブセットに分離させない対照試料にはクレノウポリメラーゼを添加しなかった(図11B)。クレノウポリメラーゼを供給すると、CD4陽性T細胞はTcrB陽性T細胞のCy5陽性サブセットとして観察することができる(図11C及び図12)。スライドガラス上で染色された細胞の共焦点画像化によって明瞭な膜染色パターンが観察された(図12A)。総合すると、このデータは、捕捉剤の結合パターンを提供するのにスライドガラス上のプライマー伸長反応を使用できることを示している。
細胞内タンパク質の染色で実施されるように、マウス脾臓細胞をメタノールで固定し、透過処理した。(A)のように、細胞を従来のTcrB−Ax488抗体及びオリゴヌクレオチド二本鎖にコンジュゲートされたCD4抗体によって共染色した。染色の後、クレノウエキソ−ポリメラーゼを伴わずに(B)またはそれ伴って(C)dUTP−Cy5と伸長緩衝液にて細胞をインキュベートした。(B)におけるTcrB陽性T細胞はAx−488染色によって示されることに留意されたい。クレノウの添加に応じて、TcrB陽性CD4陽性T細胞は(C)にてTcrB陽性T細胞のCy5陽性サブセットとして認識される。
細胞内タンパク質の染色で実施されるように、マウス脾臓細胞をメタノールで固定し、透過処理した。ポリリジンを被覆したスライドガラス上に細胞を付着させ、図12Aのように従来のTcrB−Ax488抗体及びオリゴヌクレオチド二本鎖にコンジュゲートされたCD4抗体によって共染色した。染色の後、dUTP−Cy5クレノウエキソ−ポリメラーゼと伸長緩衝液にて細胞をインキュベートし、共焦点顕微鏡によって視覚化した。示されるのは、CにおけるDIC画像、AにおけるCy5チャネル、BにおけるAx488チャネル、ならびにDにおけるAx488チャネル及びCy5チャネルを合わせたものである。(A)で確認されるように、(B)におけるTcrB−Ax488陽性T細胞のサブセットのみがプライマー伸長によってCy5陽性CD4陽性T細胞にされることに留意されたい。CD4の膜のパターンは、特定の予想された細胞内の局在化で生じるプライマー伸長による染色の特異性を指し示す。
細胞内タンパク質の染色で実施されるように、マウス脾臓細胞をメタノールで固定し、透過処理した。ポリリジンを被覆したスライドガラス上に細胞を付着させ、従来のTcrB−Ax488抗体及び(A)にて示したようなオリゴにコンジュゲートされたCD4抗体とCD8抗体との混合物とによって共染色した。染色の第1のサイクルについては、細胞をイルミナ可逆的ターミネータ及びクレノウエキソ−ポリメラーゼと伸長緩衝液にてインキュベートし、共焦点顕微鏡によって視覚化した(C)。第1のサイクル後の画像化に続いて、TCEPを含有するイルミナ切断緩衝液によって細胞を脱染した。脱染−ターミネータの再活性化に続いて、細胞を再びイルミナ可逆的ターミネータ及びクレノウエキソ−ポリメラーゼと伸長緩衝液にてインキュベートし、共焦点顕微鏡によって視覚化した(D)。(B)上で4種のT細胞が高いレベルのTcrBによって特定され、4つの白い矢印によってマークされたことに留意されたい。これらの細胞のうちの2種はCD8a陽性((C)にて紫色の矢印にてマークされた)であることが染色の第1のサイクルの後に明らかになる。染色の第2のサイクルによって他の2種の細胞がCD4陽性である((D)にて緑色の矢印にてマークされた)ことが明らかになる。CD4及びCD8aの予想された相互の排他性と同様に組み込まれた標識されたヌクレオチドの膜パターンはさらに、プライマー伸長のサイクルのよる染色の特異性を支持している。
ローリングサークル増幅によるインサイチュの抗体のシグナルの増幅
材料及び方法
記載されたようにオリゴヌクレオチド146v2に対するラット抗マウスB220抗体のコンジュゲートを調製した。コンジュゲートは、146v2にて環状ハイブリッドを形成するように設計されたパドロックオリゴヌクレオチド(PatgctaccgttAATTATTACTGAAACATACACTAAAGATAACATTAttctgcaag、配列番号125)とハイブリッド形成させた。マウス脾臓細胞をコンジュゲートのいずれかで染色し、次いでパドロック構築物で染色されたそれらの細胞を製造元のライゲーション緩衝液にて37℃で1時間T4 RNAリガーゼ(NEB)とインキュベートし、次いでphi29ポリメラーゼ及びdNTPミックスと15分間インキュベートした。細胞をPBSで3回洗浄し、次いで10nMのRCA産物検出オリゴヌクレオチド(TGAAACATACACTAAAGA、配列番号126)と10分間インキュベートした。その後、細胞を蛍光dUTP−Cy5(Jena Biosciences)とインキュベートし、200nMのdUTP−Cy5を含む緩衝液#4及び1uLのエキソ−クレノウポリメラーゼ(Thermo Scientific)とインキュベートすることによってそれを細胞に組み込んだ。細胞のアリコートを取り出し、ローリングサークル増幅(RCA)工程を行わず、次いで参照として使用して染色に対するRCAの効果を評価した。
抗体の染色を向上させるために抗体に結合された多重化DNAバーコードのローリングサークル増幅の効率について試験した。リンカー(146v2)オリゴヌクレオチドハイブリッドにアニーリングされた環化「パドロック」オリゴヌクレオチドを含有する抗B220抗体に基づいた特殊な抗体−DNAコンジュゲートを収集し、それでマウスの細胞を染色した。染色の後、パドロックオリゴヌクレオチドをT4リガーゼとライゲーションさせて、phi29ポリメラーゼとローリングサークルのプロトコルを用いて増幅させたところ、検出プライマーに相補性の反復配列を含有する各抗体に結合された長い反復DNAのストレッチが生じた。プライマーのアニーリングの後、dUTP−Cy5の複数の分子は、その性質が反復性であるため、増幅されたDNA分子に組み込むことができる。図16のパネルA〜Eはこの方法を模式的に説明している。図16のパネルF〜Gは、ローリングサークル増幅による細胞の染色は、それがない場合と比較してはるかに強力であることを示している。
分散した脾臓細胞にて22の抗原を同時検出すること
材料及び方法
以下のプロトコルを用いて抗体コンジュゲートを調製した。抗体に対して、TCEP(最終濃度1mM)のPBS、pH7.4と室温で30分間インキュベートすることによってジスルフィドの部分的な還元を行った。コンジュゲート緩衝液(PBS、pH7.0)によって飽和されたBioGelP−30スピンカラムにおける緩衝液交換によって抗体をTCEPから精製した。保護されたマレイミド基を有するオリゴヌクレオチド146v2(5’マレイミド−ATAGCAGTCCAGCCGAACGGTA GCATCTTGCAGAA、配列番号127)がTrilink incから注文された。製造元からの指示に従って抗体への共有結合架橋を調製するために、オリゴヌクレオチドに存在するマレイミド基をAdler反応(トルエンにて90℃で4時間)によって脱保護/活性化した。無水エタノールにおける数回の洗浄によってオリゴヌクレオチドからトルエンを除去した。活性化されたオリゴヌクレオチドをコンジュゲート緩衝液に溶解し、50:1のモル比で還元した抗体と混合した。最終濃度が1Mとなるまで塩化ナトリウムをコンジュゲート反応に添加した。コンジュゲート反応を1時間進行させた。未結合のオリゴヌクレオチドを除去するために、分子量カットオフフィルター(Amicon 50kDa)でコンジュゲートされた抗体を4回濾過した。0.5Mの塩化ナトリウム及び0.1%のTween−20を伴ったリン酸緩衝液にて最終洗浄及び保存を行った。
染色はポリメラーゼ反応ミックスとの反復インキュベートによって提供された。奇数のサイクル(1、3、5…)では、細胞をG−ミックス(ml当たり150nMのdG、150nMのdUssCy5、150nMのdCssCy3、25ul/mlのNEBエキソ−クレノウを含む緩衝液4)にて2分間インキュベートし、405(MgClを含まず、最終0.65MまでNaClで補完した緩衝液4)で3回洗浄し、写真撮影し、50mMのTCEPを含む緩衝液405にて2分間インキュベートし、405で2回洗浄し、写真撮影し、新しく作製した100mMのヨードアセトアミドを含む緩衝液405にて1分間インキュベートし、緩衝液4で3回洗浄した。偶数のサイクル(2、4、6…)では、細胞をA−ミックス(ml当たり150nMのdATP、150nMのdUTPssCy5、150nMのdCTPssCy3、25ul/mlのNEBエキソ−クレノウを含む緩衝液4)にて2分間インキュベートし、405(MgClを含まず、最終0.65MまでNaClで補完した緩衝液4)で3回洗浄し、写真撮影し、50mMのTCEPを含む緩衝液405にて4分間インキュベートし、405で2回洗浄し、写真撮影し、新しく作製した100mMのヨードアセトアミドを含む緩衝液405にて1分間インキュベートし、緩衝液#4で3回洗浄した。可逆的に標識された蛍光ヌクレオチド三リン酸はJena Bioscienceによって特別に合成された。
ABseqを用いて、22−抗体パネルを使用してマウスの脾臓及び骨髄における種々の細胞サブセットについて調査した。単離した脾臓細胞及び骨髄細胞をNHS−PacBlu及びNHS−Ax−488の色素による全細胞染色によってバーコード化し、混合し、DNA二本鎖でタグ付けした22の抗体のパネルで染色し、スライドガラス上に付着させ、11のプライマー伸長におけるABseq及び画像化の繰り返しによって提供した(図17)。明白に、すべてのマーカー発現データを有する疑似着色された画像における22の色マーカーの発現データは、多色パレットにおける色の近接性の故に視覚的に解析するのは不可能であることが明白に判明した(図17、右下のパネル)。
スペーサーによる多重パネルの設計
材料及び方法
抗体のコンジュゲート、細胞の染色、及びレンダリングはセクション4(分散させた脾臓細胞にて22の抗原を同時検出すること)と同じ実験手順に従って行った。脾臓細胞の9つのアリコートを異なるCD45抗体−DNAのコンジュゲートで別々に染色した。各パネルのコンジュゲートは以下の方法で形成された。
パネル1:146v2(5’マレイミド−ATAGCAGTCCAGCCGAACGGTAGCATCTTGCAGAA(配列番号174)にコンジュゲートされ、かつ
1.TTTTATTCTGCAAGATGCTACCGTTCGG−ジデオキシC(配列番号150)
2.TTTTAtTTCTGCAAGATGCTACCGTTCGGz−ジデオキシC(配列番号151)
3.TTTTACtTTCTGCAAGATGCTACCGTTCGGz−ジデオキシC(配列番号152)とDNA二本鎖を形成するCD45。
パネル2:146v2−ddC(5’マレイミド−ATAGCAGTC CAGCCGAACGGTAGCATCTTGCAGAA−ジデオキシC)(配列番号153)にコンジュゲートされ、
4.TTTTAGCGATTAAGCGTGAACTTCTGCAAGATGCTACCGTTCGG−ジデオキシC(配列番号154)
5.TTTTAtGCGATTAAGCGTGAACTTCTGCAAGATGCTACCGTTCGGz−ジデオキシC(配列番号155)
6.TTTTACtGCGATTAAGCGTGAACTTCTGCAAGATGCTACCGTTCGGz−ジデオキシC(配列番号156)とDNA二本鎖を形成するCD45。
パネル3:146v2−ddC(5’マレイミド−ATAGCAGTCCAGCCGA ACGGTAGCATCTTGCAGAA−ジデオキシC)(配列番号157)にコンジュゲートされ、
7.TTTTACGCTAATTCGCACTTGTTCTGCAAGATGCTACCGTTCGG−ジデオキシC(配列番号158)
8.TTTTAtCGCTAATTCGCACTTGTTCTGCAAGATGCTACCGTTCGGz−ジデオキシC(配列番号159)
9.TTTTACtCGCTAATTCGCACTTGTTCTGCAAGATGCTACCGTTCGGz−ジデオキシC(配列番号160)
とDNA二本鎖を形成するCD45。
ポリメラーゼの誤取り込みエラーのために、ABseqによるレンダリングのシグナル強度は、個々のヌクレオチドの順次付加を利用するディープシーケンシングプロトコルの開発に関する他の研究で認められたようにサイクル数の増加と共に低下すると予想される。それを回避し、かつ抗体に結合される過度に長いDNA断片の使用を回避するために、設計に対する以下の修正について試験した(図18、パネルA)。これらのサブパネルにおける伸長反応がddC、プロピル、または任意の他の3’末端基を持つ上の鎖のオリゴヌクレオチドの終結によって防止されるように、大きな抗体のパネルをサブパネルに分割することができる。各サブパネルの伸長が終了した後、短い「活性化」スペーサーのインサイチュのハイブリッド形成によって次のサブパネルを活性化するが、これはその3’末端で終結部分を有さないため、プライマー伸長の連続的なサイクルを開始する。この設計を3つの順次3サイクルのパネル(合計9回の伸長サイクル)で実験的に試験した(図18、パネルB)。画像の定量は、スペーサーオリゴヌクレオチドを活性化するパネルのスライドガラス上でのハイブリッド形成に関連するABseqレンダリングの効率の有意な低下が観察されないことを示し、個々のパネル間でシグナルのキャリーオーバーがないことを示した(図18、パネルC)。
多重化された単一分子RNAの検出
材料及び方法
NALM及びJurkatの細胞株を100万個/mlの密度に増殖させ、1.6%のホルムアルデヒドで10分間固定し、次いで氷冷メタノールに移した。200K細胞のアリコートをPBSTR(PBS、0.1%のTween−20及び1:1000のRnasin)で洗浄し、ハイブリッド形成緩衝液(1×SSC、10%ホルムアミド、10%バナジル−リボヌクレオチド複合体、10%ポリビニルスルホン酸)に移した。DNAプローブ混合物を最終濃度が100nMになるまで添加し、40℃で1時間インキュベートした。細胞を室温にて5分間PBSTRで2回洗浄し、40℃で20分間、高塩緩衝液(4×SSCのPBSTR)で2回洗浄し、PBSTRでもう一度洗浄し、ライゲーション溶液(0.1ulのT4DNAリガーゼ(New England Biosciences)、5ulの10×T4リガーゼ緩衝液(New England Biosciences)、45ulのH2O)に移した。ライゲーションは37℃で1時間進行した。次いで細胞を増幅溶液(1ulのphi29ポリメラーゼ(Thermo Scientific)、5ulの10×ポリメラーゼ緩衝液(Thermo Scientific)、1ulの10mMのdNTPミックス、43ulのH2O)に移し、30℃で1時間インキュベートした。細胞をPBSTRで洗浄し、37℃で10分間1mMの「RCA検出」オリゴヌクレオチドとインキュベートし、配列決定緩衝液(10mMのTris、pH7.5,10mMのMgCl2、150mMのNaCl、0.1%のトリトン×100、1:50のクレノウポリメラーゼ(Thermo Scientific)、200mMのdUTP−Cy5(Jena Biosciences))に移した。細胞を高塩洗浄緩衝液(10mMのTris、pH7.5、10mMのMgCl2、650mMのNaCl,0.1%トリトン×100)で2回洗浄し、蛍光顕微鏡を用いて撮像した。
スライドガラス上でのプライマー伸長プロトコルを適用して、NALMプロB細胞株におけるヒトHLADR mRNAの単一分子を検出した。JurkatT細胞リンパ腫株を陰性対照として用いてバックグランドを評価した。単一分子mRNAの検出を可能にするために、近接ライゲーション及びローリングサークル増幅(RCA)に基づいて単一増幅系を設計した。各対の2つのオリゴがHLADRAmRNAの直接隣接する20ntのストレッチに相補性であり、かつ上流のオリゴヌクレオチドの3’領域が下流のパドロックオリゴヌクレオチドの環化のスプリント(図19、A)としてかつローリングサークル増幅のプライマーとして機能するように、5対のプローブを設計した。複合体の構築の後、細胞を洗浄し、T4DNAリガーゼで処理してパドロックオリゴヌクレオチドを環化し、phi29ポリメラーゼ及びdNTPミックスとインキュベートしてローリングサークル増幅を実施した(図19、B)。増幅産物を「RCA検出」オリゴヌクレオチドと共にインキュベートし(図19、C)、次いでクレノウポリメラーゼによる単一塩基伸長によって蛍光dUTP−Cy5を組み込んだ(図19、D)。細胞を洗浄し、蛍光顕微鏡によって撮像した。HLADRを発現しているNALM細胞の画像がRCA産物に相当する細胞質にて豊富な点状の染色を示し(図19、E)、HLADRに対して陰性であるJurkat細胞が非常に少ない点を示し(図19、F)、これによってHLADR mRNAの近接ライゲーションの基づく検出の特異性が高いことが証明されている。
Claims (18)
- (i)複数の検出試薬であって、当該複数の検出試薬の各検出試薬が、第1の核酸鎖に結合した捕捉剤及び前記第1の核酸鎖にハイブリダイズした第2の核酸鎖を含み、
前記第1または第2の核酸鎖の5’末端または3’末端が、他方の鎖を鋳型として用いて伸長可能であり、
前記伸長可能な末端の直下流の前記鋳型が前記複数の検出試薬のそれぞれに対して異なり、かつ、
前記複数の検出試薬のおのおのが異なる相補性部位を認識する、複数の検出試薬;
(ii)平面試料;及び
(iii)化学的架橋剤を含む捕捉剤組成物であって、
前記化学的架橋剤が、前記複数の検出試薬を前記平面試料に架橋する、捕捉剤組成物。 - 前記第1の鎖の配列が前記複数の検出試薬のそれぞれに対して同一であり、かつ、
前記第2の鎖の配列が前記複数の検出試薬のそれぞれについて異なる、請求項1に記載の組成物。 - 伸長可能な3’末端に直接隣接する前記鋳型が、式3’−N4nN1、3’−N4nN2または3’−N4nN3であり、式中、N1、N2、N3及びN4はG、A、T及びCから選択される異なるヌクレオチドであり、nは1以上である、請求項1に記載の組成物。
- 前記伸長可能な3’末端に直接隣接する前記鋳型が、任意に5’末端に1〜5の無作為ヌクレオチドストレッチが続く、式3’−YN1−5’または3’−YN2−5’であり、式中、YはN3及びN4の交互のストレッチで構成され、N1、N2、N3、及びN4は、G、A、T、及びCから選択される異なるヌクレオチドである、請求項1に記載の組成物。
- 平面試料の分析方法であって、
(a)請求項1から4のいずれかに記載の捕捉剤組成物を提供する工程、
(b)前記複数の検出試薬を、前記化学的架橋剤を用いて前記平面試料に架橋し、それにより標識された試料を生成する工程、
(c)前記標識された試料と、(i)ポリメラーゼ、及び不完全なヌクレオチドミックスまたは可逆的ターミネータヌクレオチドを含むヌクレオチドミックスとを接触させ、それによって前記複数の検出試薬にヌクレオチドを付加する工程、及び/または(ii)標識されたオリゴヌクレオチド及びリガーゼとを接触させ、それによって前記複数の検出試薬に標識されたオリゴヌクレオチドを付加する工程、及び、
(d)前記複数の検出試薬のすべてではなく一部に前記ヌクレオチドまたは前記標識されたオリゴヌクレオチドを付加することによって生成されるシグナルを読み取る工程を含む、分析方法。 - 前記シグナルが蛍光シグナルを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記読み取る工程が蛍光顕微鏡を備える、請求項6に記載の方法。
- 前記(c)が、前記平面試料とポリメラーゼ及び(i)N1、N2、及びN3に相補性である複数の蛍光ヌクレオチドならびにN4に相補性である可逆的ターミネータヌクレオチドを含むヌクレオチドミックスとを、または(ii)N1及びN2に相補性である複数の蛍光ヌクレオチド、N3に相補性である非標識のヌクレオチドを含み、N4に相補性であるヌクレオチドを含まないヌクレオチドミックスとを接触させ、それによって検出試薬のすべてではなく一部の核酸に蛍光ヌクレオチドを付加する工程を含み、
前記(d)が、蛍光顕微鏡を用いて、前記複数の検出試薬のすべてではなく一部の核酸に前記蛍光ヌクレオチドを付加することによって生成される蛍光シグナルを読み取る工程を含む、請求項5に記載の方法。 - 前記伸長可能な3’末端に直接隣接する前記鋳型が、式3’−N4nN1、3’−N4nN2または3’−N4nN3であり、式中、N1、N2、N3、及びN4は、G、A、T、及びCから選択される異なるヌクレオチドであり、nは1以上であり、工程(c)が、前記平面試料とポリメラーゼ、ならびにN1、N2、及びN3に相補性である複数の蛍光ヌクレオチドならびにN4に相補性である可逆的ターミネータヌクレオチドを含むヌクレオチドミックスとを接触させる工程を含む、請求項8に記載の方法。
- (e)前記蛍光シグナルを不活化する工程、
(f)任意で、可逆的ターミネータヌクレオチドを脱保護する工程、
(g)前記試料をブロッキングする工程、及び、
(h)工程(c)及び(d)を反復する工程をさらに含む、請求項8に記載の方法。 - 工程(h)が工程(c)から(g)を複数回反復することを含む、請求項10に記載の方法。
- 前記伸長可能な3’末端に直接隣接する前記鋳型が、任意に5’末端に1〜5の無作為ヌクレオチドストレッチが続く、式3’−YN1−5’または3’−YN2−5’であり、式中、YはN3及びN4の交互のストレッチで構成され、N1、N2、N3、及びN4はG、A、T、及びCから選択される異なるヌクレオチドである、請求項8に記載の方法。
- (e)前記蛍光シグナルを不活化する工程、
(f)前記平面試料と、ポリメラーゼ、及びN4に相補性である非標識のヌクレオチドとを接触させる工程、
(g)工程(c)及び(d)を反復する工程をさらに含む、請求項12に記載の方法。 - 工程(g)が工程(c)から(f)を複数回反復することを含む、請求項13に記載の方法。
- 前記捕捉剤組成物が、前記複数の検出試薬の各検出試薬について、前記第1の鎖から下流の前記第2の鎖とハイブリッド形成する蛍光で標識されたオリゴヌクレオチドを含み、前記蛍光で標識されたオリゴヌクレオチドが消光剤を含み、前記第1の鎖の伸長が消光された蛍光で標識されたオリゴヌクレオチドのすべてではなく一部から消光剤を除去し、それによって前記複数の検出試薬のすべてではなく一部について蛍光シグナルを生成する、請求項5に記載の方法。
- 前記捕捉剤が、抗体、アプタマー、及びオリゴヌクレオチドプローブからなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記(c)が、前記標識された試料と(i)ポリメラーゼ、及び不完全なヌクレオチドミックスまたは可逆的ターミネータヌクレオチドを含むヌクレオチドミックスとを接触させ、それによって前記複数の検出試薬にヌクレオチドを付加する工程、及び(ii)標識されたオリゴヌクレオチド及びリガーゼとを接触させ、それによって前記複数の検出試薬に標識されたオリゴヌクレオチドを付加する工程を含む、請求項5に記載の方法。
- 前記(c)(ii)が、前記平面試料と、標識されたオリゴヌクレオチドと非標識のオリゴヌクレオチドとの混合物とを接触させることを含む、請求項5又は17に記載の方法。
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