SE531135C2 - Känslig detektion av gifter, patogener och sjukdomsmarkörer genom aggregation av cytoskeletala filament - Google Patents
Känslig detektion av gifter, patogener och sjukdomsmarkörer genom aggregation av cytoskeletala filamentInfo
- Publication number
- SE531135C2 SE531135C2 SE0602571A SE0602571A SE531135C2 SE 531135 C2 SE531135 C2 SE 531135C2 SE 0602571 A SE0602571 A SE 0602571A SE 0602571 A SE0602571 A SE 0602571A SE 531135 C2 SE531135 C2 SE 531135C2
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- cytoskeletal
- molecules
- aggregates
- different
- analyte
- Prior art date
Links
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 title claims description 9
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 title claims description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims description 3
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 title description 12
- 244000052769 pathogen Species 0.000 title 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 title 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 title 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 title 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 title 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 27
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims description 25
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 12
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 9
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 8
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 claims description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 4
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 4
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 claims description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 2
- 231100000317 environmental toxin Toxicity 0.000 claims description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 2
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 claims 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims 1
- 210000000867 larynx Anatomy 0.000 claims 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 claims 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 8
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 8
- 210000003632 microfilament Anatomy 0.000 description 7
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 6
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 6
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N Phalloidin Chemical compound N1C(=O)[C@@H]([C@@H](O)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C[C@@](C)(O)CO)NC(=O)[C@H](C2)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]3C[C@H](O)CN3C(=O)[C@@H]1CSC1=C2C2=CC=CC=C2N1 KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- CVOFKRWYWCSDMA-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-(2,6-diethylphenyl)-n-(methoxymethyl)acetamide;2,6-dinitro-n,n-dipropyl-4-(trifluoromethyl)aniline Chemical compound CCC1=CC=CC(CC)=C1N(COC)C(=O)CCl.CCCN(CCC)C1=C([N+]([O-])=O)C=C(C(F)(F)F)C=C1[N+]([O-])=O CVOFKRWYWCSDMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010009711 Phalloidine Proteins 0.000 description 1
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004847 absorption spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
- G01N33/586—Liposomes, microcapsules or cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4716—Muscle proteins, e.g. myosin, actin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
531 135 íL makroskopiska och rniniatyriserade system men möjliggör dessutom separation och koncentration av den bundna analyten med resulterande ökning av känsligheten. Utöver igenkänningsmolekylema kan också en rad olika rapportör-molekyler fästas till de cytoskeletala filamenten. Exempel på sådana (ej uttömmande) är fluoroforer, fluorescerande kvantprickar, fárgskapande enzymer (t ex ”horseradish peroxidase”) samt nanopartiklar av olika metaller samt magnetiska mikro-, och nanopartiklar. Då endast ett fåtal analytpartiklar väntas vara nödvändiga för aggregation av de cytoskeletala filarnenten förväntas mängden rapportörmolekyler och igenkärmingselement på varje filarnent (upp till ett par tusen) att ge upphov till en kraftig förstärkningseffekt och hög känslighet hos metoden. Känsligheten kan förstärkas ytterligare genom koncentration av den lösning där aggregation sker (t ex genom avdunstning). Ytterligare koncentrering kan därefter erhållas genom centrifugeringsbaserad precipitering av aggregat. Det bör påpekas att den aktuella detektionsmetoden är märkningsfri (”label-free”) i sådan mån att det är de cytoskeletala filamenten som är märkta med rapportörmolekyler och inte analyten eller den direkta igenkänningsmolekylen. Dessutom är det möjligt att detektion kan ske genom direkt observation av aggregat utan några rapportörmolekyler överhuvudtaget. Slutligen bör nämnas att metoden, endast i liten grad lider av problem typiska för biosensorer med antikroppar irnmobiliserade på en sensoryta, tex regenerering av ytan3 och ospeciñk inbindning av analyten.
Kort figurbeskrivning F ig. 1. Schematísk skiss som illustrerar eytoskeletalafilarnent (svängda linjer) som är märkta med igenkänníngsmolekyler exemplifierat med antikroppar (Y) i frånvaro av analyt (a). De cytoskeletala filamenten är också märkta med rapportörmolekyl (fylld cirkel). Då analytmolekylen (hexagom b) tillförs aggregeras de cytoskeltala filamenten (c). Detektion kan sedan ske genom observation av aggregat i mikroskop, makroskopisk detektion av ökad ljusspridning eller förstärkt fluorescens mm efter koncentration av aggregaten genom centrifugering. - F ig 2. Schematisk skiss som illustrerar cytoskeletalàfilarnent (svängde: tjocka linjer) som är märkta med igenkänningsmolekyler exemplifierat med nukleinsyrefragxnent/oligonukleotider (kamliknande strukturer) i frånvaro av analyt (a). De cytoskeletala filamenten är också märkta med rapportörmolekyl (fylld cirkel). Då analytmolekylen (b) tillförs aggregeras de cytoskeletala filamenten (c). Detektion kan sedan ske genom observation av aggregat i mikroskop, makroskopisk detektion av ökad ljusspridning eller förstärkt fluorescens mm efter koncentration av aggregaten genom centrifugering.
Redogörelse för uppfinningen Uppfinningen avser ett känsligt analysssystem för detektion av analyter som mikroorganismer, sjukdomsmarkörer och miljögifter. Uppfmningen är baserad på: l. bindning av specifika igenkänningsmolekyler som antikroppar eller nukleinsyra-fraginent till cytoskeletala filament, t ex aktinfilament och mikrotubuli. Nukleinsyra-fragmenten kan antingen vara s k aptamererg med specifik igenkänning av molekyler som inte är nukleinsyror eller också oli gonukleotider som specifikt hybridiserar med annan nukleinsyra. 531 135 '39 2. bindning av rapportörmolekyler till cytoskeletala filament. Exempel på rapportörmolekyler är fluoroforer, fluorescerande kvantprickar, magnetiska nano-, eller mikropartiklar, guld nanopartiklar eller enzymer. 3. specifik igenkänning mellan analytmolekyUpartikel och igenkänniiigsmolekyler på minst två olika cytoskeletala filament ledande till hopklumpning av filamenten. 4. möjligheter att detektera aggregat antingen direkt i mikroskop eller genom den ökade storleken som ger ändrad ljusspridning och precipitation (med eller utan centrifugering). 5. möjligheter att genomföra analyser och detektera aggregat i volymer från pl - ml området. 6. möjligheter att detektera mycket små mängder av aggregat genom koncentration följt av detektion av ackumulerade rapportörrnolekyler. 7. möjligheter att detektera flera olika analyter i samma mätning genom att använda cytoskeletala ñlament innehållande olika proportioner av två eller flera rapportörmolekyler.
Detaljerad beskrivning av uppfinningen Nedan redogörs i detaljfiír punkterna 1-7 i föregående avsnitt 1-2 Bindníng av specifika igenkänningsmolekyler och rapportönnolekyler till cytoskeletala filament Cytoskeletala ñlament som kan utnyttjas i den aktuella uppfinningen är t ex míkrotubuli och aktinfilament.
Flera studier har visat att det är möjligt att binda olika partiklar och rapportörmolekyler längs mikrotubuli och aktinfilarnent utan att nämnda filament depolymeriseras eller ens hindras från att flyttas fram av molekylmotorer. Partiklar eller molekyler (simulerande rapportör eller igenkänningsmolekyler) som fluoroforer, kvantprickars, och guld-nanopartilrlarw mm. har bundits längs aktinfilament t ex via phal1oidin-biotin-streptavidinkopplingar. Partiklar som virusu, antikroppar” och DNA” har också bundits till mikrotubuli t ex via biotin- streptavidinkopplingar. Således kan det förväntas att aktinfilament och mikrotubuli med lätthet ftlnktionaliseras både med igenkänningsmolekyler och rapportörsmolekyler (Fig. la-b) enligt förslag ovan. Det nya i den aktuella uppfinningen är samtidig funktionalisering av filamenten med igenkänningsmolekyler och rapportörsmolekyler med syfte att uppnå aggregering och detektion av analyter med ökad känslighet (Figs. 1-2). Dessutom är det viktigt i den aktuella uppfinningen att de cytoskeletala filamenten finns i lösning snarare än bundna till motorproteiner på ytor som i tidigare rapporter (exv. 8* 1144).
Nedan fokuseras beskrivningen på aktinfilament då vi bedömer att dessa har mest fördelaktiga egenskaper. De isoleras med lätthet och till låg kostnad från muskel (kött), t ex rester från normal köttproduktion. De kan också lagras i frys upp till ett par år” och vi har omfattande erfarenhet av att fästa biotin (biotinylering) längs aktinñlament via en phalloidiri-kopplings' 15 och även av att fasta nanopartilclar till dessa biotinmolekylers. Om phalloidin-baserad koppling av rapportör-, och igenkänningsmolekyler används kan upp till 200 molekyler av varje slag bindas per varje um av ett aktinñlament vilket, med längder upp till 20 um kan innebära att 4000 molekyler av varje slag binds till ett givet aktinfilarnent. 531 135 ”l 3. Specifik aggregation av cytoskeletala filanzent i närvaro av analyt Specifik igenkänning mellan analytmolekyl/partikel och igenkänningsmolekyler på minst två olika cytoskeletala filament krävs för aggregation av filamenten.
Sådan igenkänning som involverar monoklonala antikroppar fästa till olika fllament kan förväntas för bakterier och viruspartiklar med en kapsel/hölje där samma antikroppsbindande ställe (epitoper) upprepas flera gånger. Igenkärming via två identiska monoklonala antikroppar samtidigt (och därmed tvärlänkning av filament) kan också förväntas för proteinaggregat. För detektion av enstaka proteiner kan polyklonala antikroppar altemativt en kombination av olika monoklonala antikroppar användas. I det senare fallet fästs till frlamenten monoklonala antikroppar som känner igen olika delar av analytmolekylen.
Detektion av små molekyler kan förväntas vara mer utmanande men här skulle möjligen aptamerer kunna användas ev i kombination med antikroppar.
Specifik igenkänning med hjälp av oligonukleotider/nukleinsyrafragment används för detektion av analyter som är nukleinsyror (DNA, RNA). I detta fall är cytoskeletala filament uppmärkta med nukleinsyrafragment (oligonukleotider) som är komplementära till två eller flera delar av analytens nukleinsyresekvens. När analyten binder in till oligonukleotiderna på de cytoskeletala filamenten tvärbinds filamenten till stora aggregat (Fig. 2).
Våra hitillsvarande försök tyder på att problem med ospecifik bindning mellan filarnent/igenkänningsmolekyler och olika ”felaktiga” analyter inte blir något stort problem.
Inte heller ospecifik hopklumpning mellan aktinfilament och antikroppar/nukleinsyrafragment kan förväntas. Vi har således funnit att aktinfilamenten själva inte tycks binda andra proteiner ospecifikt i någon betydande utsträckning. Det fmns skäl att tro att detta gäller också för antikroppar och inte minst för nukleinsyrafragrnent då de senare är negativt laddade liksom aktinfilamenten.
En fördel med aktinfilament framför mikrotubuli är att analytinducerad aggregering är mer sannolik pga aktinfilalnentens betydligt mindre rigiditet både vad avser böjning och torsion.
Detta ökar chansen att två specifika ställen på två olika aktinfilament ska komma i kontakt möjliggörande tvärlänkning utan alltför stor tension i filamentet. När tvärlänkning väl skett förväntas den vara så gott som irreversibel i frånvaro av externa krafter. Bindingsenergin mellan antikropp och dess antigen (analyt) är nämligen betydligt högre än den termiska energin även för polyklonala antikroppar med låg affinitetló.
Då aktinfilarnenten är korta och flexibla kan reaktionen med lätthet ske i mycket små behållare, ner till 1 pl. 4-5. Detektion av aggregat i frånvaro av specifika rapportörmolekyler a) detektion i míkroskop. Detektion av aggregat i fluorescensmikroskop är lätt vid användande av fluorescensmärkta cytoskeletala filarnent. Emellertid är detektion i vanligt ljusfáltsmikroskop (utan fluorescensmärkning av filamentet) också möjligt då aggregaten kan förväntas bli större en den storlek som normalt kanupplösas i ett ljusmikroskop. Altemativt finns möjlighet till detektion av spritt ljus i mörkfáltsrrrikroskop eller genom fasförändringar i DIC-mikroskop. Möjligheten att detektera aggregat i mikroskop möjliggör kraftig niiniatyrisering ner till volymer (lOx10x1O pm3 = 1 pl) som kan innehålla ett antal aktinfilament och ett antal analytmolekyler. Genom mikroskopisk detektion bör det bli möjligt att detektera förekomsten av så lite som en enda analytmolekyl/partikel. Möjligheten för kombination med miniatyriserad separation med hjälp av molekylära motorer (Svensk patentansökan 0402135-8) finns också. b) detektion genom ökad ljusspridning. Det faktum att filamentaggregaten är betydligt större än de enskilda filamenten gör att deras bildning bör kunna följas genom graden av ljusspridning hos lösningen. 531 135 5/ c) detektion genom precipitation Tillräckligt stora aggregat kommer att precipitera utan centrifugering och detta bör direkt kunna observeras om antalet aggregat och deras storlek är tillräckliga. Genom att välja lämpligt g-tal vid centriftlgeringen kommer aggregat av olika storlek att kunna precipiteras. Vid tillräckligt högt g-tal (ultracentrifugering) precipiteras också isolerade aktinñlament. För att detektera förekomst av aggregat räcker alltså betydligt lägre g-tal. Förmodligen kommer det vara tillräckligt att använda en vanlig billig bordscentrifug för ändamålet. 6. Förstärkt detektion genom binding av stort antal rapportörsmolekyler till akrinfilamenten.
Förekomsten av ett fåtal, och väldigt små aggregat t ex i ett precipitat kan detekteras genom exempelvis absorptionsspektrometri, fluorescensspektmmetri, ytplasmonresonans och eventuellt ytfórstärkt Raman spridning med kraftig förstärkning av signalen då mycket stort antal rapportörsmolekyler är inkorporerade i varje aggregat. Då aggregaten kan precipitera från en relativt stor volym innebär centrifugeringen en kraftig koncentrering och ytterligare ökad känslighet hos metoden. 7. Samtidig detektion av flera olika analyter genom användande av cytoskeletala filament innehållande olika proportioner av rapportörsmolekylen Genom att märka de cytoskeletala filamenten med två eller flera olika rapportörmolekyler (t ex sådana som avgör röd respektive grön fluorescens) i varierande proportioner kan systemet utvecklas till att detektera flera olika analyter samtidigt. Varje cytoskeletalt filament med en given proportion rapportörmolekyler används för detektion av en given analyt. Då aggregering skett kan analytens identitet avläsas genom att mäta proportionen av olika rapportörsmolekyler i aggregatet (t ex genom att mäta intensitetsförhållandet mellan röd och grön fluorescens). 531 135 Referenser (1). Niemeyer, C. M. ; Mirkin, C. A. (2004) Nanobiotechnology: concepts, applications and perspectives Wiley-VCH (2) Pejcic, B.; De Marco, R. ; Parkinson, G. Analyst 2006, 131, 1079-1090. (3) D'Orazio, P. Clin Chím Acta 2003, 334, 41-69. (4) Zheng, G.; Patolsky, F.; Cui, Y.; Wang, W. U. ; Lieber, C. M. Nat Biotechnol 2005, 23, 1294-1301. * (S) Besteman, K.; Lee, J. 0.; Wiertz, F. G. M.; Heering, H. A. ; Dekker, C. Nano Left 2003, 3, 727-730. (6) Ghamekar-Nilsson, S.; Forsen, B.; Abadal, G.; Verd, J.; Campabadal, F.; Perez-Murano, F.; Esteve, J.; Barniol, N .; Boisen, A. ; Montelius, L. Nanotechnology 2005, 16, 98- 102. (7) Nam, J. M.; 'Ihaxtom C. S. ; Mirkin, C. A. Science 2003, 301, 1884-1886. (8) Mansson, A.; Sundberg, M.; Balaz, M.; Bunk, R.; Nicholls, 1. A.; Omling, P.; Tagerud, S.
; Montelius, L. Biochem Biophys Res Commun 2004, 314, 529-534. (9) Fíchou, V. ; Férec, C. Trends in Bíotechnology 2006, 24, 563-570. (10) Patolsky, F.; Weizmann, Y. ; Willner, I. Nat Mater 2004, 3, 692-695. (11) Bachand, G. D.; Rivera, S. B.;Carroll-Portil1o, A.; Hess, H. ; Bachand, M. Small 2006, 2, 381-385. - (12) Ramachandran, S.; Ernst, K. H.; Bachand, G. D.; Vogel, V. ; Hess, H. Small 2006, 2, 330-334. (13) Diez, S.; Reuther, C.; Dinu, C.; Seidel, R.; Mertig, M.; Pompe, W. ; Howard, J. Nano Lelt 2003, 3, 1251-1254. (14) Bachand, G. D.; Rivera, S. B.; Boal, A. K.; Gaudioso, J.; Liu, J. ; Bunker, B. C. Nano Lett 2004, 4, 817-821. (15) Balaz, M. ; Mansson, A. Anal Biochem 2005, 338,' 224-236. (16). Creighton, T. E. (1993) Proteins: Structures and molecular properties WH. Freeman and Company
Claims (17)
1. l. Arrangemang fór detektion av analyter i en lösning omfattande igenkänningsmolekyler, som är monoklonala eller polyklonala antikroppar eller nukleirrsyrafiagnient, fasta till minst två olika cytoskeletala ñlament som befinner sig i en lämplig buffert.
2. Arrangemang enligt patentkrav l omfattande att analyterna är valda bland biomolekyler, rniljögifcer, sjukdomsmarkörer och mikroorganismer.
3. Arrangemang enligt patentkraven 1-2 omfattande att rapportönnolekyler är fästa längs de cytoskeletala filamenten.
4. Arrangemang enligt patentkraven 1-3 omfattande att rapportönnolekylerna är fluoroforer, kvantprickar, guld nanopartiklar eller andra nanopartiklar.
5. Arrangemang enligt patentkraven 1-4 omfattande att flera olika igenkänningsmolekyler som kärmer igen flera olika analyter är bundna till alla cytoskeletala filament.
6. Arrangemang enligt patentkraven 1-5 omfattande att mer än en slags rapportörmolekyl är bunden i proportioner längs det cytoskeletala filamenten som är olika beroende på vilken analyt som känns igen av igenkänningsmolekylen på. samma cytoskeletala filament.
7. Arrangemang enligt patentlcraven l-6 omfattande att det cytoskeletala filamentet är ett alctinfilarnent.
8. Arrangemang enligt patentkraven 1-6 omfattande att det cytoskeletala filamentet är ett rnikrotubtrlus.
9. En metod omfattande arrangemanget enligt patentkrav l-3 och att detektion av aggregat i frånvaro av specifika rapportörmolekyler kan ske genom ändrad ljusspridning, precipitering av aggregaten (med eller utan centrifugering) eller genom direkt observation av aggregat med mikroskop.
10. En metod omfattande arrangemanget enligt något av patentkraven l-8 och att bindning av analyt leder till ändrade egenskaper hos rapportörrnolekylerna och/eller aggregering av de cytoskeletala filamenten, genom att igenkärmingsmolekyler från två olika filament binder analyten med resulterande tvärlänlming mellan filarnenterr.
11. ll. Metoden enligt krav 10 omfattande att bindning av analyt till igenkänningsmolekyler kan detekteras genom bildning av aggregat och/eller genom ändrade egenskaper hos rapportörmolekylema.
12. Metod enligt något av patentkraven 10-1 l omfattande att detektion av aggregaten kan ske genom detektion av rapportörrnolekyler som ackumulerats vid precipitation t ex efter centrifugering vid olika centripetalacceleration. 531 135 “ZS
13. Metod enligt patentkraven 10-12 omfattande att rapportörrnolekylerna rapporterar sin närvaro genom fluorescens eller enzymatisk bildning av en färgad produkt altemativt rapporteras hopklumpning av guldpartiklar genom fárgfórändring.
14. Metod enligt patentkraven 10-13 omfattande en miniatyrisering till mycket små volymer, dvs I pl och av att bildning av aggregat detekteras med hjälp av mikroskop.
15. Metod enligt krav 14, där milcroskopet är ett ljusfiilt; mörkfált, epifluoræcensmilcroskop, konfokalmilcoskop eller total intern reflektionsfluorescensmilcoskop.
16. Metod enligt något av patentkraven 10-15 omfattande att flera olika analyter kan aggregera de cytoskeletala filamenten.
17. Metod enligt något av patentkraven 10-16 omfattande att förekomsten av mer än en typ av analyt kan detekteras i ett prov genom förekomst av aggregat med olika proportioner av rapportönnolekyler.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE0602571A SE531135C2 (sv) | 2006-12-01 | 2006-12-01 | Känslig detektion av gifter, patogener och sjukdomsmarkörer genom aggregation av cytoskeletala filament |
| EP07852077.2A EP2092343B1 (en) | 2006-12-01 | 2007-11-30 | Detection conjugate |
| PCT/SE2007/001071 WO2008066463A1 (en) | 2006-12-01 | 2007-11-30 | Detection conjugate |
| US12/517,148 US8658381B2 (en) | 2006-12-01 | 2007-11-30 | Detection conjugate |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE0602571A SE531135C2 (sv) | 2006-12-01 | 2006-12-01 | Känslig detektion av gifter, patogener och sjukdomsmarkörer genom aggregation av cytoskeletala filament |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SE0602571L SE0602571L (sv) | 2008-06-02 |
| SE531135C2 true SE531135C2 (sv) | 2008-12-23 |
Family
ID=39468162
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SE0602571A SE531135C2 (sv) | 2006-12-01 | 2006-12-01 | Känslig detektion av gifter, patogener och sjukdomsmarkörer genom aggregation av cytoskeletala filament |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8658381B2 (sv) |
| EP (1) | EP2092343B1 (sv) |
| SE (1) | SE531135C2 (sv) |
| WO (1) | WO2008066463A1 (sv) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9909167B2 (en) | 2014-06-23 | 2018-03-06 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | On-slide staining by primer extension |
| JP7017554B2 (ja) | 2016-07-27 | 2022-02-08 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 高度に多重化された蛍光イメージング |
| US20190170737A1 (en) * | 2016-09-19 | 2019-06-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Systems including janus droplets |
| US20220163537A1 (en) * | 2019-03-26 | 2022-05-26 | Fast Bt Ug | Detection and Quantification of Molecular Species |
-
2006
- 2006-12-01 SE SE0602571A patent/SE531135C2/sv not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-11-30 EP EP07852077.2A patent/EP2092343B1/en not_active Not-in-force
- 2007-11-30 US US12/517,148 patent/US8658381B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-11-30 WO PCT/SE2007/001071 patent/WO2008066463A1/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2092343A4 (en) | 2010-06-02 |
| EP2092343B1 (en) | 2014-08-20 |
| US8658381B2 (en) | 2014-02-25 |
| US20100248212A1 (en) | 2010-09-30 |
| SE0602571L (sv) | 2008-06-02 |
| EP2092343A1 (en) | 2009-08-26 |
| WO2008066463A1 (en) | 2008-06-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7256860B2 (ja) | 改善されたアッセイ方法 | |
| US11709161B2 (en) | Assays for detecting analytes in samples and kits and compositions related thereto | |
| Min et al. | Advanced nanotechnologies for extracellular vesicle‐based liquid biopsy | |
| Herr et al. | Aptamer-conjugated nanoparticles for selective collection and detection of cancer cells | |
| Mariani et al. | Surface plasmon resonance applications in clinical analysis | |
| ES2901952T3 (es) | Métodos de ensayo mejorados | |
| Baptista et al. | Nanoparticles in molecular diagnostics | |
| JP2009540326A (ja) | 結合及び非結合ラベルの測定による検体検出の増加した特異性 | |
| US9795961B1 (en) | Devices, systems, and methods for detecting nucleic acids using sedimentation | |
| US20100035243A1 (en) | Ultra-sensitive detection of analytes | |
| Lucas et al. | Lab-on-a-chip immunoassay for multiple antibodies using microsphere light scattering and quantum dot emission | |
| EP2473595A1 (en) | Integrated sample preparation and analyte detection | |
| JP2008154493A (ja) | 分離精製方法とマイクロ流体回路 | |
| Zhang et al. | Surface-imprinted polymer coating l-cysteine-capped ZnS quantum dots for target protein specific recognition | |
| WO2007133704A2 (en) | A non-nucleic acid based biobarcode assay for detection of biological materials | |
| SE531135C2 (sv) | Känslig detektion av gifter, patogener och sjukdomsmarkörer genom aggregation av cytoskeletala filament | |
| Wang et al. | Sensitive fluorescence aptasensor based on hybridization chain reaction with upconversion nanoparticles by triplex DNA formation for bisphenol A detection | |
| Dutta et al. | Combining portable solar-powered centrifuge to nanoplasmonic sensing chip with smartphone reader for rheumatoid arthritis detection | |
| Madhu et al. | Peptide-modified carbon dot aggregates for ultrasensitive detection of lipopolysaccharide through aggregation-induced emission enhancement | |
| US20230167492A1 (en) | Molecular detection via assembly of particle complexes | |
| Krizkova et al. | Microchip Capillary Electrophoresis: Quantum Dots and Paramagnetic Particles for Bacteria Immunoseparation: Rapid Superparamagnetic-Beads-Based Automated Immunoseparation of Zn-Proteins from Staphylococcus aureus with Nanogram Yield | |
| Varshney et al. | Challenges in Biosensor Development--Detection limit, detection time, and specificity | |
| Solihin et al. | Conjugated Gold Nanosphere with scFv as Localized Plasmonic Biosensor for SARS-CoV-2 RBD Detection | |
| Ghalehno et al. | Nano aptasensors for detection of streptomycin: A review. | |
| Pallarès Rusiñol | Novel methods for the detection of exosomes as biomarkers for non-communicable diseases |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| NUG | Patent has lapsed |