ES2901952T3 - Métodos de ensayo mejorados - Google Patents

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John Kenten
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Abstract

Un método para detectar un analito de interés en una muestra que comprende: a. unir el analito a: (i) un reactivo de captura en una superficie, dicha superficie comprende el reactivo de captura del analito, en donde el reactivo de captura es un anticuerpo; (ii) un primer reactivo de detección del analito que se enlaza a una primera sonda de ácido nucleico; y (iii) un segundo reactivo de detección del analito que se enlaza a una segunda sonda de ácido nucleico, en donde el primer reactivo de detección y el segundo reactivo de detección son anticuerpos; para formar de esta manera un complejo en la superficie que comprende el reactivo de captura, el analito y el primer y segundo reactivos de detección, en donde la superficie también comprende un reactivo de anclaje que comprende una secuencia de oligonucleótido de anclaje; b. usar un proceso de extensión que requiere que la primera y segunda sondas de ácido nucleico estén próximas a una o dos secuencias conectoras que se hibridan con la primera y segunda sondas de ácido nucleico, ligar la una o dos secuencias conectoras para formar un molde circular, y extender la segunda sonda de ácido nucleico, mediante amplificación de círculo rodante del molde circular, para formar una secuencia extendida que comprende un complemento de la secuencia de anclaje que es complementario a la secuencia de oligonucleótido de anclaje; c. hibridar la secuencia de oligonucleótido de anclaje con el complemento de la secuencia de anclaje de la secuencia extendida; y d. medir la cantidad de secuencia extendida unida a la superficie.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos de ensayo mejorados
Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas
Se hace referencia a las solicitudes provisionales de los Estados Unidos con núms. de serie 61/779,050, presentada el 13 de marzo de 2013 y 61/919,887, presentada el 23 de diciembre de 2013.
Campo de la invención
La presente invención está dirigida a métodos mejorados para realizar inmunoensayos. Los métodos están diseñados para amplificar señales en inmunoensayos y anclar complejos de inmunoensayo empleados en los mismos.
Antecedentes de la invención
Se ha desarrollado un cuerpo sustancial de literatura sobre técnicas que emplean reacciones de unión, por ejemplo, reacciones antígeno-anticuerpo, hibridación de ácidos nucleicos y reacciones receptor-ligando, para la medición sensible de analitos de interés en muestras. El alto grado de especificidad en muchos sistemas de unión bioquímica ha dado lugar a muchos métodos de ensayo y sistemas de valor en una variedad de mercados que incluyen la investigación básica, el diagnóstico humano y veterinario, el monitoreo ambiental y pruebas industriales. La presencia de un analito de interés puede medirse mediante la medición directa de la participación del analito en una reacción de unión. En algunos enfoques, esta participación puede indicarse mediante la medición de una etiqueta observable unida a uno o más de los materiales de unión.
Aunque el formato de inmunoensayo tipo sándwich proporciona una sensibilidad y especificidad excelentes en muchas aplicaciones, algunos analitos están presentes en concentraciones que son demasiado bajas para su detección mediante técnicas de inmunoensayo convencionales. El rendimiento de los inmunoensayos tipo sándwich también puede estar limitado por la unión inespecífica de los anticuerpos de detección y por la inestabilidad de los complejos tipo sándwich que comprenden anticuerpos de alta velocidad de disociación. Sin embargo, los esfuerzos para modificar las técnicas de inmunoensayo convencionales para mejorar la sensibilidad y la especificidad a menudo producen protocolos más complejos y laboriosos que pueden verse obstaculizados por ineficiencias en cada etapa que pueden tener un gran impacto en la sensibilidad y especificidad de un ensayo. Por ejemplo, en un ensayo complejo que requiere múltiples eventos y/o reacciones de unión, si cualquier evento o reacción es menos que óptimo, la sensibilidad y especificidad del ensayo general pueden sufrir. Existe la necesidad de nuevas técnicas para mejorar el rendimiento del inmunoensayo tipo sándwich al mejorar la sensibilidad, reducir la unión inespecífica y mejorar la estabilidad de los complejos tipo sándwich.
Resumen de la invención
La presente invención contempla las siguientes modalidades específicas. Un experto en la técnica puede hacer varias modificaciones, adiciones y variaciones, a las modalidades descritas en la presente descripción sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención. Se pretende que tales modificaciones, adiciones y variaciones estén dentro del alcance de las reivindicaciones.
Modalidad (1): un método para detectar un analito de interés en una muestra que comprende: unir el analito a: (i) un reactivo de captura en una superficie que comprende el reactivo de captura del analito y un reactivo de anclaje; y (ii) un reactivo de detección del analito que se enlaza a una sonda de ácido nucleico; para formar de esta manera un complejo en la superficie que comprende el reactivo de captura, el analito y el reactivo de detección; extender la sonda para formar una secuencia extendida que comprende una región de anclaje que une el reactivo de anclaje; unir la secuencia extendida al reactivo de anclaje; y medir la cantidad de secuencia extendida unida a la superficie.
En la modalidad (1), el reactivo de captura puede ser un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero. En una modalidad específica, el reactivo de captura es un anticuerpo. El reactivo de detección puede ser un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero y, en una modalidad específica, el reactivo de detección es un anticuerpo. En un ejemplo específico de la modalidad (1), los reactivos de captura y detección son anticuerpos contra el analito. El reactivo de anclaje puede incluir una secuencia de oligonucleótido, aptámero, ligando de aptámero, anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, hapteno, epítopo o un mimotopo; y opcionalmente, la región de anclaje puede incluir un aptámero y el reactivo de anclaje puede incluir un ligando de aptámero. La región de anclaje puede comprender una secuencia de ácido nucleico y el reactivo de anclaje puede incluir una proteína de unión al ADN. El reactivo de anclaje puede incluir una secuencia de oligonucleótido y el reactivo de anclaje puede incluir una secuencia de oligonucleótido complementaria. La región de anclaje puede incluir una secuencia de oligonucleótido monocatenaria o una secuencia de oligonucleótido bicatenaria.
La etapa de unión de la modalidad (1) puede incluir además la formación de una triple hélice entre la región de anclaje y el reactivo de anclaje. El método puede comprender además desnaturalizar la región de anclaje para exponer una secuencia monocatenaria antes de la etapa de unión; exponer la región de anclaje a la actividad helicasa antes de la etapa de unión; y/o exponer la región de anclaje a un tratamiento con nucleasas antes de la etapa de unión. En esta modalidad, la región de anclaje puede comprender una o más bases modificadas con hapteno y el reactivo de anclaje puede incluir uno o más anticuerpos específicos para el hapteno; y/o la región de anclaje puede incluir una o más bases modificadas con ligando y el reactivo de anclaje puede incluir uno o más receptores específicos para el ligando. La secuencia extendida puede comprender además una o más secuencias de detección y la etapa de medición puede incluir poner en contacto la secuencia extendida con una pluralidad de sondas etiquetadas complementarias a la una o más secuencias de detección; la secuencia extendida puede incluir una o más bases modificadas y la etapa de medición puede incluir poner en contacto la secuencia extendida con una pluralidad de restos detectables que pueden unirse a la una o más bases modificadas; y/o la secuencia extendida puede comprender una o más bases etiquetadas y la etapa de medición puede incluir además detectar la presencia de la una o más bases etiquetadas. En esta modalidad, la una o más bases modificadas comprenden un aptámero, ligando de aptámero, anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, hapteno, epítopo o un mimotopo y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende una pareja de unión de la una o más bases modificadas y una etiqueta detectable. La una o más bases modificadas pueden comprender estreptavidina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende biotina y una etiqueta detectable; y/o la una o más bases modificadas pueden comprender biotina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende estreptavidina y una etiqueta detectable; y/o la una o más bases modificadas pueden comprender avidina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende biotina y una etiqueta detectable; y/o la una o más bases modificadas pueden comprender biotina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende avidina y una etiqueta detectable.
La primera etapa de la modalidad (1) puede comprender unir el analito a las siguientes especies en el siguiente orden: (i) el reactivo de captura en una superficie; y (ii) el reactivo de detección del analito; o la primera etapa de la modalidad (1) puede comprender unir el analito a las siguientes especies en el siguiente orden: (i) el reactivo de detección del analito; y (ii) el reactivo de captura en la superficie; y/o la primera etapa puede comprender unir el analito a las siguientes especies de forma simultánea o sustancialmente simultánea: (i) el reactivo de captura en una superficie; y (ii) el reactivo de detección del analito.
La etapa de extensión de la modalidad (1) puede comprender unir la sonda a una secuencia de ácido nucleico molde y extender la sonda mediante reacción en cadena de la polimerasa; y/o unir la sonda a una secuencia de ácido nucleico molde, formar un molde de ácido nucleico circular y extender el molde circular mediante amplificación de círculo rodante. En esta modalidad, la sonda extendida puede permanecer localizada en la superficie después de la extensión de la sonda. Por lo tanto, el complejo puede permanecer unido a la superficie después de la etapa de extensión, por ejemplo, la sonda extendida se une al reactivo de anclaje en una posición dentro de 10-100 um de la ubicación del complejo en la superficie.
La etapa de extensión de la modalidad (1) puede comprender PCR (reacción en cadena de la polimerasa), LCR (reacción en cadena de la ligasa), SDA (amplificación por desplazamiento de hebra), 3SR (reacción de síntesis autosostenida) o métodos de amplificación isotérmica. En una modalidad, la etapa de extensión puede incluir métodos de amplificación isotérmica, por ejemplo, amplificación dependiente de helicasa o amplificación de círculo rodante (RCA).
La superficie a la que se hace referencia en la modalidad (1) puede comprender una partícula y/o un pocillo de una placa de múltiples pocillos. La superficie puede comprender una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en dos dominios de unión distintos en la superficie. Si la superficie es un pocillo de una placa, el pocillo puede comprender una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en dos dominios de unión distintos dentro del pocillo; y/o la superficie puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en el mismo dominio de unión en la superficie. En una modalidad, el pocillo puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en el mismo dominio de unión dentro del pocillo. El reactivo de captura y el reactivo de anclaje pueden estar dentro de 10-100 nm en la superficie. La superficie puede incluir un electrodo y la etapa de medición puede incluir además aplicar una forma de onda de tensión al electrodo para generar una señal de electroquimioluminiscencia y, opcionalmente, el método incluye recolectar la partícula en un electrodo y aplicar una forma de onda de tensión al electrodo para generar una señal de electroquimioluminiscencia.
La etapa de medición de la modalidad (1) puede comprender además unir la secuencia extendida a una sonda de detección que tiene una etiqueta detectable, medir la etiqueta detectable y correlacionar la medición con la cantidad de analito en la muestra, en donde la sonda de detección comprende una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una región de la secuencia extendida. La etiqueta detectable puede medirse mediante una medición de dispersión de luz, absorbancia óptica, fluorescencia, quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, bioluminiscencia, fosforescencia, radioactividad, campo magnético o sus combinaciones. En un ejemplo particular de la modalidad (1), la etiqueta detectable es una etiqueta de ECL y la etapa de medición puede incluir medir una señal de ECL.
Modalidad (2): un kit para la detección de un analito de interés en una muestra que comprende, en uno o más viales, contenedores o compartimentos: (a) una superficie que comprende (i) un reactivo de captura del analito y (ii) un reactivo de anclaje; y (b) un reactivo de detección del analito que se enlaza a una sonda de ácido nucleico.
El reactivo de anclaje de la modalidad (2) puede comprender una secuencia de oligonucleótido, aptámero, ligando de aptámero, anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, hapteno, epítopo o un mimotopo, y el reactivo de captura puede comprender un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o aptámero. En una modalidad particular, el reactivo de captura puede incluir un anticuerpo y/o el reactivo de detección puede incluir un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o aptámero. En una modalidad específica del kit, el reactivo de detección es un anticuerpo.
La superficie del kit de la modalidad (2) puede incluir una partícula y/o un pocillo de una placa de múltiples pocillos. La superficie puede comprender una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en dos dominios de unión distintos en la superficie. Si la superficie del kit es un pocillo de una placa, la superficie puede comprender una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en dos dominios de unión distintos dentro del pocillo; y/o la superficie puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en el mismo dominio de unión en la superficie. En un ejemplo particular del kit, la superficie es un pocillo y el pocillo puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en el mismo dominio de unión dentro del pocillo. El reactivo de captura y el reactivo de anclaje pueden estar dentro de 10-100 nm en la superficie. Por otra parte, la superficie del kit puede comprender un electrodo.
Modalidad (3): un método para detectar un analito de interés en una muestra que comprende: (a) unir el analito a: (i) un reactivo de captura en una superficie que comprende el reactivo de captura del analito y un reactivo de anclaje que comprende una secuencia de oligonucleótido de anclaje; y (ii) un reactivo de detección del analito que se enlaza a una sonda de ácido nucleico; para formar de esta manera un complejo en la superficie que comprende el reactivo de captura, el analito y el reactivo de detección; (b) extender la sonda para formar una secuencia extendida que comprende un complemento de la secuencia de anclaje que es complementario a la secuencia de anclaje; (c) hibridar la secuencia de anclaje con el complemento de la secuencia de anclaje; y (d) medir la cantidad de secuencia extendida unida a la superficie.
En la modalidad (3), el reactivo de captura puede ser un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero y, en un ejemplo particular, el reactivo de captura es un anticuerpo. Igualmente, el reactivo de detección es un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, y en un ejemplo particular de la modalidad (3), el reactivo de detección es un anticuerpo. En un ejemplo de la modalidad (3), los reactivos de captura y detección son anticuerpos contra el analito. La secuencia de oligonucleótido de anclaje puede comprender una secuencia de oligonucleótido monocatenaria o una secuencia de oligonucleótido bicatenaria. La secuencia extendida puede comprender además una o más secuencias de detección y la etapa de medición puede incluir además poner en contacto la secuencia extendida con una pluralidad de sondas etiquetadas complementarias a la una o más secuencias de detección; alternativamente o adicionalmente, la secuencia extendida puede incluir además una o más bases modificadas y la etapa de medición puede incluir además poner en contacto la secuencia extendida con una pluralidad de restos detectables que pueden unirse a la una o más bases modificadas. En un ejemplo particular, la secuencia extendida puede incluir además una o más bases etiquetadas y la etapa de medición puede incluir además detectar la presencia de la una o más bases etiquetadas. La una o más bases modificadas comprenden un aptámero, ligando de aptámero, anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, hapteno, epítopo o un mimotopo y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende una pareja de unión de la una o más bases modificadas y una etiqueta detectable. La una o más bases modificadas pueden comprender estreptavidina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende biotina y una etiqueta detectable; la una o más bases modificadas comprenden biotina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende estreptavidina y una etiqueta detectable; la una o más bases modificadas comprenden avidina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende biotina y una etiqueta detectable; y/o la una o más bases modificadas comprenden biotina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende avidina y una etiqueta detectable.
La etapa (a) de la modalidad (3) puede incluir unir el analito a las siguientes especies en el siguiente orden: (i) el reactivo de captura en una superficie; y (ii) el reactivo de detección del analito. Alternativamente, la etapa (a) puede incluir unir el analito a las siguientes especies en el siguiente orden: (i) el reactivo de detección del analito; y (ii) el reactivo de captura en la superficie. En otro ejemplo más, la etapa (a) puede incluir unir el analito a las siguientes especies de forma simultánea o sustancialmente simultánea: (i) el reactivo de captura en una superficie; y (ii) el reactivo de detección del analito.
La etapa de extensión de la modalidad (3) puede incluir unir la sonda a una secuencia de ácido nucleico molde y extender la sonda mediante reacción en cadena de la polimerasa. Alternativamente, la etapa de extensión puede incluir unir la sonda a una secuencia de ácido nucleico molde, formar un molde de ácido nucleico circular y extender el molde circular mediante amplificación de círculo rodante. La sonda extendida puede permanecer localizada en la superficie después de la extensión de la sonda, por ejemplo, el complejo permanece unido a la superficie después de la etapa de extensión. En un ejemplo, la sonda extendida se une al reactivo de anclaje en una posición dentro de 10 100 um de la ubicación del complejo en la superficie. En esta modalidad particular, la etapa de extensión puede incluir PCR (reacción en cadena de la polimerasa), LCR (reacción en cadena de la ligasa), SDA (amplificación por desplazamiento de hebra), 3SR (reacción de síntesis autosostenida) o métodos de amplificación isotérmica. Por ejemplo, la etapa de extensión puede incluir métodos de amplificación isotérmica, por ejemplo, amplificación dependiente de helicasa o amplificación de círculo rodante (RCA).
La superficie de la modalidad (3) puede comprender una partícula y/o un pocillo de una placa de múltiples pocillos. La superficie puede comprender una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en dos dominios de unión distintos en la superficie. Si la superficie es un pocillo de una placa, este puede comprender una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en dos dominios de unión distintos dentro del pocillo. La superficie puede comprender una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en el mismo dominio de unión en la superficie. Si la superficie es un pocillo, este puede comprender una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en el mismo dominio de unión dentro del pocillo. El reactivo de captura y el reactivo de anclaje pueden estar dentro de 10-100 nm en la superficie. En un ejemplo particular, la superficie puede incluir un electrodo y la etapa de medición puede incluir además aplicar una forma de onda de tensión al electrodo para generar una señal de electroquimioluminiscencia. El método puede incluir además recolectar la partícula en un electrodo y aplicar una forma de onda de tensión al electrodo para generar una señal de electroquimioluminiscencia. La etapa de medición puede comprender además unir la secuencia extendida a una sonda de detección que tiene una etiqueta detectable, medir la etiqueta detectable y correlacionar la medición con la cantidad de analito en la muestra, en donde la sonda de detección comprende una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una región de la secuencia extendida. En esta modalidad, la etiqueta detectable se mide mediante una medición de dispersión de luz, absorbancia óptica, fluorescencia, quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, bioluminiscencia, fosforescencia, radioactividad, campo magnético o sus combinaciones. Por ejemplo, la etiqueta detectable es una etiqueta de ECL y la etapa de medición puede incluir medir una señal de ECL.
Modalidad (4): un kit para la detección de un analito de interés en una muestra que comprende, en uno o más viales, contenedores o compartimentos: (a) una superficie que comprende (i) un reactivo de captura del analito y (ii) un reactivo de anclaje que comprende una secuencia de oligonucleótido de anclaje; y (b) un reactivo de detección del analito que se enlaza a una sonda de ácido nucleico.
El kit de la modalidad (4) incluye un reactivo de captura que comprende un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o aptámero. En un ejemplo específico, el reactivo de captura puede incluir un anticuerpo. Igualmente, el reactivo de captura puede incluir un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o aptámero y, particularmente, el reactivo de detección puede incluir un anticuerpo.
El kit de la modalidad (4) incluye una superficie que puede comprender una partícula y/o un pocillo de una placa de múltiples pocillos. La superficie puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en dos dominios de unión distintos en la superficie. Si la superficie es un pocillo, el pocillo puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en dos dominios de unión distintos dentro del pocillo. La superficie puede comprender una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en el mismo dominio de unión en la superficie, por ejemplo, si la superficie es un pocillo, el pocillo puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en el mismo dominio de unión dentro del pocillo. Por ejemplo, el reactivo de captura y el reactivo de anclaje están dentro de 10-100 nm en la superficie. La superficie de la modalidad (4) puede incluir un electrodo.
Modalidad (5): un método para detectar un analito de interés en una muestra que comprende: (a) unir el analito a: (i) un reactivo de captura en una superficie que comprende el reactivo de captura del analito y un reactivo de anclaje que comprende una secuencia de oligonucleótido de anclaje; (ii) un primer reactivo de detección del analito que se enlaza a una primera sonda de ácido nucleico; y (iii) un segundo reactivo de detección del analito que se enlaza a una segunda sonda de ácido nucleico; para formar de esta manera un complejo en la superficie que comprende el reactivo de unión, el analito y el primer y segundo reactivos de detección; (b) usar un proceso de extensión que requiere que la primera y segunda sondas estén próximas, extender la segunda sonda para formar una secuencia extendida que comprende un complemento de la secuencia de anclaje que es complementario a la secuencia de anclaje; (c) hibridar la secuencia de anclaje con el complemento de la secuencia de anclaje; y (d) medir la cantidad de secuencia extendida unida a la superficie.
El reactivo de captura de la modalidad (5) puede ser un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero. En un ejemplo específico, el reactivo de captura es un anticuerpo. Igualmente, el primer reactivo de detección es un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, y en un ejemplo particular el primer reactivo de detección es un anticuerpo. El segundo reactivo de detección puede ser un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, y en un ejemplo particular el segundo reactivo de detección es un anticuerpo. Más particularmente, el reactivo de captura y el primer y segundo reactivos de detección son anticuerpos contra el analito.
En la modalidad (5), la secuencia de oligonucleótido de anclaje puede incluir una secuencia de oligonucleótido monocatenaria o una secuencia de oligonucleótido bicatenaria. En esta modalidad, la secuencia extendida puede incluir además una o más secuencias de detección y la etapa de medición puede incluir además poner en contacto la secuencia extendida con una pluralidad de sondas etiquetadas complementarias a la una o más secuencias de detección. La secuencia extendida también puede incluir una o más bases modificadas y la etapa de medición puede incluir además poner en contacto la secuencia extendida con una pluralidad de restos detectables que pueden unirse a la una o más bases modificadas. La secuencia extendida puede comprender además una o más bases etiquetadas y la etapa de medición puede incluir además detectar la presencia de la una o más bases etiquetadas. La una o más bases modificadas pueden comprender un aptámero, ligando de aptámero, anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, hapteno, epítopo o un mimotopo y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende una pareja de unión de la una o más bases modificadas y una etiqueta detectable. Por ejemplo, la una o más bases modificadas comprenden estreptavidina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende biotina y una etiqueta detectable; la una o más bases modificadas comprenden biotina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende estreptavidina y una etiqueta detectable; la una o más bases modificadas comprenden avidina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende biotina y una etiqueta detectable; y/o la una o más bases modificadas comprenden biotina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende avidina y una etiqueta detectable.
La etapa (a) de la modalidad (5) puede incluir unir el analito a las siguientes especies en el siguiente orden: (i) el reactivo de captura en una superficie; y (ii) el reactivo de detección del analito. Alternativamente, la etapa (a) puede incluir unir el analito a las siguientes especies en el siguiente orden: (i) el reactivo de detección del analito; y (ii) el reactivo de captura en la superficie; o la etapa (a) puede incluir unir el analito a las siguientes especies de forma simultánea o sustancialmente simultánea: (i) el reactivo de captura en una superficie; y (ii) el reactivo de detección del analito.
La etapa de extensión de la modalidad (5) puede incluir unir la sonda a una secuencia de ácido nucleico molde y extender la sonda mediante reacción en cadena de la polimerasa. La etapa de extensión puede incluir además unir la sonda a una secuencia de ácido nucleico molde, formar un molde de ácido nucleico circular y extender el molde circular mediante amplificación de círculo rodante. La sonda extendida puede permanecer localizada en la superficie después de la extensión de la sonda, por ejemplo, el complejo permanece unido a la superficie después de la etapa de extensión. La sonda extendida puede unirse une al reactivo de anclaje en una posición dentro de 10-100 um de la ubicación del complejo en la superficie. La etapa de extensión puede incluir PCR (reacción en cadena de la polimerasa), LCR (reacción en cadena de la ligasa), SDA (amplificación por desplazamiento de hebra), 3SR (reacción de síntesis autosostenida) o métodos de amplificación isotérmica. En un ejemplo particular, la etapa de extensión puede incluir métodos de amplificación isotérmica, por ejemplo, es la amplificación dependiente de helicasa o amplificación de círculo rodante (RCA).
El proceso de extensión de la modalidad (5) puede incluir poner en contacto el complejo formado en la etapa (a) con una secuencia conectora que comprende (i) una secuencia interior complementaria a la segunda sonda y (ii) dos secuencias de extremo complementarias a regiones no superpuestas de la primera sonda. El método puede incluir además ligar las dos secuencias de extremo del oligonucleótido conector para formar una secuencia diana circular que se hibrida tanto con la primera como con la segunda sonda. Alternativamente, el proceso de extensión puede incluir poner en contacto el complejo formado en la etapa (a) de la modalidad (5) con una primera secuencia de oligonucleótido conector que incluye una primera secuencia de sonda de conector complementaria a una primera región de la primera sonda y una primera región de la segunda sonda, y un segundo oligonucleótido conector que comprende una segunda secuencia de sonda complementaria a una segunda región no superpuesta de la primera sonda y una segunda región no superpuesta de la segunda sonda; y, opcionalmente, ligar el primer y segundo oligonucleótidos conectores para formar una secuencia diana circular que se hibrida tanto con la primera como con la segunda sonda.
La superficie de la modalidad (5) puede incluir una partícula y/o un pocillo de una placa de múltiples pocillos. La superficie puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en dos dominios de unión distintos en la superficie. Si la superficie es un pocillo de una placa, el pocillo puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en dos dominios de unión distintos dentro del pocillo. La superficie también puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en el mismo dominio de unión en la superficie. Si la superficie es un pocillo de una placa, el pocillo puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en el mismo dominio de unión dentro del pocillo. El reactivo de captura y el reactivo de anclaje pueden estar dentro de 10-100 nm en la superficie. En un ejemplo específico, la superficie puede incluir un electrodo y la etapa de medición puede incluir además aplicar una forma de onda de tensión al electrodo para generar una señal de electroquimioluminiscencia y, opcionalmente, el método de la modalidad (5) incluye además recolectar la partícula en un electrodo y aplicar una forma de onda de tensión al electrodo para generar una señal de electroquimioluminiscencia.
La etapa de medición de la modalidad (5) puede incluir además unir la secuencia extendida a una sonda de detección que tiene una etiqueta detectable, medir la etiqueta detectable y correlacionar la medición con la cantidad de analito en la muestra, en donde la sonda de detección comprende una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una región de la secuencia extendida. La etiqueta detectable puede medirse mediante una medición de dispersión de luz, absorbancia óptica, fluorescencia, quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, bioluminiscencia, fosforescencia, radioactividad, campo magnético o sus combinaciones. En un ejemplo particular, la etiqueta detectable es una etiqueta de ECL y la etapa de medición puede incluir medir una señal de ECL.
Modalidad (6): un kit para la detección de un analito de interés en una muestra que comprende, en uno o más viales, contenedores o compartimentos: (a) una superficie que comprende (i) un reactivo de captura del analito y (ii) un reactivo de anclaje que comprende una secuencia de oligonucleótido de anclaje; (b) un primer reactivo de detección del analito que se enlaza a una primera sonda de ácido nucleico; y (c) un segundo reactivo de detección del analito que se enlaza a una segunda sonda de ácido nucleico.
El reactivo de captura de la modalidad (6) puede incluir un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o aptámero y, en un ejemplo específico el reactivo de captura puede incluir un anticuerpo. Igualmente, el primer reactivo de detección puede incluir un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o aptámero y, en un ejemplo específico, el primer reactivo de detección puede incluir un anticuerpo. De manera similar, el segundo reactivo de detección puede incluir un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o aptámero y, en un ejemplo específico, el segundo reactivo de detección puede incluir un anticuerpo.
La superficie de la modalidad (6) puede comprender una partícula y/o un pocillo de una placa de múltiples pocillos. La superficie puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en dos dominios de unión distintos en la superficie. Si la superficie es un pocillo, el pocillo puede comprender una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en dos dominios de unión distintos dentro del pocillo. La superficie puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en el mismo dominio de unión en la superficie, y/o si la superficie es un pocillo, el pocillo puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en el mismo dominio de unión dentro del pocillo. El reactivo de captura y el reactivo de anclaje pueden estar dentro de 10-100 nm en la superficie. En un ejemplo específico, la superficie puede incluir un electrodo.
Modalidad (7): un método para detectar un analito de interés en una muestra que comprende: (a) unir el analito a: (i) un reactivo de captura del analito en una superficie que comprende el reactivo de captura y un reactivo de anclaje; (ii) un primer reactivo de detección del analito que comprende una primera sonda de proximidad, y (iii) un segundo reactivo de detección del analito que comprende una segunda sonda de proximidad; para formar de esta manera un complejo de detección en la superficie que comprende el reactivo de captura, el analito y el primer y segundo reactivos de detección; (b) poner en contacto el complejo de detección formado en (c) con una secuencia conectora que comprende (i) una secuencia interior complementaria a la segunda sonda de proximidad y (ii) dos secuencias de extremo complementarias a regiones no superpuestas de la primera sonda de proximidad; (c) hibridar la secuencia conectora con la primera y segunda sondas de proximidad; (d) ligar las dos secuencias de extremo del oligonucleótido conector para formar una secuencia diana circular que se hibrida tanto con la primera como con la segunda sonda de proximidad; (e) extender la segunda sonda de proximidad mediante amplificación de círculo rodante de la secuencia diana para generar un amplicón que comprende un dominio de unión que se une al reactivo de anclaje; (f) unir el amplicón al reactivo de anclaje; y (g) medir la cantidad de amplicón en la superficie.
Modalidad (8): un método para detectar un analito de interés en una muestra que comprende: (a) unir el analito a: (i) un reactivo de captura del analito en una superficie que comprende el reactivo de captura y un reactivo de anclaje; (ii) un primer reactivo de detección del analito que comprende una primera sonda de proximidad, y (iii) un segundo reactivo de detección del analito que comprende una segunda sonda de proximidad; para formar de esta manera un complejo de detección en la superficie que comprende el reactivo de captura, el analito y el primer y segundo reactivos de detección; (b) poner en contacto el complejo de detección formado en (c) con un primer oligonucleótido conector y un segundo oligonucleótido conector, en donde (i) el primer extremo del primer conector y el primer extremo del segundo conector son complementarios a dos regiones que no superpuestas de la primera sonda de proximidad y (ii) un segundo extremo del primer conector y un segundo extremo del segundo conector son complementarios a dos regiones no superpuestas de la primera sonda de proximidad; (c) hibridar la primera y segunda secuencias de oligonucleótidos conectores con la primera y segunda sondas de proximidad; (d) ligar la primera y segunda secuencias de oligonucleótidos conectores para formar una secuencia diana circular que se hibrida tanto con la primera como con la segunda sonda de proximidad; (e) extender la segunda sonda de proximidad mediante amplificación de círculo rodante de la secuencia diana para generar un amplicón que comprende un dominio de unión que se une al reactivo de anclaje; (f) unir el amplicón al reactivo de anclaje; y (g) medir la cantidad de amplicón en la superficie.
El reactivo de captura de las modalidades (7) y (8) puede ser un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero y, en un ejemplo específico, el reactivo de captura es un anticuerpo. De manera similar, el primer reactivo de detección puede ser un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, por ejemplo, el primer reactivo de detección es un anticuerpo. Además, el segundo reactivo de detección es un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, por ejemplo, el segundo reactivo de detección es un anticuerpo. En un ejemplo específico de las modalidades (7) y (8), el reactivo de captura y el primer y segundo reactivos de detección son anticuerpos contra el analito.
El reactivo de anclaje de las modalidades (7) y (8) puede incluir una secuencia de oligonucleótido, aptámero, ligando de aptámero, anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, hapteno, epítopo o un mimotopo. En un ejemplo, el dominio de unión puede incluir un aptámero y el reactivo de anclaje puede incluir un ligando de aptámero. El dominio de unión puede incluir una secuencia de ácido nucleico y el reactivo de anclaje puede incluir una proteína de unión a ADN; y/o el reactivo de anclaje puede incluir una secuencia de oligonucleótido y el amplicón puede incluir una secuencia de oligonucleótido complementaria.
El amplicón de las modalidades (7) y (8) puede comprender además una o más secuencias de detección y la etapa de medición puede comprender además poner en contacto la secuencia extendida con una pluralidad de sondas etiquetadas complementarias a la una o más secuencias de detección. Por otra parte, el amplicón puede comprender además una o más bases modificadas y la etapa de medición puede incluir además poner en contacto la secuencia extendida con una pluralidad de restos detectables que pueden unirse a la una o más bases modificadas. Aún más, el amplicón puede incluir además una o más bases etiquetadas y la etapa de medición puede incluir además detectar la presencia de la una o más bases etiquetadas. La una o más bases modificadas pueden comprender un aptámero, ligando de aptámero, anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, hapteno, epítopo o un mimotopo y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende una pareja de unión de la una o más bases modificadas y una etiqueta detectable. La una o más bases modificadas pueden comprender estreptavidina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende biotina y una etiqueta detectable; la una o más bases modificadas pueden comprender biotina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende estreptavidina y una etiqueta detectable; la una o más bases modificadas pueden comprender avidina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende biotina y una etiqueta detectable; y/o la una o más bases modificadas pueden comprender biotina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende avidina y una etiqueta detectable.
La etapa (a) de las modalidades (7) y (8) puede comprender unir el analito a las siguientes especies en el siguiente orden: (i) el reactivo de captura en una superficie; y (ii) el primer y segundo reactivos de detección del analito. Alternativamente, la etapa (a) puede incluir unir el analito a las siguientes especies en el siguiente orden: (i) el primer y segundo reactivos de detección del analito; y (ii) el reactivo de captura en la superficie. Aún más, la etapa (a) puede incluir unir el analito a las siguientes especies de forma simultánea o sustancialmente simultánea: (i) el reactivo de captura en una superficie; y (ii) el primer y segundo reactivos de detección del analito.
El amplicón de las modalidades (7) y (8) puede permanecer localizado en la superficie después de la extensión de la sonda. El complejo puede permanecer unido a la superficie después de la etapa de extensión. Por ejemplo, el amplicón se une al reactivo de anclaje en una posición dentro de 10-100 um de la ubicación del complejo en la superficie.
La superficie de las modalidades (7) y (8) puede incluir una partícula y/o un pocillo de una placa de múltiples pocillos. La superficie puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en dos dominios de unión distintos en la superficie. Si la superficie es un pocillo de una placa, el pocillo puede comprender una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en dos dominios de unión distintos dentro del pocillo. La superficie puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en el mismo dominio de unión en la superficie. Si la superficie es un pocillo de una placa, el pocillo puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en el mismo dominio de unión dentro del pocillo. En un ejemplo específico, el reactivo de captura y el reactivo de anclaje están dentro de 10-100 nm en la superficie.
Aún más, la superficie puede incluir un electrodo y la etapa de medición puede incluir aplicar una forma de onda de tensión al electrodo para generar una señal de electroquimioluminiscencia. En estas modalidades ((7) y (8)), el método puede incluir además colectar la partícula en un electrodo y aplicar una forma de onda de tensión al electrodo para generar una señal de electroquimioluminiscencia. La etapa de medición puede incluir unir el amplicón a una sonda de detección que tiene una etiqueta detectable, medir la etiqueta detectable y correlacionar la medición con la cantidad de analito en la muestra, en donde la sonda de detección comprende una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una región del amplicón. La etiqueta detectable se mide mediante una medición de dispersión de luz, absorbancia óptica, fluorescencia, quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, bioluminiscencia, fosforescencia, radioactividad, campo magnético o sus combinaciones. Por ejemplo, la etiqueta detectable es una etiqueta de ECL y la etapa de medición puede incluir medir una señal de ECL.
Modalidad (9): un kit para la detección de un analito de interés en una muestra que comprende, en uno o más viales, contenedores o compartimentos: (a) una superficie que comprende (i) un reactivo de captura del analito y (ii) un reactivo de anclaje; (b) un primer reactivo de detección del analito que comprende una primera sonda de proximidad; (c) un segundo reactivo de detección del analito que comprende una segunda sonda de proximidad; y (d) una secuencia conectora que comprende (i) una secuencia interior complementaria a la segunda sonda de proximidad y (ii) dos secuencias de extremo complementarias a regiones no superpuestas de la primera sonda de proximidad.
Modalidad (10): un kit para la detección de un analito de interés en una muestra que comprende, en uno o más viales, contenedores o compartimentos: (a) una superficie que comprende (i) un reactivo de captura del analito, y (ii) un reactivo de anclaje; y (b) un primer reactivo de detección del analito que comprende una primera sonda de proximidad; (c) un segundo reactivo de detección del analito que comprende una segunda sonda de proximidad; y (d) (i) un primer oligonucleótido conector y (ii) un segundo oligonucleótido conector, en donde (x) un primer extremo del primer conector y un primer extremo del segundo conector son complementarios a dos regiones no superpuestas de la primera sonda de proximidad y (y) un segundo extremo del primer conector y un segundo extremo del segundo conector son complementarios a dos regiones no superpuestas de la primera sonda de proximidad.
El reactivo de captura de las modalidades (9) y (10) puede incluir un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o aptámero. En un ejemplo específico, el reactivo de captura puede incluir un anticuerpo. El primer reactivo de detección puede incluir un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o aptámero y, en un ejemplo específico, el primer reactivo de detección puede incluir un anticuerpo. El segundo reactivo de detección puede incluir un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o aptámero y, en un ejemplo específico, el segundo reactivo de detección puede incluir un anticuerpo.
La superficie de las modalidades (9) y (10) puede incluir una partícula y/o un pocillo de una placa de múltiples pocillos. La superficie puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en dos dominios de unión distintos en la superficie. Si la superficie es un pocillo de una placa, el pocillo puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en dos dominios de unión distintos dentro del pocillo. La superficie puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en el mismo dominio de unión en la superficie. Si la superficie es un pocillo, el pocillo puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en el mismo dominio de unión dentro del pocillo. En un ejemplo específico, el reactivo de captura y el reactivo de anclaje están dentro de 10-100 nm en la superficie.
La superficie de las modalidades (9) y (10) puede incluir un electrodo.
Modalidad (11): un método para detectar un analito de interés en una muestra que comprende: (a) unir el analito a: (i) un reactivo de captura del analito en una superficie que comprende el reactivo de captura y un reactivo de anclaje que comprende una secuencia de oligonucleótido de anclaje; (ii) un primer reactivo de detección del analito que comprende una primera sonda de proximidad, y (iii) un segundo reactivo de detección del analito que comprende una segunda sonda de proximidad; para formar de esta manera un complejo de detección en la superficie que comprende el reactivo de captura, el analito y el primer y segundo reactivos de detección; (b) poner en contacto el complejo de detección formado en (c) con una secuencia conectora que comprende (i) una secuencia interior complementaria a la segunda sonda de proximidad, (ii) dos secuencias de extremo complementarias a regiones no superpuestas de la primera sonda de proximidad y (iii) una secuencia que se aparea con la secuencia de anclaje; (c) hibridar la secuencia conectora con la primera y segunda sondas de proximidad; (d) ligar las dos secuencias de extremo del oligonucleótido conector para formar una secuencia diana circular que se hibrida tanto con la primera como con la segunda sonda de proximidad; (e) extender la segunda sonda de proximidad mediante amplificación de círculo rodante de la secuencia diana para generar un amplicón que comprende una pluralidad de complementos de secuencias de anclaje que son complementarios a la secuencia de anclaje; (f) hibridar la secuencia de anclaje con uno de los complementos de secuencia de anclaje; y (g) medir la cantidad de amplicón en la superficie.
Modalidad (12): un método para detectar un analito de interés en una muestra que comprende: (a) unir el analito a: (i) un reactivo de captura del analito en una superficie que comprende el reactivo de captura y un reactivo de anclaje que comprende una secuencia de oligonucleótido de anclaje; (ii) un primer reactivo de detección del analito que comprende una primera sonda de proximidad, y (iii) un segundo reactivo de detección del analito que comprende una segunda sonda de proximidad; para formar de esta manera un complejo de detección en la superficie que comprende el reactivo de captura, el analito y el primer y segundo reactivos de detección; (b) poner en contacto el complejo de detección formado en (a) con un primer oligonucleótido conector y un segundo oligonucleótido conector, en donde (i) un primer extremo del primer conector y un primer extremo del segundo conector son complementarios a dos regiones no superpuestas de la primera sonda de proximidad, (ii) un segundo extremo del primer conector y un segundo extremo del segundo conector son complementarios a dos regiones no superpuestas de la primera sonda de proximidad y (iii) el primer y/o segundo conector también comprenden una secuencia que se aparea con la secuencia de anclaje; (c) hibridar el primer y segundo oligonucleótidos conectores con la primera y segunda sondas de proximidad; (d) ligar el primer y segundo oligonucleótidos conectores para formar una secuencia diana circular que se hibrida tanto con la primera como con la segunda sonda de proximidad; (e) extender la segunda sonda de proximidad mediante amplificación de círculo rodante de la secuencia diana para generar un amplicón que comprende una pluralidad de complementos de secuencias de anclaje que son complementarios a la secuencia de anclaje; (f) hibridar la secuencia de anclaje con uno de los complementos de secuencia de anclaje; y (g) medir la cantidad de amplicón en la superficie.
El reactivo de captura de las modalidades (11) y (12) es un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero. En un ejemplo específico, el reactivo de captura es un anticuerpo. El primer reactivo de detección es un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero y, en un ejemplo específico, el primer reactivo de detección es un anticuerpo. Igualmente, el segundo reactivo de detección es un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero y, en un ejemplo específico, el segundo reactivo de detección es un anticuerpo. En un ejemplo, el primer y segundo reactivos de detección son anticuerpos contra el analito.
El amplicón de las modalidades (11) y (12) puede comprender además una o más secuencias de detección y la etapa de medición puede incluir poner en contacto la secuencia extendida con una pluralidad de sondas etiquetadas complementarias a la una o más secuencias de detección. Por otra parte, el amplicón también puede comprender una o más bases modificadas y la etapa de medición puede incluir poner en contacto la secuencia extendida con una pluralidad de restos detectables que pueden unirse a la una o más bases modificadas. El amplicón incluye adicionalmente una o más bases etiquetadas y la etapa de medición puede incluir detectar la presencia de la una o más bases etiquetadas. La una o más bases modificadas comprenden un aptámero, ligando de aptámero, anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, hapteno, epítopo o un mimotopo y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende una pareja de unión de la una o más bases modificadas y una etiqueta detectable. La una o más bases modificadas pueden comprender estreptavidina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende biotina y una etiqueta detectable; la una o más bases modificadas pueden comprender biotina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende estreptavidina y una etiqueta detectable; la una o más bases modificadas pueden comprender avidina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende biotina y una etiqueta detectable; y/o la una o más bases modificadas pueden incluir biotina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende avidina y una etiqueta detectable.
La etapa (a) de las modalidades (11) y (12) puede comprender unir el analito a las siguientes especies en el siguiente orden: (i) el reactivo de captura en una superficie; y (ii) el primer y segundo reactivos de detección del analito. Alternativamente, la etapa (a) puede incluir unir el analito a las siguientes especies en el siguiente orden: (i) el primer y segundo reactivos de detección del analito; y (ii) el reactivo de captura en la superficie. Aún más, la etapa (a) puede incluir unir el analito a las siguientes especies de forma simultánea o sustancialmente simultánea: (i) el reactivo de captura en una superficie; y (ii) el primer y segundo reactivos de detección del analito.
El amplicón en las modalidades (11) y (12) puede permanecer localizado en la superficie después de la extensión de la sonda y, opcionalmente, el complejo permanece unido a la superficie después de la etapa de extensión. Por ejemplo, el amplicón se une al reactivo de anclaje en una posición dentro de 10-100 um de la ubicación del complejo en la superficie.
La superficie de las modalidades (11) y (12) puede incluir una partícula y/o un pocillo de una placa de múltiples pocillos. Opcionalmente, la superficie puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en dos dominios de unión distintos en la superficie. Si la superficie es un pocillo, el pocillo puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en dos dominios de unión distintos dentro del pocillo. La superficie puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en el mismo dominio de unión en la superficie. Si la superficie es un pocillo, el pocillo puede comprender una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en el mismo dominio de unión dentro del pocillo. El reactivo de captura y el reactivo de anclaje pueden estar dentro de 10-100 nm en la superficie.
La superficie de las modalidades (11) y (12) puede comprender un electrodo y la etapa de medición puede incluir aplicar una forma de onda de tensión al electrodo para generar una señal de electroquimioluminiscencia. Opcionalmente, las modalidades (11) y (12), comprenden además colectar la partícula en un electrodo y aplicar una forma de onda de tensión al electrodo para generar una señal de electroquimioluminiscencia. La etapa de medición también puede incluir unir el amplicón a una sonda de detección que tiene una etiqueta detectable, medir la etiqueta detectable y correlacionar la medición con la cantidad de analito en la muestra, en donde la sonda de detección comprende una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una región del amplicón. La etiqueta detectable puede medirse mediante una medición de dispersión de luz, absorbancia óptica, fluorescencia, quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, bioluminiscencia, fosforescencia, radioactividad, campo magnético o sus combinaciones. En un ejemplo, la etiqueta detectable es una etiqueta de ECL y la etapa de medición puede incluir medir una señal de ECL.
La muestra de las modalidades (11) y (12) puede comprender una o más moléculas de analito, y la superficie puede incluir una pluralidad de reactivos de captura de la una o más moléculas de analito distribuidas en una pluralidad de regiones de unión resolubles colocadas en la superficie, y el método puede incluir: (x) unir la una o más moléculas de analito a uno o más reactivos de captura en la superficie; (y) determinar la presencia o ausencia de una molécula de analito en cada región de unión; e (z) identificar el número de regiones de unión que contienen una molécula de analito y/o el número de dominios de analito que no contienen una molécula de analito. La etapa de medición puede incluir obtener imágenes de una señal óptica de la superficie para generar una imagen que comprende una pluralidad de píxeles y cada región de unión resoluble se asigna a uno o más píxeles de la imagen. Las regiones de unión resolubles pueden ser elementos de una serie y/o las regiones de unión resolubles se configuran para aislar partículas individuales. Cada región de unión resoluble puede ser un nanopocillo individual que tiene un volumen < 100 nl, por ejemplo, en donde al menos 99 % de las regiones de unión contienen cero o una molécula de analito, en donde al menos aproximadamente 95 % de las regiones de unión contienen cero o una molécula de analito, en donde al menos aproximadamente 80 % de las regiones de unión contienen cero o una molécula de analito, y/o en donde al menos aproximadamente 50 % de las regiones de unión contienen cero o una molécula de analito. La concentración de moléculas de analito en la muestra en las modalidades (11) y (12) puede determinarse al menos en parte mediante el uso de una curva de calibración, un análisis de distribución de Poisson y/o un análisis de distribución de Gauss del número de regiones de unión que contienen al menos una o ninguna molécula de analito.
En las modalidades (11) y (12), la muestra puede comprender una o más moléculas de analito, la superficie puede incluir una pluralidad de partículas, cada una de las cuales comprende una pluralidad de reactivos de unión de una molécula de analito en donde la pluralidad de partículas se distribuye en una pluralidad de regiones de unión resolubles, y el método puede incluir: (i) unir la una o más moléculas de analito a uno o más reactivos de unión en la superficie, y (ii) distribuir la pluralidad de partículas en una serie de regiones de unión resolubles; y (iii) determinar la presencia o ausencia de una molécula de analito en cada región de unión resoluble, para identificar el número de regiones de unión que contienen una molécula de analito y/o el número de regiones de unión que no contienen una molécula de analito.
Modalidad (13): un kit para la detección de un analito de interés en una muestra que comprende, en uno o más viales, contenedores o compartimentos: (a) una superficie que comprende (i) un reactivo de captura del analito y (ii) un reactivo de anclaje que comprende una secuencia de oligonucleótido de anclaje; (b) un primer reactivo de detección del analito que comprende una primera sonda de proximidad; (c) un segundo reactivo de detección del analito que comprende una segunda sonda de proximidad; y (d) una secuencia conectora que comprende (i) una secuencia interior complementaria a la segunda sonda de proximidad y (ii) dos secuencias de extremo complementarias a regiones no superpuestas de la primera sonda de proximidad.
Modalidad (14): un kit para la detección de un analito de interés en una muestra que comprende, en uno o más viales, contenedores o compartimentos: (a) una superficie que comprende (i) un reactivo de captura del analito, y (ii) un reactivo de anclaje que comprende una secuencia de oligonucleótido de anclaje; y (b) un primer reactivo de detección del analito que comprende una primera sonda de proximidad; (c) un segundo reactivo de detección del analito que comprende una segunda sonda de proximidad; y (d) (i) un primer oligonucleótido conector y (ii) un segundo oligonucleótido conector, en donde (x) un primer extremo del primer conector y un primer extremo del segundo conector son complementarios a dos regiones no superpuestas de la primera sonda de proximidad y (y) un segundo extremo del primer conector y un segundo extremo del segundo conector son complementarios a dos regiones no superpuestas de la primera sonda de proximidad.
El reactivo de captura de las modalidades (13) y (14) puede comprender un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o aptámero, por ejemplo, el reactivo de captura puede incluir un anticuerpo. Igualmente, el primer reactivo de captura puede incluir un anticuerpo y/o el reactivo de detección puede incluir un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o aptámero, por ejemplo, el primer reactivo de detección puede incluir un anticuerpo. De manera similar, el segundo reactivo de captura puede incluir un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o aptámero, por ejemplo, el segundo reactivo de detección puede incluir un anticuerpo.
La superficie de las modalidades (13) y (14) puede incluir una partícula y/o un pocillo de una placa de múltiples pocillos. La superficie puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en dos dominios de unión distintos en la superficie. Si la superficie es un pocillo, el pocillo puede comprender una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en dos dominios de unión distintos dentro del pocillo. La superficie puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en el mismo dominio de unión en la superficie. Si la superficie es un pocillo, el pocillo puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en el mismo dominio de unión dentro del pocillo. El reactivo de captura y el reactivo de anclaje pueden estar dentro de 10-100 nm en la superficie y, opcionalmente, la superficie puede incluir un electrodo.
Modalidad (15): un método para detectar analitos en una muestra, en donde el método puede incluir: (a) unir los analitos al primer y segundo reactivos de detección para formar complejos de detección, cada complejo de detección comprende un analito, un primer reactivo de detección y un segundo reactivo de detección, en donde el primer reactivo de detección tiene una primera etiqueta detectable y el segundo reactivo de detección tiene una segunda etiqueta detectable, (b) distribuir los analitos en una pluralidad de recipientes de reacción de manera que la mayoría de los recipientes de reacción contengan uno o menos analitos; y (c) detectar el número de moléculas de analito mediante el recuento del número de recipientes de reacción que contienen la primera y segunda etiquetas detectables. En esta modalidad (15), el primer reactivo de detección puede ser un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, por ejemplo, el primer reactivo de detección es un anticuerpo. Igualmente, el segundo reactivo de detección puede ser un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, por ejemplo, el segundo reactivo de detección es un anticuerpo. En un ejemplo específico, el primer y segundo reactivos de detección son anticuerpos contra el analito.
La etapa (a) de la modalidad (15) puede comprender además formar una solución que comprende dichos analitos y dichos reactivos de detección y la etapa (b) puede incluir distribuir la solución en la pluralidad de recipientes de reacción para que la posibilidad de encontrar un primer reactivo de detección no unido y un segundo reactivo de detección no unido en el mismo recipiente sea menos de 1 en 10. Alternativamente, la etapa (a) de la modalidad (15) puede comprender además formar una solución que comprende dichos analitos y dichos reactivos de detección y la etapa (b) puede incluir distribuir la solución en la pluralidad de recipientes de reacción para que la posibilidad de encontrar un primer reactivo de detección no unido y un segundo reactivo de detección no unido en el mismo recipiente sea menos de 1 en 100. Aún más, la etapa (a) de la modalidad (15) puede comprender además formar una solución que comprende dichos analitos y dichos reactivos de detección y la etapa (b) puede incluir distribuir la solución en la pluralidad de recipientes de reacción para que la posibilidad de encontrar un primer reactivo de detección no unido y un segundo reactivo de detección no unido en el mismo recipiente sea menos de 1 en 1000. Por otra parte, la etapa (a) de la modalidad (15) puede comprender además formar una solución que comprende dichos analitos y dichos reactivos de detección y la etapa (b) puede incluir distribuir la solución en la pluralidad de recipientes de reacción para que la posibilidad de encontrar un primer reactivo de detección no unido y un segundo reactivo de detección no unido en el mismo recipiente sea menos de 1 en 10000.
Modalidad (16): un método para detectar analitos en una muestra, el método comprende: (a) unir los analitos a reactivos de captura y al primer y segundo reactivos de detección para formar complejos de detección, cada complejo de detección comprende un reactivo de captura, un analito, un primer reactivo de detección y un segundo reactivo de detección, en donde (i) el primer reactivo de detección tiene una primera etiqueta detectable y el segundo reactivo de detección tiene una segunda etiqueta detectable, (ii) el reactivo de captura está en la superficie; (b) distribuir los analitos en una pluralidad de recipientes de reacción de manera que la mayoría de los recipientes de reacción contengan uno o menos analitos; y (c) detectar el número de moléculas de analito mediante el recuento del número de recipientes de reacción que contienen la primera y segunda etiquetas detectables. En esta modalidad, el reactivo de captura puede ser un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, por ejemplo, el reactivo de captura es un anticuerpo. Igualmente, el primer reactivo de detección puede ser un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, por ejemplo, el primer reactivo de detección es un anticuerpo. Por otra parte, el segundo reactivo de detección puede ser un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, por ejemplo, el segundo reactivo de detección es un anticuerpo. Por ejemplo, el reactivo de captura, el primer y segundo reactivos de detección son anticuerpos contra el analito.
La etapa (b) de la modalidad (16) puede comprender además distribuir la solución en la pluralidad de recipientes de reacción para que la posibilidad de encontrar un primer reactivo de detección no unido y un segundo reactivo de detección no unido en el mismo recipiente sea menos de 1 en 10. Por otra parte, la etapa (b) de la modalidad (16) puede comprender además distribuir la solución en la pluralidad de recipientes de reacción para que la posibilidad de encontrar un primer reactivo de detección no unido y un segundo reactivo de detección no unido en el mismo recipiente sea menos de 1 en 100. La etapa (b) de la modalidad (16) puede comprender además distribuir la solución en la pluralidad de recipientes de reacción para que la posibilidad de encontrar un primer reactivo de detección no unido y un segundo reactivo de detección no unido en el mismo recipiente sea menos de 1 en 1000. Además, la etapa (b) de la modalidad (16) puede comprender además distribuir la solución en la pluralidad de recipientes de reacción para que la posibilidad de encontrar un primer reactivo de detección no unido y un segundo reactivo de detección no unido en el mismo recipiente sea menos de 1 en 10000.
El reactivo de captura en el complejo de detección de la modalidad (16) puede estar en la superficie antes de unir el reactivo de captura al analito; o el reactivo de captura en el complejo de detección se une al analito antes de inmovilizar el reactivo de captura en la superficie. En un ejemplo, el reactivo de captura puede incluir un resto de direccionamiento y la superficie puede incluir un complemento de resto de direccionamiento. El resto de direccionamiento y la pareja de unión del agente de direccionamiento se seleccionan de los siguientes pares de unión: avidina-biotina, estreptavidinabiotina, receptor-ligando, anticuerpo-antígeno, ácido nucleico-complemento de ácido nucleico.
La superficie de la modalidad (16) es una partícula y, opcionalmente, los reactivos de captura se inmovilizan en una pluralidad de partículas y la distribución de los analitos se logra mediante la unión de los analitos a los reactivos de captura y la distribución de las partículas en la pluralidad de recipientes de reacción. Los reactivos de captura pueden inmovilizarse en una pluralidad de partículas y la distribución de los analitos se logra mediante la distribución de las partículas en una pluralidad de recipientes de reacción y después la unión de los analitos a los reactivos de captura.
La modalidad (16) puede comprender además distribuir una pluralidad de partículas en la pluralidad de recipientes de reacción, en donde la pluralidad de partículas comprende restos de direccionamiento, los reactivos de captura comprenden un complemento de grupo de direccionamiento y la distribución de los analitos se logra mediante la unión de los complementos de grupo de direccionamiento a los restos de direccionamiento. La modalidad (16) también puede incluir lavar las partículas antes de la etapa de distribución y/o después de la etapa de distribución.
La superficie de la modalidad (16) puede ser una ubicación dentro de uno de los recipientes de reacción. En esta modalidad, los reactivos de captura pueden inmovilizarse en superficies de la pluralidad de recipientes de reacción y la distribución de los analitos se logra mediante la unión de los analitos a los reactivos de captura. Opcionalmente, los recipientes de reacción tienen superficies con restos de direccionamiento inmovilizados en los mismos, los reactivos de captura comprenden complementos de grupo de direccionamiento y la distribución de los analitos se logra mediante la unión de los complementos de grupo de direccionamiento a los restos de direccionamiento. En este ejemplo específico, el método puede comprender además lavar el recipiente de reacción antes de la etapa de detección.
La pluralidad de recipientes de reacción de la modalidad (16) puede comprender una serie de nanopocillos. La pluralidad de recipientes de reacción puede comprender al menos 10000 recipientes de reacción. En una modalidad, los recipientes de reacción tienen un volumen de menos de 100 nl. Opcionalmente, menos del 50 % de los recipientes de reacción contienen un analito en el momento de la detección, menos del 10 % de los recipientes de reacción contienen un analito en el momento de la detección, menos del 1 % de los recipientes de reacción contienen un analito en el momento de la detección, y/o menos del 0,1 % de los recipientes de reacción contienen un analito en el momento de la detección.
En un aspecto de la modalidad (16), la primera etiqueta detectable es una primera enzima de un sistema de reacción enzimática acoplada y la segunda etiqueta detectable es una segunda enzima del sistema de reacción enzimática acoplada y la etapa (d) puede incluir la adición de uno o más sustratos del sistema de reacción, lo que produce un producto del sistema de reacción enzimática y cuenta con los recipientes de reacción que contienen el producto. En esta modalidad, el producto solo puede producirse cuando la primera enzima y la segunda enzima están muy próximas, por ejemplo, la primera y la segunda enzima están dentro de 200 nM entre sí, o la primera y segunda enzimas están dentro de 50 nM entre sí. Por ejemplo, la primera enzima es una oxidasa, la segunda enzima es una peroxidasa y los sustratos comprenden un sustrato de oxidasa y un derivado etiquetado con rojo Amplex o luminol. En esta modalidad, la oxidasa puede ser glucosa oxidasa y el sustrato de oxidasa es glucosa. En una modalidad, las reacciones catalizadas por la primera y segunda enzimas en el complejo de detección conducen a la inmovilización del rojo Amplex o luminol etiquetado en la superficie y, opcionalmente, el método puede incluir medir el rojo Amplex o luminol etiquetado en la superficie. El rojo Amplex o luminol etiquetado es opcionalmente biotina-rojo Amplex o luminol, y el método puede incluir añadir estreptavidina etiquetada y medir las etiquetas en la estreptavidina.
La etapa (d) de la modalidad (16) puede incluir medir una señal dependiente de la proximidad que se genera cuando la primera y segunda etiquetas detectables se unen a la misma molécula de analito y contar el número de recipientes de reacción que producen la señal dependiente de la proximidad, por ejemplo, la señal dependiente de la proximidad se genera mediante PLA-RCA. Por ejemplo, la primera etiqueta detectable puede ser un donante de FRET y la etiqueta detectable es un aceptor de FRET y la señal dependiente de la proximidad se mide al excitar al donante de FRET y medir la emisión del aceptor de FRET. En un ejemplo, la primera y segunda etiquetas detectables pueden medirse independientemente. Opcionalmente, la primera y segunda etiquetas detectables son etiquetas luminiscentes que se diferencian entre sí con respecto a las propiedades espectrales. En un ejemplo, la primera etiqueta detectable es una primera enzima que reacciona con un primer sustrato para producir una primera señal y la segunda etiqueta detectable es una segunda enzima que reacciona con un segundo sustrato para producir una segunda señal diferente, y la etapa (d) de la modalidad (16) puede incluir añadir el primer sustrato enzimático y el segundo sustrato enzimático y contar el número de recipientes de reacción en los que se generan la primera y segunda señales. La primera y segunda señales pueden ser cambios en la absorbancia óptica con propiedades espectrales diferentes. Opcionalmente, la primera y la segunda señal son señales luminiscentes con propiedades espectrales diferentes. La primera y la segunda enzima pueden ser enzimas hidrolíticas, por ejemplo, seleccionadas de una fosfatasa, sulfatasa, galactosidasa, glucuronidasa o sus combinaciones, y el primer y segundo sustratos se seleccionan de fosfato, sulfato, galactósido y glucurónido, dioxetanos estabilizados modificados, 4-metilumbeliferilo, fluoresceína o sus combinaciones. En un ejemplo específico, la primera y la segunda enzima se seleccionan de peroxidasa de rábano picante, betagalactosidasa y fosfatasa alcalina. La etapa de detección de la modalidad (16) puede incluir la detección mediante dispersión de luz, absorbancia óptica, fluorescencia, quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, luminiscencia, radioactividad, campo magnético o sus combinaciones.
Modalidad (17): un kit para la detección de analitos en una muestra, el kit comprende, en uno o más viales, contenedores o compartimentos: (a) un primer reactivo de detección que comprende una primera etiqueta detectable; (b) un segundo reactivo de detección que comprende una segunda etiqueta detectable; (c) una pluralidad de recipientes de reacción configurados de modo que contengan una o menos moléculas de analito.
Modalidad (18): un kit para la detección de analitos en una muestra, el kit comprende, en uno o más viales, contenedores o compartimentos: (a) un primer reactivo de detección que comprende una primera etiqueta detectable; (b) un segundo reactivo de detección que comprende una segunda etiqueta detectable; (c) una superficie que comprende un reactivo de captura; y (d) una pluralidad de recipientes de reacción configurados de modo que contengan una o menos moléculas de analito.
El primer y segundo reactivos de detección de las modalidades (17) y (18) pueden comprender un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo, aptámero o sus combinaciones. En un ejemplo, el primer y segundo reactivos de detección comprenden un anticuerpo. El anticuerpo de captura puede comprender un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o aptámero, por ejemplo, el anticuerpo de captura puede incluir un anticuerpo. En un ejemplo, el reactivo de captura puede incluir un resto de direccionamiento y la superficie puede incluir un complemento de resto de direccionamiento, por ejemplo, el resto de direccionamiento y la pareja de unión del agente de direccionamiento se seleccionan de los siguientes pares de unión: avidina-biotina, estreptavidina-biotina, receptor-ligando, anticuerpo-antígeno, ácido nucleico-complemento de ácido nucleico.
La superficie de las modalidades (17) y (18) puede ser una partícula y, por ejemplo, los reactivos de captura están inmovilizados en una pluralidad de partículas. Alternativamente, la superficie es una ubicación dentro de uno de los recipientes de reacción y, por ejemplo, los reactivos de captura se inmovilizan en superficies de la pluralidad de recipientes de reacción. Opcionalmente, los recipientes de reacción tienen superficies con restos de direccionamiento inmovilizados en los mismos y los reactivos de captura comprenden complementos de restos de direccionamiento. La pluralidad de recipientes de reacción puede comprender una serie de nanopocillos o gotitas de agua dispersas en una emulsión de agua en aceite. La pluralidad de recipientes de reacción puede incluir al menos 10 000 recipientes de reacción y, opcionalmente, un recipiente de reacción en la pluralidad tiene un volumen de menos de 100 nl.
En el kit de las modalidades (17) y (18), la primera etiqueta detectable puede ser una primera enzima de un sistema de reacción enzimática acoplada y la segunda etiqueta detectable es una segunda enzima del sistema de reacción enzimática acoplada y el kit puede incluir, en uno o más viales, contenedores o compartimentos adicionales, uno o más sustratos del sistema de reacción. Por ejemplo, la primera enzima es una oxidasa, la segunda enzima es una peroxidasa y los sustratos comprenden un sustrato de oxidasa y un derivado etiquetado con rojo Amplex o luminol. En una modalidad específica, la oxidasa es glucosa oxidasa y el sustrato de oxidasa es glucosa. La primera y segunda etiquetas detectables pueden ser componentes de un sistema dependiente de la proximidad, por ejemplo, la primera etiqueta detectable es un donante de FRET y la etiqueta detectable es un aceptor de FRET. La primera y segunda etiquetas detectables pueden medirse independientemente. Opcionalmente, la primera y segunda etiquetas detectables son etiquetas luminiscentes que se diferencian entre sí con respecto a las propiedades espectrales.
En el kit de las modalidades (17) y (18), la primera etiqueta detectable es una primera enzima que reacciona con un primer sustrato para producir una primera señal y la segunda etiqueta detectable es una segunda enzima que reacciona con un segundo sustrato para producir una segunda señal diferente, y el kit puede incluir en uno o más viales, contenedores o compartimentos, el primer sustrato enzimático y el segundo sustrato enzimático. Opcionalmente, la primera y segunda señales son cambios en la absorbancia óptica con propiedades espectrales diferentes. En un ejemplo, la primera y la segunda señal son señales luminiscentes con propiedades espectrales diferentes. La primera y la segunda enzima pueden ser enzimas hidrolíticas. En un ejemplo, la primera y la segunda enzima se seleccionan de una fosfatasa, sulfatasa, galactosidasa, glucuronidasa o sus combinaciones. El primer y segundo sustratos pueden seleccionarse de dioxetanos estabilizados modificados con fosfato, sulfato, galactósido y glucurónido, 4-metilumbeliferilo, fluoresceína o sus combinaciones. Opcionalmente, la primera y la segunda enzima se seleccionan de peroxidasa de rábano picante, beta-galactosidasa y fosfatasa alcalina.
Modalidad (19): un método para detectar un analito de interés en una muestra que comprende: (a) unir el analito a un reactivo de captura, un primer reactivo de detección que tiene una primera etiqueta detectable y un segundo reactivo de detección que tiene una segunda etiqueta detectable y formar un complejo, en donde el reactivo de captura en el complejo está inmovilizado en una superficie; (b) reticular el primer y segundo reactivo de detección para formar un producto reticulado; (c) liberar el producto reticulado de la superficie a un eluyente; (d) contar los productos reticulados individuales en el eluyente que comprenden tanto la primera como la segunda etiquetas detectables. En este ejemplo (19), el reactivo de captura es un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero y, en un ejemplo específico, el reactivo de captura es un anticuerpo. Igualmente, el primer reactivo de detección puede incluir un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero y, en un ejemplo específico, el primer reactivo de detección es un anticuerpo. Por otra parte, el segundo reactivo de detección es un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, y específicamente, el segundo reactivo de detección puede ser un anticuerpo. En un ejemplo particular, el reactivo de captura y el primer y segundo reactivos de detección son anticuerpos contra el analito.
La modalidad (19) puede comprender además la adición de un agente de reticulación para reticular el primer y segundo reactivos de detección, por ejemplo, el primer y segundo reactivos de detección comprenden restos reactivos y el agente de reticulación es un agente de reticulación multifuncional que se enlaza a los restos reactivos. Por ejemplo, los restos reactivos comprenden una amina, tiol, hidrazida, aldehído, éster, yodoacetamida, maleimida, reactivos de química clic y sus combinaciones. Los agentes de reticulación pueden comprender una amina, tiol, hidrazida, aldehído, éster, yodoacetamida, maleimida, reactivos de química clic y sus combinaciones. El primer y segundo reactivos de detección pueden incluir restos de unión y el agente de reticulación es una pareja de unión multivalente de los restos de unión. En un ejemplo, el primer y segundo reactivos de detección son anticuerpos de una especie animal y el agente de reticulación es un anticuerpo antiespecie multivalente dirigido a anticuerpos de la especie animal. El primer y segundo reactivos de detección pueden comprender biotina y el agente de reticulación es estreptavidina; el primer y segundo reactivos de detección incluyen estreptavidina y el agente de reticulación es biotina; el primer y segundo reactivos de detección se enlazan a estreptavidina y el agente de reticulación es un polímero que comprende una pluralidad de moléculas de biotina; y/o el primer y segundo reactivos de detección comprenden la primera y segunda sondas de ácido nucleico, respectivamente, y el agente de reticulación es un oligonucleótido que puede incluir una secuencia complementaria a la primera sonda de ácido nucleico y una secuencia separada complementaria a la segunda sonda de ácido nucleico.
La superficie de la modalidad (19) puede comprender una partícula, un recipiente de reacción, por ejemplo, un tubo o una ampolla, y/o la superficie puede incluir un pocillo de una placa de múltiples pocillos. El método de la modalidad (19) puede incluir además recolectar las partículas y lavar las partículas para eliminar impurezas y opcionalmente, la primera y segunda etiquetas detectables se miden mediante una medición de dispersión de luz, absorbancia óptica, fluorescencia, quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, bioluminiscencia, fosforescencia, radioactividad, campo magnético o sus combinaciones. En un ejemplo específico, la primera y segunda etiquetas detectables comprenden una etiqueta de ECL y la etapa de recuento puede incluir medir una señal de ECL.
Modalidad (20): un kit para la detección de un analito de interés en una muestra que comprende, en uno o más viales, contenedores o compartimentos: (a) una superficie que comprende un reactivo de captura inmovilizado; (b) un primer reactivo de detección que tiene una primera etiqueta detectable; (c) un segundo reactivo de detección que tiene una segunda etiqueta detectable; y (d) un agente de reticulación que reacciona con el primer y segundo reactivos de detección.
El primer y segundo reactivos de detección de la modalidad (20) pueden comprender restos reactivos y el agente de reticulación es un agente de reticulación multifuncional que se enlaza a los restos reactivos. Los restos reactivos pueden incluir una amina, tiol, hidrazida, aldehído, éster, yodoacetamida, maleimida, reactivos de química clic y sus combinaciones; y los agentes de reticulación pueden incluir una amina, tiol, hidrazida, aldehído, éster, yodoacetamida, maleimida, reactivos de química clic y sus combinaciones. El primer y segundo reactivos de detección de la modalidad (20) pueden comprender restos de unión y el agente de reticulación es una pareja de unión multivalente de los restos de unión, por ejemplo, el primer y segundo reactivos de detección son anticuerpos de una especie animal y el agente de reticulación es un anticuerpo antiespecie multivalente dirigido a anticuerpos de la especie animal; el primer y segundo reactivos de detección comprenden biotina y el agente de reticulación es estreptavidina; el primer y segundo reactivos de detección comprenden estreptavidina y el agente de reticulación es biotina; el primer y segundo reactivos de detección se enlazan a estreptavidina y el agente de reticulación es un polímero que comprende una pluralidad de moléculas de biotina; y/o el primer y segundo reactivos de detección comprenden la primera y segunda sondas de ácido nucleico, respectivamente, y el agente de reticulación es un oligonucleótido que puede incluir una secuencia complementaria a la primera sonda de ácido nucleico y una secuencia separada complementaria a la segunda sonda de ácido nucleico.
La superficie de la modalidad (20) puede incluir una partícula, un pocillo de una placa de múltiples pocillos o un recipiente de reacción, por ejemplo, un tubo o una ampolla. Además, la superficie puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura se ubica en un dominio de unión distinto en la superficie. Si la superficie es un pocillo, el pocillo puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura se ubica en un dominio de unión distinto dentro del pocillo. La superficie también puede incluir un electrodo.
Modalidad (21): un método para detectar un analito de interés en una muestra que comprende: (a) unir el analito a un reactivo de captura, un primer reactivo de detección y un segundo reactivo de detección para formar un complejo, en donde el primer reactivo de detección puede incluir una primera etiqueta detectable y una primera sonda de ácido nucleico, el segundo reactivo de detección puede incluir una segunda etiqueta detectable y una segunda sonda de ácido nucleico, y el reactivo de captura en el complejo se inmoviliza en una superficie; (b) reticular el primer y segundo reactivo de detección (i) hibridar la primera sonda con la segunda sonda, (ii) hibridar la primera y segunda sondas con un tercer ácido nucleico que tiene regiones complementarias a la primera y segunda sondas, o (iii) ligar la primera y la segunda sondas; (c) liberar el producto reticulado de la superficie a un eluyente; (d) contar los productos reticulados individuales en el eluyente que comprenden tanto la primera como la segunda etiquetas detectables.
El reactivo de captura de la modalidad (21) puede ser un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, por ejemplo, el reactivo de captura es un anticuerpo. Igualmente, el primer reactivo de detección es un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, por ejemplo, el primer reactivo de detección es un anticuerpo; el segundo reactivo de detección puede ser un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, por ejemplo, el segundo reactivo de detección es un anticuerpo. En un ejemplo específico, el reactivo de captura y el primer y segundo reactivos de detección son anticuerpos contra el analito.
La superficie de la modalidad (21) puede incluir una partícula, un recipiente de reacción, por ejemplo, un tubo o una ampolla, o un pocillo de una placa de múltiples pocillos. El método de la modalidad (21) puede comprender además recolectar las partículas y lavar las partículas para eliminar las impurezas. La primera y segunda etiquetas detectables pueden medirse mediante una medición de dispersión de luz, absorbancia óptica, fluorescencia, quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, bioluminiscencia, fosforescencia, radioactividad, campo magnético o sus combinaciones. En un ejemplo específico, la primera y segunda etiquetas detectables comprenden una etiqueta de ECL y la etapa de recuento puede incluir medir una señal de ECL.
Modalidad (22): un kit para la detección de un analito de interés en una muestra que comprende, en uno o más viales, contenedores o compartimentos: (a) una superficie que comprende un reactivo de captura inmovilizado; (b) un primer reactivo de detección que tiene una primera etiqueta detectable y una primera sonda de ácido nucleico; (c) un segundo reactivo de detección que tiene una segunda etiqueta detectable y una segunda sonda de ácido nucleico; y (d) un tercer ácido nucleico que tiene regiones complementarias a la primera y segunda sondas de ácido nucleico.
La superficie de la modalidad (22) puede incluir una partícula, un pocillo de una placa de múltiples pocillos o un recipiente de reacción, por ejemplo, un tubo o una ampolla. La superficie puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura se ubica en un dominio de unión distinto en la superficie, y si la superficie es un pocillo, el pocillo puede comprender una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura se ubica en un dominio de unión distinto dentro del pocillo. La superficie puede incluir opcionalmente un electrodo.
Modalidad (23): un método para detectar un analito de interés en una muestra que comprende: (a) unir el analito a un reactivo de captura, un primer reactivo de detección y un segundo reactivo de detección para formar un complejo, en donde el primer reactivo de detección puede incluir una primera sonda de ácido nucleico, el segundo reactivo de detección puede incluir una segunda sonda de ácido nucleico, y el reactivo de captura en el complejo se inmoviliza en una superficie; (b) extender la segunda sonda de ácido nucleico para formar una secuencia extendida que comprende una etiqueta detectable, la extensión depende de la colocalización de la primera y segunda sondas de ácido nucleico en el complejo; (c) liberar la secuencia extendida de la superficie a un eluyente; y (d) contar las secuencias extendidas individuales en el eluyente. En esta modalidad, el reactivo de captura es un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero. En un ejemplo específico, el reactivo de captura es un anticuerpo. Igualmente, el primer reactivo de detección es un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, y en un ejemplo específico, el primer reactivo de detección es un anticuerpo. El segundo reactivo de detección es un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero y, específicamente, el segundo reactivo de detección es un anticuerpo. En un ejemplo específico, el reactivo de captura y el primer y segundo reactivos de detección son anticuerpos contra el analito.
La superficie de la modalidad (23) puede incluir una partícula, un recipiente de reacción, por ejemplo, un tubo o una ampolla; o un pocillo de una placa de múltiples pocillos. El método de la modalidad (23) puede comprender además recolectar las partículas y lavar las partículas para eliminar las impurezas.
La etiqueta de la modalidad (23) puede medirse mediante una medición de dispersión de luz, absorbancia óptica, fluorescencia, quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, bioluminiscencia, fosforescencia, radioactividad, campo magnético o sus combinaciones. En un ejemplo específico, la etiqueta puede incluir una etiqueta de ECL y la etapa de recuento puede incluir medir una señal de ECL.
La etapa de extensión de la modalidad (23) puede incluir unir la sonda a una secuencia de ácido nucleico molde y extender la sonda mediante reacción en cadena de la polimerasa. La etapa de extensión también puede comprender unir la primera sonda a una secuencia de ácido nucleico molde, formar un molde de ácido nucleico circular y extender el molde circular mediante amplificación de círculo rodante. La etapa de extensión puede comprender unir la primera sonda a una secuencia de ácido nucleico molde, unir la segunda sonda a la secuencia molde, y ligar la primera y segunda sondas. Opcionalmente, la etiqueta es una etiqueta fluorescente y el recuento de secuencias extendidas individuales puede incluir la detección de fluorescencia de moléculas individuales, por ejemplo, puede incluir espectroscopía de correlación de fluorescencia y/o espectroscopía de correlación cruzada de fluorescencia. La detección de fluorescencia de moléculas individuales puede comprender hacer fluir el eluyente a través de un capilar, enfocar una fuente de luz en un volumen dentro del capilar para crear una zona de interrogación y observar la zona de interrogación con un detector de luz para detectar el paso de moléculas fluorescentes a través de la zona de interrogación. La detección de fluorescencia de moléculas individuales también puede comprender hacer fluir el eluyente a través de un capilar, enfocar una fuente de luz en un volumen dentro del capilar para crear una zona de interrogación y observar la zona de interrogación con un detector de luz para detectar el paso de moléculas fluorescentes a través de la zona de interrogación.
Modalidad (24): método para detectar un analito de interés en una muestra que comprende: (a) unir el analito a un reactivo de captura, un primer reactivo de detección que tiene una primera etiqueta detectable y un segundo reactivo de detección que tiene una segunda etiqueta detectable y formar un complejo, en donde el reactivo de captura en el complejo está inmovilizado en una superficie; (b) liberar el complejo formado de la superficie, mediante la disociación del reactivo de captura inmovilizado de la superficie a un eluyente; y (c) contar los productos individuales en el eluyente que comprenden tanto la primera como la segunda etiquetas detectables. En esta modalidad, el reactivo de captura es un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, por ejemplo, el reactivo de captura es un anticuerpo; el primer reactivo de detección es un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, por ejemplo, el primer reactivo de detección es un anticuerpo; el segundo reactivo de detección es un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, por ejemplo, el segundo reactivo de detección es un anticuerpo; y en un ejemplo específico, el reactivo de captura y el primer y segundo reactivos de detección son anticuerpos contra el analito.
La superficie de la modalidad (24) puede comprender una partícula, un recipiente de reacción, por ejemplo, un tubo o ampolla, y/o un pocillo de una placa de múltiples pocillos. El método de la modalidad (24) puede incluir recolectar las partículas y lavar las partículas para eliminar las impurezas. La primera y segunda etiquetas detectables pueden medirse mediante una medición de dispersión de luz, absorbancia óptica, fluorescencia, quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, bioluminiscencia, fosforescencia, radioactividad, campo magnético o sus combinaciones, y en una modalidad específica, la primera y segunda etiquetas detectables comprenden una etiqueta de ECL y la etapa de recuento puede incluir medir una señal de ECL.
Modalidad (25): un método para detectar un analito de interés en una muestra que comprende: (a) unir el analito a: (i) un reactivo de captura en una superficie que comprende el reactivo de captura del analito; (ii) un primer reactivo de detección del analito que se enlaza a una primera sonda de ácido nucleico; y (iii) un segundo reactivo de detección del analito que se enlaza a una segunda sonda de ácido nucleico; para formar de esta manera un complejo en la superficie que comprende el reactivo de unión, el analito y el primer y segundo reactivos de detección; (b) usar un proceso de extensión que requiere que la primera y segunda sondas estén próximas, extender la segunda sonda para formar una secuencia extendida; y (c) medir la cantidad de secuencia extendida unida a la superficie. En esta modalidad, el reactivo de captura es un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, por ejemplo, el reactivo de captura es un anticuerpo; el primer reactivo de detección es un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, por ejemplo, el primer reactivo de detección es un anticuerpo; el segundo reactivo de detección es un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero; por ejemplo, el segundo reactivo de detección es un anticuerpo; y en un ejemplo específico, el reactivo de captura y el primer y segundo reactivos de detección son anticuerpos contra el analito.
La secuencia extendida de la modalidad (25) puede incluir una o más secuencias de detección y la etapa de medición puede incluir poner en contacto la secuencia extendida con una pluralidad de sondas etiquetadas complementarias a la una o más secuencias de detección; la secuencia extendida puede incluir una o más bases modificadas y la etapa de medición puede incluir poner en contacto la secuencia extendida con una pluralidad de restos detectables que pueden unirse a la una o más bases modificadas; y/o la secuencia extendida puede incluir una o más bases etiquetadas y la etapa de medición puede incluir detectar la presencia de la una o más bases etiquetadas. La una o más bases modificadas comprenden un aptámero, ligando de aptámero, anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, hapteno, epítopo o un mimotopo y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende una pareja de unión de la una o más bases modificadas y una etiqueta detectable. La una o más bases modificadas pueden incluir estreptavidina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende biotina y una etiqueta detectable; la una o más bases modificadas comprenden biotina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende estreptavidina y una etiqueta detectable; la una o más bases modificadas comprenden avidina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende biotina y una etiqueta detectable; y/o la una o más bases modificadas comprenden biotina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende avidina y una etiqueta detectable.
La etapa (a) de la modalidad (25) puede incluir unir el analito a las siguientes especies en el siguiente orden: (i) el reactivo de captura en una superficie; y (ii) el reactivo de detección del analito; unir el analito a las siguientes especies en el siguiente orden: (i) el reactivo de detección del analito; y (ii) el reactivo de captura en la superficie; o unir el analito a las siguientes especies de forma simultánea o sustancialmente simultánea: (i) el reactivo de captura en una superficie; y (ii) el reactivo de detección del analito. La etapa de extensión puede incluir unir la sonda a una secuencia de ácido nucleico molde y extender la sonda mediante reacción en cadena de la polimerasa; o unir la sonda a una secuencia de ácido nucleico molde, formar un molde de ácido nucleico circular y extender el molde circular mediante amplificación de círculo rodante. En esta modalidad, la sonda extendida puede permanecer localizada en la superficie después de la extensión de la sonda, por ejemplo, el complejo permanece unido a la superficie después de la etapa de extensión. La etapa de extensión puede incluir PCR (reacción en cadena de la polimerasa), LCR (reacción en cadena de la ligasa), SDA (amplificación por desplazamiento de hebra), 3SR (reacción de síntesis autosostenida) o métodos de amplificación isotérmica. En un ejemplo específico, la etapa de extensión puede incluir métodos de amplificación isotérmica, por ejemplo, amplificación dependiente de helicasa o amplificación de círculo rodante (RCA).
El proceso de extensión de la modalidad (25) puede comprender poner en contacto el complejo formado en la etapa (a) con una secuencia conectora que comprende (i) una secuencia interior complementaria a la segunda sonda y (ii) dos secuencias de extremo complementarias a regiones no superpuestas de la primera sonda. El proceso puede comprender además ligar las dos secuencias de extremo del oligonucleótido conector para formar una secuencia diana circular que se hibrida tanto con la primera como con la segunda sonda. El proceso de extensión de la modalidad (25) también puede incluir poner en contacto el complejo formado en la etapa (a) con una primera secuencia de oligonucleótido conector que incluye una primera secuencia de sonda de conector complementaria a una primera región de la primera sonda y una primera región de la segunda sonda, y un segundo oligonucleótido conector que comprende una segunda secuencia de sonda complementaria a una segunda región no superpuesta de la primera sonda y una segunda región no superpuesta de la segunda sonda. El proceso también puede incluir ligar el primer y segundo oligonucleótidos conectores para formar una secuencia diana circular que se hibrida tanto con la primera como con la segunda sonda.
La superficie de la modalidad (25) puede comprender una partícula o un pocillo de una placa de múltiples pocillos. La superficie puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el(los) reactivo(s) de captura se ubica(n) en dos dominios de unión distintos en la superficie. Si la superficie es un pocillo, el pocillo puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el(los) reactivo(s) de captura se ubica(n) en dos dominios de unión distintos dentro del pocilio. La superficie puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y los reactivos de captura se ubican en el mismo dominio de unión en la superficie, y si la superficie es un pocillo, el pocillo puede comprender una pluralidad de dominios de unión distintos y el(los) reactivo(s) de captura se ubica(n) en el mismo dominio de unión dentro del pocillo. La superficie puede incluir un electrodo y la etapa de medición puede incluir aplicar una forma de onda de tensión al electrodo para generar una señal de electroquimioluminiscencia. El método incluye opcionalmente recolectar la partícula en un electrodo y aplicar una forma de onda de tensión al electrodo para generar una señal de electroquimioluminiscencia. La etapa de medición puede comprender además unir la secuencia extendida a una sonda de detección que tiene una etiqueta detectable, medir la etiqueta detectable y correlacionar la medición con la cantidad de analito en la muestra, en donde la sonda de detección comprende una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una región de la secuencia extendida. La etiqueta detectable puede medirse mediante una medición de dispersión de luz, absorbancia óptica, fluorescencia, quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, bioluminiscencia, fosforescencia, radioactividad, campo magnético o sus combinaciones. En un ejemplo específico, la etiqueta detectable es una etiqueta de ECL y la etapa de medición puede incluir medir una señal de ECL.
Modalidad (26): un kit para la detección de un analito de interés en una muestra que comprende, en uno o más viales, contenedores o compartimentos: (a) una superficie que comprende un reactivo de captura del analito; (b) un primer reactivo de detección del analito que se enlaza a una primera sonda de ácido nucleico; y (c) un segundo reactivo de detección del analito que se enlaza a una segunda sonda de ácido nucleico.
El reactivo de captura de la modalidad (26) puede incluir un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o aptámero, por ejemplo, el reactivo de captura puede incluir un anticuerpo; el primer reactivo de detección puede incluir un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o aptámero, por ejemplo, el primer reactivo de detección puede incluir un anticuerpo; el segundo reactivo de detección puede incluir un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o aptámero, por ejemplo, el segundo reactivo de detección puede incluir un anticuerpo; y la superficie puede incluir una partícula y/o un pocillo de una placa de múltiples pocillos. La superficie puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el(los) reactivo(s) de captura se ubica(n) en dos dominios de unión distintos en la superficie; y si la superficie es un pocillo, el pocillo puede comprender una pluralidad de dominios de unión distintos y el(los) reactivo(s) de captura se ubica(n) en dos dominios de unión distintos dentro del pocillo. Opcionalmente, la superficie puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el(los) reactivo(s) de captura se ubica(n) en el mismo dominio de unión en la superficie, y si la superficie es un pocillo, el pocillo puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el(los) reactivo(s) de captura se ubica(n) en el mismo dominio de unión dentro del pocillo. La superficie puede comprender un electrodo.
La superficie de las modalidades 1-26 puede incluir una superficie interior de un contenedor de ensayo, por ejemplo, un tubo de ensayo, cubeta, celda de flujo, clasificador de células de FACS, cartucho o un pocillo de una placa de múltiples pocillos. La superficie también puede comprender un portaobjetos, chips de ensayo o matriz de ensayo; un pin, sonda, perla o medio de filtración; medios de flujo lateral, por ejemplo, una membrana de filtración.
Modalidad (27): un método para detectar un analito de interés en una muestra que comprende una o más moléculas de analito, el método comprende: (a) poner en contacto la muestra con una superficie que comprende una pluralidad de regiones de unión resolubles colocadas en la superficie, cada región de unión resoluble comprende una pluralidad de reactivos de captura de una o más moléculas de analito en la muestra; (b) unir una o más moléculas de analito a (i) uno o más reactivos de captura en la superficie; (ii) un primer reactivo de detección del analito que comprende una primera etiqueta detectable, y (iii) un segundo reactivo de detección del analito que comprende una segunda etiqueta detectable; para formar de esta manera un complejo de detección en un dominio de unión resoluble en la superficie que comprende el reactivo de captura, el analito y el primer y segundo reactivos de detección, en donde la primera y segunda etiquetas detectables son compuestos de etiqueta diferentes; (c) determinar la presencia o ausencia de la molécula de analito en cada región de unión; y (d) identificar el número de regiones de unión que contienen la molécula de analito y/o el número de regiones de unión que no contienen la molécula de analito. La etapa de identificación puede incluir obtener la imagen de una señal óptica de la superficie para generar una imagen que comprende una pluralidad de píxeles y cada región de unión resoluble se asigna a uno o más píxeles en la imagen. Las regiones de unión resolubles pueden ser elementos de una matriz y/o estar configuradas para aislar partículas individuales. Cada región de unión resoluble puede ser un nanopocillo individual que tiene un volumen <100 nl y/o al menos 99 % de las regiones de unión contienen cero o una molécula de analito; al menos aproximadamente 95 % de las regiones de unión contienen cero o una molécula de analito; al menos aproximadamente 80 % de las regiones de unión contienen cero o una molécula de analito; o al menos aproximadamente 50 % de las regiones de unión contienen cero o una molécula de analito. La concentración de moléculas de analito en la muestra puede determinarse al menos en parte mediante el uso de una curva de calibración, un análisis de distribución de Poisson y/o un análisis de distribución de Gauss del número de regiones de unión que contienen al menos una o una molécula de analito.
La superficie de la modalidad (27) puede incluir una pluralidad de partículas, cada una de las cuales comprende una pluralidad de reactivos de captura de una molécula de analito en donde la pluralidad de partículas se distribuye en una pluralidad de regiones de unión resolubles, y el método puede incluir: (i) unir la una o más moléculas de analito a uno o más reactivos de captura en la superficie, y un primer y segundo reactivos de detección para cada una de la una o más moléculas de analito, en donde el primer y segundo reactivos de detección incluyen una primera y segunda etiquetas detectables, respectivamente; (ii) distribuir la pluralidad de partículas en una matriz de regiones de unión resolubles; y (iii) determinar la presencia o ausencia de una molécula de analito en cada una de las regiones de unión resolubles, para identificar el número de regiones de unión que contienen una molécula de analito y/o el número de regiones de unión que no contienen una molécula de analito, en donde opcionalmente, cada región de unión resoluble es un nanopocillo individual que tiene un volumen < 100 nl, y/o al menos 99 % de las regiones de unión contienen cero o una molécula de analito; al menos aproximadamente 95 % de las regiones de unión contienen cero o una molécula de analito; al menos aproximadamente 80 % de las regiones de unión contienen cero o una molécula de analito; y/o al menos aproximadamente 50 % de las regiones de unión contienen cero o una molécula de analito.
El reactivo de captura en la modalidad (27) es un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, por ejemplo, el reactivo de captura es un anticuerpo; el primer reactivo de detección es un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, por ejemplo, el primer reactivo de detección es un anticuerpo; el segundo reactivo de detección es un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, por ejemplo, el segundo reactivo de detección es un anticuerpo. En un ejemplo específico, el reactivo de captura y el primer y segundo reactivos de detección son anticuerpos contra el analito.
La etapa (a) de la modalidad (27) puede incluir unir el analito a las siguientes especies en el siguiente orden: (i) el reactivo de captura en una superficie; y (ii) el primer y segundo reactivos de detección del analito; unir el analito a las siguientes especies en el siguiente orden: (i) el primer y segundo reactivos de detección del analito; y (ii) el reactivo de captura en la superficie; o unir el analito a las siguientes especies de forma simultánea o sustancialmente simultánea: (i) el reactivo de captura en una superficie; y (ii) el primer y segundo reactivos de detección del analito.
La superficie de la modalidad (27) puede incluir una partícula o un pocillo de una placa de múltiples pocillos. En un ejemplo específico, la superficie puede incluir un electrodo y la etapa de identificación puede incluir aplicar una forma de onda de tensión al electrodo para generar una señal de electroquimioluminiscencia. El método de la modalidad (27) puede incluir además recolectar la partícula en un electrodo y aplicar una forma de onda de tensión al electrodo para generar una señal de electroquimioluminiscencia. La primera etiqueta detectable se mide mediante una medición de dispersión de luz, absorbancia óptica, fluorescencia, quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, bioluminiscencia, fosforescencia, radioactividad, campo magnético o sus combinaciones; y/o la segunda etiqueta detectable se mide mediante una medición de dispersión de luz, absorbancia óptica, fluorescencia, quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, bioluminiscencia, fosforescencia, radioactividad, campo magnético o sus combinaciones. La primera y segunda etiquetas detectables pueden medirse independientemente y, en un ejemplo, la primera y segunda etiquetas detectables son etiquetas luminiscentes que difieren entre sí con respecto a las propiedades espectrales.
La superficie de la modalidad (27) puede incluir una superficie interior de un recipiente de ensayo, por ejemplo, un tubo de ensayo, cubeta, celda de flujo, clasificador de células de FACS, cartucho o un pocillo de una placa de múltiples pocillos. La superficie también puede comprender un portaobjetos, chips de ensayo o matriz de ensayo; un pin, sonda, perla o medio de filtración; medios de flujo lateral, por ejemplo, una membrana de filtración.
Modalidad (28): un kit para la detección de un analito de interés en una muestra que comprende una o más moléculas de analito, el kit comprende: (a) una superficie que comprende una pluralidad de regiones de unión resolubles colocadas en la superficie, cada región de unión resoluble comprende una pluralidad de reactivos de captura de una o más moléculas de analito en la muestra; (b) un primer reactivo de detección del analito que comprende una primera etiqueta detectable, y (c) un segundo reactivo de detección del analito que comprende una segunda etiqueta detectable; en donde la primera y segunda etiquetas detectables son compuestos de etiqueta diferentes.
Las regiones de unión resolubles de la modalidad (28) pueden ser elementos de una matriz y/o estar configuradas para aislar partículas individuales. Cada región de unión resoluble es, opcionalmente, un nanopocillo individual que tiene un volumen < 100 nl. La superficie puede incluir una pluralidad de partículas, cada una de las cuales comprende una pluralidad de reactivos de captura de una molécula de analito en donde la pluralidad de partículas se distribuye en una pluralidad de regiones de unión resolubles, y el kit puede incluir: primer y segundo reactivos de detección para cada una de la una o más moléculas de analito, en donde el primer y segundo reactivos de detección incluyen una primera y segunda etiquetas detectables, respectivamente.
El reactivo de captura en la modalidad (28) es un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, por ejemplo, el reactivo de captura es un anticuerpo; el primer reactivo de detección es un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, por ejemplo, el primer reactivo de detección es un anticuerpo; el segundo reactivo de detección es un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, por ejemplo, el segundo reactivo de detección es un anticuerpo. En un ejemplo específico, el reactivo de captura y el primer y segundo reactivos de detección son anticuerpos contra el analito.
La superficie de la modalidad (28) puede incluir una partícula o un pocillo de una placa de múltiples pocillos. En un ejemplo específico, la superficie puede incluir un electrodo y la etapa de identificación puede incluir aplicar una forma de onda de tensión al electrodo para generar una señal de electroquimioluminiscencia. La primera etiqueta detectable se mide mediante una medición de dispersión de luz, absorbancia óptica, fluorescencia, quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, bioluminiscencia, fosforescencia, radioactividad, campo magnético o sus combinaciones; y/o la segunda etiqueta detectable se mide mediante una medición de dispersión de luz, absorbancia óptica, fluorescencia, quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, bioluminiscencia, fosforescencia, radioactividad, campo magnético o sus combinaciones. La primera y segunda etiquetas detectables pueden medirse independientemente y, en un ejemplo, la primera y segunda etiquetas detectables son etiquetas luminiscentes que difieren entre sí con respecto a las propiedades espectrales.
La superficie de la modalidad (28) puede incluir una superficie interior de un contenedor de ensayo, por ejemplo, un tubo de ensayo, cubeta, celda de flujo, clasificador de células de FACS, cartucho o un pocillo de una placa de múltiples pocillos. La superficie también puede comprender un portaobjetos, chips de ensayo o matriz de ensayo; un pin, sonda, perla o medio de filtración; medios de flujo lateral, por ejemplo, una membrana de filtración.
Modalidad (29): un método para detectar p24 de VIH en una muestra que comprende: (a) unir p24 de VIH a: (i) un reactivo de captura en una superficie que comprende el reactivo de captura de p24 de VIH y un reactivo de anclaje que comprende una secuencia de oligonucleótido de anclaje; (ii) un primer reactivo de detección de p24 de VIH que se enlaza a una primera sonda de ácido nucleico; y (iii) un segundo reactivo de detección de p24 de VIH que se enlaza a una segunda sonda de ácido nucleico; para formar de esta manera un complejo en la superficie que comprende el reactivo de unión, p24 de VIH y el primer y segundo reactivos de detección; (b) usar un proceso de extensión que requiere que la primera y segunda sondas estén próximas, extender la segunda sonda para formar una secuencia extendida que comprende un complemento de la secuencia de anclaje que es complementario a la secuencia de anclaje; (c) hibridar la secuencia de anclaje con el complemento de la secuencia de anclaje; y (d) medir la cantidad de secuencia extendida unida a la superficie.
El reactivo de captura de la modalidad (29) puede ser un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero. En un ejemplo específico, el reactivo de captura es un anticuerpo. Igualmente, el primer reactivo de detección es un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, y en un ejemplo particular, el primer reactivo de detección es un anticuerpo. El segundo reactivo de detección puede ser un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero y, en un ejemplo particular, el segundo reactivo de detección es un anticuerpo. Más particularmente, el reactivo de captura y el primer y segundo reactivos de detección son anticuerpos contra p24 de VIH.
En la modalidad (29), la secuencia de oligonucleótido de anclaje puede incluir una secuencia de oligonucleótido monocatenaria o una secuencia de oligonucleótido bicatenaria. En esta modalidad, la secuencia extendida puede incluir una o más secuencias de detección y la etapa de medición puede incluir poner en contacto la secuencia extendida con una pluralidad de sondas etiquetadas complementarias a la una o más secuencias de detección. La secuencia extendida también puede incluir una o más bases modificadas y la etapa de medición puede incluir poner en contacto la secuencia extendida con una pluralidad de restos detectables que pueden unirse a la una o más bases modificadas. La secuencia extendida puede comprender además una o más bases etiquetadas y la etapa de medición puede incluir detectar la presencia de la una o más bases etiquetadas. La una o más bases modificadas pueden comprender un aptámero, ligando de aptámero, anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, hapteno, epítopo o un mimotopo y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende una pareja de unión de la una o más bases modificadas y una etiqueta detectable. Por ejemplo, la una o más bases modificadas comprenden estreptavidina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende biotina y una etiqueta detectable; la una o más bases modificadas comprenden biotina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende estreptavidina y una etiqueta detectable; la una o más bases modificadas comprenden avidina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende biotina y una etiqueta detectable; y/o la una o más bases modificadas comprenden biotina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende avidina y una etiqueta detectable.
La etapa (a) de la modalidad (29) puede incluir unir p24 de VIH a las siguientes especies en el siguiente orden: (i) el reactivo de captura en una superficie; y (ii) el reactivo de detección de p24 de VIH. Alternativamente, la etapa (a) puede incluir unir p24 de VIH a las siguientes especies en el siguiente orden: (i) el reactivo de detección de p24 de VIH; y (ii) el reactivo de captura en la superficie; o la etapa (a) puede incluir unir p24 de VIH a las siguientes especies de forma simultánea o sustancialmente simultánea: (i) el reactivo de captura en una superficie; y (ii) el reactivo de detección de p24 de VIH.
La etapa de extensión de la modalidad (29) puede incluir unir la sonda a una secuencia de ácido nucleico molde y extender la sonda mediante reacción en cadena de la polimerasa. La etapa de extensión puede incluir además unir la sonda a una secuencia de ácido nucleico molde, formar un molde de ácido nucleico circular y extender el molde circular mediante amplificación de círculo rodante. La sonda extendida puede permanecer localizada en la superficie después de la extensión de la sonda, por ejemplo, el complejo permanece unido a la superficie después de la etapa de extensión. La sonda extendida puede unirse al reactivo de anclaje en una posición dentro de 10-100 um de la ubicación del complejo en la superficie. La etapa de extensión puede incluir PCR (reacción en cadena de la polimerasa), LCR (reacción en cadena de la ligasa), SDA (amplificación por desplazamiento de hebra), 3SR (reacción de síntesis autosostenida) o métodos de amplificación isotérmica. En un ejemplo particular, la etapa de extensión puede incluir métodos de amplificación isotérmica, por ejemplo, amplificación dependiente de helicasa o amplificación de círculo rodante (RCA).
El proceso de extensión de la modalidad (29) puede incluir poner en contacto el complejo formado en la etapa (a) con una secuencia conectora que comprende (i) una secuencia interior complementaria a la segunda sonda y (ii) dos secuencias de extremo complementarias a regiones no superpuestas de la primera sonda. El método puede incluir además ligar las dos secuencias de extremo del oligonucleótido conector para formar una secuencia diana circular que se hibrida tanto con la primera como con la segunda sonda. Alternativamente, el proceso de extensión puede incluir poner en contacto el complejo formado en la etapa (a) de la modalidad (29) con una primera secuencia de oligonucleótido conector que incluye una primera secuencia de sonda de conector complementaria a una primera región de la primera sonda y una primera región de la segunda sonda y un segundo oligonucleótido conector que comprende una segunda secuencia de sonda complementaria a una segunda región no superpuesta de la primera sonda y una segunda región no superpuesta de la segunda sonda; y, opcionalmente, ligar el primer y segundo oligonucleótidos conectores para formar una secuencia diana circular que se hibrida tanto con la primera como con la segunda sonda.
La superficie de la modalidad (29) puede incluir una partícula y/o un pocillo de una placa de múltiples pocillos. La superficie puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en dos dominios de unión distintos en la superficie. Si la superficie es un pocillo de una placa, el pocillo puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en dos dominios de unión distintos dentro del pocillo. La superficie también puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en el mismo dominio de unión en la superficie. Si la superficie es un pocillo de una placa, el pocillo puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en el mismo dominio de unión dentro del pocillo. El reactivo de captura y el reactivo de anclaje pueden estar dentro de 10-100 nm en la superficie. En un ejemplo específico, la superficie puede incluir un electrodo y la etapa de medición puede incluir aplicar una forma de onda de tensión al electrodo para generar una señal de electroquimioluminiscencia y, opcionalmente, el método de la modalidad (29) incluye además recolectar la partícula en un electrodo y aplicar una forma de onda de tensión al electrodo para generar una señal de electroquimioluminiscencia.
La etapa de medición de la modalidad (29) puede incluir unir la secuencia extendida a una sonda de detección que tiene una etiqueta detectable, medir la etiqueta detectable y correlacionar la medición con la cantidad de p24 en la muestra, en donde la sonda de detección comprende una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una región de la secuencia extendida. La etiqueta detectable puede medirse mediante una medición de dispersión de luz, absorbancia óptica, fluorescencia, quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, bioluminiscencia, fosforescencia, radioactividad, campo magnético o sus combinaciones. En un ejemplo particular, la etiqueta detectable es una etiqueta de ECL y la etapa de medición puede incluir medir una señal de ECL.
Modalidad (30): un kit para la detección de p24 de VIH en una muestra que comprende, en uno o más viales, contenedores o compartimentos: (a) una superficie que comprende (i) un reactivo de captura de p24 de VIH, y (ii) un reactivo de anclaje que comprende una secuencia de oligonucleótido de anclaje; (b) un primer reactivo de detección de p24 de VIH que se enlaza a una primera sonda de ácido nucleico; y (c) un segundo reactivo de detección de p24 de VIH que se enlaza a una segunda sonda de ácido nucleico.
El reactivo de captura de la modalidad (30) puede incluir un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o aptámero y, en un ejemplo específico, el reactivo de captura puede incluir un anticuerpo. Igualmente, el primer reactivo de detección puede incluir un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o aptámero y, en un ejemplo específico, el primer reactivo de detección puede incluir un anticuerpo. De manera similar, el segundo reactivo de detección puede incluir un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o aptámero y, en un ejemplo específico, el segundo reactivo de detección puede incluir un anticuerpo.
La superficie de la modalidad (30) puede incluir una partícula y/o un pocillo de una placa de múltiples pocillos. La superficie puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en dos dominios de unión distintos en la superficie. Si la superficie es un pocillo, el pocillo puede comprender una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en dos dominios de unión distintos dentro del pocillo. La superficie puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en el mismo dominio de unión en la superficie; y/o si la superficie es un pocillo, el pocillo puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en el mismo dominio de unión dentro del pocillo. El reactivo de captura y el reactivo de anclaje pueden estar dentro de 10-100 nm en la superficie. En un ejemplo específico, la superficie puede incluir un electrodo.
Modalidad (31): un método para detectar p24 de VIH en una muestra que comprende: (a) unir p24 de VIH a: (i) un reactivo de captura de p24 de VIH en una superficie que comprende el reactivo de captura y un reactivo de anclaje; (ii) un primer reactivo de detección de p24 de VIH que comprende una primera sonda de proximidad, y (iii) un segundo reactivo de detección de p24 de VIH que comprende una segunda sonda de proximidad; para formar de esta manera un complejo de detección en la superficie que comprende el reactivo de captura, p24 de VIH y el primer y segundo reactivos de detección; (b) poner en contacto el complejo de detección formado en (c) con una secuencia conectora que comprende (i) una secuencia interior complementaria a la segunda sonda de proximidad y (ii) dos secuencias de extremo complementarias a regiones no superpuestas de la primera sonda de proximidad; (c) hibridar la secuencia conectora con la primera y segunda sondas de proximidad; (d) ligar las dos secuencias de extremo del oligonucleótido conector para formar una secuencia diana circular que se hibrida tanto con la primera como con la segunda sonda de proximidad; (e) extender la segunda sonda de proximidad mediante amplificación de círculo rodante de la secuencia diana para generar un amplicón que comprende un dominio de unión que se une al reactivo de anclaje; (f) unir el amplicón al reactivo de anclaje; y (g) medir la cantidad de amplicón en la superficie.
Modalidad (32): un método para detectar p24 de VIH en una muestra que comprende: (a) unir p24 de VIH a: (i) un reactivo de captura de p24 de VIH en una superficie que comprende el reactivo de captura y un reactivo de anclaje; (ii) un primer reactivo de detección de p24 de VIH que comprende una primera sonda de proximidad, y (iii) un segundo reactivo de detección de p24 de VIH que comprende una segunda sonda de proximidad; para formar de esta manera un complejo de detección en la superficie que comprende el reactivo de captura, p24 de VIH y el primer y segundo reactivos de detección; (b) poner en contacto el complejo de detección formado en (c) con un primer oligonucleótido conector y un segundo oligonucleótido conector, en donde (i) un primer extremo del primer conector y un primer extremo del segundo conector son complementarios a dos regiones no superpuestas de la primera sonda de proximidad y (ii) un segundo extremo del primer conector y un segundo extremo del segundo conector son complementarios a dos regiones no superpuestas de la primera sonda de proximidad; (c) hibridar el primer y segundo oligonucleótidos conectores con la primera y segunda sondas de proximidad; (d) ligar el primer y segundo oligonucleótidos conectores para formar una secuencia diana circular que se hibrida tanto con la primera como con la segunda sonda de proximidad; (e) extender la segunda sonda de proximidad mediante amplificación de círculo rodante de la secuencia diana para generar un amplicón que comprende un dominio de unión que se une al reactivo de anclaje; (f) unir el amplicón al reactivo de anclaje; y (g) medir la cantidad de amplicón en la superficie.
El reactivo de captura de las modalidades (31) y (32) es un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero y, en un ejemplo específico, el reactivo de captura es un anticuerpo. De manera similar, el primer reactivo de detección es un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, por ejemplo, el primer reactivo de detección es un anticuerpo. Además, el segundo reactivo de detección es un anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, oligonucleótido, hapteno, epítopo, mimotopo o un aptámero, por ejemplo, el segundo reactivo de detección es un anticuerpo. En un ejemplo específico de las modalidades (31) y (32), el reactivo de captura y el primer y segundo reactivos de detección son anticuerpos contra p24 de VIH.
El reactivo de anclaje de las modalidades (31) y (32) puede incluir una secuencia de oligonucleótido, aptámero, ligando de aptámero, anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, hapteno, epítopo o un mimotopo. En un ejemplo, el dominio de unión puede incluir un aptámero y el reactivo de anclaje puede incluir un ligando de aptámero. El dominio de unión puede incluir una secuencia de ácido nucleico y el reactivo de anclaje puede incluir una proteína de unión a ADN; y/o el reactivo de anclaje puede incluir una secuencia de oligonucleótido y el amplicón puede incluir una secuencia de oligonucleótido complementaria.
El amplicón de las modalidades (31) y (32) puede incluir una o más secuencias de detección y la etapa de medición puede incluir poner en contacto la secuencia extendida con una pluralidad de sondas etiquetadas complementarias a la una o más secuencias de detección. Por otra parte, el amplicón puede comprender además una o más bases modificadas y la etapa de medición puede incluir poner en contacto la secuencia extendida con una pluralidad de restos detectables que pueden unirse a la una o más bases modificadas. Aún más, el amplicón puede incluir además una o más bases etiquetadas y la etapa de medición puede incluir detectar la presencia de la una o más bases etiquetadas. La una o más bases modificadas pueden comprender un aptámero, ligando de aptámero, anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, hapteno, epítopo o un mimotopo y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende una pareja de unión de la una o más bases modificadas y una etiqueta detectable. La una o más bases modificadas pueden comprender estreptavidina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende biotina y una etiqueta detectable; la una o más bases modificadas pueden comprender biotina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende estreptavidina y una etiqueta detectable; la una o más bases modificadas pueden comprender avidina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende biotina y una etiqueta detectable; y/o la una o más bases modificadas pueden comprender biotina y cada uno de la pluralidad de restos detectables comprende avidina y una etiqueta detectable.
La etapa (a) de las modalidades (31) y (32) puede incluir unir p24 de VIH a las siguientes especies en el siguiente orden: (i) el reactivo de captura en una superficie; y (ii) el primer y segundo reactivos de detección de p24 de VIH. Alternativamente, la etapa (a) puede incluir unir p24 de VIH a las siguientes especies en el siguiente orden: (i) el primer y segundo reactivos de detección de p24 de VIH; y (ii) el reactivo de captura en la superficie. Aún más, la etapa (a) puede incluir unir p24 de VIH a las siguientes especies de forma simultánea o sustancialmente simultánea: (i) el reactivo de captura en una superficie; y (ii) el primer y segundo reactivos de detección de p24 de VIH.
El amplicón de las modalidades (31) y (32) permanece localizado en la superficie después de la extensión de la sonda. El complejo puede permanecer unido a la superficie después de la etapa de extensión. Por ejemplo, el amplicón se une al reactivo de anclaje en una posición dentro de 10-100 um de la ubicación del complejo en la superficie.
La superficie de las modalidades (31) y (32) puede incluir una partícula y/o un pocillo de una placa de múltiples pocillos. La superficie puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en dos dominios de unión distintos en la superficie. Si la superficie es un pocillo de una placa, el pocillo puede comprender una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en dos dominios de unión distintos dentro del pocillo. La superficie puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en el mismo dominio de unión en la superficie. Si la superficie es un pocillo de una placa, el pocillo puede incluir una pluralidad de dominios de unión distintos y el reactivo de captura y el reactivo de anclaje se ubican en el mismo dominio de unión dentro del pocillo. En un ejemplo específico, el reactivo de captura y el reactivo de anclaje están dentro de 10-100 nm en la superficie.
Aún más, la superficie puede incluir un electrodo y la etapa de medición puede incluir aplicar una forma de onda de tensión al electrodo para generar una señal de electroquimioluminiscencia. En estas modalidades ((31) y (32)), el método puede incluir además recolectar la partícula en un electrodo y aplicar una forma de onda de tensión al electrodo para generar una señal de electroquimioluminiscencia. La etapa de medición puede incluir unir el amplicón a una sonda de detección que tiene una etiqueta detectable, medir la etiqueta detectable y correlacionar la medición con la cantidad de analito en la muestra, en donde la sonda de detección comprende una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una región del amplicón. La etiqueta detectable se mide mediante una medición de dispersión de luz, absorbancia óptica, fluorescencia, quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, bioluminiscencia, fosforescencia, radioactividad, campo magnético o sus combinaciones. Por ejemplo, la etiqueta detectable es una etiqueta de ECL y la etapa de medición puede incluir medir una señal de ECL.
Breve descripción de las figuras
Las Figuras 1(a)-(c) ilustran el uso de un reactivo de anclaje en un inmunoensayo. La Figura 1(a) muestra el uso de un reactivo de anclaje para unir y estabilizar un complejo de detección que comprende un reactivo de captura, un analito de interés y un reactivo de detección que incluye una sonda de ácido nucleico. La sonda de ácido nucleico se extiende para unirse al reactivo de anclaje. En la Figura 1(b), el reactivo de anclaje incluye una secuencia de oligonucleótido que incluye una región complementaria a una porción de la secuencia extendida que se forma en el reactivo de detección. La Figura 1(c) muestra una modalidad específica en la que se usan dos reactivos de detección para unir el analito, cada uno de los cuales incluye una sonda de ácido nucleico. Las sondas de los reactivos de detección se someten a un proceso de amplificación que permite la hibridación de una sonda extendida con la secuencia de oligonucleótido de anclaje.
La Figura 2(a) muestra una modalidad específica en la que el complejo inmunológico formado en una superficie portadora de un reactivo de anclaje se somete a un proceso de PLA-RCA para incorporar una pluralidad de especies detectables en la secuencia extendida unida al complejo inmunológico. Las Figuras 2(b) y 2(c) son dos configuraciones alternativas de oligonucleótidos de conexión.
La Figura 3 muestra un método para unir un oligonucleótido a una proteína.
La Figura 4(a) ilustra una modalidad preferida de la invención en la que se forma un complejo unido a la superficie entre un reactivo de captura, el analito y dos reactivos de detección, cada uno unido a una primera y segunda sondas de proximidad, respectivamente, que se ligan a sondas de conector para formar un molde de ADN circular que se amplifica mediante amplificación de círculo rodante. Circ-1, SEQ ID NO: 4; Circ-2, SEQ ID NO: 5; PP1, SEQ ID NO: 1 (cola poli-A truncada); PP2, SEQ ID NO: 2. La Figura 4(a) también incluye un reactivo de amplificación con una secuencia de oligonucleótido de anclaje que es complementaria a una secuencia del amplicón que se forma a medida que avanza el método de ensayo. La Figura 4(b) muestra una secuencia ilustrativa (SEQ ID NO: 4) de un molde de ADN circular Circ-1, con una secuencia de oligonucleótido de detección, la región inerte del amplicón y una porción PP2, que se hibrida con la segunda sonda de proximidad. La Figura 4(c) representa una modalidad con Circ-1 (SEQ ID NO: 4) y Circ-2 (SEQ ID NO: 5) hibridados con P1b+P1a (SEQ ID NO: 1) y P2a+P2b (SEQ ID NO: NO: 2).
Las Figuras 5 y 6(a)-(b) ilustran métodos alternativos para generar un amplicón que puede amplificarse mediante amplificación de círculo rodante.
La Figura 7 ilustra una modalidad alternativa en la que una porción de cada una de las sondas de proximidad en el complejo tipo sándwich está protegida temporalmente por hebras cortas de ARN hibridadas con cada segmento. Esas hebras se eliminan enzimáticamente para permitir que las sondas de proximidad se hibriden entre sí y la cadena se extienda.
La Figura 8 muestra una modalidad adicional en la que se unen sondas de proximidad al reactivo de captura y un reactivo de detección, y una porción de cada sonda de proximidad está protegida temporalmente por hebras cortas de ARN hibridadas con ellas, como se describió anteriormente en referencia a la Figura 7.
La Figura 9 muestra una curva de calibración de un ensayo de IL-10 realizado mediante el uso del método descrito en el Ejemplo 1.
Las Figuras 10(a)-(b) muestran imágenes de microscopía de fluorescencia con (a) y sin (b) el uso de un reactivo de anclaje.
La Figura 11(a) muestra la configuración de una secuencia de oligonucleótido conector lineal simple que incluye el sitio de ligación 1 o 2 y el uso de estos conectores en un ensayo. Circ-1, SEQ ID NO: 4; Circ-2, SEQ ID NO: 5; sonda de proximidad 1, SEQ ID NO: 1; sonda de proximidad 2, SEQ ID NO: 2. La Figura 11(b) compara un ensayo que usa una combinación de Circ-1 y Circ-2 frente al uso de una secuencia de oligonucleótido conector lineal simple con el sitio de ligación 1, o una secuencia de oligonucleótido conector lineal simple con el sitio de ligación 2.
La Figura 12 muestra una curva de calibración de un ensayo de p24 de VIH realizado mediante el uso del método descrito en los Ejemplos 1 y 6.
La Figura 13 muestra los resultados de un análisis de un panel de seroconversión mediante el uso del método descrito en los Ejemplos 1 y 6.
Descripción detallada de la invención
A menos que se defina de cualquier otra manera en la presente descripción, los términos científicos y técnicos usados con relación a la presente invención tendrán los significados que entienden comúnmente los expertos en la técnica. Además, a menos que de cualquier otra manera se requiera por el contexto, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. Los artículos "un" y "una" se usan en la presente descripción para referirse a uno o a más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A manera de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.
La presente invención incluye métodos de inmunoensayo mejorados que comprenden (i) anclar el complejo de detección formado entre el analito diana y uno o más reactivos de unión de analito usados en el ensayo; y/o (ii) amplificar la señal de los complejos de detección etiquetados. El anclaje puede usarse para estabilizar complejos que involucran interacciones de baja afinidad de unión y/o etiqueta(s) o sitio(s) de etiquetado de alto peso molecular. La amplificación de la señal puede lograrse mediante la unión de una sonda extendida al complejo de unión que contiene múltiples etiquetas o sitios de etiquetado de detección, para de esta manera amplificar la señal detectable de cada complejo de detección individual. En una modalidad preferida, el método incluye unir una sonda extendida que incluye múltiples etiquetas o sitios de etiquetado de detección al complejo de detección y anclar el complejo a la superficie para garantizar que el complejo se retenga en la superficie. Este método de ensayo modificado puede usarse para detectar un número extremadamente bajo de eventos de unión, incluso complejos individuales de reactivo de unión y analito. El enfoque básico no se limita a los inmunoensayos y puede usarse para llevar a cabo ensayos de unión mediante el uso de otras clases de reactivos de unión.
Un método que puede usarse para mejorar los ensayos de unión es el uso de un reactivo de anclaje unido a la superficie para adherir un complejo de detección que incluye el analito de interés a la superficie y para estabilizar el complejo de detección. Este enfoque puede usarse para superar las bajas afinidades de unión entre los reactivos que forman el complejo de detección y/o evitar que el complejo se disocie de la superficie antes del procesamiento posterior. El uso de un reactivo de anclaje en un ensayo de unión se ilustra en la Figura 1(a). La superficie (101) incluye un reactivo de captura (102) que se une al analito A y un reactivo de anclaje (103). En una o más etapas, el analito se une al reactivo de captura y un reactivo de detección (104) que también se une al analito, en donde el reactivo de detección se enlaza a una sonda de ácido nucleico (105). El analito puede unirse a los reactivos de captura y detección de forma simultánea o sustancialmente simultánea, o el analito puede unirse a cada uno de los reactivos de captura y detección secuencialmente (en cualquier orden). Por lo tanto, se forma un complejo (106) en la superficie que incluye el reactivo de captura, el analito y el reactivo de detección. La sonda se extiende para formar una secuencia extendida (107) que incluye una región de anclaje que se une al reactivo de anclaje. La secuencia extendida se une al reactivo de anclaje y se mide la cantidad de secuencia extendida unida a la superficie.
El experto en el campo de los ensayos de unión apreciará fácilmente el alcance de los reactivos de captura y las parejas de unión acompañantes que pueden usarse en los presentes métodos. Una lista no limitante de dichos pares incluye (en cualquier orden) pares de receptor/ligando, anticuerpos/antígenos, pares de receptor/ligando naturales o sintéticos, pares de hapteno/anticuerpo, pares de antígeno/anticuerpo, pares de epítopo/anticuerpo, pares de mimotopo/anticuerpo, pares de aptámero/molécula diana, parejas de hibridación y pares de intercalador/molécula diana. En una modalidad, los ensayos de unión emplean anticuerpos u otras proteínas receptoras como reactivos de captura y/o detección para un analito de interés. El término "anticuerpo" incluye moléculas de anticuerpos intactas (que incluyen anticuerpos híbridos ensamblados por reasociación in vitro de subunidades de anticuerpos), fragmentos de anticuerpos y construcciones de proteínas recombinantes que comprenden un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo (como se describe, por ejemplo, en Porter, R. R. y Weir, R. C. J. Cell Physiol., 67 (Supl.); 51-64 (1966) y Hochman, 1. Inbar, D. y Givol, D. Biochemistry 12: 1130 (1973)), así como también construcciones de anticuerpos que se han modificado químicamente, por ejemplo, mediante la introducción de una etiqueta detectable.
Igualmente, el reactivo de anclaje y el miembro o región de anclaje correspondiente pueden incluir cualquier par de unión adecuado, por ejemplo, pares de receptor/ligando, anticuerpos/antígenos, pares de receptor/ligando naturales o sintéticos, pares de hapteno/anticuerpo, pares de antígeno/anticuerpo, pares de epítopo/anticuerpo, pares de mimotopo/anticuerpo, pares de aptámero/molécula diana, parejas de hibridación, pares de intercalador/molécula diana, y el uso de un reactivo de superficie y de anclaje unido por carga electrostática. Por ejemplo, el reactivo de anclaje puede ser una secuencia de oligonucleótido, aptámero, ligando de aptámero, anticuerpo, antígeno, ligando, receptor, hapteno, epítopo o un mimotopo, y la región de anclaje correspondiente incluye una secuencia de oligonucleótido complementaria, ligando de aptámero, aptámero, antígeno, anticuerpo, receptor, ligando o anticuerpo, respectivamente. En una modalidad específica, la región de anclaje es una secuencia de oligonucleótido y el reactivo de anclaje comprende una proteína de unión al ADN. Alternativamente, si la región de anclaje es una secuencia de oligonucleótido bicatenaria, el reactivo de anclaje puede incluir un intercalador. En una modalidad adicional, la región de anclaje puede incluir una o más bases oligonucleotídicas modificadas y el reactivo de anclaje correspondiente incluye uno o más restos que se unen a las bases modificadas en la región de anclaje. Por ejemplo, las bases modificadas pueden incluir un hapteno o ligando y el reactivo de anclaje correspondiente incluye uno o más anticuerpos o ligandos específicos para el hapteno o ligando, respectivamente. Por otra parte, la región de anclaje puede incluir una pluralidad de bases nucleotídicas etiquetadas que pueden usarse para detectar el complejo de detección.
En una modalidad específica representada en la Figura 1(b), el reactivo de anclaje unido a la superficie incluye un oligonucleótido que se usa para anclar el complejo de detección a la superficie. La secuencia de oligonucleótido de anclaje se une a una secuencia de oligonucleótido complementaria que se une al complejo de detección. En esta modalidad, la superficie (108) incluye un reactivo de captura (109) que se une al analito, A, y un reactivo de anclaje (110) que comprende una secuencia de oligonucleótido de anclaje (111). En una o más etapas, el analito se une al reactivo de captura y un reactivo de detección (112) que también se une al analito, en donde el reactivo de detección se enlaza a una sonda de ácido nucleico (113). Como se describió anteriormente con referencia a la Figura 1(a), el analito puede unirse a los reactivos de captura y detección de forma simultánea o sustancialmente simultánea, o el analito puede unirse a cada uno de los reactivos de captura y detección secuencialmente (en cualquier orden). Por lo tanto, se forma un complejo (114) en la superficie que incluye el reactivo de unión, el analito y el reactivo de detección. La sonda se extiende para formar una secuencia extendida (115) que incluye un complemento de la secuencia de anclaje que es complementario a la secuencia de anclaje. La secuencia de anclaje se hibrida con el complemento de la secuencia de anclaje y se mide la cantidad de secuencia extendida unida a la superficie.
El complejo de detección puede incluir uno o más reactivos de detección, por ejemplo, para mejorar la especificidad de un ensayo para un analito. El uso de múltiples reactivos de detección puede mejorar la especificidad de un ensayo si, por ejemplo, el ensayo se diseña para emitir una señal detectable si cada uno de los reactivos de detección está próximo al analito o si la señal de un único reactivo de detección unido al analito se distingue de la señal emitida por múltiples reactivos de detección unidos al analito. En la Figura 1(c) se muestra una modalidad de un ensayo de este tipo. La superficie (116) incluye un reactivo de captura (117) que se une al analito A y un reactivo de anclaje (118) que incluye una secuencia de oligonucleótido de anclaje (119). En una o más etapas, el analito se une al reactivo de captura y a cada uno de los dos (o más) reactivos de detección (120 y 121, respectivamente) que se unen al analito, en donde cada uno del primer y segundo reactivos de detección se enlaza a una sonda de ácido nucleico (122 y 123, la primera y segunda sondas de ácido nucleico, respectivamente). El analito puede unirse a los reactivos de captura y detección de forma simultánea o sustancialmente simultánea, o de manera secuencial, por etapas. Por lo tanto, se forma un complejo (124) en la superficie que incluye el reactivo de captura, el analito y el primer y segundo reactivos de detección. Mediante el uso de un proceso de extensión que requiere que la primera y segunda sondas estén próximas entre sí, la primera sonda se extiende para formar una secuencia extendida (125) que comprende un complemento de la secuencia de anclaje que es complementario a la secuencia de anclaje. En la penúltima etapa, la secuencia de anclaje se hibrida con el complemento de la secuencia de anclaje y se mide la cantidad de secuencia extendida unida a la superficie.
Una modalidad específica del método representado en la Figura 1(c) se muestra en la Figura 2(a), en donde se usa un reactivo de anclaje para adherir el complejo de detección a la superficie y una sonda unida al complejo de detección se extiende para generar una región extendida que se une al reactivo de anclaje. En esta modalidad, el complejo se detecta mediante el uso de dos reactivos de detección unidos a sondas de proximidad. El método comprende además unir los reactivos de detección con una secuencia conectora que después se liga para formar una secuencia diana circular y se somete a amplificación de círculo rodante para generar un amplicón que se une al reactivo de anclaje. La superficie (201) incluye un reactivo de captura (202) y un reactivo de anclaje (203). En una o más etapas, el analito se une al reactivo de captura, un primer reactivo de detección (204) que comprende una primera sonda de proximidad (205) y un segundo reactivo de detección (206) que comprende una segunda sonda de proximidad (207), para formar de esta manera un complejo de detección (208) en la superficie. El complejo de detección se pone en contacto con dos secuencias conectoras (209a y 209b) que incluyen cada una, una secuencia de extremo complementaria a regiones no superpuestas de la primera sonda de proximidad y una secuencia de extremo complementaria a regiones no superpuestas de la segunda sonda de proximidad. Las secuencias conectoras se hibridan con la primera y segunda sondas de proximidad, y las secuencias de extremo de los oligonucleótidos conectores se ligan para formar una secuencia diana circular (210) que se hibrida con la primera y segunda sondas de proximidad. La segunda sonda de proximidad se extiende mediante hibridación de círculo rodante para generar un amplicón que comprende un reactivo de unión que se une al reactivo de anclaje y se mide la cantidad de amplicón unido a la superficie. La primera sonda de proximidad puede bloquearse, o modificarse de cualquier otra manera, para evitar la extensión de la primera sonda. (En una modalidad alternativa, la primera sonda de proximidad se extiende y la segunda sonda de proximidad puede bloquearse o modificarse de cualquier otra manera para evitar la extensión). En la modalidad representada en la Figura 2(a), el amplicón también incluye dos o más secuencias de detección que son complementarias a las sondas de detección etiquetadas que se hibridan con el amplicón y se usan para medir la cantidad de amplicón unido a la superficie. En una modalidad alternativa (no representada en la Figura 2(a)), el proceso de extensión incorpora bases nucleotídicas etiquetadas en el amplicón que se usan para detectar el amplicón en la superficie directamente, sin la adición de una o más sondas etiquetadas complementarias al amplicón. La Figura 2(b) es una representación esquemática de los componentes de las secuencias conectoras que muestra el primer y segundo oligonucleótidos conectores (209a y 209b, respectivamente), en donde un primer extremo del primer conector (C-i(E1)) y un primer extremo del segundo conector (C2(E1)) son complementarios a dos regiones no superpuestas de la primera sonda de proximidad, y un segundo extremo del primer conector (C1(E2)) y un segundo extremo del segundo conector (C2(E2)) son complementarios a dos regiones no superpuestas de la segunda sonda de proximidad. El primer y segundo conectores se hibridan con la primera y segunda sondas de proximidad y el primer y segundo conectores se ligan para formar una secuencia diana circular que se hibrida tanto con la primera como con la segunda sonda de proximidad.
La Figura 2(c) muestra una modalidad alternativa del conector. La secuencia conectora 211 incluye una secuencia interior (Cis) complementaria a la segunda sonda de proximidad y dos secuencias de extremo (Ce1 y Ce2, respectivamente) complementarias a regiones no superpuestas de la primera sonda de proximidad. En esta modalidad, solo se necesita un evento de ligación para formar una secuencia diana circular para la amplificación de círculo rodante (es decir, ligación de los extremos CE1 y CE2 hibridados con la primera sonda de proximidad), sin embargo, dado que el cebado/extensión es a partir de la segunda sonda de proximidad, se mantiene el requisito de proximidad de las dos sondas de proximidad. Preferentemente, la primera sonda de proximidad se bloquea, o se modifica de cualquier otra manera, para evitar la extensión de la primera sonda.
A continuación, la segunda sonda de proximidad se extiende mediante amplificación de círculo rodante de la secuencia diana circular para generar un amplicón que comprende una región de unión que se une al reactivo de anclaje y se mide la cantidad de amplicón unido a la superficie.
Las secuencias de la primera y segunda sondas de proximidad pueden diseñarse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, cada una de las sondas tiene aproximadamente 20-50 bases de longitud, preferentemente entre 25-40 bases de longitud y con la máxima preferencia entre aproximadamente 30-35 bases de longitud. La primera y segunda sondas de proximidad también incluyen secuencias complementarias a una o más secuencias conectoras o porciones de las mismas usadas en el proceso como se describe en la presente descripción. En una modalidad, el complejo de detección se pone en contacto con dos secuencias conectoras (209a y 209b) que incluyen cada una, una secuencia de extremo complementaria a regiones no superpuestas de la primera sonda de proximidad y una secuencia de extremo complementaria a regiones no superpuestas de la segunda sonda de proximidad. Por lo tanto, en esta modalidad, la primera y segunda sondas de proximidad incluyen cada una región no superpuesta complementaria a las secuencias de extremo de los conectores. Alternativamente, solo puede usarse un conector y la secuencia conectora (211) incluye una secuencia interior (Cis) complementaria a la segunda sonda de proximidad y dos secuencias de extremo (CE1 y CE2, respectivamente) complementarias a regiones no superpuestas de la primera sonda de proximidad. Por lo tanto, en esta modalidad, la primera sonda de proximidad incluye regiones no superpuestas complementarias a dos secuencias de extremo del conector, Ce1 y Ce2, respectivamente, y la segunda sonda de proximidad incluye una secuencia complementaria a una secuencia interior del conector (Cis). La primera sonda de proximidad puede bloquearse, o modificarse de cualquier otra manera, para evitar la extensión de la primera sonda. (En una modalidad alternativa, la primera sonda de proximidad se extiende y la segunda sonda de proximidad puede bloquearse o modificarse de cualquier otra manera para evitar la extensión).
Por lo tanto, las modalidades ilustradas en las Figuras 1-2 demuestran que puede modificarse un ensayo de unión para incorporar un reactivo de anclaje y/o puede amplificarse la señal de un complejo de detección. En una modalidad preferida, en un ensayo de unión se emplea un reactivo de anclaje y métodos de amplificación de la señal. Alternativamente, solo puede usarse uno u otro método para lograr un ensayo de unión mejorado. La invención, por lo tanto, incluye ensayos con métodos de amplificación de la señal como se describe en las Figuras 1-2, con omisión del reactivo de anclaje.
En aquellas modalidades en las que el reactivo de anclaje incluye una secuencia de anclaje que se une directa o indirectamente (por ejemplo, a través de reacciones de unión) a la superficie, pueden emplearse métodos establecidos en la técnica para inmovilizar oligonucleótidos para generar el reactivo de anclaje, que incluyen métodos de unión covalente y no covalente. En una modalidad, el reactivo de anclaje comprende una proteína enlazada o unida de cualquier otra manera a la secuencia de anclaje. En esta modalidad, puede usarse cualquier proteína que pueda inmovilizarse en una superficie (covalentemente o no covalentemente) y modificarse mediante un oligonucleótido de anclaje. Los ejemplos no limitantes incluyen estreptavidina, avidina o seroalbúmina bovina (BSA). En una modalidad preferida, el reactivo de anclaje comprende BSA. La proteína puede modificarse mediante un oligonucleótido de anclaje y unirse a una superficie mediante el uso de métodos conocidos, por ejemplo, como se ilustra en la Figura 3, mediante el uso de sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (Sulfo-SMCC), un agente reticulante heterobifuncional bien establecido. La reacción del grupo N-hidroxisuccinimida (NHS) de SMCC con seroalbúmina bovina (BSA) etiqueta la BSA con grupos maleimida reactivos con tiol. Los grupos maleimida, a su vez, reaccionan con oligonucleótidos modificados con tiol para formar conjugados BSA-oligonucleótido que se enlazan a través de enlaces tioéter estables. En un ejemplo específico, se forman matrices mediante la impresión de una serie de los conjugados BSA-oligonucleótido sobre superficies de carbono grafítico, preferentemente electrodos de tinta de carbono serigrafiados. Alternativamente, si la proteína es avidina o estreptavidina, la secuencia de anclaje puede enlazarse a biotina y unirse a avidina o estreptavidina inmovilizada a través de interacciones biotina-avidina o biotinaestreptavidina.
El oligonucleótido de anclaje unido al reactivo de anclaje puede ser cualquier secuencia que se hibridará con la secuencia extendida (o amplicón) que se desarrolla durante el proceso de extensión. El oligonucleótido de anclaje también puede comprender una región no complementaria (por ejemplo, una secuencia poli(A)) que se usa como secuencia enlazadora entre la superficie y la región complementaria (de hibridación) para extender la región complementaria más allá de la superficie. En una modalidad, se selecciona una secuencia de hibridación para regiones del amplicón que no están asociadas con la unión a las sondas de proximidad o detección (las regiones "inertes"). En una modalidad más específica, la secuencia de hibridación es complementaria a la longitud completa de la región inerte del amplicón que se incluye (preferentemente, aproximadamente 25 nucleótidos de longitud), sola o en combinación con un brazo poli(A) de, por ejemplo, hasta 30 nucleótidos de longitud. Preferentemente, el oligonucleótido de anclaje se selecciona de: (i) (complemento de longitud completa a la región inerte del amplicón, 25 nucleótidos de longitud) -(brazo poli(A) de 20 nucleótidos); o (ii) (complemento a una porción de la región inerte del amplicón, 15 nucleótidos de longitud) -(brazo poli(A) de 30 nucleótidos).
En una modalidad, se lleva a cabo una amplificación por ligación de proximidad (PLA) para extender la segunda sonda de proximidad. Como se describió anteriormente en referencia a las Figuras 2(a)-(c), el complejo que comprende las dos sondas de proximidad se pone en contacto con uno o más oligonucleótidos conectores (209a-209b o 211) y la ligación de las secuencias conectoras hibridadas forma un oligonucleótido circular que se usa después para extender la segunda sonda de proximidad mediante amplificación de círculo rodante (RCA) del círculo. Los diseños de sonda adecuados y las condiciones de amplificación para la amplificación por ligación de proximidad están bien establecidos en la técnica. Un aspecto único de la presente invención es la inclusión en uno de los conectores de la misma secuencia que se usa en el reactivo de anclaje. Durante la extensión de la segunda sonda de proximidad, la región extendida incluye de esta manera el complemento de la secuencia de anclaje, que se hibrida con el reactivo de anclaje, para estabilizar de esta manera el complejo tipo sándwich y evitar la disociación de la segunda sonda de proximidad. La segunda sonda de proximidad extendida puede contener etiquetas detectables (por ejemplo, mediante la inclusión de nucleótidos etiquetados durante la reacción de extensión RCA) que pueden medirse para determinar la cantidad de analito en la superficie. Alternativamente, se añade una pluralidad de sondas etiquetadas que comprenden etiquetas detectables y se hibridan con la segunda sonda de proximidad extendida, y se mide la cantidad de analito unido a la superficie Weibrecht y otros (Expert Review of Proteomics 7(3):401-409, 2010) describen una PLA que usa RCA.
Puede usarse cualquier técnica de amplificación adecuada para generar la secuencia extendida (o amplicón), que incluye, pero sin limitarse a, PCR (reacción en cadena de la polimerasa), LCR (reacción en cadena de la ligasa), SDA (amplificación por desplazamiento de hebra), 3SR (reacción de síntesis autosostenida) y métodos de amplificación isotérmica, por ejemplo, amplificación dependiente de helicasa y amplificación de círculo rodante (RCA). En una modalidad preferida, se usa RCA porque tiene ventajas significativas en términos de sensibilidad, adaptación a formato múltiple, intervalo dinámico y escalabilidad. Las técnicas de RCA se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, Baner y otros, NucleicAcids Research, 26:50735078, 1998; Lizardi y otros, Nature Genetics 19:226, 1998; Schweitzer y otros. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:10113 119, 2000; Faruqi y otros, BMC Genomics 2:4, 2000; Nallur y otros, Nucl. Acids Res. 29:e118, 2001; Dean y otros, Genome Res. 11:10951099, 2001; Schweitzer y otros, Nature Biotech. 20:359365, 2002; patentes de Estados Unidos núm. 6,054,274, 6,291,187, 6,323,009, 6,344,329 y 6,368,801). Se conocen varias variantes diferentes de RCA, que incluyen RCA lineal (LRCA) y RCA exponencial (ERCA). RCA genera muchos miles de copias de un molde circular, con la cadena de copias unida al ADN diana original, lo que permite la resolución espacial de la diana y la rápida amplificación de la señal. RCA facilita (i) la detección de moléculas diana individuales; (ii) la amplificación de señales de proteínas, así como también de ADN y ARN; (iii) la identificación de la ubicación de moléculas que se han amplificado en una superficie sólida; (iv) la medición de muchas dianas diferentes de forma simultánea; y (v) el análisis de una o más dianas en solución o fase sólida. La localización espacial de los productos de RCA con el complejo de detección es especialmente ventajosa cuando se realizan ensayos de unión en formato múltiple en una matriz o formato basado en partículas.
En la Figura 4(a) se representa una modalidad específica de la invención en la que se usan tanto un reactivo de anclaje como un proceso de amplificación de la señal. La Figura 4(a) representa un complejo formado en una superficie (401) entre un reactivo de captura (402), el analito (403) y dos reactivos de detección (304 y 305), cada uno de los cuales incluye una primera sonda de proximidad (406) (PP1, SEQ ID NO: 1) y una segunda sonda de proximidad (407) (PP2, SEQ ID NO: 2), respectivamente. Se añaden el primer y segundo oligonucleótidos conectores Circ-1 (408) (SEQ ID NO: 4) y Circ-2 (409) (SEQ ID NO: 5) que, cuando ambas sondas de proximidad están presentes en el complejo, se hibridan cada una con Circ-1 y Circ-2, lo que crea un puente entre las dos sondas de proximidad. Las sondas de conector unidas se ligan en los sitios de ligación 1 y 2 (410 y 411), respectivamente, para formar un molde de ADN circular (412). El molde de ADN circular se amplifica mediante amplificación de círculo rodante para extender la segunda sonda de proximidad y, de esta manera, generar un amplicón que comprende una o más secuencias de detección (413) y un complemento de la secuencia de oligonucleótido de anclaje (414) (que incluye un complemento de la secuencia de anclaje parcial (415)). La secuencia de oligonucleótido de anclaje (416) (unida a un resto de captura (417)) y su complemento se hibridan, una pluralidad de sondas de detección se hibridan con la pluralidad de secuencias de sondas de detección y se mide la cantidad de analito unido a la superficie (no se muestra, pero se ilustra en la Figura 1(a)). La Figura 4(b) muestra una secuencia ilustrativa del primer molde de ADN circular Circ-1 (408) (SEQ ID NO: 4) que tiene una porción diseñada para hibridarse con la primera sonda de proximidad (PP1), una secuencia de oligonucleótido de detección, una región inerte del amplicón (que puede usarse en su totalidad o en parte para unirse a la secuencia de oligonucleótido de anclaje) y una porción PP2 (que está diseñada para hibridarse con la segunda sonda de proximidad). En la Figura 4(c) se representa una modalidad adicional, en la que el molde de ADN circular (que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5) se amplifica mediante amplificación de círculo rodante para generar un amplicón que comprende una pluralidad de secuencias de detección (418 y 419, respectivamente). Debe entenderse que las colas poli-A de las sondas de proximidad PP1 y PP2 como se describen en las Figuras, tales como la Figura 4(c), pueden variar en el número de repeticiones de alanina que se muestran específicamente en las Figuras, con relación a las secuencias de PP1 y/o PP2 descritas, sin pretender alterar las secuencias descritas en la presente descripción.
En una modalidad adicional de la invención representada en la Figura 4(a), la secuencia de oligonucleótido de anclaje (416), unida al resto de captura 417, puede actuar como cebador, con un extremo 3' libre. En esta modalidad, la segunda sonda de proximidad incluye una secuencia que es complementaria a la secuencia de detección (413).
En la Figura 5 se ilustra otro enfoque para generar una secuencia diana que se amplifica mediante RCA o cualquier método de amplificación adecuado. En esta modalidad, cada una de las sondas de proximidad puede plegarse en una estructura de horquilla y bucle. La formación de estas estructuras de horquilla genera un bucle monocatenario y una porción bicatenaria que contiene una señal de recombinación. Se añade recombinasa para impulsar la recombinación de las dos estructuras de horquilla para formar un molde de ADN circular, que subsecuentemente se somete a RCA como se describió anteriormente. El amplicón se etiqueta y opcionalmente se ancla a un reactivo de anclaje y se detecta el analito. El elemento clave de esta modalidad es la capacidad de las recombinasas para catalizar la recombinación específica de sitio de ADN que contiene sitios de recombinación específicos de secuencia. Por ejemplo, la recombinasa Cre del bacteriófago PI cataliza la recombinación en sitios que contienen sitios loxP y otros ejemplos no limitantes incluyen, pero no se limitan a Flipasa (flp, de levadura), Hin (Salmonella) y Tre, una versión manipulada (desarrollada) de Cre. Este enfoque alternativo no requiere la adición de componentes adicionales tales como moldes oligonucleotídicos, ATP y dNTP. En esta modalidad, los sitios loxP (recombinación) se modifican preferentemente de modo que no sean simétricos, lo que da como resultado un desplazamiento en el equilibrio normal hacia la formación del producto recombinado deseado. Esto se ilustra en la Figura 5, con el sombreado claro/oscuro de los sitios de recombinación.
Por otra parte, la Figura 6(a) ilustra otro método más para generar una secuencia diana que se amplifica mediante RCA o cualquier método de amplificación adecuado. Cada una de las sondas de proximidad unidas a los reactivos de detección incluye un sitio loxP que permite la recombinación específica de sitio entre los dos oligonucleótidos mediante la recombinasa Cre, lo que da como resultado la formación de una nueva secuencia de oligonucleótido compuesta por la porción 5' de una sonda de proximidad y la porción 3' de la otra sonda de proximidad, que flanquea los sitios lox P. La secuencia diana recién creada puede amplificarse subsecuentemente mediante cualquier método adecuado, etiquetarse, anclarse opcionalmente y detectarse como se describió anteriormente. La Figura 6(a) ilustra esta modalidad que usa el promotor de la ARN polimerasa de T7 como el elemento factible para la amplificación. También se entenderá que otros sitios de ARN polimerasa tales como T3 y SP6 enlazados en las porciones 3 o 5' de las sondas de proximidad, son igualmente adecuados para el uso en este método. En esta modalidad, los sitios loxP (recombinación) se modifican preferentemente de modo que no sean simétricos, lo que da como resultado un desplazamiento en el equilibrio normal hacia la formación del producto recombinado deseado. Como se muestra en la Figura 6(b), el método también puede usarse para generar un molde de ADN circular que puede usarse en RCA.
La invención incluye un método para detectar un analito que comprende unir el analito a un reactivo de captura en una superficie y dos reactivos de detección para formar un complejo de detección. El método comprende medir el complejo de detección, en donde el método de medición mide preferentemente los complejos que comprenden ambos reactivos de detección, con relación a los complejos que comprenden solo uno de los dos reactivos de detección. En una modalidad, el método comprende formar el complejo y después reticular los reactivos de detección y detectar los reactivos reticulados. Puede usarse cualquier química de reticulación adecuada para unir los componentes del complejo de detección. Por ejemplo, el primer y segundo reactivos de detección pueden incluir restos reactivos que reaccionan con y se unen mediante la adición de un agente de reticulación multifuncional que se enlaza a los restos reactivos. En esta modalidad, los restos reactivos y el agente de reticulación pueden incluir una amina, tiol, hidrazida, aldehído, éster, yodoacetamida, maleimida, reactivos de química clic y sus combinaciones. En otra modalidad, el primer y segundo reactivos de detección pueden incluir restos de unión y el agente de reticulación es una pareja de unión multivalente de los restos de unión. Varios ejemplos no limitantes de esta modalidad incluyen: (a) el primer y segundo reactivos de detección son anticuerpos de una especie animal y el agente de reticulación es un anticuerpo antiespecie multivalente dirigido a anticuerpos de la especie animal; (b) el primer y segundo reactivos de detección comprenden biotina y el agente de reticulación es estreptavidina (o viceversa); (c) el primer y segundo reactivos de detección se enlazan a estreptavidina y el agente de reticulación es un polímero que comprende una pluralidad de moléculas de biotina (o viceversa); o (d) el primer y segundo reactivos de detección comprenden una primera y segunda sondas de ácido nucleico, respectivamente, y el agente de reticulación es un oligonucleótido que comprende una secuencia complementaria a la primera sonda de ácido nucleico y una secuencia separada complementaria a la segunda sonda de ácido nucleico.
En una modalidad específica, un analito de interés en una muestra puede detectarse mediante la unión del analito a un reactivo de captura inmovilizado, un primer reactivo de detección y un segundo reactivo de detección para formar un complejo, en donde el primer reactivo de detección comprende una primera etiqueta detectable y una primera sonda de ácido nucleico y el segundo reactivo de detección comprende una segunda etiqueta detectable y una segunda sonda de ácido nucleico. En esta modalidad, el primer y segundo reactivos de detección se reticulan mediante (i) hibridación de la primera sonda con la segunda sonda, (ii) hibridación de la primera y segunda sondas con un tercer ácido nucleico que tiene regiones complementarias a la primera y segunda sondas, o (iii) ligación de la primera y segunda sondas.
Los productos reticulados pueden detectarse una vez que se unen a la superficie, u opcionalmente, los productos reticulados pueden liberarse de la superficie a un eluyente y detectarse. Con respecto a esto, solo se cuentan los productos reticulados individuales en el eluyente que incluyen tanto la primera como la segunda etiqueta detectable. Puede emplearse cualquier método de detección adecuado para detectar la presencia de etiquetas en el eluyente. En una modalidad preferida, la etiqueta es una molécula fluorescente y los productos reticulados etiquetados presentes en el eluyente se cuentan mediante detección de fluorescencia de moléculas individuales, por ejemplo, espectroscopía de correlación de fluorescencia y/o espectroscopía de correlación cruzada de fluorescencia. En esta modalidad, la detección de fluorescencia de moléculas individuales comprende hacer fluir el eluyente a través de un capilar, enfocar una fuente de luz en un volumen dentro del capilar para crear una zona de interrogación y observar la zona de interrogación con un detector de luz para detectar el paso de moléculas fluorescentes a través de la zona de interrogación. El método de detección puede comprender además detectar una primera señal de fluorescencia asociada con la primera etiqueta y una segunda señal de fluorescencia asociada con la segunda etiqueta, y contar los eventos de detección cuando ambas señales se detectan desde la zona de interrogación. Alternativamente, una etiqueta es un donante de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) y la otra etiqueta es un aceptor de FRET y el método de detección puede comprender además excitar donantes de FRET en la zona de interrogación y detectar señales de fluorescencia del aceptor de FRET.
En una modalidad específica, un analito en una muestra puede detectarse mediante la unión del analito a un reactivo de captura inmovilizado, un primer reactivo de detección y un segundo reactivo de detección para formar un complejo, en donde el primer reactivo de detección comprende una primera sonda de ácido nucleico, el segundo reactivo de detección comprende una segunda sonda de ácido nucleico; extensión de la segunda sonda de ácido nucleico para formar una secuencia extendida que comprende una etiqueta detectable, la extensión depende de la colocalización de la primera y segunda sondas de ácido nucleico en el complejo; liberación de la secuencia extendida de la superficie a un eluyente; y recuento de las secuencias extendidas individuales en el eluyente. La etapa de extensión puede incluir unir la sonda a una secuencia de ácido nucleico molde y extender la sonda mediante reacción en cadena de la polimerasa. Alternativamente, la etapa de extensión comprende unir la primera sonda a una secuencia de ácido nucleico molde, formar un molde de ácido nucleico circular y extender el molde circular mediante amplificación de círculo rodante. La etapa de extensión también puede comprender unir la primera sonda a una secuencia de ácido nucleico molde, unir la segunda sonda a la secuencia molde y ligar la primera y segunda sondas.
En los métodos de la invención que emplean reactivos de captura, los reactivos de captura pueden inmovilizarse directamente sobre fases sólidas o pueden inmovilizarse indirectamente a través de reactivos de unión secundarios, tales como reactivos de direccionamiento como se describe a continuación. Por ejemplo, un reactivo de captura puede enlazarse a o comprender un reactivo de direccionamiento que se une a un complemento del reactivo de direccionamiento inmovilizado en la fase sólida. La unión de un reactivo de direccionamiento a su complemento puede ser directa (por ejemplo, el reactivo de direccionamiento puede ser estreptavidina y el complemento puede ser biotina) o indirecta a través de un agente puente (por ejemplo, el reactivo de direccionamiento y el complemento pueden ser biotina, y el reactivo puente puede ser un receptor de unión a biotina multivalente tal como la estreptavidina). En una modalidad, un agente de direccionamiento y su complemento comprenden un primer oligonucleótido y un oligonucleótido complementario, un par receptor-ligando, un par antígeno-anticuerpo, un par hapteno-anticuerpo, un par epítopo-anticuerpo, un par mimotopo-anticuerpo, un par aptámero-molécula diana, parejas de hibridación o un par intercalador-molécula diana. Los agentes de direccionamiento y los complementos usados en un ensayo se seleccionan de manera que los agentes de direccionamiento y los complementos asociados con un reactivo de captura o detección de un analito medido por el ensayo sustancialmente no reaccionen de forma cruzada con los agentes de direccionamiento y los complementos asociados con los reactivos de captura o detección de los otros analitos medidos por el ensayo. Por ejemplo, la unión de un reactivo de unión a su dominio de unión asociado (a través de su agente de direccionamiento y complemento de agente de direccionamiento asociados) debería ser sustancialmente mayor que su unión a dominios de unión asociados con otros analitos (y que presentan complementos de agentes de direccionamiento diferentes). Preferentemente, la reactividad cruzada para la unión de reactivos de captura o detección de un analito a dominios de unión asociados con otros analitos con relación a la unión al dominio de unión correcto es < 1 %, con mayor preferencia < 0,1 % y con mayor preferencia < 0,01 %. En una modalidad preferida, el agente de direccionamiento/complemento de agente de direccionamiento comprende un par de oligonucleótidos que incluye secuencias complementarias y el agente de direccionamiento y su complemento se ponen en contacto en condiciones suficientes para hibridar el agente de direccionamiento con su complemento.
Cuando se usan agentes de direccionamiento, existe cierta flexibilidad en cuanto a cuándo el reactivo de captura usado en un método de ensayo se inmoviliza sobre una fase sólida. En una modalidad, el reactivo de captura se proporciona al usuario preinmovilizado sobre una fase sólida a través de una interacción agente de direccionamiento - complemento de agente de direccionamiento. En otra modalidad, un reactivo de captura enlazado a un agente de direccionamiento y una fase sólida que soporta un complemento de agente de direccionamiento inmovilizado se proporcionan como componentes separados. Por lo tanto, el método de ensayo comprende además la etapa de inmovilizar el reactivo de captura sobre la fase sólida mediante la unión del agente de direccionamiento a su complemento (directamente o a través del uso de un agente puente). Esta etapa puede llevarse a cabo antes, simultáneamente o después de las etapas asociadas con la formación de un complejo de detección.
Una amplia variedad de superficies son adecuadas para el uso en los métodos de la presente invención, que incluyen las superficies convencionales de la técnica de ensayos de unión. Las superficies pueden estar hechas de una variedad de materiales diferentes que incluyen polímeros (por ejemplo, poliestireno y polipropileno), cerámica, vidrio, materiales compuestos (por ejemplo, compuestos de carbono-polímero tales como tintas basadas en carbono). Las superficies adecuadas incluyen las superficies de objetos macroscópicos, tales como una superficie interior de un contenedor de ensayo (por ejemplo, tubos de ensayo, cubetas, celdas de flujo, clasificador de células de FACS, cartuchos, pocillos en una placa de múltiples pocillos, etc.), portaobjetos, chips de ensayo (tales como los que se usan en las mediciones de chips de proteínas o genes), pines o sondas, perlas, medios de filtración, medios de flujo lateral (por ejemplo, membranas de filtración usadas en tiras de prueba de flujo lateral), etc.
Las superficies adecuadas también incluyen partículas (que incluyen, pero no se limitan a coloides o perlas) usadas comúnmente en otros tipos de ensayos basados en partículas, por ejemplo, partículas magnéticas, de polipropileno y látex, materiales usados típicamente en síntesis en fase sólida, por ejemplo, partículas de poliestireno y poliacrilamida, y materiales usados típicamente en aplicaciones cromatográficas, por ejemplo, sílice, alúmina, poliacrilamida, poliestireno. Los materiales también pueden ser una fibra, tal como una fibrilla de carbono. Las micropartículas pueden ser inanimadas o, alternativamente, pueden incluir entidades biológicas animadas tales como células, virus, bacterias y similares. Una partícula usada en el presente método puede estar compuesta por cualquier material adecuado para la unión a uno o más reactivos de captura o detección, y que puede recolectarse mediante, por ejemplo, centrifugación, gravedad, filtración o recolección magnética. Se vende comercialmente una amplia variedad de diferentes tipos de partículas que pueden unirse a los reactivos de captura o detección para el uso en ensayos de unión. Estos incluyen partículas no magnéticas, así como también partículas que comprenden materiales magnetizables que permiten que las partículas se recolecten con un campo magnético. En una modalidad, las partículas están compuestas por un material conductor y/o semiconductor, por ejemplo, partículas de oro coloidal. Las micropartículas pueden tener una amplia variedad de tamaños y formas. A manera de ejemplo y no de limitación, las micropartículas pueden tener entre 5 nanómetros y 100 micrómetros. Preferentemente, las micropartículas tienen tamaños entre 20 nm y 10 micrómetros. Las partículas pueden ser esféricas, oblongas, en forma de varilla, etc., o pueden tener forma irregular.
Las partículas usadas en el presente método pueden codificarse de modo que permitan la identificación de partículas o subpoblaciones de partículas específicas en una mezcla de partículas. El uso de tales partículas codificadas se ha usado para permitir la adaptación a formato múltiple de ensayos que emplean partículas como soportes de fase sólida para ensayos de unión. En un enfoque, las partículas se fabrican de modo que incluyan uno o más colorantes fluorescentes y las poblaciones de partículas específicas se identifican en base a la intensidad y/o la intensidad relativa de las emisiones de fluorescencia a una o más longitudes de onda. Este enfoque se ha usado en los sistemas Luminex xMAP (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 6,939,720) y los sistemas de matrices Cytometric Bead de Becton Dickinson. Alternativamente, las partículas pueden codificarse a través de diferencias en otras propiedades físicas tales como tamaño, forma, patrones ópticos incrustados y similares. Una o más partículas proporcionadas en una mezcla o conjunto de partículas pueden codificarse de modo que puedan distinguirse de otras partículas en la mezcla en virtud de las propiedades ópticas, tamaño, forma, patrones ópticos incrustados y similares, de las partículas.
En una modalidad específica, los métodos de la invención pueden usarse en un formato múltiple mediante la unión de una pluralidad de analitos diferentes a una pluralidad de reactivos de captura de esos analitos, los analitos de captura se inmovilizan sobre una perla codificada, de manera que la codificación identifique el reactivo de captura (y analito diana) de una perla específica. El método puede comprender además contar el número de perlas que tienen un analito unido (mediante el uso de los enfoques de detección descritos en la presente descripción).
Alternativamente o adicionalmente, el complejo de detección y/o los reactivos de captura pueden unirse, directa o indirectamente, a diferentes dominios de unión discretos en una o más fases sólidas, por ejemplo, como en una matriz de unión en donde los dominios de unión son elementos de matriz individuales, o en un conjunto de perlas en donde los dominios de unión son las perlas individuales, de manera que se generen señales de ensayo discretas y se midan a partir de cada dominio de unión. Si los reactivos de captura de analitos diferentes se inmovilizan en dominios de unión diferentes, los analitos diferentes unidos a esos dominios pueden medirse independientemente. En un ejemplo de una modalidad de este tipo, los dominios de unión se preparan mediante la inmovilización, sobre una o más superficies, de dominios discretos de reactivos de captura que se unen a analitos de interés. Opcionalmente, la(s) superficie(s) puede(n) definir, en parte, uno o más límites de un contenedor (por ejemplo, una celda de flujo, pocilio, cubeta, etc.) que contiene la muestra o a través del cual pasa la muestra. En una modalidad preferida, se forman dominios de unión individuales sobre electrodos para el uso en ensayos electroquímicos o electroquimioluminiscentes. La medición en formato múltiple de analitos en una superficie que comprende una pluralidad de dominios de unión mediante el uso de electroquimioluminiscencia se ha usado en la línea de productos de Meso Scale Diagnostics, LLC, MULTI-ARRAY® y SECTOR® Imager (ver, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núms. 7,842,246 y 6,977,722.
Aún más, el complejo de detección y/o los reactivos de captura pueden unirse, directa o indirectamente, a la superficie de un electrodo, que opcionalmente incluye diferentes dominios de unión discretos, como se describió anteriormente. La superficie del electrodo puede ser un componente de una placa de múltiples pocillos y/o una celda de flujo. Los electrodos pueden comprender un material conductor, por ejemplo, un metal tal como oro, plata, platino, níquel, acero, iridio, cobre, aluminio, una aleación conductora o similar. También pueden incluir metales recubiertos con óxido, por ejemplo, aluminio recubierto con óxido de aluminio. El electrodo puede incluir electrodos de trabajo y contraelectrodos que pueden estar hechos de materiales iguales o diferentes, por ejemplo, un contraelectrodo de metal y un electrodo de trabajo de carbono. En una modalidad específica, los electrodos comprenden materiales basados en carbono tales como carbón, negro de carbón, carbono grafítico, nanotubos de carbono, fibrillas de carbono, grafito, grafeno, fibras de carbono y sus mezclas. En una modalidad, los electrodos comprenden carbono elemental, por ejemplo, grafítico, negro de carbón, nanotubos de carbono, etc. Ventajosamente, pueden incluir compuestos de carbono-polímero conductores, partículas conductoras dispersas en una matriz (por ejemplo, tintas de carbono, pastas de carbono, tintas metálicas, tintas de grafeno) y/o polímeros conductores. Una modalidad específica de la invención es un módulo de ensayo, preferentemente una placa de múltiples pocillos, que tiene electrodos (por ejemplo, electrodos de trabajo y/o contraelectrodos) que comprenden carbono, por ejemplo, capas de carbono y/o capas serigrafiadas de tintas de carbono.
La invención incluye métodos para detectar y contar complejos de detección individuales. En una modalidad específica, la superficie puede comprender una pluralidad de reactivos de captura de una o más moléculas de analito que están presentes en una muestra y la pluralidad de reactivos de captura se distribuyen en una pluralidad de regiones de unión resolubles colocadas en la superficie. En las condiciones usadas para llevar a cabo y analizar una medición, una "región de unión resoluble" es el área superficial mínima asociada con un evento de unión individual que puede resolverse y diferenciarse de otra área en la que está ocurriendo un evento de unión individual adicional. Por lo tanto, el método consiste en unir la una o más moléculas de analito a uno o más reactivos de captura en la superficie, determinar la presencia o ausencia de una molécula de analito en una pluralidad de regiones de unión resolubles en la superficie e identificar el número de regiones de unión resolubles que contienen una molécula de analito y/o el número de dominios de analito que no contienen una molécula de analito.
Las regiones de unión resolubles pueden interrogarse ópticamente, en su totalidad o en parte, es decir, cada región de unión resoluble individual puede interrogarse ópticamente individualmente y/o puede obtenerse una imagen de la superficie completa que comprende una pluralidad de regiones de unión resolubles y uno o más píxeles o agrupaciones de píxeles dentro de esa imagen pueden asignarse a una región de unión individual resoluble. Una región de unión resoluble también puede ser una micropartícula dentro de una pluralidad de micropartículas. Las regiones de unión resolubles que exhiben cambios en su firma óptica pueden identificarse mediante un sistema de detección óptica convencional. En dependencia de la especie detectada (por ejemplo, tipo de entidad de fluorescencia, etc.) y las longitudes de onda operativas, pueden emplearse filtros ópticos diseñados para una longitud de onda particular para la interrogación óptica de las regiones de unión resolubles. En modalidades en donde se usa interrogación óptica, el sistema puede comprender más de una fuente de luz y/o una pluralidad de filtros para ajustar la longitud de onda y/o la intensidad de la fuente de luz. En algunas modalidades, la señal óptica de una pluralidad de regiones de unión resolubles se captura mediante el uso de una cámara CCD. Otros ejemplos no limitantes de sistemas de obtención de imágenes de cámara que pueden usarse para capturar imágenes incluyen dispositivos de inyección de carga (CID), dispositivos semiconductores complementarios de óxido metálico (CMOS), dispositivos CMOS científicos (sCMOS) y dispositivos de integración de retardo de tiempo (TDI), como conocerán los expertos en la técnica. En algunas modalidades, puede usarse un sistema de espejos de barrido acoplado con un fotodiodo o tubo fotomultiplicador (PMT) para la obtención de imágenes.
La etapa de medición del método puede comprender la obtención de imágenes de una señal óptica de la superficie (o una porción de la misma) para generar una imagen que consiste en una pluralidad de píxeles, en donde cada región de unión resoluble se asigna a uno o más píxeles o grupos de píxeles en la imagen. El análisis de imágenes para identificar los píxeles o conjuntos de píxeles que tienen una señal indicativa de un evento de unión (complejo de detección) puede realizarse mediante el uso de métodos reconocidos en la técnica, por ejemplo, la gran cantidad de algoritmos de análisis de imágenes y programas informáticos disponibles para identificar y contar estructuras biológicas etiquetadas en imágenes de microscopía de fluorescencia. En una modalidad, después de filtrar la imagen para eliminar gradientes de señal a gran escala, la imagen se convierte en una imagen binaria mediante el uso de un umbral de segmentación. Las regiones de unión resolubles se encuentran mediante la identificación de regiones contiguas de intensidad por encima del umbral. Los dominios de unión se clasifican como eventos de unión si cumplen con los requisitos de tamaño e intensidad.
En una modalidad, las regiones de unión resolubles son elementos de una matriz. En una modalidad preferida, la matriz es una matriz de micropocillos o nanopocillos, por ejemplo, depresiones o pocillos individuales de un sustrato unitario. Preferentemente, el volumen de los pocillos es menor que 100 nl, preferentemente menor que 50 nl. En una modalidad, el volumen de los pocillos varía de aproximadamente 10 al - 100 pl. Opcionalmente, los pocillos pueden configurarse de modo que contengan una micropartícula.
En una modalidad, al menos 50 % de las regiones de unión resolubles colocadas sobre un sustrato y abordadas durante un ensayo contienen cero o una molécula de analito. Preferentemente, al menos 80 %, con mayor preferencia al menos 95 % y con la máxima preferencia al menos 99 % de las regiones de unión resolubles contienen cero o más moléculas de analito. La concentración de moléculas de analito en la muestra se determina al menos en parte mediante el uso de una curva de calibración, un análisis de distribución de Poisson y/o un análisis de distribución de Gauss del número de regiones de unión que contienen al menos una o una molécula de analito. En una modalidad específica, la superficie comprende una pluralidad de partículas, cada una de las cuales incluye una pluralidad de reactivos de captura de una molécula de analito y la pluralidad de partículas se distribuye en una pluralidad de regiones de unión resolubles (por ejemplo, una matriz de micro- o nanopocillos). Por lo tanto, el método incluye: (i) unir una o más moléculas de analito a uno o más reactivos de captura en la superficie, (ii) distribuir la pluralidad de partículas en una matriz de regiones de unión resolubles; y (iii) determinar la presencia o ausencia de una molécula de analito en cada una de las regiones de unión resolubles, para identificar el número de dominios de unión que contienen una molécula de analito y/o el número de dominios de unión que no contienen una molécula de analito.
También puede ser ventajoso detectar un analito en un volumen confinado mediante el uso de uno o más de los métodos de la presente invención. En estas modalidades, una molécula de analito en una muestra se une a un par de reactivos de detección, cada uno portador de etiquetas distinguibles, y los analitos se distribuyen en una pluralidad de ubicaciones, por ejemplo, pocillos o recipientes de reacción (denominados en la presente descripción "recipientes de reacción"), sobre un sustrato, por ejemplo, una placa, plato, chip, fibra óptica, etc., de modo que la mayoría de los recipientes de reacción contengan uno o menos analitos. Este método permite al usuario detectar la molécula de analito mediante el recuento del número de recipientes de reacción que contienen cada una de las etiquetas distinguibles unidas al analito. En algunos casos, la pluralidad de recipientes de reacción abordados es una porción o esencialmente la totalidad de la cantidad total de recipientes de reacción que pueden contener al menos una molécula de analito (por ejemplo, asociada con al menos una molécula de analito o no asociada con ninguna molécula de analito). Se hace referencia a las siguientes solicitudes de patente de Estados Unidos publicadas: solicitud de patente de Estados Unidos núm. 20070259448; solicitud de patente de Estados Unidos núm. 20070259385; solicitud de patente de Estados Unidos núm. 20070259381; y solicitud de patente internacional núm. PCT/US07/019184. Puede abordarse al menos una porción de los recipientes de reacción y puede hacerse una medición indicativa del número/porcentaje de los recipientes de reacción que contienen al menos una molécula o partícula de analito. En algunos casos, en base al número/porcentaje, puede determinarse una medición de la concentración de moléculas de analito en la muestra de fluido.
En una modalidad específica que permite la detección de una molécula de analito en un volumen confinado, los analitos en una muestra pueden detectarse mediante la unión de los analitos al primer y segundo reactivos de detección para formar complejos de detección. Cada complejo de detección incluye un analito, un primer reactivo de detección y un segundo reactivo de detección, y el primer reactivo de detección y el segundo reactivo de detección tienen una primera y segunda etiquetas detectables, respectivamente. Los complejos de detección pueden formarse de forma simultánea, sustancialmente simultánea o secuencial. Los complejos de detección se distribuyen en una pluralidad de recipientes de reacción de modo que la mayoría de los recipientes de reacción contengan uno o menos complejos de detección, y el número de moléculas de analito se detecta mediante el recuento del número de recipientes de reacción que contienen cada una de la primera y segunda etiquetas detectables. Preferentemente, los complejos de detección se distribuyen en la pluralidad de recipientes de reacción de modo que la probabilidad de detectar un primer reactivo de detección no unido y un segundo reactivo de detección no unido en el mismo recipiente sea menor que aproximadamente 1 en 10, preferentemente menor que aproximadamente 1 en 100, con mayor preferencia menor que aproximadamente 1 en 1000, y con la máxima preferencia menor que aproximadamente 1 en 10 000. Los complejos de detección se distribuyen en una pluralidad de recipientes de reacción, es decir, se distribuyen o separan en partes o porciones, por ejemplo, manualmente por división en alícuotas de una porción de complejos de detección en una pluralidad de recipientes de reacción y/o al hacer fluir una solución que comprende complejos de detección en una pluralidad de recipientes de reacción de modo que los complejos de detección se separen en recipientes de reacción individuales sobre un soporte.
En una modalidad adicional, los analitos en una muestra pueden detectarse (a) mediante la unión de los analitos a reactivos de captura unidos a la superficie y al primer y segundo reactivos de detección para formar complejos de detección, en donde (i) cada complejo de detección incluye un reactivo de captura, un analito, un primer reactivo de detección y un segundo reactivo de detección, y (ii) el primer reactivo de detección tiene una primera etiqueta detectable y el segundo reactivo de detección tiene una segunda etiqueta detectable. Los complejos de detección pueden formarse mediante cualquier orden de adición de los componentes, por ejemplo, mediante la unión simultánea o sustancialmente simultánea de los componentes, o la adición secuencial de cada componente para construir el complejo de detección por etapas. Los complejos de detección se distribuyen en una pluralidad de recipientes de reacción de modo que la mayoría de los recipientes de reacción contienen uno o menos analitos, y el número de moléculas de analito se detecta mediante el recuento del número de recipientes de reacción que contienen la primera y segunda etiquetas detectables. El método puede realizarse con o sin lavado después de cada etapa y antes de la etapa de detección.
La superficie puede ser una partícula y, opcionalmente, se inmoviliza una pluralidad de reactivos de captura sobre una partícula o una pluralidad de partículas. En esta modalidad, la etapa de distribución puede realizarse de varias formas: (i) los reactivos de captura se inmovilizan sobre una pluralidad de partículas y la distribución de analitos se logra mediante la unión de los analitos a los reactivos de captura y la distribución de las partículas en la pluralidad de recipientes de reacción; o (ii) los reactivos de captura se inmovilizan sobre una pluralidad de partículas y la distribución de los analitos se logra mediante la distribución de las partículas en una pluralidad de recipientes de reacción y después la unión de los analitos a los reactivos de captura.
La pluralidad de recipientes de reacción también puede comprender gotitas de agua dispersas en una emulsión de agua en aceite. Se pueden preparar emulsiones con gotitas de diámetros de hasta 100 um y volúmenes de casi 1 nl. La alta capacidad, es decir, mayor que 1010 gotitas en 1 ml de emulsión, la facilidad de preparación de las emulsiones y su alta estabilidad en una amplia variedad de condiciones las convierten en un medio ideal para compartimentar los ensayos bioquímicos. Cada gotita de agua funciona como un recipiente de reacción independiente y los complejos de detección, opcionalmente unidos a una partícula, pueden distribuirse en una pluralidad de gotitas de agua.
Alternativamente, la superficie es una ubicación dentro de uno de los recipientes de reacción, por ejemplo, si los recipientes de reacción son pocillos de una placa, entonces la superficie puede ser un dominio o región dentro de uno de los pocillos de la placa. En esta modalidad, los reactivos de captura pueden inmovilizarse en los dominios o regiones de la pluralidad de recipientes de reacción y la etapa de distribución se logra mediante la unión de las moléculas de analito a los reactivos de captura. En otra modalidad, la pluralidad de recipientes de reacción incluye regiones con restos diana inmovilizados en las mismas, los reactivos de captura comprenden complementos de restos de direccionamiento y la etapa de distribución se logra mediante la unión de los complementos de restos de direccionamiento a los restos diana colocados en la pluralidad de recipientes de reacción. En una modalidad adicional, los ensayos de unión descritos en la presente descripción también pueden incluir una etapa de concentración previa para mejorar el rendimiento del ensayo, por ejemplo, mediante el aumento de la concentración de analito en la muestra y/o la reducción de la concentración de materiales extraños que pueden estar presentes en muestra que pueden dificultar la ejecución del ensayo. Esto puede hacerse mediante (a) contacto de una muestra que incluye el analito de interés con una partícula enlazada a un primer reactivo de unión que se une al analito, para formar de esta manera un complejo que comprende el analito unido a dicho primer reactivo de unión; (b) recolección del complejo; (c) separación de los componentes no unidos de la muestra desde el complejo; (d) y liberación del complejo. Este método de concentración previa puede realizarse antes de que se realicen los ensayos de unión descritos en la presente descripción para eliminar las impurezas que pudieran dificultar la ejecución del ensayo. Con respecto a esto, se hace referencia a la publicación de solicitud de Estados Unidos núm. US 2010/0261292, cuya descripción se incorpora en la presente descripción como referencia.
Ejemplos de muestras que pueden analizarse mediante los métodos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, muestras de alimentos (que incluyen extractos alimenticios, homogeneizados alimenticios, bebidas, etc.), muestras ambientales (por ejemplo, muestras de suelo, lodos ambientales, aerosoles ambientales recolectados, toallitas ambientales, filtrados de agua, etc.), muestras industriales (por ejemplo, materias primas, productos o intermediarios de un proceso de producción industrial), muestras clínicas humanas, muestras veterinarias y otras muestras de origen biológico. Las muestras biológicas que pueden analizarse incluyen, pero no se limitan a, heces, frotis de mucosas, muestras fisiológicas y/o muestras que contienen suspensiones de células. Los ejemplos específicos de muestras biológicas incluyen muestra de sangre, suero, plasma, heces, frotis de mucosas, aspirados de tejido, homogeneizados de tejido, cultivos celulares y sobrenadantes de cultivos celulares (que incluyen cultivos de células eucariotas y procariotas), orina, saliva, esputo y cerebroespinal.
Los analitos que pueden medirse mediante el uso de los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a proteínas, toxinas, ácidos nucleicos, microorganismos, virus, células, hongos, esporas, carbohidratos, lípidos, glicoproteínas, lipoproteínas, polisacáridos, fármacos, hormonas, esteroides, nutrientes, metabolitos y cualquier derivado modificado de las moléculas anteriores, o cualquier complejo que comprenda una o más de las moléculas anteriores o sus combinaciones. El nivel de un analito de interés en una muestra puede ser indicativo de una enfermedad o afección patológica o simplemente puede indicar si el paciente estuvo expuesto a ese analito.
Los ensayos de la presente invención pueden usarse para determinar la concentración de uno o más, por ejemplo, dos o más analitos en una muestra. Por lo tanto, pueden medirse dos o más analitos en la misma muestra. Los paneles de analitos que pueden medirse en la misma muestra incluyen, por ejemplo, paneles de ensayos de analitos o actividades asociadas con un estado patológico o condiciones fisiológicas. Ciertos paneles de este tipo incluyen paneles de citocinas y/o sus receptores (por ejemplo, uno o más de TNF-alfa, TNF-beta, ILl-alfa, ILl-beta, IL2, IL4, IL6, IL-10, IL-12, IFN-y, etc.), factores de crecimiento y/o sus receptores (por ejemplo, uno o más de EGF, VGF, TGF, VEGF, etc.), fármacos de abuso, fármacos terapéuticos, vitaminas, anticuerpos específicos de patógenos, autoanticuerpos (por ejemplo, uno o más anticuerpos dirigidos contra los antígenos Sm, r Np , SS-A, SS-alfa, JO-1 y Scl-70), anticuerpos específicos de alérgenos, marcadores tumorales (por ejemplo, uno o más de CEA, PSA, CA-125 II, CA 15-3, CA 19-9, CA 72-4, CYFRA 21-1, NSE, AFP, etc.), marcadores de enfermedad cardíaca que incluyen cardiopatía congestiva y/o infarto agudo de miocardio (por ejemplo, uno o más de troponina T, troponina I, troponina C, mioglobina, CKMB, mieloperoxidasa, glutatión peroxidasa, proteína p-natriurética (BNP), proteína alfa-natriurética (ANP), endotelina, aldosterona, proteína C reactiva (CRP), etc.), marcadores asociados con la hemostasia (por ejemplo, uno o más de monómero de fibrina, dímero D, complejo trombina-antitrombina, fragmentos de protrombina 1 y 2, anti-factor Xa, etc.), marcadores de infección por hepatitis viral aguda (por ejemplo, uno o más de anticuerpos IgM contra el virus de la hepatitis A, anticuerpos IgM contra el antígeno central de la hepatitis B, antígeno de superficie de la hepatitis B, anticuerpos contra el virus de la hepatitis C, etc.), marcadores de la enfermedad de Alzheimer (alfaamiloide, beta-amiloide, Ap 42, Ap 40, Ap 38, Ap 39, Ap 37, Ap 34, proteína tau, etc.), marcadores de osteoporosis (por ejemplo, uno o más de los telopéptidos N o C reticulados, desoxipiridinolina total, desoxipiridinolina libre, osteocalcina, fosfatasa alcalina, propéptido C-terminal de colágeno tipo I, fosfatasa alcalina específica de hueso, etc. ), marcadores del estado de fertilidad o trastornos asociados con la fertilidad (por ejemplo, uno o más de estradiol, progesterona, hormona estimulante de folículos (FSH), hormona luteinizante (LH), prolactina, hCG, testosterona, etc.), marcadores de trastornos tiroideos (por ejemplo, una o más de la hormona estimulante de tiroides (TSH), T3 total, T3 libre, T4 total, T4 libre y T3 inversa) y marcadores de cáncer de próstata (por ejemplo, uno o más de PSA total, PSA libre, PSA en complejo, fosfatasa ácida prostática, creatina quinasa, etc.). Ciertas modalidades de la invención incluyen medir, por ejemplo, uno o más, dos o más, cuatro o más o 10 o más analitos asociados con un estado patológico o condición fisiológica específica (por ejemplo, analitos agrupados en un panel, tales como los enumerados anteriormente; por ejemplo, un panel útil para el diagnóstico de trastornos tiroideos puede incluir, por ejemplo, una o más de la hormona estimulante de tiroides (TSH), T3 total, T3 libre, T4 total, T4 libre y T3 inversa).
En una modalidad preferida, el panel incluye uno o más analitos de poca abundancia en matrices de muestras tradicionales, por ejemplo, analitos a una concentración de menos de aproximadamente 100 fg/ml y, preferentemente, menos de aproximadamente 10 fg/ml. Una lista no limitante de analitos que pueden incluirse en el panel incluye, por ejemplo, IL-17, IL-21, IL-31, Ab-38, Ab-40, Ab-42, Ab-39, Ab-43, Ab-15, Ab-16, Ab-17, oligómeros Abeta, péptido C, iL-13, IL-17A, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, INF-g, PSA, PSAc, Tau, fosfo-Tau, TNFa, troponina I, troponina T cardíaca, troponina C, VEGF, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, EPO, LC3B, albúmina, CHO-P, E. HCP de coli, IgA, IgE, IgG, IgG1, IgG4, IgM, NSO-P, Per-C6, proteína residual A, IgG2, IgG3, IgG4, AFP, CA125, Caspasa-3 activa, CXCL11/I-TAC, ErbB2/HER2, HGFR/o-MET, IFN-beta, MMP1, MMP2, MMP3, MMP9, beta-NGF, TFF3, TIMP1, Kim-1, alfa-2 macroglobulina, dímero D, ICAM-1, mieloperoxidasa, mioglobina, PAI-1, PCSK9, plasminógeno, renina/prorrenina, tPA, CXCL1/GRO-alfa, CCL2/MCP1, CCL3/MIP-1alfa, CCL4/MIP-1beta, CCL5/Rantes, CRP, CXCL9/MIG, CXCL10/IL-10, G-CSF, GM-CSF, IFN-alfa, IFN-gamma, IL1alfa, IL-1beta, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL12(p70), IL13, IL15, IL18, IL-22, IL-23, IL-33, c-MET, adiponectina, FGF21, GLP-1, hormona del crecimiento, IGF1, IGF2, insulina, leptina, prolactina, p24 de VIH, HB-EGF, a Kt , fosfo-AKT y sus combinaciones.
Además, los métodos y el kit descritos en la presente descripción pueden usarse en inmunoensayos para detectar la sensibilidad de organismos individuales a marcadores de resistencia a antimicrobianos (PBP2a/mecA (S. aureus, grampositivo), TEM1 (E. coli, gramnegativo)). Estos ensayos pueden usarse para esta clase de analitos, tanto en bacterias grampositivas como gramnegativas. En el ensayo pueden incluirse una o más de las siguientes proteínas diana involucradas en la resistencia a antimicrobianos a los antibióticos vancomicina, beta-lactámicos, carbapenem, aminoglucósidos y macrólidos; familia erm, vanA, vanB, aac(6')-aph(2"), KPC, NDM, OXA-48, VIM, similar a OXA-23, similar a OXA-40, similar a OXA-58, genes de ESBL de las familias de CTX-M-1 y CTX-M-9 y sus combinaciones.
Además, los métodos y kits descritos en la presente descripción pueden usarse en un inmunoensayo para detectar una o más de las siguientes clases de biomarcadores: citocinas, proteínas circulantes específicas de tumor, proteínas asociadas con una o más enfermedades infecciosas, marcadores intracelulares, etc. y sus combinaciones.
En una modalidad particular, el panel incluye uno o más analitos de poca abundancia en matrices de muestras tradicionales, por ejemplo, analitos a una concentración de menos de aproximadamente 100 fg/ml y, preferentemente, menos de aproximadamente 10 fg/ml. El panel incluye preferentemente uno o más de los siguientes analitos: IL-17, IL-21, IL-31, IL-22, IL-23, IL-33, troponina T cardíaca y sus combinaciones. En modalidades específicas, la concentración de analito detectada en la muestra está dentro de un intervalo de 0,01 fM a 100 fM, 0,03 fM - 50 fM o 0,03 fM - 10 fM. En algunas modalidades, la concentración de moléculas de analito en la muestra que puede determinarse de manera sustancialmente exacta es menos de aproximadamente 100 fM, menos de aproximadamente 10 fM, menos de aproximadamente 3 fM, menos de aproximadamente 1 fM, menos de aproximadamente 0,3 fM, menos de aproximadamente 0,1 fM, menos de aproximadamente 0,03 fM o menos. Se puede considerar que la concentración de moléculas de analito en una muestra se determina de manera sustancialmente exacta si la concentración medida de las moléculas de analito en la muestra está dentro de aproximadamente el 20 % de la concentración real de las moléculas de analito en la muestra. En ciertas modalidades, la concentración medida de las moléculas de analito en la muestra puede estar dentro de aproximadamente el 10 %, dentro de aproximadamente el 3 % o dentro de aproximadamente el 1 % de la concentración real de las moléculas de analito en la muestra. El límite de detección para el ensayo es aquella concentración que da una señal que es al menos 2,5 desviaciones estándar por encima de la señal de fondo, y preferentemente el ensayo puede detectar aproximadamente 10-10000 moléculas en una muestra, o 100-5000 moléculas en una muestra, o 100-1000 moléculas en una muestra.
En una modalidad adicional, los métodos descritos en la presente descripción pueden usarse para detectar analitos que se encuentran en poca abundancia debido a una exposición y/o infección reciente. El diagnóstico temprano de varias enfermedades o afecciones, por ejemplo, cáncer, infecciones bacterianas, por ejemplo, Bacillus Anthracis (ántrax), infecciones virales, por ejemplo, VIH, hepatitis, HPV, etc., exposición a toxinas, por ejemplo, ricina, toxina botulínica A, B o E, etc., está limitado por el hecho de que los límites de detección (LOD) de las tecnologías disponibles, tales como ELISA, son más altas que las concentraciones circulantes de proteínas de poca abundancia que podrían indicar el inicio de una enfermedad. El panel puede incluir uno o más analitos de poca abundancia en matrices de muestras tradicionales, por ejemplo, analitos a una concentración de menos de aproximadamente 100 fg/ml o menos de aproximadamente 10 fg/ml. Una lista no limitante de analitos que pueden incluirse en el panel incluye, por ejemplo, HIVgp41, HIVgp120, HIVgp160, HIVp24, HIVp66, HIVp51, HIVp17, HIVp31, Tat, Nef, Viv, antígenos de la hepatitis A, B, C, D o E, tipos de HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 y/o 82, proteínas de HPV-E6 y E7, IL-17, IL-21, IL-31, IL-22, IL-23, IL-33, troponina T cardíaca y sus combinaciones. Aún más, el panel también puede incluir uno o más de los siguientes analitos que pueden encontrarse en poca abundancia debido al inicio reciente de la enfermedad, exposición y/o infección: Ab-38, Ab-40, Ab-42, Ab-39, Ab-43, Ab-15, Ab-16, Ab-17, oligómeros Abeta, péptido C, IL-13, IL-17A, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, INF-g, PSA, Tau, fosfo-Tau, TNFa, troponina I, troponina T cardíaca, troponina C, VEGF, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, EPO, LC3B, albúmina, CHO-P, HCP de E. coli, IgA, IgE, IgG, IgG1, IgG4, IgM, NSO-P, Per-C6, proteína residual A, IgG2, IgG3, IgG4, AFP, CA125, caspasa-3 activa, CXCL11/I-TAC, ErbB2/HER2, HGFR/o-MET, IFN-beta, MMP1, MMP2, MMP3, MMP9, beta-NGF, TFF3, TIMP1, Kim-1, alfa-2 macroglobulina, dímero D, ICAM-1, mieloperoxidasa, mioglobina, PAI-1, PCSK9, plasminógeno, renina/prorrenina, tPA, CXCL1/GRO-alfa, CCL2/MCP1, CCL3/MIP-1alfa, CCL4/MIP-1beta, CCL5/Rantes, CRP, CXCL9/MIG, CXCL10/IL-10, G-CSF, GM-CSF, IFN-alfa, IFN-gamma, IL1alfa, IL-1beta, IL-3, IL-7, IL-12(p70), IL-13, IL-15, IL-18, c-MET, adiponectina, FGF21, GLP-1, hormona del crecimiento, IGF1, IGF2, insulina, leptina, prolactina, HB-EGF, AKT, fosfo-AKT y sus combinaciones.
Los métodos de la presente invención están diseñados para permitir la detección de una amplia variedad de agentes biológicos y bioquímicos, como se describió anteriormente. En una modalidad, los métodos pueden usarse para detectar virus, bacterias y toxinas patógenas y/o potencialmente patógenas, que incluyen agentes de guerra biológica ("BWA") en una variedad de matrices ambientales y clínicas relevantes, que incluyen y sin limitación, sangre, esputo, heces, filtros, frotis, etc. Una lista no limitante de patógenos y toxinas que pueden analizarse (solos o en combinación) mediante el uso de los métodos de la presente invención es Bacillus Anthracis (ántrax), Yersinia pestis (plaga), Vibrio cholerae (cólera), Francisella tularensis (tularemia), Brucellaspp. (brucelosis), Coxiella burnetii (fiebre Q), listeria, salmonella, shigella, V. cholera, Chlamydia trachomatis, Burkholderia pseudomallei, ortopoxvirus, que incluyen el virus variola (viruela), la encefalitis viral, el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE), el virus de la encefalitis equina occidental (WEE), el virus de la encefalitis equina oriental (EEE), alfavirus, fiebres hemorrágicas virales, Arenaviridae, Bunyaviridae, Filoviridae, Flaviviridae, virus del Ébola, enterotoxinas estafilocócicas, ricina, toxinas botulínicas (A, B, E), Clostridium botulinum, micotoxina, Fusarium, Myrotecium, Cephalosporium, Trichoderma, Verticimonosporium, Stachybotrys, muermo, hongo del trigo, Bacillus globigii, Serratia marcescens, lluvia amarilla, micotoxinastricotecenas, Salmonella typhimurium, aflatoxina, Xenopsylla cheopis, Diamanus montanus, alastrim, viruela del simio, arenavirus, hantavirus, fiebre de Lassa, fiebres hemorrágicas argentinas, fiebres hemorrágicas bolivianas, virus de la fiebre del valle del Rift, virus de Crimea-Congo, virus Hanta, fiebres hemorrágicas de Marburg, virus de la fiebre amarilla, virus de la fiebre del dengue, influenza (que incluye cepas humanas y animales que incluyen influenza aviar H5N1, influenza A, influenza A, específica de H1, influenza A, específica de H3, influenza A, específica de H5, influenza A, específica de 2009-H1N1, influenza B), RSV, virus de inmunodeficiencia humana I y II (VIH I y II), hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis (no A, B o C), enterovirus, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus, virus del herpes simple, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrheae, Trichomonas vaginalis, virus del papiloma humano, Treponema pallidum, Streptococcus pneumoniae, Borellia burgdorferi, Haemophilus influenzae, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Legionella pneumophila, Staphylococcus aureus, enterotoxina B estafilocócica (SEB), abrina, toxina Shiga 1, toxina Shiga 2, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pyogenes, Clostridium difficile, Neisseria meningitidis, Klebsiella pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis, estreptococos del Grupo A, E. Coli0157, coronavirus, virus Coxsackie A, rinovirus, virus parainfluenza, virus sincitial respiratorio (RSV), metapneumovirus, vaccinia y adenovirus.
Las mejoras en los ensayos de unión descritos en la presente descripción pueden usarse para expandir el intervalo dinámico de un ensayo de unión, es decir, el intervalo de concentración de moléculas de analito en una muestra de fluido que puede cuantificarse mediante un sistema o método sin dilución o concentración de la muestra o cambio en las condiciones de ensayo que produce un resultado similar (por ejemplo, concentración de reactivos empleados, etc.), y en donde la concentración medida de las moléculas de analito puede determinarse de manera sustancialmente exacta. Se puede considerar que la concentración de moléculas de analito en una muestra de fluido se determina de manera sustancialmente exacta si la concentración medida de las moléculas de analito en la muestra de fluido está dentro de aproximadamente el 10 % de la concentración real (por ejemplo, verdadera) de las moléculas de analito en la muestra de fluido. En ciertas modalidades, la concentración medida de las moléculas de analito en la muestra de fluido se determina de manera sustancialmente exacta en modalidades donde la concentración medida está dentro de aproximadamente el 5 %, dentro de aproximadamente el 4 %, dentro de aproximadamente el 3 %, dentro de aproximadamente el 2 %, dentro de aproximadamente el 1 %, dentro de aproximadamente el 0,5 %, dentro de aproximadamente el 0,4 %, dentro de aproximadamente el 0,3 %, dentro de aproximadamente el 0,2 % o dentro de aproximadamente el 0,1 % de la concentración real de las moléculas de analito en la muestra de fluido. En algunos casos, la medida de la concentración determinada difiere de la concentración verdadera (por ejemplo, real) en no más de aproximadamente 20 %, no más de aproximadamente 15 %, no más de aproximadamente 10 %, no más de aproximadamente 5 %, no más de aproximadamente 4 %, no más de aproximadamente 3 %, no más de aproximadamente 2 %, no más de aproximadamente 1 % o no más de aproximadamente 0,5 %. La exactitud del método de ensayo puede determinarse, en algunas modalidades, mediante la determinación de la concentración de moléculas de analito en una muestra de fluido de una concentración conocida mediante el uso del método de ensayo seleccionado y la comparación de la concentración medida con la concentración real.
En algunas modalidades, los sistemas o métodos pueden ser capaces de medir concentraciones de moléculas de analito en una muestra de fluido en un intervalo dinámico de más de aproximadamente 1000 (3 log), aproximadamente 10 000 (4 log), aproximadamente 100 000 (5 log), aproximadamente 350 000 (5,5 log), 1 000 000 (6 log), aproximadamente 3500000 (6,5 log), aproximadamente 10000000 (7 log), aproximadamente 35000000 (7,5 log), aproximadamente 100000000 (8 log) o más.
En algunas modalidades, la concentración (por ejemplo, concentración desconocida) de moléculas de analito en la muestra de fluido que puede determinarse de manera sustancialmente exacta es menos de aproximadamente 5000 fM (femtomolar), menos de aproximadamente 3000 fM, menos de aproximadamente 2000 fM, menos de aproximadamente 1000 fM, menos de aproximadamente 500 fM, menos de aproximadamente 300 fM, menos de aproximadamente 200 fM, menos de aproximadamente 100 fM, menos de aproximadamente 50 fM, menos de aproximadamente 25 fM, menos de aproximadamente 10 fM, menos de aproximadamente 5 fM, menos de aproximadamente 2 fM, menos de aproximadamente 1 fM, menos de aproximadamente 500 aM (attomolar), menos de aproximadamente 100 aM, menos de aproximadamente 10 aM, menos de aproximadamente 5 aM, menos de aproximadamente 1 aM, menos de aproximadamente 0,1 aM, menos de aproximadamente 500 zM (zeptomolar), menos de aproximadamente 100 zM, menos de aproximadamente 10 zM, menos de aproximadamente 5 zM, menos de aproximadamente 1 zM, menos de aproximadamente 0,1 zM o menos. En algunos casos, el límite de detección (por ejemplo, la concentración más baja de una molécula de analito que puede determinarse en solución) es aproximadamente 100 fM, aproximadamente 50 fM, aproximadamente 25 fM, aproximadamente 10 fM, aproximadamente 5 fM, aproximadamente 2 fM, aproximadamente 1 fM, aproximadamente 500 aM (attomolar), aproximadamente 100 aM, aproximadamente 50 aM, aproximadamente 10 aM, aproximadamente 5 aM, aproximadamente 1 aM, aproximadamente 0,1 aM, aproximadamente 500 zM (zeptomolar), aproximadamente 100 zM, aproximadamente 50 zM, aproximadamente 10 zM, aproximadamente 5 zM, aproximadamente 1 zM, aproximadamente 0,1 zM o menos. En algunas modalidades, la concentración de moléculas o partículas de analito en la muestra de fluido que puede determinarse de manera sustancialmente exacta está entre aproximadamente 5000 fM y aproximadamente 0,1 fM, entre aproximadamente 3000 fM y aproximadamente 0,1 fM, entre aproximadamente 1000 fM y aproximadamente 0,1 fM, entre aproximadamente 1000 fM y aproximadamente 0,1 zM, entre aproximadamente 100 fM y aproximadamente 1 zM, entre aproximadamente 100 aM y aproximadamente 0,1 zM, o menos. El límite superior de detección (por ejemplo, la concentración superior de una molécula de analito que puede determinarse en solución) es al menos aproximadamente 100 fM, al menos aproximadamente 1000 fM, al menos aproximadamente 10 pM (picomolar), al menos aproximadamente 100 pM, al menos aproximadamente 100 pM, al menos aproximadamente 10 nM (nanomolar), al menos aproximadamente 100 nM, al menos aproximadamente 1000 nM, al menos aproximadamente 10 uM, al menos aproximadamente 100 uM, al menos aproximadamente 1000 uM, al menos aproximadamente 10 mM, al menos aproximadamente 100 mM, al menos aproximadamente 1000 mM o más. En algunas modalidades, la concentración de moléculas o partículas de analito en la muestra de fluido determinada es menos de aproximadamente 50 x 10-15M, o menos de aproximadamente 40 x 10-15M, o menos de aproximadamente 30 X 10-15M, o menos de aproximadamente 20 x 10-15M, o menos de aproximadamente 10 x 10-15M, o menos de aproximadamente, o menos de aproximadamente 1 x 10-15M.
En algunas modalidades, la concentración de moléculas de analito en la muestra que puede determinarse de manera sustancialmente exacta es menos de aproximadamente 100 fM, menos de aproximadamente 10 fM, menos de aproximadamente 3 fM, menos de aproximadamente 1 fM, menos de aproximadamente 0,3 fM, menos de aproximadamente 0,1 fM, menos de aproximadamente 0,03 fM o menos. En algunas modalidades, la concentración de moléculas de analito en la muestra que puede determinarse de manera sustancialmente exacta está entre aproximadamente 5000 fM y aproximadamente 0,1 fM, entre aproximadamente 3000 fM y aproximadamente 0,1 fM, entre aproximadamente 1000 fM y aproximadamente 0,1 fM, entre aproximadamente 1000 fM y aproximadamente 1 fM, entre aproximadamente 100 fM y aproximadamente 1 fM, entre aproximadamente 100 fM y aproximadamente 0,1 fM. Se puede considerar que la concentración de moléculas de analito en una muestra se determina de manera sustancialmente exacta si la concentración medida de las moléculas de analito en la muestra está dentro de aproximadamente el 20 % de la concentración real de las moléculas de analito en la muestra. En ciertas modalidades, la concentración medida de las moléculas de analito en la muestra puede estar dentro de aproximadamente el 10 %, dentro de aproximadamente el 3 % o dentro de aproximadamente el 1 % de la concentración real de las moléculas de analito en la muestra. La exactitud del método de ensayo puede determinarse, en algunas modalidades, mediante la determinación de la concentración de moléculas de analito en una muestra de concentración conocida mediante el uso del método de ensayo seleccionado. Preferentemente, el ensayo puede detectar aproximadamente 10-10 000 moléculas en una muestra, preferentemente 100-5000 moléculas en una muestra y con mayor preferencia 100-1000 moléculas en una muestra.
Con relación a las técnicas de inmunoensayo tipo sándwich convencionales, medidas, por ejemplo, mediante el uso del mismo anticuerpo de captura y uno de los dos anticuerpos de detección y la misma etiqueta y tecnología de detección, el uso de los formatos de ensayo descritos en la presente descripción puede mejorar las señales de detección y la sensibilidad del ensayo tanto como 10 veces, preferentemente, tanto como 50 veces, 100 veces o hasta 1000 veces. Preferentemente, el uso de los formatos de ensayo descritos en la presente descripción mejora la señal de detección y la sensibilidad del ensayo tanto como 100 veces con relación a un inmunoensayo tipo sándwich estándar.
Un aspecto ventajoso de los métodos de la invención, especialmente cuando se acopla con una técnica de detección óptica sensible, es que la amplificación de la señal permite la detección de eventos de unión individuales como puntos brillantes de luz. La cuantificación de la señal puede llevarse a cabo entonces mediante el recuento de los eventos individuales (que pueden proporcionar una mejor sensibilidad para concentraciones bajas de analito al proporcionar una mejor discriminación de los eventos de unión respecto al ruido de fondo) o la integración de la señal para todos los eventos de unión (lo que puede proporcionar un mejor intervalo dinámico para medir concentraciones altas de analitos).
Los métodos de la presente invención pueden usarse en una variedad de dispositivos y/o formatos de ensayo. Los dispositivos de ensayo pueden incluir, por ejemplo, módulos de ensayo, tales como placas de ensayo, cartuchos, placas de ensayo de múltiples pocillos, recipientes de reacción, tubos de ensayo, cubetas, celdas de flujo, chips de ensayo, dispositivos de flujo lateral, etc., con adición de los reactivos de ensayo (que pueden incluir agentes de direccionamiento u otros reactivos de unión) a medida que avanza el ensayo o precargados en los pocillos, cámaras o regiones de ensayo del módulo de ensayo. Estos dispositivos pueden emplear una variedad de formatos de ensayo para ensayos de unión específica, por ejemplo, inmunoensayos o ensayos inmunocromatográficos. Los dispositivos y formatos de ensayo ilustrativos se describen a continuación en la presente descripción. En ciertas modalidades, los métodos de la presente invención pueden emplear reactivos de ensayo que se almacenan en un estado seco y los dispositivos/kits de ensayo pueden comprender además o suministrarse con materiales desecantes para mantener los reactivos de ensayo en un estado seco. Los dispositivos de ensayo precargados con los reactivos de ensayo pueden mejorar en gran medida la velocidad y reducir la complejidad de las mediciones del ensayo al tiempo que mantienen una excelente estabilidad durante el almacenamiento. Los reactivos de ensayo secos pueden ser cualquier reactivo de ensayo que pueda secarse y después reconstituirse antes de su uso en un ensayo. Estos incluyen, pero no se limitan a, reactivos de unión útiles en ensayos de unión, enzimas, sustratos de enzimas, colorantes indicadores y otros compuestos reactivos que pueden usarse para detectar un analito de interés. Los reactivos de ensayo también pueden incluir sustancias que no están directamente involucradas en el mecanismo de detección, pero que desempeñan un papel auxiliar en un ensayo, que incluyen, pero sin limitarse a, agentes bloqueadores, agentes estabilizantes, detergentes, sales, tampones de pH, conservantes, etc. Los reactivos pueden estar presentes en forma libre o soportados sobre fases sólidas, que incluyen las superficies de los compartimentos (por ejemplo, cámaras, canales, celdas de flujo, pocillos, etc.) en los módulos de ensayo o las superficies de coloides, perlas u otros soportes particulados.
Los métodos de la invención pueden usarse con una variedad de métodos para medir la cantidad de un analito y, en particular, medir la cantidad de un analito unido a una fase sólida. Las técnicas que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, técnicas conocidas en la técnica tales como ensayos basados en cultivos celulares, ensayos de unión (que incluyen ensayos de aglutinación, inmunoensayos, ensayos de hibridación de ácidos nucleicos, etc.), ensayos enzimáticos, ensayos colorimétricos, etc. Otras técnicas adecuadas serán fácilmente evidentes para un experto promedio en la técnica. Algunas técnicas de medición permiten que las mediciones se realicen mediante inspección visual, otras pueden requerir o beneficiarse del uso de un instrumento para realizar la medición.
Los métodos para medir la cantidad de un analito incluyen técnicas sin etiquetas, que incluyen, pero no se limitan a, i) técnicas que miden cambios en la masa o el índice de refracción en una superficie después de la unión de un analito a una superficie (por ejemplo, técnicas de ondas acústicas de superficie, sensores de resonancia de plasmón de superficie, técnicas elipsométricas, etc.), ii) técnicas de espectrometría de masas (que incluyen técnicas como MALDI, SELDI, etc. que pueden medir analitos en una superficie), iii) técnicas cromatográficas o electroforéticas, iv) técnicas de fluorescencia (que puede basarse en la fluorescencia inherente de un analito), etc.
Los métodos para medir la cantidad de un analito también incluyen técnicas que miden los analitos a través de la detección de etiquetas que pueden unirse directa o indirectamente (por ejemplo, a través del uso de parejas de unión etiquetadas de un analito) a un analito. Las etiquetas adecuadas incluyen etiquetas que pueden visualizarse directamente (por ejemplo, partículas que pueden observarse visualmente y etiquetas que generan una señal medible tal como dispersión de luz, absorbancia óptica, fluorescencia, quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, radioactividad, campos magnéticos, etc.). Las etiquetas que pueden usarse también incluyen enzimas u otras especies químicamente reactivas que tienen una actividad química que conduce a una señal medible tal como dispersión de luz, absorbancia, fluorescencia, etc. El uso de enzimas como etiquetas se ha establecido bien en ensayos de inmunoabsorción ligada a enzimas, también llamados ELISA, inmunoensayos enzimáticos o EIA. En el formato ELISA, se fija una cantidad desconocida de antígeno a una superficie y después la superficie se baña con un anticuerpo específico de modo que este pueda unirse al antígeno. Este anticuerpo está enlazado a una enzima y, en la etapa final, se añade una sustancia que la enzima convierte en un producto que proporciona un cambio en una señal detectable. La formación de producto puede ser detectable, por ejemplo, debido a una diferencia, con relación al sustrato, en una propiedad medible tal como absorbancia, fluorescencia, quimioluminiscencia, dispersión de luz, etc. Ciertos métodos de medición (pero no todos) que pueden usarse con métodos de unión en fase sólida de acuerdo con la invención pueden beneficiarse de o requerir una etapa de lavado para eliminar los componentes no unidos (por ejemplo, etiquetas) de la fase sólida. En consecuencia, los métodos de la invención pueden comprender dicha etapa de lavado.
En las modalidades que emplean un par de etiquetas detectables, esas sustancias etiquetadas se seleccionan en base a su capacidad de ser detectables independientemente y/o la capacidad de esas sustancias para trabajar en conjunto para generar una señal detectable cuando en el par las etiquetas están próximas entre sí, es decir, cada una unida, directa o indirectamente, al analito de interés en un complejo de detección. En una modalidad, la primera etiqueta detectable es una primera enzima de un sistema de reacción enzimática acoplada y la segunda etiqueta detectable es una segunda enzima del sistema de reacción enzimática acoplada y el método incluye además la etapa de añadir uno o más sustratos del sistema de reacción, para producir de esta manera un producto detectable del sistema de reacción enzimática. Los recipientes de reacción que incluyen el producto detectable pueden distinguirse de los recipientes de reacción que no lo incluyen. En una modalidad preferida, el producto detectable solo se produce cuando la primera enzima y la segunda enzima están muy próximas, por ejemplo, a menos de 200 nm, idealmente a menos de 50 nm. En una modalidad, la primera enzima es una oxidasa, por ejemplo, una glucosa oxidasa, la segunda enzima es una peroxidasa y los sustratos comprenden un sustrato de oxidasa, por ejemplo, glucosa, y una tiramida etiquetada, derivado de rojo Amplex (10-acetil-3,7-dihidroxifenoxazina) o luminol (denominados colectivamente derivado de reactivo etiquetado en la presente descripción y en una modalidad preferida, el derivado de reactivo etiquetado comprende rojo Amplex o luminol). En esta modalidad, la primera enzima reacciona con un sustrato para generar un producto que reacciona con la segunda enzima para generar un segundo producto que reacciona con el derivado de reactivo etiquetado para generar una especie detectable. Preferentemente, las reacciones catalizadas por la primera y segunda enzimas en el complejo de detección conducen a la inmovilización del derivado de reactivo etiquetado en la superficie, que puede medirse para determinar el número de moléculas de analito presentes en la superficie. En una modalidad, el derivado de reactivo etiquetado es biotina-tiramida, y el método comprende además añadir estreptavidina etiquetada y medir las etiquetas en la estreptavidina.
Otro sistema más de etiquetado dependiente de la proximidad que puede usarse en el método es un par de FRET, por ejemplo, la primera etiqueta detectable es un donante de FRET y la etiqueta detectable es un aceptor de FRET. La transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) es una interacción dependiente de la distancia entre los estados electrónicos excitados de dos moléculas de colorante en la que la excitación se transfiere de una molécula donante a una molécula aceptora sin emisión de un fotón. La eficiencia de FRET depende de la sexta potencia inversa de la separación intermolecular, lo que la hace útil en distancias comparables a las dimensiones de las macromoléculas biológicas. En este sistema de etiquetado, la señal dependiente de la proximidad se mide al excitar el donante de FRET y medir la emisión del aceptor de FRET. Las moléculas donante y aceptora están preferentemente muy próximas, por ejemplo, aproximadamente 10-100 Angstroms, el espectro de absorción del aceptor se superpone preferentemente con el espectro de emisión de fluorescencia del donante, y las orientaciones de los dipolos de transición del donante y el aceptor deben ser aproximadamente paralelas. En la Tabla 1 a continuación se proporciona una lista no limitante de pares de FRET.
Tabla 1. Ejemplos de pares de FRET
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Existe una variedad de métodos de detección de FRET para microscopía óptica, por ejemplo, mediciones de fotoblanqueo del aceptor, fotoblanqueo del donante, imágenes de relación, emisión sensibilizada y tiempo de vida de la fluorescencia.
Otro sistema de etiquetado adecuado que puede usarse en una modalidad que emplea un par de etiquetas de detección es un sistema en el que la primera y segunda etiquetas detectables pueden medirse independientemente. Por ejemplo, la primera y segunda etiquetas detectables pueden ser etiquetas luminiscentes que difieren entre sí con respecto a las propiedades espectrales. Alternativamente, la primera etiqueta detectable es una primera enzima que reacciona con un primer sustrato para producir una primera señal y la segunda etiqueta detectable es una segunda enzima que reacciona con un segundo sustrato para producir una segunda señal diferente, y el método comprende además añadir el primer sustrato enzimático y el segundo sustrato enzimático y contar el número de recipientes de reacción en los que se generan la primera y segunda señales. La primera y segunda señales pueden ser cambios en la absorbancia óptica y/o señales luminiscentes con propiedades espectrales diferentes.
Si la primera y segunda etiquetas detectables incluyen una primera y segunda enzimas, cada una de ellas puede ser una enzima hidrolítica, por ejemplo, una fosfatasa, sulfatasa, galactosidasa, glucuronidasa o sus combinaciones y, por lo tanto, el primer y segundo sustratos se seleccionan de fosfato, sulfato, dioxetanos estabilizados modificados con galactósido y glucurónido, 4-metilumbeliferilo, fluoresceína o sus combinaciones. Alternativamente, la primera y segunda enzimas se seleccionan de peroxidasa de rábano picante, beta-galactosidasa y fosfatasa alcalina.
Alternativamente, las etiquetas usadas para detectar moléculas de analito pueden ser especies fluorescentes que pueden usarse en la detección de fluorescencia de moléculas individuales, por ejemplo, espectroscopía de correlación de fluorescencia y/o espectroscopía de correlación cruzada de fluorescencia. La detección de fluorescencia de moléculas individuales comprende hacer fluir un eluyente que incluye una especie detectable a través de un capilar, enfocar una fuente de luz en un volumen dentro del capilar para crear una zona de interrogación y observar la zona de interrogación con un detector de luz para detectar el paso de moléculas fluorescentes a través de la zona de interrogación.
En una modalidad, un(os) analito(s) de interés en la muestra puede(n) medirse mediante el uso de formatos de ensayo basados en electroquimioluminiscencia, por ejemplo, inmunoensayos basados en electroquimioluminiscencia (ECL). La alta sensibilidad, el amplio intervalo dinámico y la selectividad de ECL son factores importantes para el diagnóstico médico. Los instrumentos de ECL disponibles comercialmente han demostrado un rendimiento excepcional y se han usado ampliamente por razones que incluyen su excelente sensibilidad, intervalo dinámico, precisión y tolerancia de matrices de muestras complejas. Las especies que pueden inducirse a emitir ECL (especies activas de ECL) se han usado como etiquetas de ECL, por ejemplo, i) compuestos organometálicos en los que el metal proviene, por ejemplo, de los metales nobles del grupo VIII, que incluyen los compuestos organometálicos que contienen Ru y que contienen Os tales como el resto tris-bipiridil-rutenio (RuBpy) y ii) luminol y compuestos relacionados. Las especies que participan con la etiqueta de ECL en el proceso de ECL se denominan en la presente descripción correactantes de ECL. Los correactantes usados comúnmente incluyen aminas terciarias (por ejemplo, ver la patente de Estados Unidos núm.
5,846,485), oxalato y persulfato para ECL de RuBpy y peróxido de hidrógeno para ECL de luminol (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 5,240,863). La luz generada por las etiquetas de ECL puede usarse como señal indicadora en procedimientos de diagnóstico (Bard y otros, patente de Estados Unidos núm. 5,238,808, incorporada en la presente descripción como referencia). Por ejemplo, una etiqueta de ECL puede acoplarse covalentemente a un agente de unión tal como un anticuerpo, sonda de ácido nucleico, receptor o ligando; la participación del reactivo de unión en una interacción de unión puede monitorearse por medición de la ECL emitida por la etiqueta de ECL. Alternativamente, la señal de ECL de un compuesto activo de ECL puede ser indicativa del entorno químico (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 5,641,623 que describe ensayos de ECL que monitorean la formación o destrucción de correactantes de ECL). Para obtener más información sobre ECL, etiquetas de ECL, ensayos de ECL e instrumentación para realizar ensayos de ECL, ver las patentes de Estados Unidos núms.
5,093,268; 5,147,806; 5,324,457; 5,591,581; 5,597,910; 5,641,623; 5,643,713; 5,679,519; 5,705,402; 5,846,485; 5,8 66,434; 5,786,141; 5,731,147; 6,066,448; 6,136,268; 5,776,672; 5,308,754; 5,240,863; 6,207,369; 6,214,552 and 5,5 89,136 y documentos PCT publicados núms. WO99/63347; WO00/03233; WO99/58962; WO99/32662; WO99/14599; WO98/12539; WO97/36931 y WO98/57154.
Los métodos de la invención pueden aplicarse a formatos simples o múltiples en los que se realizan múltiples mediciones de ensayo en una sola muestra. Las mediciones en formato múltiple que pueden usarse con la invención incluyen, pero no se limitan a, mediciones en formato múltiple i) que involucran el uso de múltiples sensores; ii) que usan dominios de ensayo discretos en una superficie (por ejemplo, una matriz) que pueden distinguirse en base a la ubicación en la superficie; iii) que involucran el uso de partículas recubiertas con reactivos que pueden distinguirse en base a una propiedad de la partícula, tal como tamaño, forma, color, etc.; iv) que producen señales de ensayo que pueden distinguirse en base a las propiedades ópticas (por ejemplo, absorbancia o espectro de emisión) o v) que se basan en propiedades temporales de la señal de ensayo (por ejemplo, tiempo, frecuencia o fase de una señal).
En algunas modalidades, una medida de la concentración de moléculas de analito en la muestra puede determinarse al menos en parte mediante la comparación de un parámetro medido con un estándar de calibración. Por ejemplo, la fracción de superficies de unión que comprenden una molécula de analito puede compararse con una curva de calibración para determinar una medida de la concentración de la molécula de analito en la muestra. La curva de calibración puede producirse por completamiento del ensayo con una pluralidad de muestras estandarizadas de concentración conocida en las condiciones usadas para analizar las muestras de prueba. Se puede obtener una lectura de la señal relacionada con la detección/cuantificación de las moléculas de analito para cada muestra estandarizada, lo que permite por lo tanto la formación de una curva de calibración que relaciona la detección de las moléculas de analito con una concentración conocida de la molécula de analito. Después, el ensayo puede completarse en una muestra que comprende la molécula de analito en una concentración desconocida, y la detección de las moléculas de analito de este ensayo puede representarse en la curva de calibración para determinar, por lo tanto, una medida de la concentración de la molécula de analito en la muestra.
En el caso específico del uso de una técnica de obtención de imágenes para medir una señal óptica (tal como fluorescencia, quimioluminiscencia o electroquimioluminiscencia), un evento de unión puede detectarse como una fuente puntual de luz brillante. Cuando la densidad de superficie de las fuentes puntuales es baja (por ejemplo, cuando la probabilidad de encontrar una fuente puntual en un área RxR - donde R es la resolución espacial del sistema de detección- es menor que 10 %), es probable que cualquier fuente puntual observada se deba a un solo evento de unión. En estas condiciones, el recuento de los eventos puede proporcionar la medición más sensible. A medida que aumenta la densidad de la superficie, se hace cada vez más difícil resolver y contar eventos de unión individuales. En estas condiciones, la integración de la señal óptica de la superficie de unión proporciona una medición más exacta.
Será evidente para el experto que los métodos descritos en la presente descripción pueden aplicarse a numerosas plataformas de inmunoensayo conocidas por los expertos en la técnica. Varias características de las plataformas de inmunoensayo pueden ajustarse para adaptarlas a la plataforma particular, pero esos ajustes están dentro de la habilidad del experto. Por ejemplo, los métodos descritos en la presente descripción pueden aplicarse a un formato basado en perlas que usa partículas codificadas. En un sistema de este tipo, la perla usada puede ser magnética o no magnética y la superficie de las perlas se modifica de modo que incluya una o más copias de un reactivo de captura. Los reactivos de detección empleados en este sistema son un par de reactivos de detección. En una modalidad, los dos reactivos de detección incluyen etiquetas fluorescentes distinguibles. Alternativamente, los dos reactivos de detección se modifican con sondas de ácido nucleico, como se describe en la presente descripción, en cuyo caso, el método de inmunoensayo incluye un proceso de extensión, por ejemplo, RCA-PLA para generar un producto amplificado indicativo de la presencia de cada reactivo de detección que pueda detectarse. Si los reactivos de detección incluyen dos etiquetas fluorescentes distinguibles, la etapa de medición incluye introducir las perlas en una celda de flujo y, si las perlas son magnéticas, capturar las perlas en la celda de flujo. Si los reactivos de detección se modifican con sondas de ácido nucleico, la etapa de medición incluye formar un complejo tipo sándwich en las perlas, realizar RCA-PLA y etiquetar el amplicón con sondas de detección etiquetadas con fluorescencia. Después, las perlas etiquetadas se introducen en la celda de flujo y, si las perlas son magnéticas, las perlas se capturan en la celda de flujo. En cada modalidad, el ensayo puede detectar múltiples espectros en base a la identificación de perlas codificadas etiquetadas con fluorescencia. Puede usarse una fuente de luz de excitación y un detector de luz de emisión para la detección de varios colores para detectar eventos de unión en cada modalidad, la cuantificación se logra mediante el recuento de perlas que tienen ambas etiquetas detectables o aquellas perlas que incluyen un producto de extensión etiquetado de forma detectable, y la cuantificación también se logra mediante la integración de la intensidad, por ejemplo, la detección mediante la integración de la señal para todos los eventos de unión. Por lo tanto, puede proporcionarse un kit para el uso con el método descrito anteriormente que incluye uno o más de los siguientes en uno o más viales, contenedores o compartimentos: a) Perlas magnéticas o no magnéticas con reactivo de captura; (b) dos reactivos de detección con etiquetas fluorescentes distinguibles; y (c) Tampones y/o diluyentes opcionales para el protocolo de ensayo. Otro kit que puede usarse con el método descrito anteriormente puede incluir uno o más de los siguientes en uno o más viales, contenedores o compartimentos: a) Perlas magnéticas o no magnéticas con reactivo de captura; (b) Dos reactivos de detección modificados con sondas de ácido nucleico (opcionalmente, los reactivos de detección se proporcionan por separado y las sondas de proximidad (1 y 2) se proporcionan adicionalmente con instrucciones para modificar los reactivos de detección con sondas); y (c) sondas etiquetadas con fluorescencia; reactivos opcionales requeridos para la modificación de los reactivos de detección con sondas de proximidad; diluyente de ensayo, calibrador, oligonucleótidos de circularización, mezcla de ligación o sus componentes, por ejemplo, tampón de ligación, ATP, BSA, Tween 20, ADN ligasa T4; mezcla de RCA o sus componentes, por ejemplo, BSA, tampón, dNTP, Tween 20, ADN polimerasa Phi29.
En otra modalidad, los métodos descritos en la presente descripción pueden aplicarse a un formato basado en perlas analizadas en celda de flujo. En un sistema de este tipo, la perla usada puede ser magnética y la superficie de las perlas se modifica de modo que incluya una o más copias de un reactivo de captura. Los reactivos de detección empleados en este sistema son un par de reactivos de detección modificados con sondas de ácido nucleico, como se describe en la presente descripción, en cuyo caso, el método de inmunoensayo incluye un proceso de extensión, por ejemplo, RCA-PLA para generar un producto amplificado indicativo de la presencia de cada reactivo de detección que pueda detectarse. La etapa de medición incluye formar un complejo tipo sándwich en las perlas, realizar RCA-PLA y etiquetar el amplicón con sondas de detección etiquetadas con e Cl . Después, las perlas etiquetadas se introducen en la celda de flujo y las perlas se capturan en la celda de flujo. En particular, se aplica un campo magnético para atraer las partículas magnéticas, por ejemplo, perlas, a la superficie del electrodo, que puede comprender varios metales, por ejemplo, platino. Se usa una fuente de tensión para aplicar una tensión a un electrodo y puede usarse un detector de luz de emisión para detectar eventos de unión; la cuantificación se logra mediante el recuento de las perlas que tienen un producto de extensión etiquetado de forma detectable, y la cuantificación también se logra mediante la integración de la intensidad, por ejemplo, la detección mediante la integración de la señal para todos los eventos de unión. Un kit que puede usarse con el método descrito anteriormente puede incluir uno o más de los siguientes en uno o más viales, contenedores o compartimentos: (a) Perlas magnéticas con reactivo de captura; (b) Dos reactivos de detección modificados con sondas de ácido nucleico (opcionalmente, los reactivos de detección se proporcionan por separado y las sondas de proximidad (1 y 2) se proporcionan adicionalmente con instrucciones para modificar los reactivos de detección con sondas); y (c) sondas etiquetadas con ECL; reactivos opcionales requeridos para la modificación de los reactivos de detección con sondas de proximidad; diluyente de ensayo, calibrador, oligonucleótidos de circularización, mezcla de ligación o sus componentes, por ejemplo, tampón de ligación, ATP, BSA, Tween 20, ADN ligasa T4; mezcla de RCA o sus componentes, por ejemplo, b Sa , tampón, dNTP, Tween 20, ADN polimerasa Phi29.
En una modalidad específica de un formato basado en perlas, analizadas en celda de flujo, una muestra se incuba con un anticuerpo monoclonal de captura biotinilado específico de analito y una mezcla de anticuerpos monoclonales específicos de analito, cada uno conjugado con oligonucleótidos, que reaccionan para formar un complejo tipo sándwich. Después de la adición de micropartículas recubiertas con estreptavidina, el complejo se une a la fase sólida mediante interacciones entre biotina y estreptavidina. Se añade una mezcla de ligación a la mezcla y la mezcla se incuba con la mezcla de ligación, se lava para eliminar el exceso de oligonucleótidos de circularización y se incuba con mezcla de RCA. La mezcla se lava y se añade una mezcla de sondas de detección etiquetadas con biotina. Para incorporar una etiqueta adecuada, por ejemplo, una etiqueta luminiscente, quimioluminiscente o electroquimioluminiscente, por ejemplo, SULFO-TAg , la sonda de detección se sintetiza con una etiqueta de biotina terminal y se une previamente a estreptavidina etiquetada con SULFO-TAG. La mezcla de reacción se aspira a la celda de medición donde las micropartículas se capturan magnéticamente sobre la superficie del electrodo, por ejemplo, un electrodo metálico, tal como un electrodo de platino. Después, las sustancias no unidas se eliminan con un tampón de lavado adecuado, por ejemplo, ProCell (tampón que contiene TPA). La aplicación de una tensión al electrodo induce una emisión de quimioluminiscencia que se mide con un fotomultiplicador. La aplicación de tensión y la medición de la emisión resultante puede realizarse en cualquier celda de flujo adecuada, por ejemplo, un instrumento Cobas y/o Elecsys (disponible de Hoffmann-La Roche LTD.).
En otra modalidad más, los métodos descritos en la presente descripción pueden aplicarse a un formato basado en perlas, con flujo capilar para contar digitalmente moléculas individuales. En un sistema de este tipo, la perla usada puede ser magnética y la superficie de la perla se modifica de modo que incluya una o más copias de un reactivo de captura. Los reactivos de detección empleados en este sistema son un par de reactivos de detección que incluyen etiquetas fluorescentes distinguibles. La etapa de medición incluye formar un complejo tipo sándwich que incluye el reactivo de captura, el analito y los reactivos de detección, reticular los reactivos de detección, eluir los reactivos de detección e introducir las perlas en una celda de flujo. Puede usarse una fuente de luz de excitación y un detector de luz de emisión para la detección de varios colores para detectar eventos de unión, la cuantificación se logra por correlación de la detección de dos fluoróforos en la celda de flujo, y la cuantificación también se logra mediante la integración de la intensidad, por ejemplo, la detección mediante la integración de la señal para todos los eventos de unión. Un kit que puede usarse con el método descrito anteriormente puede incluir uno o más de los siguientes en uno o más viales, contenedores o compartimentos: (a) Perlas magnéticas con reactivo de captura; (b) Dos reactivos de detección reticulables con etiquetas fluorescentes distinguibles; y (c) Tampones y/o diluyentes opcionales para el protocolo de ensayo.
Por otra parte, los métodos descritos en la presente descripción pueden aplicarse a un formato basado en perlas que incluye la separación de perlas en nanopocillos individuales. En un sistema de este tipo, la perla usada puede ser magnética y la superficie de la perla se modifica de modo que incluya una o más copias de un reactivo de captura. Los reactivos de detección empleados en este sistema son un par de reactivos de detección que incluyen etiquetas enzimáticas distinguibles. La etapa de medición incluye formar un complejo tipo sándwich que incluye el reactivo de captura, el analito y los reactivos de detección, y añadir los sustratos de las dos etiquetas enzimáticas. Después, las perlas se capturan en nanopocillos individuales. El ensayo puede detectar múltiples espectros en base a la identificación de productos enzimáticos con propiedades espectrales diferentes. Puede usarse una fuente de luz de excitación y un detector de luz de emisión para la detección de varios colores para detectar eventos de unión, la cuantificación se logra mediante el recuento de los nanopocillos que contienen ambos productos enzimáticos, y la cuantificación también se logra mediante la integración de la intensidad, por ejemplo, la detección mediante la integración de la señal para todos los nanopocillos. Un kit que puede usarse con el método descrito anteriormente puede incluir uno o más de los siguientes en uno o más viales, contenedores o compartimentos: (a) Perlas magnéticas con reactivo de captura; (b) Dos reactivos de detección, cada uno modificado con etiquetas enzimáticas distinguibles, por ejemplo, reactivo de detección biotinilado y un reactivo de detección conjugado con hapteno; (c) Estreptavidinabeta-galactosidasa, enzima conjugada con antihapteno, resorrufina-beta-d-galactopiranósido; (d) matriz, por ejemplo, matriz de formato Quanterix DVD; (e) aceite de fluorocarbono; y (f) tampones y/o diluyentes opcionales para el protocolo de ensayo. En esta modalidad específica, la señal detectable se mejora mediante la combinación del uso de un sistema de alta sensibilidad de nanopocillos con un sistema de detección basado en la proximidad. Aunque esta modalidad específica se ilustra mediante el uso de un sistema de detección basado en la proximidad particular, el experto apreciará el hecho de que los otros sistemas de detección basados en la proximidad descritos en la presente descripción también pueden usarse para mejorar la señal detectable en el ensayo, por ejemplo, sistema donante/aceptor de FRET; etiquetas luminiscentes que difieren entre sí con respecto a las propiedades espectrales; o el uso de una primera y segunda enzimas que son enzimas hidrolíticas, como se describió anteriormente, y los sustratos acompañantes apropiados.
Aún más, los métodos descritos en la presente descripción pueden aplicarse a una plataforma basada en matriz de perlas. En un sistema de este tipo, la perla usada puede ser no magnética y la superficie de la perla se modifica de modo que incluya una o más copias de un reactivo de captura. Los reactivos de detección empleados en este sistema son un par de reactivos de detección que incluyen una primera y segunda sondas de ácido nucleico. La etapa de medición incluye formar un complejo tipo sándwich que incluye el reactivo de captura, el analito y los reactivos de detección, extender una de las sondas para formar una secuencia extendida, en donde la extensión depende de la colocalización de la primera y segunda sondas en el complejo tipo sándwich, etiquetar la secuencia extendida con una sonda fluorescente y liberar la secuencia extendida de la superficie a un eluyente. Puede usarse una fuente de luz de excitación y un detector de luz de emisión para la detección de varios colores para detectar eventos de unión, la cuantificación se logra mediante el recuento de productos de extensión individuales etiquetados de forma detectable, y la cuantificación también se logra mediante la integración de la intensidad, por ejemplo, la detección mediante la integración de la señal para todos los eventos de unión. Un kit que puede usarse con el método descrito anteriormente puede incluir uno o más de los siguientes en uno o más viales, contenedores o compartimentos: (a) Perlas no magnéticas con reactivo de captura; (b) Dos reactivos de detección modificados con sondas de ácido nucleico (opcionalmente, los reactivos de detección se proporcionan por separado y las sondas de proximidad (1 y 2) se proporcionan adicionalmente con instrucciones para modificar los reactivos de detección con sondas); y (c) sondas etiquetadas con fluorescencia; reactivos opcionales requeridos para la modificación de los reactivos de detección con sondas de proximidad; diluyente de ensayo, calibrador, oligonucleótidos de circularización, mezcla de ligación o sus componentes, por ejemplo, tampón de ligación, ATP, BSA, Tween 20, ADN ligasa T4; mezcla de RCA o sus componentes, por ejemplo, BSA, tampón, dNTP, Tween 20, ADN polimerasa Phi29.
Los ensayos de unión mejorados descritos en la presente descripción pueden realizarse mediante el uso de uno o más kits que incluyen un conjunto de componentes empleados en el ensayo. Por ejemplo, un kit usado en la detección de un analito en una muestra incluye, en uno o más viales, contenedores o compartimentos, una superficie que incluye un reactivo de captura del analito y un reactivo de anclaje; y un reactivo de detección del analito que se enlaza a una sonda de ácido nucleico. Un kit de este tipo puede incluir un reactivo de anclaje que comprende una secuencia de oligonucleótido de anclaje.
Otro kit que puede usarse para llevar a cabo los métodos descritos en la presente descripción incluye, en uno o más viales, contenedores o compartimentos, una superficie que comprende un reactivo de captura del analito y un reactivo de anclaje que comprende una secuencia de oligonucleótido de anclaje; un primer reactivo de detección enlazado a una primera sonda de ácido nucleico; y un segundo reactivo de detección enlazado a una segunda sonda de ácido nucleico.
Otro kit más que puede usarse para realizar los ensayos de unión descritos en la presente descripción incluye, en uno o más viales, contenedores o compartimentos, una superficie que comprende un reactivo de captura del analito y un reactivo de anclaje; un primer reactivo de detección del analito que comprende una primera sonda de proximidad; un segundo reactivo de detección del analito que comprende una segunda sonda de proximidad; y una secuencia conectora que comprende (i) una secuencia interior complementaria a la segunda sonda de proximidad y (ii) dos secuencias de extremo complementarias a regiones no superpuestas de la primera sonda de proximidad. Alternativamente, un kit puede incluir en su lugar una superficie que comprende un reactivo de captura del analito y un reactivo de anclaje; un primer reactivo de detección del analito que comprende una primera sonda de proximidad; un segundo reactivo de detección del analito que comprende una segunda sonda de proximidad; y (i) un primer oligonucleótido conector y (ii) un segundo oligonucleótido conector, en donde (x) un primer extremo del primer conector y un primer extremo del segundo conector son complementarios a dos regiones no superpuestas de la primera sonda de proximidad y (y) un segundo extremo del primer conector y un segundo extremo del segundo conector son complementarios a dos regiones no superpuestas de la primera sonda de proximidad. Además, los reactivos de anclaje en uno o ambos de estos kits pueden incluir una secuencia de oligonucleótido de anclaje.
Por otra parte, los métodos descritos en la presente descripción pueden realizarse mediante el uso de un kit que incluye, en uno o más viales, contenedores o compartimentos, un primer reactivo de detección que comprende una primera etiqueta detectable; un segundo reactivo de detección que comprende una segunda etiqueta detectable; una pluralidad de recipientes de reacción configurados de modo que contengan una o menos moléculas de analito; y opcionalmente, una superficie que comprende un reactivo de captura.
Por último, un kit para la detección de un analito mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción puede incluir, en uno o más viales, contenedores o compartimentos, una superficie que comprende un reactivo de captura inmovilizado; un primer reactivo de detección que tiene una primera etiqueta detectable; un segundo reactivo de detección que tiene una segunda etiqueta detectable; y un agente de reticulación que reacciona con el primer y segundo reactivos de detección. El agente de reticulación puede incluir un agente de reticulación multifuncional que enlaza restos reactivos unidos a los reactivos de detección o una pareja de unión multivalente de restos de unión unidos a los reactivos de detección. Los agentes de reticulación multifuncionales adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminas, tioles, hidrazidas, aldehidos, ésteres, yodoacetamidas, maleimidas, reactivos de química clic y sus combinaciones. Igualmente, un ejemplo de una pareja de unión multivalente es un anticuerpo antiespecie multivalente dirigido a reactivos de detección que son anticuerpos de esa especie animal. El agente de reticulación también puede incluir estreptavidina, avidina o biotina, cuando se combina con una pareja de unión unida a los reactivos de detección. El agente de reticulación también puede ser un oligonucleótido que incluye una secuencia complementaria a una sonda de ácido nucleico unida, directa o indirectamente, a un componente del kit. En una modalidad específica, un kit usado en los métodos descritos en la presente descripción incluye, en uno o más viales, contenedores o compartimentos, una superficie que comprende un reactivo de captura inmovilizado; un primer reactivo de detección que tiene una primera etiqueta detectable y una primera sonda de ácido nucleico; un segundo reactivo de detección que tiene una segunda etiqueta detectable y una segunda sonda de ácido nucleico; y un tercer ácido nucleico que tiene regiones complementarias a la primera y segunda sondas de ácido nucleico.
Las superficies de los kits descritos en la presente descripción pueden incluir una pluralidad de reactivos de captura de una o más moléculas de analito, en donde los reactivos de captura se distribuyen en una pluralidad de regiones de unión o recipientes de reacción resolubles colocados en la superficie, por ejemplo, en una matriz, una placa de múltiples pocillos, o una placa de micro- o nanopocillos. Además, la superficie también puede incluir una pluralidad de partículas, cada una de las cuales comprende una pluralidad de reactivos de captura de una molécula de analito.
Los kits descritos anteriormente en la presente descripción pueden incluir además uno o más de los siguientes: uno o más reactivos, tampones, polimerasa, ligasa y/o dNTP (etiquetados o sin etiquetar) adicionales. Además, si el uno o más reactivos de detección comprenden una etiqueta detectable, el kit también puede incluir un correactante para la etiqueta detectable empleada en el kit. Alternativamente, si el uno o más reactivos de detección son componentes de un sistema de reacción enzimática acoplada, entonces cada uno de los reactivos de detección comprende una primera y segunda enzimas y el kit incluye, además, en uno o más contenedores, viales o compartimentos, uno o más sustratos para el sistema de reacción enzimática acoplada y, opcionalmente, un componente etiquetado configurado para unirse a un producto del sistema de reacción enzimática acoplada. Por ejemplo, la primera enzima puede ser una oxidasa, la segunda enzima una peroxidasa, y el kit incluye además un sustrato de oxidasa y un derivado de tiramida etiquetado. En otra modalidad, el primer y segundo reactivos detectables pueden comprender componentes de un sistema de detección dependiente de la proximidad, por ejemplo, un donante de FRET y un aceptor de FRET, o etiquetas luminiscentes que difieren entre sí con respecto a sus propiedades espectrales.
Modalidades alternativas adicionales
En la Figura 7 se ilustra una modalidad adicional. Una porción de cada una de las sondas de proximidad en el complejo de inmunoensayo tipo sándwich en el panel (a) está temporalmente protegida por hebras cortas de ARN hibridadas con cada segmento. Las hebras de ARN se eliminan enzimáticamente de modo que cada una de las sondas de proximidad pueda hibridarse entre sí y la cadena se extiende por extensión de polimerasa mediante el uso de dNTP biotinilados (panel (b)). Cada base biotinilada incorporada en la cadena se une a estreptavidina etiquetada con una etiqueta detectable (panel (c)).
En la Figura 8 se ilustra otro enfoque adicional. Las sondas de proximidad pueden unirse al reactivo de anclaje y un reactivo de detección (como se muestra en el panel (a)) o cada una de las sondas de proximidad puede unirse a dos reactivos de detección como se describió anteriormente en la presente descripción (no se muestra). Algo así como el método ilustrado en la Figura 7, una porción de cada una de las sondas de proximidad está protegida temporalmente por hebras cortas de ARN hibridadas con cada segmento. Las hebras de a Rn se eliminan enzimáticamente de modo que cada una de las sondas de proximidad pueda hibridarse entre sí y la cadena se extiende por extensión de polimerasa mediante el uso de dNTP biotinilados (panel (b)). Cada base biotinilada incorporada en la cadena se une a estreptavidina etiquetada con una etiqueta detectable (panel (c)).
Ejemplos
Ejemplo 1. Protocolo general para ligación de proximidad y amplificación de círculo rodante
Se modificó un par de anticuerpos de detección para un analito diana mediante la adición de las sondas de proximidad 1 y 2 de la siguiente manera: a 200 ug del primer anticuerpo de detección en 100 ul de tampón, se añadió 1,74 ul de sulfo-SMCC 23 mM, diluido en 150 mM de tampón fosfato y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se eliminó el sulfo-SMCC libre mediante cromatografía de exclusión por tamaño. La concentración final del anticuerpo de detección fue de 2 mg/ml o ligeramente inferior. Se redujeron noventa y cinco (95) ul de oligonucleótido modificado con tiol 300 uM (sonda de proximidad 1 y 2) con 5 ul de DTT 1 mM en tampón fosfato 100 mM, EDTA 0,5 mM, pH 8,4, durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secuencias de las sondas de proximidad 1 y 2 son:
Sonda de proximidad 1 modificada con tiol: SH-AAA AAA AAA AGA CGC TAA TAG TTA AGA CGC TTU UU (SEQ ID NO: 1; en donde los tres residuos de U son 2' O-metil ARN)
Sonda de proximidad 2 modificada con tiol: SH-AAA AAA AAA ATA TGA CAG AAC TAG ACA CTC TT (SEQ ID NO: 2).
Se eliminó el exceso de Sulfo-SMCC y DTT, por ejemplo, mediante el uso de tres separaciones por columna de centrifugación y el anticuerpo y el ADN se combinaron para la conjugación covalente. La solución se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con mezcla. Los conjugados anticuerpo-sonda de proximidad se purificaron, por ejemplo, mediante cromatografía de exclusión por tamaño para eliminar los anticuerpos y oligonucleótidos no conjugados.
Una placa MSD MULTI-SPOT® se bloqueó durante 1 hora con la solución de bloqueo MSD® apropiada y se lavó. Cada dominio de unión en la placa incluía un anticuerpo de captura y un resto de anclaje (inmovilizado como un conjugado BSA-oligonucleótido, el oligonucleótido se seleccionó de modo que fuera específico para un amplicón de círculo rodante). La secuencia del oligonucleótido de anclaje usado en este ejemplo fue 5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAAAAAAAAAAAA-/3TioMC3-D/-3' (SEQ ID NO: 3). Se añadió a cada pocillo veinticinco (25) ^l de cada calibrador y diluyente de ensayo, o muestra (diluida según corresponda) (lo que dio como resultado 50 ^l de volumen total). La placa se incubó con agitación durante 1-3 horas y cada pocillo se lavó. Se añadió a cada pocillo una solución de anticuerpos de detección etiquetados con las sondas de proximidad 1 y 2, preparada como se describió anteriormente (25 ul por pocillo), y se incubó con agitación durante 1-2 horas (alternativamente, cada anticuerpo de detección individual puede añadirse secuencialmente, con una incubación de 1 hora después de cada adición). Se añadió una mezcla de ligación a cada pocillo que incluía los siguientes componentes: (i) oligonucleótido de circularización 1 (4 nM), oligonucleótido de circularización 2 (4 nM), tampón de ligación, ATP (1 mM), ADN ligasa T4 (0,15 U/ul), en donde cada uno de los oligonucleótidos de circularización era:
Circ- 1: Fosfato -CTA TTA GCG TCC AGT GAA TGC GAG TCC GTC
TAA GAG AGT AGT AGA GCA GCC GTC AAG AGT GTC TA (SEQ ID NO: 4).
Circ-2: Fosfato -GTT CTG TCA TAT TTA AGC GTC TTA A (SEQ ID
NO: 5).
La placa se incubó con la mezcla de ligación durante 30 minutos a temperatura ambiente, se lavó para eliminar el exceso de oligonucleótidos de circularización y se incubó con la mezcla de RCA durante 1,5 horas a 37 C, en donde la mezcla de RCA contenía tampón de RCA, dNTP (250 uM de cada uno), ADN polimerasa Phi29 (0,125 U/ml). La placa se lavó y se añadió una mezcla de sondas de detección y se incubó durante 30 minutos a 37 C, en donde la mezcla de sondas de detección incluye: Tris 20 mM, SDTA 1 mM, NaCl 250 mM, Triton al 0,01 %, BSA (200 ug/ml), Tween 20 (0,05 %), sondas de detección (6,25 nM). La sonda de detección fue la secuencia CAG TGA ATG CGA GTC CGT CT (SEQ ID NO: 6). Para incorporar la etiqueta de electroquimioluminiscencia SULFO-TAG (Meso Scale Diagnostics), la sonda de detección se sintetizó con una etiqueta de biotina terminal y se unió previamente a estreptavidina etiquetada con SULFO-TAG. La placa se lavó y se llenó con 150 ^l de tampón de lectura MSD y se leyó inmediatamente en el lector MSD SECTOR® 6000 (placas y lector suministrados por Meso Scale Discovery, Rockville, MD).
Este procedimiento general se usó para detectar los siguientes analitos: troponina I, Akt (total), fosfo-Akt (473), fosfo-Akt (308), nucleoproteína (NP) de influenza A, IL-12p40, IL-12p70, Abeta1-42, ensayos de puenteo e isotipado de Ig mediante el uso del sistema modelo TNFalfa, ensayos de puenteo e isotipado de Ig mediante el uso del antígeno de superficie de la hepatitis B, y ensayos de puenteo e isotipado de Ig mediante el uso de Lyme C6. Los aumentos en la señal de ECL y la sensibilidad del ensayo con relación a un inmunoensayo tipo sándwich estándar variaron entre los ensayos, pero se observaron mejoras de hasta 100 veces. Para ciertos ensayos evaluados, por ejemplo, troponina-I, Akt (total), IL-12p40, IL-12p70 y Abeta1-42, la presencia del resto de anclaje mejoró la señal y/o la linealidad de la dilución, al prevenir la disociación del complejo de detección durante la etapa de amplificación. En la Figura 9 se muestra una curva de calibración para un ensayo de IL-10 realizado de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente. Además, la Tabla 2 (a continuación) muestra el LOD para un conjunto de ensayos representativos realizados de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente (columna 2, "Ensayo 3-AB Rc A/PLA") con relación al LOD para un protocolo estándar de inmunoensayo de dos anticuerpos de Meso Scale Diagnostics (MSD), Rockville, MD, disponible en el sitio web de Meso Scale Diagnostics (columna 3, "Protocolo de inmunoensayo MSD V-Plex 2-AB").
Tabla 2.
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Ejemplo 2. Protocolo de ensayo con y sin reactivo de anclaje
Se recubrió una placa MULTI-SPOT de 7 puntos de MSD como se describió anteriormente en el Ejemplo 1 con cada uno de los anticuerpos de captura de troponina I (220 ug/ml). Los anticuerpos de captura se aplicaron junto con o sin un resto de anclaje, BSA, al que se unió covalentemente un oligonucleótido específico para un amplicón (ancla a 5 ug/ml, si estaba presente). Se añadió veinticinco (25) |jl de cada diluyente de ensayo, calibrador o muestra (diluida según corresponda) a cada pocillo (50 j l en total). La placa se incubó con agitación durante 2 horas y cada pocillo se lavó. Se añadió a cada pocillo una solución de anticuerpos de detección etiquetados con las sondas de proximidad 1 y 2, preparada como se describió anteriormente (25 ul por pocillo) y se incubó con agitación durante 1 hora. Se añadió una mezcla de ligación a cada pocillo como se describió anteriormente en el Ejemplo 1. La placa se incubó con la mezcla de ligación durante 30 minutos a temperatura ambiente, se lavó para eliminar el exceso de oligonucleótidos de circularización y se incubó con la mezcla de RCA durante 1,5 horas a 37 C como se describió anteriormente en el Ejemplo 1. La placa se lavó y se añadió una mezcla de sondas de detección y se incubó durante 30 minutos a 37 C como se describió anteriormente en el Ejemplo 1. La placa se lavó y se llenó con 150 j l de tampón de lectura MSD y se leyó inmediatamente en el lector MSD SECTOR® 6000. El electrodo MSD se retiró de la parte superior de la placa para obtener imágenes de fluorescencia y se mantuvo húmedo con PBS y un cubreobjetos. La superficie se observó en un microscopio con una cámara Zyla, objetivo 20x, lectura de píxeles 2x2, conjunto de filtros del cliente, con una exposición de 2 segundos.
Como se muestra en la Tabla 3 (a continuación), los valores de ECL fueron 4-5 veces mayores en presencia del reactivo de anclaje y el límite de detección fue tres veces menor (más sensible).
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Tabla 3
La Figura 10 (a) y (b) muestran imágenes de microscopía de fluorescencia de superficies de placa con (panel (a)) y sin (panel (b)) reactivo de anclaje a 5 ug/ml. La imagen muestra puntos fluorescentes brillantes asociados con eventos de unión individuales y confirma que la amplificación por RCA en presencia del reactivo de anclaje fue más eficiente para generar eventos de unión observables.
Ejemplo 3. Comparación de uno frente a dos oligonucleótidos conectores
Se repitió el ensayo descrito en el Ejemplo 2 mediante el uso de un oligonucleótido conector lineal simple con un sitio de ligación para formar un molde circular en lugar de dos oligonucleótidos conectores con dos sitios de ligación separados. Como se muestra en la Figura 11(a), se preparó un oligonucleótido conector lineal simple que estaba expuesto en el sitio de ligación 1 o en el sitio de ligación 2. Ambos oligonucleótidos conectores lineales simples se evaluaron en paralelo con la combinación de oligonucleótidos usada en los Ejemplos 1 y 2, Circ-1 y Circ-2. Se empleó el protocolo descrito en el Ejemplo 2 y, además, los oligonucleótidos conectores lineales simples se evaluaron a tres concentraciones: 125 nM, 62,5 nM y 31 nM, mientras que el ensayo estándar que usa la combinación de oligonucleótidos Circ-1 y Circ-2 se evaluó a 125 nM. Como se muestra en la Figura 11(b), los dos oligonucleótidos conectores lineales simples se incorporaron con éxito en productos de amplificación por RCA con aproximadamente la misma eficacia que la mezcla de oligonucleótidos conectores de dos partes (Circ-1 y Circ-2). El oligonucleótido conector lineal simple que estaba expuesto en el sitio de ligación 1 tuvo un rendimiento comparable al de la mezcla de conectores de dos partes, en base a la intensidad de la señal, el fondo inespecífico y la sensibilidad general. Como se esperaba, el oligonucleótido conector lineal simple que estaba expuesto en el sitio de ligación 2 tenía un fondo inespecífico mayor y una sensibilidad menor. En este último caso, tanto la ligación como el cebado solo dependían de la presencia de la sonda de proximidad #1; por lo tanto, se perdieron algunos de los beneficios de la especificidad del enfoque de amplificación de proximidad.
Ejemplo 4. Ensayos de tres anticuerpos realizados mediante el uso de una sonda de proximidad alternativa, un oligonucleótido de anclaje y secuencias conectoras
Se realizó un ensayo mediante el uso del protocolo descrito en el Ejemplo 1, mediante el uso de los siguientes conjuntos alternativos de reactivos:
Tabla 4
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Los resultados de la Tabla 5 a continuación son para un ensayo de troponina en el que la concentración de troponina era de 500 pg/ml y cada pocillo de una placa MULTI-SPOT incluía un punto de captura con oligonucleótido de anclaje de uno de los conjuntos enumerados en la Tabla 4. El ensayo usó una sonda de proximidad (1) y una sonda de proximidad (2), a las mismas concentraciones que se describieron en el Ejemplo 1. La unión inespecífica para los conjuntos (a)-(c) fue mayor porque tenían una concentración 9 veces mayor de oligonucleótido de detección-SA-STAG en comparación con la descrita en el Ejemplo 1. La mayor concentración de oligonucleótido de detección-SA-STAG fue resultado de la titulación del complejo previamente unido en conjunto, en lugar de la titulación de SA-STAG solo, como en el Ejemplo 1.
Tabla 5.
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Ejemplo 5. Ensayos de tres anticuerpos realizados en plataformas de inmunoensayo adicionales
(а) Formato de inmunoensayo basado en perlas mediante el uso de partículas codificadas
Todas las etapas del ensayo se realizan en una placa de filtro de 96 pocillos. Extraer el líquido de la placa con un colector de vacío (que no exceda las 10 pulg. de Hg). Nunca invertir la placa. Si ocurre una obstrucción, usar el extremo puntiagudo de un tubo cónico de 15 ml para presionar suavemente el área debajo del pocillo obstruido y después usar una perilla de goma de pipeta Pasteur de 1 ml o colocar el pulgar sobre el pocillo obstruido para eliminar la obstrucción mediante la generación de presión. Después de la etapa de aspiración final, golpear ligeramente la parte inferior de la placa sobre una pila de toallas de papel y después frotar la parte inferior de la placa del filtro con un Kimwipe para eliminar el líquido/gotitas residuales.
Preparación de la solución de lavado: Preparar la solución de lavado de trabajo 1x mediante la dilución de todo el contenido de la botella de solución de lavado 20x con 285 ml de agua desionizada.
Preparación del estándar del ensayo: Reconstituir el estándar liofilizado en diluyente de ensayo al 100 % (muestras de suero y plasma) o diluyente de ensayo al 50 %/medio de cultivo de tejidos al 50 % (sobrenadantes de cultivo de tejidos); volúmenes de reconstitución: (i) 1 vial: 1 ml; (ii) 2 viales: 0,5 ml por vial. Rehidratar a temperatura ambiente durante 8-10 minutos. Invertir suavemente el(los) vial(es) varias veces y dejar que el(los) vial(es) se asiente(n) durante 3-5 minutos más para garantizar una hidratación completa. Si se usa más de 1 estándar, combinar volúmenes iguales de cada estándar y mezclar suavemente. Realizar diluciones seriadas en 3 veces del estándar reconstituido para preparar una curva estándar de siete puntos.
Captura del analito:
(1) Agitar en vórtex (30 s) la reserva de perlas de captura 10x y aplicar ultrasonidos (30 s). En un tubo envuelto en papel de aluminio, diluir la reserva de perlas de captura 10x (2,5 pl por pocillo) en solución de lavado de trabajo (25 pl por pocillo de -2000 a 5000 perlas/ensayo). Para un formato múltiple mayor, ajustar el volumen de la solución de lavado de trabajo para tener en cuenta los volúmenes adicionales retenidos de las reservas de perlas de captura 10x.
(2) Humedecer previamente los pocillos de muestra y estándar con 200 pl de solución de lavado de trabajo.
(3) Agitar en vórtex (30 s) la solución de perlas de captura diluida y aplicar ultrasonidos (30 s). Añadir inmediatamente 25 pl a cada pocillo de ensayo seguido de 200 pl de solución de lavado 1x. Aspirar y repetir el lavado con 200 pl de solución de lavado de trabajo. Golpear ligeramente y frotar la parte inferior de la placa del filtro según sea necesario.
(4) Añadir 50 pl de tampón de incubación a todos los pocillos del ensayo.
(5) Añadir 100 pl de estándar a los pocillos designados. Para los pocillos designados para muestras, añadir 50 pl de diluyente de ensayo seguido de 50 pl de muestra. Cubrir e incubar la placa durante 2 horas a temperatura ambiente en un agitador de placas orbital (500-600 rpm). Cubrir la placa de ensayo con una tapa opaca durante todas las incubaciones para protegerla de la luz. Puede ser necesario ajustar la velocidad en dependencia del radio del agitador orbital.
Detección del analito
(б) Preparar una mezcla 1x de anticuerpos de detección etiquetados con fluorescencia: Diluir la mezcla de anticuerpos de detección 10x (10 pl por pocillo) en diluyente (100 pl por pocillo). La mezcla incluye un par de anticuerpos de detección específicos del analito de interés, uno etiquetado con Alexa Fluor 350 (etiqueta fluorescente azul) y el otro etiquetado con Alexa Fluor 594 (etiqueta fluorescente roja) (cada una de estas etiquetas fluorescentes está disponible en Life Technologies, Grand Island, Nueva York, www.lifetechnologies.com). Para un formato múltiple mayor, ajustar el volumen de diluyente para tener en cuenta los volúmenes adicionales de reservas de mezcla de anticuerpos 10x requeridos. Aspirar y lavar los pocillos de ensayo dos veces con 200 pl de solución de lavado de trabajo. Añadir 100 pl de mezcla de anticuerpos de detección diluida a cada pocillo de ensayo. Cubrir e incubar la placa durante 1 hora en un agitador de placas (500-600 rpm).
Lectura del ensayo
(8) Aspirar y lavar los pocilios de ensayo 3 veces con 200 |jl de solución de lavado de trabajo. Secar la parte inferior de la placa de filtro con toallas de papel limpias para eliminar por completo todas las gotitas residuales. Añadir 100 j l de solución de lavado de trabajo a cada pocillo de ensayo y colocar la placa en el agitador de placas (500-600 rpm) durante 2-3 minutos.
(9) Analizar la suspensión de perlas en un analizador de partículas de fluorescencia de varios colores (tal como un sistema FACS o un instrumento xMAP modificado) que incluye canales de color para cada etiqueta fluorescente. Para una sensibilidad máxima, el ensayo se realiza en condiciones en las que es probable que cualquier partícula tenga solo cero o un analito unido y la cantidad de analito se cuantifica mediante el recuento del número de partículas específicas para un analito dado (en base a la codificación de las partículas) que comprenden ambas etiquetas fluorescentes. Opcionalmente, el ensayo puede realizarse en un formato múltiple mediante el uso de perlas codificadas donde el código indica la especificidad de analito del anticuerpo de captura en una perla y pares adicionales de anticuerpos de detección para cada analito. Cuando se determina la codificación, como en xMAP mediante el uso de colores de fluorescencia adicionales incorporados en las perlas, el analizador debe tener canales de detección adicionales para medir los colores adicionales e identificar el código de la perla.
(b) Formato de inmunoensayo basado en perlas mediante el uso de partículas codificadas que incluyen un resto de anclaje, mediante el uso de dos reactivos de detección modificados con sondas de ácido nucleico
Como se describió en el Ejemplo 5 (a), todas las etapas del ensayo se realizan en una placa de filtro de 96 pocillos. La solución de lavado y el estándar de ensayo se preparan como se describió en el Ejemplo 5 (a) y un par de anticuerpos de detección de un analito diana se modifican mediante la adición de las sondas de proximidad 1 y 2 como se describió en el Ejemplo 1. El analito se captura en perlas de captura como se describió en el Ejemplo 5(a). Las perlas de captura incluyen un resto de anclaje, inmovilizado a la superficie de la perla como un conjugado BSA-oligonucleótido, con el oligonucleótido seleccionado de modo que sea específico para un amplicón de círculo rodante. La secuencia del oligonucleótido de anclaje usada es la SEQ ID NO: 3.
Se mezclan veinticinco (25) j l de diluyente de ensayo, calibrador o muestra (diluida según corresponda) con una mezcla de perlas de captura. La mezcla se incuba con agitación durante 1-3 horas y se lava. Se añade a la mezcla una solución de anticuerpos de detección etiquetados con las sondas de proximidad 1 y 2, preparada como se describió anteriormente, y se incuba con agitación durante 1-2 horas (alternativamente, cada anticuerpo de detección individual puede añadirse secuencialmente, con una incubación de 1 hora después de cada adición). Se añade la mezcla de ligación descrita en el Ejemplo 1. La mezcla se incuba con la mezcla de ligación durante 30 minutos a 37 C, se lava para eliminar el exceso de oligonucleótidos de circularización y se incuba con mezcla de RCA durante 1,5 horas a 37 C, en donde la mezcla de RCA se describió anteriormente en el Ejemplo 1. La mezcla se lava y se añade una mezcla de sondas de detección etiquetadas con fluoresceína y se incuba durante 30 minutos a 37 C, en donde la mezcla de sondas de detección se describió anteriormente. La mezcla se lava y las partículas se aspiran a un analizador de partículas de fluorescencia multicanal.
(c) Formato basado en perlas y separación de moléculas de analito capturadas en nanopocillos individuales
La muestra se prepara en 100 j l de suero bovino al 25 % (dilución de 2-4 veces) y se añaden a la muestra 500K perlas (paramagnéticas de 2,7 jm , opcionalmente codificadas con fluorescencia) recubiertas con anticuerpo de captura. La muestra se incuba durante aproximadamente 2 h a 23 °C. La muestra se lava tres veces con PBS (5X, Tween-20 al 0,1 %) y se añade una mezcla de anticuerpos de detección etiquetados (una mezcla que incluye un primer anticuerpo de detección biotinilado y un anticuerpo conjugado con hapteno). La mezcla se incuba durante aproximadamente 1 h a 23 °C. La mezcla se lava tres veces con PBS (5X, Tween-20 al 0,1 %), se añade la etiqueta enzimática, estreptavidina-beta-galactosidasa (40 pM), también se añade enzima conjugada con antihapteno y la mezcla se incuba durante aproximadamente 30 min a 23 °C (o 3 min en un analizador Simoa). La mezcla se lava siete veces con PBS (5X, Tween-20 al 0,1 %) y se añade el sustrato enzimático, 15 ul de resorrufina-beta-d-galactopiranósido (100 uM, en tampón de carga).
La mezcla se extiende sobre una matriz de nanopocillos (proporcionada por Quanterix en formato DVD, hecha de un polímero de olefina cíclica, con 24 muestras por disco) y se deja reposar durante aproximadamente 2 minutos. La matriz se lava con tampón, la matriz se sella con aceite de fluorocarbono, se incuba durante 2-5 min a 23 °C y los resultados se leen en un generador de imágenes de fluorescencia de varios colores. El análisis de imágenes se usa para contar el número de nanopocillos que contienen ambos productos enzimáticos fluorescentes y, de esta manera, proporcionar un valor que se correlaciona con la concentración de analito en la muestra.
(d) Formato de inmunoensayo basado en perlas analizadas en celda de flujo
Primera incubación: 10 ul de muestra, un anticuerpo monoclonal de captura biotinilado específico de analito (solución de trabajo a 2,6 mg/l) y una mezcla de anticuerpos monoclonales específicos de analito, cada uno conjugado con oligonucleótidos (solución de trabajo a 0,3 mg/l) reaccionan para formar un complejo tipo sándwich. La mezcla de anticuerpos monoclonales específicos de analito se prepara como en el Ejemplo 1 y la mezcla incluye un par de anticuerpos conjugados con las sondas de proximidad 1 y 2 como se describió anteriormente en el Ejemplo 1.
Segunda incubación: después de la adición de micropartículas recubiertas con estreptavidina (Dynal M280, 2,8 um, 0,72 mg/ml, capacidad de unión para biotina 470 ng/mg), el complejo se une a la fase sólida mediante interacciones entre biotina y estreptavidina. Se añade una mezcla de ligación a la mezcla, en donde la mezcla de ligación se prepara de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 1. La mezcla se incuba con la mezcla de ligación durante 30 minutos a 37 C, se lava para eliminar el exceso de oligonucleótidos de circularización y se incuba con mezcla de RCA como se describió en el Ejemplo 1. La mezcla se lava y se añade una mezcla de sondas de detección etiquetadas con biotina y se incuba durante 30 minutos a 37 C, en donde la mezcla de sondas de detección se prepara como se describió en el Ejemplo 1. Para incorporar la etiqueta de electroquimioluminiscencia SULFO-TAG (Meso Scale Diagnostics), la sonda de detección se sintetiza con una etiqueta de biotina terminal y se une previamente a estreptavidina etiquetada con SULFO-TAG.
La mezcla de reacción se aspira a la celda de medición donde las micropartículas se capturan magnéticamente sobre la superficie del electrodo. Después, las sustancias no unidas se eliminan con ProCell (tampón que contiene TPA). La aplicación de una tensión al electrodo induce una emisión de quimioluminiscencia que se mide con un fotomultiplicador. Los resultados se determinan mediante una curva de calibración que genera específicamente el instrumento mediante la calibración de 2 puntos y una curva patrón proporcionada mediante el código de barras del reactivo.
Ejemplo 6. Detección de P24 de VIH-1
Materiales, métodos y resultados:
Se usó el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 para detectar p24 de VIH-1. Se evaluaron aproximadamente 64 muestras de suero o plasma de un panel de rendimiento de títulos mixtos de VIH-1 (disponible en Seracare Life Sciences, www.seracarecatalog.com), panel de seroconversión de VIH-1 (también disponible en Seracare Life Sciences), muestras positivas de anticuerpos contra VIH (disponibles en ProMedDx, LLC, www.promeddx.com) y muestras equivalentes normales (disponibles en Bioreclamation, www.bioreclamation.com). En la Figura 12 se muestra una curva de calibración de un ensayo de p24 de VIH-1 realizado de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente. Se encontró que el LOD para el ensayo era 1,3 fg/ml, LLOQ fue 3,0 fg/ml y ULOQ fue 37500 fg/ml. Un límite de detección de 1,3 fg/ml para una muestra de 25 ul corresponde a aproximadamente 650 moléculas de p24 y cada partícula de virus (molécula) produce aproximadamente 2000 copias de la proteína p24.
El panel de rendimiento de títulos mixtos, PRA204 (B), consistía en un conjunto de diez especímenes con reactividad que variaba de débil a fuertemente positiva para el antígeno p24 de VIH en ensayos disponibles comercialmente (bioMerieux, Perkin Elmer y Zeptometrix). Se incluyeron dos especímenes negativos en el panel. Los resultados de los ensayos se muestran en la Tabla 6 a continuación:
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Tabla 6.
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Los niveles de p24 de VIH fueron altos y por encima del ULOQ para la mayoría de las muestras. Las diez muestras positivas fueron detectables y comparables a los kits de p24 disponibles comercialmente, mientras que las muestras negativas (en base a ensayos comerciales, PRA204(B)-10 y -20, respectivamente) fueron bastante bajas, aproximadamente 3 y 2 fg/ml, respectivamente.
Los resultados del análisis del panel de seroconversión se muestran en la Figura 13. Se encontró que el formato de ensayo de 3 anticuerpos es tan sensible como la PCR y el retraso estimado en el tiempo para detectar la primera muestra positiva y los niveles de p24 en ambas muestras de los paneles PRB948 y PRB962 se compara con el kit de PCR y funciona mejor que otros ensayos de p24 comerciales. Los datos se muestran en la Tabla 7.
Tabla 7.
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Conclusiones:
Los pacientes que se han infectado recientemente con VIH contribuyen de manera desproporcionada a la transmisión de la enfermedad. Las cargas virales son altas en las primeras semanas después de la infección y es poco probable que los pacientes recién infectados se den cuenta de que están infectados y pueden transmitir la enfermedad a otras personas. Por lo tanto, la detección temprana de la infección aguda por V iH es de gran importancia para la salud pública. Los métodos de PCR son el estándar de referencia con respecto a la sensibilidad; pueden detectar tan poco como 60 copias de ARN de VIH por ml de suero o plasma (30 partículas de virus por ml). Sin embargo, la tecnología de PCR es compleja y costosa y, por lo tanto, no es adecuada para todos los escenarios. Los inmunoensayos son más simples y económicos, pero el límite de detección de los inmunoensayos de p24 de 4ta generación actuales es solo de aproximadamente 10 pg/ml, o aproximadamente 250 millones de proteínas de la cápside por ml. Por virus, estos inmunoensayos son varios miles de veces menos sensibles que las pruebas de PCR, a pesar de que hay aproximadamente 2000 proteínas p24 de la cápside por virus.
Como se describe en la presente descripción, se desarrolló un formato de ensayo de electroquimioluminiscencia de nueva generación en base a la tecnología MULTI-ARRAY® de MSD y se caracterizó su rendimiento. El límite de detección para este nuevo inmunoensayo de p24 fue de aproximadamente 1 fg/ml, 10000 veces más sensible que los inmunoensayos de p24 actuales. Una sensibilidad de 1 fg/ml corresponde a menos de 1 partícula de virus en nuestro volumen de muestra de 25 ul. Los límites de cuantificación inferior y superior fueron 3 fg/ml y 38000 fg/ml, respectivamente. El CV dentro de la placa fue 7 % y el CV total 15 %. La recuperación del pico y la linealidad de la dilución estuvieron entre 80 % y 120 %. La p24 fue indetectable en el suero o plasma de 32 donantes aparentemente sanos. El panel de títulos mixtos de p24 mostró una buena correlación entre los ensayos 3-AB HIVp24 y los inmunoensayos de p24 comerciales. Se evaluaron dos paneles de seroconversión: SeraCare PRB948 (días 0 y 18, PCR negativa; días 22 y 23, PCR positiva) y PRB962 (días 0 y 2, PCR negativa; días 7, 9, 14 y 17, PCR positiva). En ambos casos, el resultado del ensayo 3AB HIVp24 fue negativo para todas las muestras negativas por p Cr y positivo para todas las muestras positivas por PCR, y la infección se detectó mucho antes que en los inmunoensayos de p24 convencionales.
En conclusión, el inmunoensayo 3-AB HIVp24 descrito en la presente descripción es 10000 veces más sensible que los límites actuales de los ELISA de p24 y comparable en sensibilidad a los ensayos de PCR. El ensayo no requiere equipo especializado y puede realizarse en lectores de placa MESO™ QuickPlex SQ 120 y SECTOR®.
La presente invención no se limita en su alcance por las modalidades específicas descritas en la presente descripción. De hecho, varias modificaciones del método además de las descritas en la presente descripción resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y las figuras adjuntas.
Referencias
1. Patente de Estados Unidos núm. 7,306,904
2. Patente de Estados Unidos núm. 7,320,860
3. Patente de Estados Unidos núm. 7,351,528
4. Patente de Estados Unidos núm. 7,192,703
5. Patente de Estados Unidos núm. 6,878,515

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un método para detectar un analito de interés en una muestra que comprende:
a. unir el analito a: (i) un reactivo de captura en una superficie, dicha superficie comprende el reactivo de captura del analito, en donde el reactivo de captura es un anticuerpo; (ii) un primer reactivo de detección del analito que se enlaza a una primera sonda de ácido nucleico; y (iii) un segundo reactivo de detección del analito que se enlaza a una segunda sonda de ácido nucleico, en donde el primer reactivo de detección y el segundo reactivo de detección son anticuerpos; para formar de esta manera un complejo en la superficie que comprende el reactivo de captura, el analito y el primer y segundo reactivos de detección, en donde la superficie también comprende un reactivo de anclaje que comprende una secuencia de oligonucleótido de anclaje;
b. usar un proceso de extensión que requiere que la primera y segunda sondas de ácido nucleico estén próximas a una o dos secuencias conectoras que se hibridan con la primera y segunda sondas de ácido nucleico, ligar la una o dos secuencias conectoras para formar un molde circular, y extender la segunda sonda de ácido nucleico, mediante amplificación de círculo rodante del molde circular, para formar una secuencia extendida que comprende un complemento de la secuencia de anclaje que es complementario a la secuencia de oligonucleótido de anclaje;
c. hibridar la secuencia de oligonucleótido de anclaje con el complemento de la secuencia de anclaje de la secuencia extendida; y
d. medir la cantidad de secuencia extendida unida a la superficie.
2. Un kit para la detección de un analito de interés en una muestra que comprende, en uno o más viales, contenedores o compartimentos:
a. una superficie que comprende (i) un reactivo de captura del analito, en donde el reactivo de captura es un anticuerpo y (ii) un reactivo de anclaje que comprende una secuencia de oligonucleótido de anclaje; b. un primer reactivo de detección del analito que se enlaza a una primera sonda de ácido nucleico; y c. un segundo reactivo de detección del analito que se enlaza a una segunda sonda de ácido nucleico,
en donde el primer reactivo de detección y el segundo reactivo de detección son anticuerpos, y en donde la secuencia de oligonucleótido de anclaje es complementaria a un complemento de la secuencia de anclaje contenido en una secuencia extendida de la segunda sonda de ácido nucleico, en donde la secuencia extendida se forma mediante amplificación de círculo rodante de un molde circular formado por ligación de una o dos secuencias conectoras que se hibridan con la primera y segunda sondas de ácido nucleico.
3. El método de la reivindicación 1, en donde la secuencia de oligonucleótido de anclaje es una secuencia de oligonucleótido monocatenaria.
4. El método de la reivindicación 1, en donde la secuencia extendida comprende además una o más secuencias de detección.
5. El método de la reivindicación 1, en donde la medición de la cantidad de secuencia extendida unida a la superficie comprende incorporar bases nucleotídicas etiquetadas durante la amplificación de círculo rodante.
6. El método de la reivindicación 1, en donde la medición de la cantidad de secuencia extendida unida a la superficie comprende hibridar sondas de detección etiquetadas con la secuencia extendida.
7. El kit de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el molde circular se forma mediante la ligación de una secuencia conectora que se hibrida con la primera y segunda sondas de ácido nucleico.
8. El kit de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el molde circular se forma mediante la ligación de dos secuencias conectoras que se hibridan con la primera y segunda sondas de ácido nucleico.
9. El kit de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la secuencia extendida comprende además una o más secuencias de detección.
10. El kit de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la secuencia extendida comprende además una o más bases nucleotídicas etiquetadas.
11. El kit de la reivindicación 2, en donde la secuencia extendida se forma mediante amplificación de círculo rodante del molde circular formado por una secuencia conectora que se hibrida con la primera y segunda sondas de ácido nucleico.
12. El kit de la reivindicación 2, en donde la secuencia extendida se forma mediante amplificación de círculo rodante del molde circular formado por dos secuencias conectoras que se hibridan con la primera y segunda sondas de ácido nucleico.
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Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3191015A1 (en) 2012-02-07 2013-08-15 Vibrant Holdings, Llc Substrates, peptide arrays, and methods
US10006909B2 (en) 2012-09-28 2018-06-26 Vibrant Holdings, Llc Methods, systems, and arrays for biomolecular analysis
US10286376B2 (en) 2012-11-14 2019-05-14 Vibrant Holdings, Llc Substrates, systems, and methods for array synthesis and biomolecular analysis
CA2923379C (en) * 2013-02-15 2023-01-03 Vibrant Holdings, Llc Methods and compositions for amplified electrochemiluminescence detection
US10114015B2 (en) 2013-03-13 2018-10-30 Meso Scale Technologies, Llc. Assay methods
EP2971183A4 (en) 2013-03-13 2016-10-26 Meso Scale Technologies Llc IMPROVED TEST PROCEDURES
KR20250011724A (ko) * 2014-05-15 2025-01-21 메소 스케일 테크놀러지즈, 엘엘시 개선된 분석 방법
US10472620B2 (en) 2014-07-01 2019-11-12 General Electric Company Method, substrate and device for separating nucleic acids
US9593368B2 (en) 2014-07-01 2017-03-14 General Electric Company Methods for amplifying nucleic acids on substrates
US10870845B2 (en) 2014-07-01 2020-12-22 Global Life Sciences Solutions Operations UK Ltd Methods for capturing nucleic acids
GB201503387D0 (en) * 2015-02-27 2015-04-15 ALERE TECHNOLOGIES GmbH Anti-carbapenem antibodies and uses thereof
EP3991848A3 (en) 2015-04-06 2022-07-20 Meso Scale Technologies, LLC. High throughput system for performing assays using electrochemiluminescence including a consumable shaking apparatus
CN107667291B (zh) * 2015-04-10 2021-11-05 科里斯生物概念私人有限公司 用于检测产碳青霉烯酶的肠杆菌科的方法和装置
WO2016178350A1 (ja) * 2015-05-07 2016-11-10 Tdk株式会社 検出システムおよび修飾物質
US11156609B2 (en) * 2015-10-05 2021-10-26 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Development and parameter assessment for vertically aligned platinum wire aptasensor arrays for impedimetric detection of cardiac biomarkers
WO2017106232A1 (en) * 2015-12-15 2017-06-22 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Detection of polynucleotides with nanotubes
US11713483B2 (en) 2016-02-09 2023-08-01 Children's Medical Center Corporation Method for detection of analytes via polymer complexes
WO2017165647A1 (en) * 2016-03-23 2017-09-28 Children's Medical Center Corporation Rapid and sensitive detection and quantification of analytes in complex samples using polymer-based methods
CN105651840B (zh) * 2016-04-01 2017-12-26 商丘师范学院 一种检测β‑淀粉样蛋白寡聚体的类免疫电化学传感器及其制备方法
WO2018107054A1 (en) 2016-12-09 2018-06-14 Ultivue, Inc. Improved methods for multiplex imaging using labeled nucleic acid imaging agents
US11149319B2 (en) * 2016-12-20 2021-10-19 Roche Molecular Systems, Inc. Systems and methods for detecting cells using engineered transduction particles
CN117187346A (zh) 2017-03-31 2023-12-08 乌尔蒂维尤股份有限公司 Dna-抗原交换和扩增
GB201705764D0 (en) * 2017-04-10 2017-05-24 Imp Innovations Ltd Analyte detection method
US11529628B2 (en) * 2017-04-28 2022-12-20 Ezdia Tech Inc. Automated immunoassay device and method using large magnetic particle complex
US10538808B2 (en) 2017-05-26 2020-01-21 Vibrant Holdings, Llc Photoactive compounds and methods for biomolecule detection and sequencing
WO2019034437A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Conicet - Consejo Nacional De Investigaciones Científicas Y Técnicas DIRECT DETECTION OF MALDI-TOF MASS SPECTROMETRY RESISTANCE MECHANISMS
CN107966564B (zh) * 2017-08-23 2020-06-02 武汉菲思特生物科技有限公司 一种人前蛋白转化酶枯草溶菌素9酶联免疫检测试剂和检测试剂盒与应用
AU2019225476A1 (en) 2018-02-20 2020-09-10 Pavonis Diagnostics Inc. Aluminum oxide surfaces and interface molecules
CA3265017A1 (en) 2018-03-08 2025-10-31 Meso Scale Technologies, Llc. Genetic marker and/or biomarkers for traumatic brain injury, and ultrasensitive assays for biomarkers of traumatic brain injury
US12319712B2 (en) 2018-05-09 2025-06-03 Vibrant Holdings, Llc Methods of synthesizing a polynucleotide array using photoactivated agents
EP3857228A4 (en) * 2018-09-26 2022-07-06 The University of North Carolina at Chapel Hill COMPOUNDS, COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVING ASSAYS
CN111139285A (zh) * 2018-11-02 2020-05-12 深圳华大生命科学研究院 一种高通量检测多个待测样本中不同目的蛋白含量的方法及其专用试剂盒
WO2020142313A1 (en) 2019-01-03 2020-07-09 Meso Scale Technologies, Llc Compositions and methods for carrying out assay measurements
CN114144422B (zh) * 2019-03-01 2025-03-07 中尺度技术有限责任公司 用于免疫方法的被电化学发光标记的探针、使用这类探针的方法和包含这类探针的试剂盒
JP7649252B2 (ja) * 2019-05-03 2025-03-19 メソ スケール テクノロジーズ エルエルシー サンプル中の１つ以上の標的核酸分析物を検出するためのキットならびにそれを作製および使用する方法
CN120992927A (zh) * 2019-06-25 2025-11-21 维拉维斯公司 用于检测和贫化样品干扰物的组合物和方法
CN111621551B (zh) * 2019-07-31 2021-10-26 深圳闪量科技有限公司 多重连接探针微阵列检测
WO2021108666A2 (en) 2019-11-26 2021-06-03 Meso Scale Technologies, Llc. Methods and kits for detecting autoimmune diseases
WO2021174071A1 (en) 2020-02-29 2021-09-02 President And Fellows Of Harvard College Nanoswitch caliper trains for high-throughput, high-resolution structural analysis of biomolecules
US20210302436A1 (en) * 2020-03-23 2021-09-30 Baseline Viral Diagnostics, Inc. Method, Systems, and a Kit for Detection, Diagnosis, Monitoring and Treatment of COVID-19
US20230184768A1 (en) 2020-05-01 2023-06-15 Meso Scale Technologies, Llc. Viral serology ace2 competition assays
EP4154008A1 (en) 2020-05-19 2023-03-29 Meso Scale Technologies, LLC Methods, compositions, and kits for nucleic acid detection
JP2023532902A (ja) 2020-07-01 2023-08-01 メソ スケール テクノロジーズ エルエルシー アッセイ測定のための組成物及び方法
WO2022051485A2 (en) 2020-09-02 2022-03-10 Meso Scale Technologies,Llc. Kits for detecting one or more target analytes in a sample and methods of making and using the same
CN112269025A (zh) * 2020-11-13 2021-01-26 三诺生物传感股份有限公司 一种白介素-6化学发光测定试剂盒及其制备方法
CN113030469B (zh) * 2021-03-18 2024-04-09 贵州省分析测试研究院 一种新型冠状病毒检测方法
KR20240026443A (ko) 2021-04-26 2024-02-28 메소 스케일 테크놀러지즈, 엘엘시 다중 검정 플레이트 및 제조 방법
US20220404360A1 (en) 2021-05-21 2022-12-22 Meso Scale Technologies, Llc. Assays for viral strain determination
ES3042384T3 (en) * 2021-06-17 2025-11-20 Hoffmann La Roche Method for immunosensing on a lipid layer using magnetic tunnel junctions
JP7610736B2 (ja) * 2021-06-17 2025-01-08 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 磁気トンネル接合部を使用して脂質層上で免疫センシングするための方法ｉｉ
JP2024524931A (ja) * 2021-06-17 2024-07-09 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 脂質層上で免疫センシングするための方法
AU2022304570A1 (en) * 2021-06-28 2024-01-18 Meso Scale Technologies, Llc. Methods, compositions, and kits for assay signal amplification
CN113640515B (zh) * 2021-08-09 2023-08-08 郑州大学 一种利用多种标志物联合检测外泌体的方法及试剂盒
KR20240146115A (ko) 2021-12-30 2024-10-07 메소 스케일 테크놀러지즈, 엘엘시 전기화학발광 검출 방법
WO2023245184A1 (en) 2022-06-17 2023-12-21 Meso Scale Technologies, Llc. Viral strain serology assays
US20240103002A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Meso Scale Technologies, Llc. Orthopoxvirus serology assays
WO2024137572A1 (en) 2022-12-20 2024-06-27 Meso Scale Technologies, Llc. Assay methods and kits
CN116334209B (zh) * 2023-01-06 2024-06-21 上海大格生物科技有限公司 基于crispr技术的病理切片原位基因检测产品及其用途
WO2025049305A1 (en) 2023-08-25 2025-03-06 Meso Scale Technologies, Llc. Viral strain serology assays
WO2025260043A1 (en) 2024-06-14 2025-12-18 Meso Scale Technologies, Llc. Methods and kits for measuring three or more tau epitopes
WO2026039455A1 (en) 2024-08-13 2026-02-19 Meso Scale Technologies, Llc. Detection of nucleic acids

Family Cites Families (152)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4342566A (en) 1980-02-22 1982-08-03 Scripps Clinic & Research Foundation Solid phase anti-C3 assay for detection of immune complexes
US4595661A (en) 1983-11-18 1986-06-17 Beckman Instruments, Inc. Immunoassays and kits for use therein which include low affinity antibodies for reducing the hook effect
US5238808A (en) 1984-10-31 1993-08-24 Igen, Inc. Luminescent metal chelate labels and means for detection
US5310687A (en) 1984-10-31 1994-05-10 Igen, Inc. Luminescent metal chelate labels and means for detection
US5026653A (en) 1985-04-02 1991-06-25 Leeco Diagnostic, Inc. Scavenger antibody mixture and its use for immunometric assay
US5356774A (en) 1986-04-16 1994-10-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Replicative RNA-based amplification/detection systems
US5147806A (en) 1988-04-29 1992-09-15 Igen, Inc. Method and apparatus for conducting electrochemiluminescence measurements
US5635347A (en) 1986-04-30 1997-06-03 Igen, Inc. Rapid assays for amplification products
US6165729A (en) 1986-04-30 2000-12-26 Hyperion Catalysis International, Inc. Electrochemiluminescent reaction utilizing amine-derived reductant
US5591581A (en) 1986-04-30 1997-01-07 Igen, Inc. Electrochemiluminescent rhenium moieties and methods for their use
US5656731A (en) 1987-10-15 1997-08-12 Chiron Corporation Nucleic acid-amplified immunoassay probes
US5308754A (en) 1988-03-21 1994-05-03 Kankare Jouko J Electrogenerated luminescence in solution
US4988617A (en) 1988-03-25 1991-01-29 California Institute Of Technology Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids
US5093268A (en) 1988-04-28 1992-03-03 Igen, Inc. Apparatus for conducting a plurality of simultaneous measurements of electrochemiluminescent phenomena
US5185243A (en) 1988-08-25 1993-02-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Method for detection of specific nucleic acid sequences
US5705402A (en) 1988-11-03 1998-01-06 Igen International, Inc. Method and apparatus for magnetic microparticulate based luminescence assay including plurality of magnets
US5200051A (en) * 1988-11-14 1993-04-06 I-Stat Corporation Wholly microfabricated biosensors and process for the manufacture and use thereof
US5324457A (en) 1989-10-02 1994-06-28 Board Of Regents, The University Of Tx System Devices and methods for generating electrogenerated chemiluminescence
US5200314A (en) 1990-03-23 1993-04-06 Chiron Corporation Polynucleotide capture assay employing in vitro amplification
EP0453301A3 (en) 1990-04-20 1993-07-21 Syntex (U.S.A.) Inc. Double receptor polynucleotide assay method
JP3034304B2 (ja) * 1990-05-04 2000-04-17 カイロン コーポレイション タンパク質―核酸プローブおよびそれを用いたイムノアッセイ
US5776672A (en) 1990-09-28 1998-07-07 Kabushiki Kaisha Toshiba Gene detection method
JP3080178B2 (ja) 1991-02-18 2000-08-21 東洋紡績株式会社 核酸配列の増幅方法およびそのための試薬キット
JPH0534345A (ja) 1991-02-19 1993-02-09 Tdk Corp 化学発光を利用する抗原・抗体の測定方法
US5665539A (en) 1991-07-12 1997-09-09 The Regents Of The University Of California Immuno-polymerase chain reaction system for antigen detection
US6872816B1 (en) 1996-01-24 2005-03-29 Third Wave Technologies, Inc. Nucleic acid detection kits
ZA929351B (en) 1991-12-11 1993-06-04 Igen Inc Electrochemiluminescent label for DNA assays.
EP0625213B1 (en) 1992-10-09 1999-12-29 VYSIS, Inc. Assay methods
FR2699537B1 (fr) * 1992-12-18 1995-02-17 Pasteur Institut Protéine conférant une résistance de type inductible, à des glycopeptides, notamment chez des bactéries à gram-positif. Séquences de nucléotides codant pour cette protéine.
AU6088094A (en) 1993-01-15 1994-08-15 General Hospital Corporation, The Rna assays using rna binary probes and ribozyme ligase
DE69430665T2 (de) 1993-01-15 2002-11-21 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Empfindlicher nukleinsäure-sandwichhybridisierungs-assay und kits
US6077668A (en) 1993-04-15 2000-06-20 University Of Rochester Highly sensitive multimeric nucleic acid probes
US5714320A (en) 1993-04-15 1998-02-03 University Of Rochester Rolling circle synthesis of oligonucleotides and amplification of select randomized circular oligonucleotides
EP0722508B1 (en) 1993-09-22 2003-04-02 Igen International, Inc. Self-sustained sequence replication electrochemiluminescent nucleic acid assay
US5561043A (en) 1994-01-31 1996-10-01 Trustees Of Boston University Self-assembling multimeric nucleic acid constructs
SE9400522D0 (sv) 1994-02-16 1994-02-16 Ulf Landegren Method and reagent for detecting specific nucleotide sequences
USRE38442E1 (en) 1994-06-22 2004-02-24 Mount Sinai School Of Medicine Nucleic acid amplification method hybridization signal amplification method (HSAM)
US5942391A (en) 1994-06-22 1999-08-24 Mount Sinai School Of Medicine Nucleic acid amplification method: ramification-extension amplification method (RAM)
US20070269799A9 (en) 1994-06-22 2007-11-22 Zhang David Y Nucleic acid amplification methods
WO1995035390A1 (en) 1994-06-22 1995-12-28 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Ligation-dependent amplification for the detection of infectious pathogens and abnormal genes
US5786141A (en) 1994-08-26 1998-07-28 Bard; Allen J. Electrogenerated chemiluminescence labels for analysis and/or referencing
US5660991A (en) 1994-10-28 1997-08-26 Lakowicz; Joseph R. Long lifetime anisotropy (polarization) probes for clinical chemistry, immunoassays, affinity assays and biomedical research
SE9404166D0 (sv) 1994-11-30 1994-11-30 Pharmacia Biotech Ab Multifunctional surfaces
US5866434A (en) 1994-12-08 1999-02-02 Meso Scale Technology Graphitic nanotubes in luminescence assays
US5641623A (en) 1995-01-04 1997-06-24 Martin; Mark T. Electrochemiluminescence assay
US5643713A (en) 1995-06-07 1997-07-01 Liang; Pam Electrochemiluminescent monitoring of compounds
US6207369B1 (en) 1995-03-10 2001-03-27 Meso Scale Technologies, Llc Multi-array, multi-specific electrochemiluminescence testing
US6673533B1 (en) 1995-03-10 2004-01-06 Meso Scale Technologies, Llc. Multi-array multi-specific electrochemiluminescence testing
WO1996028538A1 (en) 1995-03-10 1996-09-19 Meso Scale Technologies, Llc Multi-array, multi-specific electrochemiluminescence testing
US6319670B1 (en) 1995-05-09 2001-11-20 Meso Scale Technology Llp Methods and apparatus for improved luminescence assays using microparticles
US5679519A (en) 1995-05-09 1997-10-21 Oprandy; John J. Multi-label complex for enhanced sensitivity in electrochemiluminescence assay
US5667974A (en) 1995-06-07 1997-09-16 Abbott Laboratories Method for detecting nucleic acid sequences using competitive amplification
SE504798C2 (sv) * 1995-06-16 1997-04-28 Ulf Landegren Immunanalys och testkit med två reagens som kan tvärbindas om de adsorberats till analyten
US5589136A (en) 1995-06-20 1996-12-31 Regents Of The University Of California Silicon-based sleeve devices for chemical reactions
AU7398996A (en) 1995-10-11 1997-04-30 Luminex Corporation Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and method
WO1997019193A2 (en) 1995-11-21 1997-05-29 Yale University Unimolecular segment amplification and detection
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
GB9606850D0 (en) 1996-04-01 1996-06-05 Univ Liverpool An assay system and novel labelled compounds for use therwith
SE9601676D0 (sv) 1996-04-30 1996-04-30 Ulf Landegren Improved probing of specific mucleic acids
SE9603171D0 (sv) 1996-08-30 1996-08-30 Marek Kwiatkowski Solid phase synthesis
WO1998050403A1 (en) 1997-05-05 1998-11-12 Third Wave Technologies,Inc. Target-dependent reactions using structure-bridging oligonucleotides
US7314711B2 (en) 1997-05-23 2008-01-01 Bioveris Corporation Assays employing electrochemiluminescent labels and electrochemiluminescence quenchers
FR2764381A1 (fr) 1997-06-09 1998-12-11 Univ De Neuchatel Detecteur electrochimioluminescent
US6413783B1 (en) 1997-09-18 2002-07-02 Meso Scale Technologies, Llc Assay sonication apparatus and methodology
US6054274A (en) 1997-11-12 2000-04-25 Hewlett-Packard Company Method of amplifying the signal of target nucleic acid sequence analyte
AU3601599A (en) 1998-03-25 1999-10-18 Ulf Landegren Rolling circle replication of padlock probes
US6200531B1 (en) 1998-05-11 2001-03-13 Igen International, Inc. Apparatus for carrying out electrochemiluminescence test measurements
US8063190B2 (en) 1998-06-02 2011-11-22 Tom Robin Caine Boyde Nucleic acid-linked conjugates and methods for making and using them
EP0962773A1 (en) 1998-06-03 1999-12-08 Mark Howard Jones Electrochemical based assay processes instrument and labels
GB9815042D0 (en) 1998-07-10 1998-09-09 Imperial College Detector
WO2000004193A1 (en) * 1998-07-20 2000-01-27 Yale University Method for detecting nucleic acids using target-mediated ligation of bipartite primers
AU770993B2 (en) 1998-09-15 2004-03-11 Yale University Molecular cloning using rolling circle amplification
US6214552B1 (en) 1998-09-17 2001-04-10 Igen International, Inc. Assays for measuring nucleic acid damaging activities
US6136268A (en) 1999-08-17 2000-10-24 Orion Diagnostica Method for luminescence measurements
ES2225264T3 (es) 1999-11-12 2005-03-16 Clinical Micro Sensors, Inc. Tecnicas de aceleracion de union para la deteccion de analitos.
US7309569B2 (en) 1999-12-21 2007-12-18 Ingeneus, Inc. Parallel or antiparallel, homologous or complementary binding of nucleic acids or analogues thereof to form duplex, triplex or quadruplex complexes
US7306904B2 (en) 2000-02-18 2007-12-11 Olink Ab Methods and kits for proximity probing
US6368801B1 (en) 2000-04-12 2002-04-09 Molecular Staging, Inc. Detection and amplification of RNA using target-mediated ligation of DNA by RNA ligase
SE0001670D0 (sv) * 2000-05-04 2000-05-04 Forskarpatent I Syd Ab Mass-spectrometry-based biosensor
US6291187B1 (en) 2000-05-12 2001-09-18 Molecular Staging, Inc. Poly-primed amplification of nucleic acid sequences
US6511809B2 (en) 2000-06-13 2003-01-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for the detection of an analyte by means of a nucleic acid reporter
US6531283B1 (en) * 2000-06-20 2003-03-11 Molecular Staging, Inc. Protein expression profiling
US6323009B1 (en) 2000-06-28 2001-11-27 Molecular Staging, Inc. Multiply-primed amplification of nucleic acid sequences
US7572642B2 (en) 2001-04-18 2009-08-11 Ambrigen, Llc Assay based on particles, which specifically bind with targets in spatially distributed characteristic patterns
US6800608B2 (en) 2001-06-22 2004-10-05 Beckman Coulter, Inc. Homogeneous assay of vancomycin using a stable particle-vancomycin conjugate, a novel rate enhancer, and a novel dose response modulator
US6808939B2 (en) 2001-06-29 2004-10-26 Igen International, Inc. ECL labels having improved non-specific binding properties, methods of using and kits containing the same
EP1412725B1 (en) 2001-06-29 2019-01-09 Meso Scale Technologies LLC Multi-well plates for luminescence test measurements
GB2378245A (en) 2001-08-03 2003-02-05 Mats Nilsson Nucleic acid amplification method
GB2382137A (en) 2001-11-20 2003-05-21 Mats Gullberg Nucleic acid enrichment
EP1451356A1 (en) 2001-11-23 2004-09-01 Simon Fredriksson Method and kit for proximity probing with multivalent proximity probes
CA2480525A1 (en) 2002-03-29 2003-10-09 Nugen Technologies, Inc. Single primer isothermal nucleic acid amplification-enhanced analyte detection and quantification
US8090542B2 (en) 2002-11-14 2012-01-03 Dharmacon Inc. Functional and hyperfunctional siRNA
WO2004061131A1 (en) 2002-12-18 2004-07-22 Aclara Biosciences, Inc. Multiplexed immunohistochemical assays using molecular tags
US7192703B2 (en) 2003-02-14 2007-03-20 Intel Corporation, Inc. Biomolecule analysis by rolling circle amplification and SERS detection
EP1615948B1 (en) 2003-04-18 2015-04-01 Becton Dickinson and Company Immuno-amplification
US7195875B2 (en) 2003-04-18 2007-03-27 Beckman Coulter, Inc. Oligonucleotide pairs for multiplexed binding assays
US20040248103A1 (en) * 2003-06-04 2004-12-09 Feaver William John Proximity-mediated rolling circle amplification
WO2005059509A2 (en) 2003-12-12 2005-06-30 Saint Louis University Biosensors for detecting macromolecules and other analytes
CN101198707A (zh) * 2004-05-12 2008-06-11 内诺斯佩尔公司 基于生物条形码检测靶分析物
SE0401270D0 (sv) 2004-05-18 2004-05-18 Fredrik Dahl Method for amplifying specific nucleic acids in parallel
GB0421529D0 (en) 2004-09-28 2004-10-27 Landegren Gene Technology Ab Microfluidic structure
US20060078894A1 (en) 2004-10-12 2006-04-13 Winkler Matthew M Methods and compositions for analyzing nucleic acids
US8080393B2 (en) 2005-04-12 2011-12-20 Olink Ab Methods for production of oligonucleotides
BRPI0611474A2 (pt) * 2005-05-26 2010-09-14 Ensemble Discovery Corp biodetecção por quìmica modelada com ácido nucléico
US7883848B2 (en) 2005-07-08 2011-02-08 Olink Ab Regulation analysis by cis reactivity, RACR
US20070161029A1 (en) 2005-12-05 2007-07-12 Panomics, Inc. High throughput profiling of methylation status of promoter regions of genes
US8460879B2 (en) 2006-02-21 2013-06-11 The Trustees Of Tufts College Methods and arrays for target analyte detection and determination of target analyte concentration in solution
GB0605584D0 (en) 2006-03-20 2006-04-26 Olink Ab Method for analyte detection using proximity probes
EP2511383B1 (en) 2006-03-31 2013-12-25 Columbia University Binary probes for fluorescent analysis of nucleic acids
EP2010475A2 (en) 2006-04-27 2009-01-07 Intezyne Technologies Incorporated Heterofunctional poly(ethylene glycol) containing acid-labile amino protecting groups and uses thereof
US8338776B2 (en) 2007-06-25 2012-12-25 Tufts University Optical array device and methods of use thereof for screening, analysis and manipulation of particles
ES2556627T3 (es) 2007-08-30 2016-01-19 Trustees Of Tufts College Métodos para determinar la concentración de un analito en solución
JP2009106220A (ja) * 2007-10-31 2009-05-21 Genodive Pharma Kk 基板上での等温増幅反応による標的塩基配列の捕捉及び検出方法
BRPI0819739A2 (pt) 2007-11-21 2017-05-09 Univ Erasmus Med Ct Rotterdam sondas de fret otimizadas e usos das mesmas
US8617806B2 (en) 2008-01-25 2013-12-31 Hansabiomed Ou Method to measure and characterize microvesicles in the human body fluids
JP5435878B2 (ja) 2008-02-12 2014-03-05 富士フイルム株式会社 断片化抗体を標識物質に固定した標識粒子
JP2009222712A (ja) * 2008-02-21 2009-10-01 Univ Nagoya メチシリン耐性ブドウ球菌の検出法、検出用試薬及び検出用キット
WO2009108637A1 (en) 2008-02-25 2009-09-03 Prometheus Laboratories, Inc. Drug selection for breast cancer therapy using antibody-based arrays
EP2294196A1 (en) 2008-06-06 2011-03-16 Centre National de la Recherche Scientifique - CNRS Use of endo-lysosomal system and secreted vesicles (exosome-like) in treatments and diagnostics based on small rna and experimental study of small rna
US20100075862A1 (en) 2008-09-23 2010-03-25 Quanterix Corporation High sensitivity determination of the concentration of analyte molecules or particles in a fluid sample
US8222047B2 (en) 2008-09-23 2012-07-17 Quanterix Corporation Ultra-sensitive detection of molecules on single molecule arrays
JP5850746B2 (ja) 2008-11-17 2016-02-03 ヘッドウェイ テクノロジーズ, インク.Headway Technologies, Inc. 連結分子を用いた標的分子の粒子ベースの検出における方法および組成物
CA2744003C (en) * 2008-11-21 2016-03-15 Mediomics Llc Biosensor for detecting multiple epitopes on a target
US20100261292A1 (en) 2009-04-10 2010-10-14 Meso Scale Technologies, Llc Methods for Conducting Assays
CA2759211C (en) 2009-04-24 2017-02-28 Daniel Kelly Treiber Assay for detecting protein by a cellular process
KR101029343B1 (ko) 2009-07-30 2011-04-13 한국과학기술연구원 면역분석 기반의 항원 검출용 키트 및 항원 검출 방법
US9914963B2 (en) * 2009-09-28 2018-03-13 Igor Kutyavin Methods and compositions for detection of nucleic acids based on stabilized oligonucleotide probe complexes
WO2011047087A2 (en) 2009-10-13 2011-04-21 Nanostring Technologies, Inc. Protein detection via nanoreporters
US8415171B2 (en) 2010-03-01 2013-04-09 Quanterix Corporation Methods and systems for extending dynamic range in assays for the detection of molecules or particles
US8236574B2 (en) 2010-03-01 2012-08-07 Quanterix Corporation Ultra-sensitive detection of molecules or particles using beads or other capture objects
US20130059741A1 (en) * 2010-05-13 2013-03-07 Illumina, Inc. Binding assays for markers
WO2012006476A2 (en) 2010-07-07 2012-01-12 Aethlon Medical, Inc. Methods and compositions for quantifying exosomes
GB201011971D0 (en) * 2010-07-15 2010-09-01 Olink Ab Methods and product
EP2627781B1 (en) 2010-10-15 2017-02-22 Olink Bioscience AB Dynamic range methods
US9952237B2 (en) 2011-01-28 2018-04-24 Quanterix Corporation Systems, devices, and methods for ultra-sensitive detection of molecules or particles
GB201101621D0 (en) * 2011-01-31 2011-03-16 Olink Ab Method and product
EP2500435B1 (en) * 2011-03-18 2016-09-21 miacom Diagnostics GmbH Identification of antibiotic resistance in micro organisms
GB201107863D0 (en) 2011-05-11 2011-06-22 Olink Ab Method and product
GB201108678D0 (en) 2011-05-24 2011-07-06 Olink Ab Multiplexed proximity ligation assay
KR101329127B1 (ko) * 2011-06-30 2013-11-14 한국생명공학연구원 올리고뉴클레오타이드 결합 항체를 이용한 당단백질 검증방법
DK3467500T3 (da) 2011-11-11 2021-08-16 Eli N Glezer Cobinder-understøttede assayfremgangsmåder
GB201201547D0 (en) * 2012-01-30 2012-03-14 Olink Ab Method and product
WO2014031984A1 (en) 2012-08-24 2014-02-27 Baylor Research Institute Immunological detection methods and compositions
DK2972353T3 (da) 2013-03-11 2023-03-27 Meso Scale Technologies Llc Forbedrede fremgangsmåder til udførelse af multipleksanalyser
EP2971183A4 (en) 2013-03-13 2016-10-26 Meso Scale Technologies Llc IMPROVED TEST PROCEDURES
US10114015B2 (en) * 2013-03-13 2018-10-30 Meso Scale Technologies, Llc. Assay methods
KR20250011724A (ko) * 2014-05-15 2025-01-21 메소 스케일 테크놀러지즈, 엘엘시 개선된 분석 방법
CN108374052A (zh) 2018-03-20 2018-08-07 徐州工程学院 用于生物芯片检测金黄色葡萄球菌的探针组序列
US20210381025A1 (en) 2018-10-31 2021-12-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and kits for detecting cells using oligonucleotide conjugated antibodies
CN114144422B (zh) 2019-03-01 2025-03-07 中尺度技术有限责任公司 用于免疫方法的被电化学发光标记的探针、使用这类探针的方法和包含这类探针的试剂盒
WO2022051485A2 (en) 2020-09-02 2022-03-10 Meso Scale Technologies,Llc. Kits for detecting one or more target analytes in a sample and methods of making and using the same

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