CN107667291B

CN107667291B - 用于检测产碳青霉烯酶的肠杆菌科的方法和装置

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Publication number: CN107667291B
Application number: CN201680030887.6A
Authority: CN
Inventors: P·博加尔茨; G·格鲁普茨恩斯基; T-D·黄; P·莫滕斯; I·奥特; T·莱克利普泰奥克斯
Original assignee: Coris Bioconcept SPRL
Current assignee: Coris Bioconcept SPRL
Priority date: 2015-04-10
Filing date: 2016-04-11
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2036-04-11
Also published as: EP3280815A1; HRP20210037T1; PT3280815T; WO2016162564A1; ES2843954T3; PL3280815T3; BR112017021686A2; CN107667291A; EP3280815B1

Abstract

本发明涉及检测生物样品中可能存在的来自产碳青霉烯酶的肠杆菌科(CPE)的一种或多种碳青霉烯酶的方法，所述方法包括以下步骤：提供支持物，在所述支持物上固定与一种或多种碳青霉烯酶的一个或多个表位区相互作用的一种或多种捕获试剂，提供与一种或多种碳青霉烯酶的一个或多个表位区相互作用的一种或多种检测试剂，所述检测试剂直接或间接地与标签连接以形成一种或多种检测缀合物，提供包含或不包含一种或多种碳青霉烯酶的待测样品以进行检测，使样品与一种或多种捕获试剂接触，揭示样品中存在的一种或多种碳青霉烯酶被一种或多种检测试剂的特异性结合。本发明还涉及用于实施根据本发明的方法的免疫色谱检测装置。

Description

用于检测产碳青霉烯酶的肠杆菌科的方法和装置

发明领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于检测和/或鉴定一种或多种产碳青霉烯酶的肠杆菌科(CPE)的方法和装置，所述产碳青霉烯酶的肠杆菌科特别选自OXA型CPE，KPC型CPE，VIM型CPE和NDM型CPE，更优选选自OXA型CPE和KPC型CPE，特别是OXA-48CPE和OXA-48样CPE。

发明背景

产碳青霉烯酶的肠杆菌科(CPE)构成公共健康的主要问题。事实上，碳青霉烯酶-内酰胺抗生素，特别是碳青霉烯，被认为是治疗与多重抗性革兰氏阴性细菌有关的感染的最后一种有效的治疗方法，并且因为由这样的细菌表达的碳青霉烯酶常常与针对不同的其他类别的抗生素的抗性机制有关。

通常，用于检测或鉴定产碳青霉烯酶的肠杆菌科(CPE)的已知方法的实施时间相对较长，在48小时和72小时之间，包括培养步骤和在存在抗生素的情况下测试细菌的表型分析(比较生长分析)和/或分子鉴定测定，并且需要许多比较测试。

存在于肠杆菌中的主要碳青霉烯酶是OXA、KPC、VIM、NDM和IMP型，而其他碳青霉烯酶如SME或IMI表现出较低的临床意义。

因此，存在明确的临床需求，需要开发新的方法和手段、测定，其允许主要碳青霉烯酶(特别是在北欧国家流行率很高的OXA-48型碳青霉烯酶和至少在美国和希腊流行的KPC型碳青霉烯酶)的快速和有效鉴定，优选延迟少于十五分钟，特别是能够与实际的表型和/或分子检测方法和测定互补甚至取代其的方法和手段。

现有技术

已经提出了用于检测碳青霉烯酶的各种方法和测定，如例如在科学出版物Nordmann等人,Emerg.Infect.Dis.,2012或国际专利申请WO2013072494中描述了使用通过亚胺培南抗生素的酶水解产生的反应介质的酸化来检测碳青霉烯酶的酶方法，被称为Carba NP(碳青霉烯酶Nordmann-Poirel)测试。然而，这样的测定和方法需要使用不稳定的反应介质，仔细操作以执行测定，并且需要相当多的技巧和专业知识以避免假阴性或假阳性检测。

国际专利申请WO2012/003955描述了通过使用可被这些酶水解的荧光抗生素的碳青霉烯酶检测方法。但是，如果这种方法相对较快，即在30分钟和几个小时之间，则需要使用复杂和昂贵的手段，如落射荧光和共聚焦显微镜，以及训练有素的人员进行这种分析。

国际专利申请WO2012/143535描述了通过质谱法(MS)检测碳青霉烯酶。然而，这种方法是复杂的，并且需要高素质的人员执行不同的方法步骤，并提供对获得的结果的分析。

因此，迫切重要的是简单和快速检测碳青霉烯酶，特别是OXA-48型和KPC型碳青霉烯酶，以检测构成重大公共卫生问题的抗性肠细菌。

本发明的目的

本发明提供了用于碳青霉烯酶(特别是OXA特别是OXA-48、KPC、VIM和/或NDM型碳青霉烯酶)检测和/或鉴定的新方法和手段，其不存在现有技术的缺点。

本发明提供简单、快速并且允许检测和/或鉴定碳青霉烯酶的方法和手段，优选在少于1小时内，更优选在少于30分钟内，更优选在少于15分钟内。

本发明还提供了在室温下高度稳定并因此可以保持很长时间(例如六个月，优选多于一年，更优选多于两年)的手段，特别是检测测定和/或装置，其用于主要的临床微生物实验室，而没有任何特别的专用检测手段用于检测和结果编码。

本发明的另一目的是提供允许(可能同时)检测涉及各种细菌特别是肠杆菌的抗生素抗性的多种碳青霉烯酶的方法和手段，优选使用相同的检测手段，更优选在相同的检测支持物上检测。

发明概述

本发明涉及检测生物样品中可能存在的来自产碳青霉烯酶的肠杆菌科(CPE)的一种或多种碳青霉烯酶的方法，所述方法包括以下步骤：提供支持物，在所述支持物上固定与选自OXA特别是OXA-48、KPC、VIM和/或NDM碳青霉烯酶的一种或多种碳青霉烯酶的一个或多个表位区相互作用的一种或多种捕获试剂，提供与选自OXA特别是OXA-48、KPC、VIM和/或NDM碳青霉烯酶的一种或多种碳青霉烯酶的一个或多个表位区相互作用的一种或多种检测试剂，所述检测试剂直接或间接地与标签连接以形成一种或多种检测缀合物，提供包含或不包含一种或多种碳青霉烯酶的待测样品以进行检测，使样品与一种或多种捕获试剂接触，揭示样品中存在的一种或多种碳青霉烯酶被一种或多种检测试剂的特异性结合。

根据本发明的方法还可以包括以下特征中的任何一个或任何合适的组合：

-捕获试剂具有相同的性质，并且结合或不结合与检测试剂所结合的碳青霉烯酶表位区(第二表位区)相同的碳青霉烯酶第一表位区，

-该方法还包括以下步骤：将一种或多种对照试剂固定在支持物上以与一种或多种检测试剂相互作用，提供一种或多种对照检测试剂以与一种或多种对照试剂相互作用并结合，所述一种或多种检测试剂直接或间接连接至标签以形成一种或多种对照检测缀合物，

-捕获试剂、检测试剂和/或对照试剂选自单克隆抗体、多克隆抗体、抗体的部分、纳米抗体、α体、微抗体、affiline、affimer、fymomer、affitin或其混合物，

-检测试剂和/或对照检测试剂的标签选自金属胶体，胶乳颗粒或有色颗粒，

-来自产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌(CPE)的碳青霉烯酶是OXA，优选OXA-48型碳青霉烯酶，并且其中捕获试剂或可能的捕获试剂是特异性的并且与下列氨基酸序列或下列序列的至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个优选连续氨基酸的片段结合：SEQ.ID.NO3：IRAKTGYSTRIEPKIGWW，

-该方法还包括区分OXA-163型碳青霉烯酶和其他OXA特别是OXA-48型碳青霉烯酶的步骤，

-捕获试剂和/或检测试剂与下列氨基酸序列或下列序列的至少6、7、8、9、10、11或12个优选连续氨基酸的片段结合：SEQ.ID.NO1:TAMKYSVVPVY,SEQ.ID.NO2:SFLRKLYHNKLHV，

-来自产碳青霉烯酶的肠杆菌科(CPE)的碳青霉烯酶是KPC型碳青霉烯酶，其中捕获试剂和检测试剂是特异性的并且与下列氨基酸序列或下列序列的至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个优选连续氨基酸的片段结合：SEQ.ID.NO8:GDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTR，

-支持物选自由试纸条(dipstick)或横流装置组成的组。

本发明还涉及用于执行根据本发明的方法步骤的免疫色谱检测装置，该装置包含支持物，所述支持物包含与一种或多种碳青霉烯酶的一个或多个第一表位区相互作用的一种或多种捕获试剂，和包含与碳青霉烯酶的一个或多个第二表位区相互作用的一种或多种检测试剂，所述检测试剂直接或间接连接至标签以形成一种或多种检测缀合物。

除了上面提到的特征之外，根据本发明的装置还可以包括以下特征中的任何一个或任何合适的组合：

-所述装置进一步包含与一种或多种对照检测试剂相互作用并结合的一种或多种对照试剂，以及与对照试剂相互作用并结合的一种或多种对照检测试剂，所述检测试剂直接连接或间接地连接至标签以形成一种或多种对照缀合物，

-检测试剂和/或对照检测试剂的标签选自由金属胶体，胶乳颗粒或有色颗粒组成的组，

-该装置是试纸条或横流装置。

-来自产碳青霉烯酶的肠杆菌科(CPE)的碳青霉烯酶是OXA优选OXA-48型碳青酶烯酶，并且捕获试剂是特异性的并且与下列氨基酸序列或下列序列的至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个氨基酸的片段结合：SEQ.ID.NO3：IRAKTGYSTRIEPKIGWW，

-捕获试剂和/或检测试剂与下列氨基酸序列或下列序列的至少6、7、8、9、10或11个氨基酸的片段结合：SEQ.ID.NO1:TAMKYSVVPVY,SEQ.ID.NO2:SFLRKLYHNKLHV，

-来自产碳青霉烯酶的肠杆菌科(CPE)的碳青霉烯酶是KPC型碳青酶烯酶，并且其中所述捕获试剂和检测试剂是特异性的并且与下列氨基酸序列或下列序列的至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个氨基酸的片段结合：SEQ.ID.NO8:GDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTR。

本发明还涉及根据本发明的检测装置用于检测和/或鉴定生物样品中的来自产碳青霉烯酶的肠杆菌科(CPE)的OXA特别是OXA-48和/或KPC型碳青霉烯酶的用途。

附图说明

图1示意性地表示根据本发明的方法的不同步骤，其中在根据本发明的片状免疫色谱装置上进行检测。

图2示意性地表示在放入样品前的根据本发明的检测装置以及与阳性、阴性和无效测试有关的可视结果。

本发明的详细描述

本发明涉及用于检测和/或鉴定检测生物样品例如临床样品或细菌培养物或血培养物中可能存在的来自产碳青霉烯酶的肠杆菌科(CPE)的碳青霉烯酶(特别是选自OXA，KPC，VIM和/或NDM型碳青霉烯酶的碳青霉烯酶，更优选选自OXA特别是OXA-48或OXA-163和/或KPC型碳青霉烯酶)的免疫色谱方法。

有利地，根据本发明的方法包括以下步骤：

-提供支持物3，

-在支持物3上固定与一种或多种碳青霉烯酶10的一个或多个第一表位区相互作用的一种或多种捕获试剂5，以检测优选选自OXA特别是OXA-48、KPC、VIM和/或NDM碳青霉烯酶的碳青霉烯酶，

-提供与碳青霉烯酶(优选选自OXA特别是OXA-48、KPC、VIM和/或NDM碳青霉烯酶)的一个或多个第二表位区相互作用的一种或多种检测试剂7，所述检测试剂7直接或间接地连接到标签9以形成一种或多种检测缀合物11，

-提供包含或不包含一种或多种碳青霉烯酶10的待测样品以进行检测，

-使该样品与一种或多种捕获试剂5接触，

-揭示样品中存在的一种或多种碳青霉烯酶10被检测试剂7(优选经标记的)的特异性结合。

在本发明的当前描述中，术语“相互作用”可被解释为“结合”的同义词。

优选地，一种捕获试剂5与一种碳青霉烯酶的一个第一表位区相互作用。然而，一种捕获试剂5可以与一种碳青霉烯酶的几个第一表位区相互作用。

优选地，可以使用与一种特定碳青霉烯酶的一个或多个第一表位区相互作用的多种捕获试剂5与可能同时存在于样品中的多种碳青霉烯酶相互作用。

根据本发明的优选实施方案，捕获试剂与检测试剂同相同的碳青霉烯酶表位区相互作用。

根据本发明的方法还可以包括以下步骤：

-将与一种或多种对照检测试剂8相互作用的一种或多种对照试剂6固定在支持物上，

-提供一种或多种对照检测试剂8以与所述一种或多种对照试剂6相互作用并结合，所述对照检测试剂8直接或间接地与标签9连接以形成一种或多种对照检测缀合物12。

优选地，由捕获试剂5和检测缀合物11形成的复合物和/或由对照试剂6和对照检测缀合物12形成的复合物产生可检测的信号，优选为可视或比色信号。

优选地，样品是包含来自产碳青霉烯酶的肠杆菌科(CPE)的菌落的生物样品。

优选地，使待分析的样品与捕获试剂5接触的步骤通过被动扩散使用含有重悬细菌菌落的缓冲溶液进行。如果测试样品含有待检测的碳青霉烯酶10，由碳青霉烯酶和检测试剂7形成的复合物将保持与吸附在支持物上的抗碳青霉烯酶捕获试剂5结合。这种特异性结合的结果具有在至少15分钟内以支持物上形成的至少一条红线的形式可见的优点。缓冲溶液继续迁移以遇到结合一种或多种对照缀合物12的对照试剂6，由此产生至少第二红线。

优选地，所讨论的碳青霉烯酶选自OXA优选OXA-48、KPC、VIM和/或NDM型碳青霉烯酶，更优选选自OXA特别是OXA-48、KPC、VIM和NDM型碳青霉烯酶，甚至更优选选自OXA特别是OXA-48、KPC和VIM型碳青霉烯酶，或进一步更优选选自OXA特别是OXA-48和KPC型碳青霉烯酶。

优选地，捕获试剂5是能够特异性或非特异性结合和固定样品中待检测的一种或多种碳青霉烯酶的一个或多个抗原性结构的第一区域、氨基酸序列的试剂。优选地，捕获试剂是针对所讨论的一种或多种碳青霉烯酶的一个或多个表位区的单克隆或多克隆抗体或其部分。优选地，它是任何合适的免疫球蛋白(Ig)。

优选地，捕获试剂5可以是结构域抗体(sdAb)，也称为纳米抗体，nanofitine，α体，微抗体(即从完全功能性天然抗体拷贝的人造氨基酸短链)，affiline，affimer，affitin，fymomer，适体，somamer或能够通过合适的互补区特异性识别待检测的碳青霉烯酶结构或其结构的一部分的任何特定捕获分子。

优选地，通过基因工程或通过合成产生捕获试剂5，并且根据其针对碳青霉烯酶结构的结合亲和力进行筛选和选择。

一种或多种捕获试剂5与支持物例如硝化纤维素的结合可以通过直接或间接的共价结合获得。

优选地，检测试剂7是能够特异性结合和固定样品中待检测的一种或多种碳青霉烯酶的一个或多个抗原性结构的第二区域、氨基酸序列的试剂。优选地，它是针对所讨论的碳青霉烯酶的第二表位区的单克隆或多克隆抗体或其部分。优选地，它是任何合适的免疫球蛋白(Ig)。

优选地，检测试剂7是针对碳青霉烯酶的第二表位区的单克隆抗体，所述第二表位区不同于或非不同于由捕获试剂5结合的碳青霉烯酶的第一表位区。

检测试剂7直接或间接地与标签9连接以形成检测缀合物11。

优选地，对照试剂6是适合结合对照检测试剂8的试剂。例如，它可以是单克隆抗体或多克隆抗体或其一部分。更优选地，它是山羊抗鸡抗体，更优选抗IgY。

优选地，对照检测试剂8是能够结合和固定对照试剂6的试剂，更优选其是单克隆或多克隆抗体，例如鸡抗体，优选IgY。

优选地，对照检测试剂8直接或间接连接至标签9以形成对照缀合物12。

优选地，标签9选自金属胶体，优选胶体金，硫，硒，硫酸钡，硫酸铁，碘酸盐，卤化银，水合氧化物，金属硫化物，硒化铅，硒化镉，金属磷酸盐，金属亚铁盐，二氧化硅，可能用有机或无机层涂覆的脂质体或颗粒，共轭或有机胶乳，纤维素或聚苯乙烯颗粒和有色或荧光微粒，以用于一种或多种(不同的)碳青霉烯酶或参与革兰氏阴性细菌的抗生素抗性的其他酶的有效和可能区分性的比色或荧光检测。

优选地，标签9包含平均直径为约5nm至约50nm的胶体金颗粒，优选直径为约20nm至约40nm的颗粒。

优选地，标签9包含含有一个或多个化学附加官能(例如羧基，氨基，羟基和/或巯基官能团)的纤维素、聚酯和胶乳颗粒。在一个优选的实施方案中，标签9包含羧基化的氨基或巯基胶乳或纤维素颗粒。

还可以使用几种交联的试剂用于使用检测试剂7的氨基酸部分或者通过使用在现有技术中描述的其他均质-或异质-双官能交联剂特异性偶联存在于微粒上的官能团。

优选地，支持物具有条状或棒状的形式。其优选是片状结构，更优选其中主要物质(例如纤维素，硝酸纤维素，醋酸纤维素，玻璃纤维，尼龙，丙烯酸共聚物/尼龙，聚醚砜和聚酯)层压在刚性或半刚性聚合物上的多层结构。在一个优选的实施方案中，一部分支持物包括由玻璃纤维制成的具有由聚酯制成的结合垫的膜，另一个区域包括由硝酸纤维素制成的膜，而另一个区域包括由纤维素制成的膜。

根据本发明的方法是即可使用的方法，可快速且容易地实施。

现在将关于OXA型特别是OXA-48型和KPC型碳青霉烯酶描述根据本发明的方法作为实例，但是该方法步骤也可以使用与碳青霉烯酶相关的捕获试剂5和检测试剂7进行检测而应用于VIM和/或NDM型碳青霉烯酶。

捕获试剂5和检测试剂7可特异性识别OXA-48型碳青霉烯酶(例如SEQ.ID.NO4和SEQ.ID.NO5中所述的来自肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的OXA-48)或KPC型碳青霉烯酶(例如SEQ.ID.NO6和SEQ.ID.NO7中所述的来自肺炎克雷伯菌的KPC)的任何合适的表位区。

用十二种不同的小鼠单克隆抗体(MAT-8377,MAT-8378,MB6,1B11,1D12,1G5,2A2,3B11,3C1,3G10,4F9,4F12)进行的表位作图鉴定了OXA-48型碳青霉烯酶氨基酸序列的这三个特定部分作为结合区。

因此，在一个实例中，捕获试剂5和可能检测试剂7特异性或非特异性地识别OXA型优选OXA-48或OXA-163型碳青霉烯酶氨基酸序列的这三个下列部分或表位的全部或至少其片段，或任何下列氨基酸序列的至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个氨基酸的片段，优选至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个连续线性片段：

-SEQ.ID.NO1：TAMKYSVVPVY

-SEQ.ID.NO2：SFLRKLYHNKLHV

-SEQ.ID.NO3：IRAKTGYSTRIEPKIGWW。

本发明人意外地发现，针对序列SEQ.ID.NO：3的序列或片段的捕获试剂5是特异性的，并且甚至可以用于区分OXA型碳青霉烯酶，特别是OXA-48型和OXA-163型碳青霉烯酶。实际上，MAT-8377小鼠单克隆抗体可以用作捕获试剂5并且提供针对OXA-163样变体的检测特异性。OXA-163氨基酸序列与OXA-48氨基酸序列在SEQ.ID.NO3区内不同(缺失4个氨基酸)(IRAKTGYDT----KIGWW)。有利地，MAT-8377(针对SEQ.ID.NO3)结合特异性允许检测所有的OXA-48样碳青霉烯酶变体而不是OXA-163样非碳青霉烯酶变体。

用三种不同的小鼠单克隆抗体(PF7，NE7和NA3)进行的表位作图鉴定了KPC型碳青霉烯酶氨基酸序列的特定部分作为结合区。

因此，在另一个实例中，捕获试剂5和检测试剂7特异性识别KPC型碳青霉烯酶氨基酸序列的下列部分或表位的全部或至少一部分，或下列序列的至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个氨基酸的片段：SEQ.ID.NO8：GDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTR。

使用纯化的重组OXA-48蛋白质，基于根据本发明的方法的测定的检测极限已经显示为0.125ng/mL，并且使用纯化的重组KPC蛋白质，基于根据本发明的方法的测定的检测极限已经显示是0.625ng/mL。

实施例的方法针对参考菌株的集合进行评估。

在产碳青霉烯酶细菌的比利时国家参考实验室中对76个完全表征的临床菌株的集合评估了OXA-48K-SeT和KPC K-SeT(表1和表3)。

表1：

通过比较参考分子方法(包括测序)，在产碳青霉烯酶的细菌的比利时国家参考实验室中对342名非重复的疑似CPE连续临床分离株进行的前瞻性研究中验证了OXA-48K-SeTKPC K-SeT(表2和表4)。

表2：

表3：

表4：

为了检查批内精确度，即根据本发明的方法的可重复性，在相同的实验条件下，在相同的生产批次的试剂盒上处理相同的阳性样品和缓冲溶液十五次。所有观察结果均如预期证实。

为了检查批间精确度(即，根据本发明的方法的再现性)，在来自三个不同生产批次的试剂盒上处理一些阳性样品和缓冲液样品。所有结果均如预期证实。

为了实施根据本发明的方法，根据本发明的检测装置1包括优选呈条带形式的支持物，所述支持物包含与待分析的样品中的一种或多种碳青霉烯酶10的一个或多个第一表位区相互作用的捕获试剂5，其旨在与直接或间接连接至标签9以形成一种或多种检测缀合物11的检测试剂7形成复合物，所述检测缀合物11可被检测为比色信号。

优选地，检测装置1进一步包括一种或多种对照试剂6，其旨在与由直接或间接连接至标签9的对照检测试剂8形成的一种或多种对照缀合物12形成复合物。

优选地，碳青霉烯酶、产碳青霉烯酶的肠杆菌科(CPE)、捕捉剂5、检测试剂7、标签9、对照试剂6和8以及对照缀合物12是关于根据本发明的方法描述的那些。

优选地，根据本发明的检测装置1包含层压在刚性聚合物上以形成条带或棒的作为支持物的主要物质。

根据本发明的检测装置1优选地包含多孔聚合物质，所述多孔聚合物质优选层压在刚性或半刚性聚合物上以提供机械强度并且使装置1易于操作。聚合物质的孔隙度可以使得包含待检测的碳青霉烯酶的流体(例如生物样品)的毛细管迁移及其组分可从检测装置1的底部到顶部毫无障碍地获得，与再水合的缀合物即检测缀合物11和对照缀合物12一起移动。这是由于所用聚合物如纤维素、硝酸纤维素、醋酸纤维素、玻璃纤维、尼龙、丙烯酸共聚物/尼龙、聚醚砜和聚酯的亲水性而获得的。

优选地，根据本发明的检测装置1包括施加区域2，检测区域3，可能的控制区域6以及可选的吸收区域4。

施加区域2任选地包括例如由吸收性纸制成的结合垫。

检测区域3优选包含用于检测所讨论的碳青霉烯酶的特定部分的捕获试剂5。

检测区域3可进一步包含对照试剂6，优选山羊抗鸡抗体，例如抗IgY，以特异性结合对照检测试剂8。

检测区域3优选由纤维素制成，更优选从Advanced Microdevices Pvt，Ltd或GEHealthcare，Pall和Millipore获得。

施加区域2可以由刚性聚合物制成，其上附着有覆盖吸收垫(例如由玻璃纤维制成)，从而吸收并传导连接至检测区域3的样品。玻璃纤维可以进一步覆盖包含检测缀合物11(具有其标签9的检测试剂7)的由聚酯制成的结合垫。此外，该垫可以具有任何合适的特性，使得缀合物11(具有其标签9的检测试剂7)可以容易地被生物样品液体再水化，以允许再水化的缀合物11的完全去除和试剂7与待检测的碳青霉烯酶10的特异性反应。

优选地，根据本发明的装置1还可以包括吸收区域4，其允许已经通过毛细作用输送到硝化纤维素层末端的样品的吸入。

优选地，吸收区域4由纤维素和玻璃纤维制成，更优选由来自AdvancedMicrodevices Pvt，Ldt的纤维素和由来自GE Healthcare的硼硅酸盐玻璃纤维制成。

在优选的实施方案中，施加区域2包括具有由聚酯制成的结合垫的由玻璃纤维制成的膜，检测区域3包括由硝酸纤维素制成的膜，并且吸收区域4包括由纤维素制成的膜。

优选地，在根据本发明的检测装置1中，施加区域2和结合垫可以由相同的材料制成。

优选地，根据本发明的检测装置1是试纸条或横流装置。

在优选实施方案(图2)中，检测装置1包括包含根据本发明的支持物的壳体，设置在用于样本沉积的施加区域2上方的第一窗口以及设置在检测区域3上方的第二窗口以视觉上读取测定结果。

序列表

<110> Coris BioConcept

<120> 用于检测产碳青霉烯酶的肠杆菌科的方法和装置

<130> BPCORI0005PC

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 肠杆菌科

<400> 1

Thr Ala Met Lys Tyr Ser Val Val Pro Val Tyr

1 5 10

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 肠杆菌科

<400> 2

Ser Phe Leu Arg Lys Leu Tyr His Asn Lys Leu His Val

1 5 10

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> 肠杆菌科

<400> 3

Ile Arg Ala Lys Thr Gly Tyr Ser Thr Arg Ile Glu Pro Lys Ile Gly

1 5 10 15

Trp Trp

<210> 4

<211> 798

<212> DNA

<213> 肺炎克雷伯菌

<400> 4

atgcgtgtat tagccttatc ggctgtgttt ttggtggcat cgattatcgg aatgcctgcg 60

gtagcaaagg aatggcaaga aaacaaaagt tggaatgctc actttactga acataaatca 120

cagggcgtag ttgtgctctg gaatgagaat aagcagcaag gatttaccaa taatcttaaa 180

cgggcgaacc aagcattttt acccgcatct acctttaaaa ttcccaatag cttgatcgcc 240

ctcgatttgg gcgtggttaa ggatgaacac caagtcttta agtgggatgg acagacgcgc 300

gatatcgcca cttggaatcg cgatcataat ctaatcaccg cgatgaaata ttcagttgtg 360

cctgtttatc aagaatttgc ccgccaaatt ggcgaggcac gtatgagcaa gatgctacat 420

gctttcgatt atggtaatga ggacatttcg ggcaatgtag acagtttctg gctcgacggt 480

ggtattcgaa tttcggccac ggagcaaatc agctttttaa gaaagctgta tcacaataag 540

ttacacgtat cggagcgcag ccagcgtatt gtcaaacaag ccatgctgac cgaagccaat 600

ggtgactata ttattcgggc taaaactgga tactcgacta gaatcgaacc taagattggc 660

tggtgggtcg gttgggttga acttgatgat aatgtgtggt tttttgcgat gaatatggat 720

atgcccacat cggatggttt agggctgcgc caagccatca caaaagaagt gctcaaacag 780

gaaaaaatta ttccctag 798

<210> 5

<211> 265

<212> PRT

<213> 肺炎克雷伯菌

<400> 5

Met Arg Val Leu Ala Leu Ser Ala Val Phe Leu Val Ala Ser Ile Ile

1 5 10 15

Gly Met Pro Ala Val Ala Lys Glu Trp Gln Glu Asn Lys Ser Trp Asn

20 25 30

Ala His Phe Thr Glu His Lys Ser Gln Gly Val Val Val Leu Trp Asn

35 40 45

Glu Asn Lys Gln Gln Gly Phe Thr Asn Asn Leu Lys Arg Ala Asn Gln

50 55 60

Ala Phe Leu Pro Ala Ser Thr Phe Lys Ile Pro Asn Ser Leu Ile Ala

65 70 75 80

Leu Asp Leu Gly Val Val Lys Asp Glu His Gln Val Phe Lys Trp Asp

85 90 95

Gly Gln Thr Arg Asp Ile Ala Thr Trp Asn Arg Asp His Asn Leu Ile

100 105 110

Thr Ala Met Lys Tyr Ser Val Val Pro Val Tyr Gln Glu Phe Ala Arg

115 120 125

Gln Ile Gly Glu Ala Arg Met Ser Lys Met Leu His Ala Phe Asp Tyr

130 135 140

Gly Asn Glu Asp Ile Ser Gly Asn Val Asp Ser Phe Trp Leu Asp Gly

145 150 155 160

Gly Ile Arg Ile Ser Ala Thr Glu Gln Ile Ser Phe Leu Arg Lys Leu

165 170 175

Tyr His Asn Lys Leu His Val Ser Glu Arg Ser Gln Arg Ile Val Lys

180 185 190

Gln Ala Met Leu Thr Glu Ala Asn Gly Asp Tyr Ile Ile Arg Ala Lys

195 200 205

Thr Gly Tyr Ser Thr Arg Ile Glu Pro Lys Ile Gly Trp Trp Val Gly

210 215 220

Trp Val Glu Leu Asp Asp Asn Val Trp Phe Phe Ala Met Asn Met Asp

225 230 235 240

Met Pro Thr Ser Asp Gly Leu Gly Leu Arg Gln Ala Ile Thr Lys Glu

245 250 255

Val Leu Lys Gln Glu Lys Ile Ile Pro

260 265

<210> 6

<211> 960

<212> DNA

<213> 肺炎克雷伯菌

<400> 6

atgtcactgt atcgccgtct agttctgctg tcttgtctct catggccgct ggctggcttt 60

tctgccaccg cgctgaccaa cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga acaggacttt 120

ggcggctcca tcggtgtgta cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt aagttaccgc 180

gctgaggagc gcttcccact gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc cgctgtgctg 240

gctcgcagcc agcagcaggc cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg caaaaatgcg 300

ctggttccgt ggtcacccat ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac ggtggcggag 360

ctgtccgcgg ccgccgtgca atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt gctgaaggag 420

ttgggcggcc cggccgggct gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac cacgttccgt 480

ctggaccgct gggagctgga gctgaactcc gccatcccag gcgatgcgcg cgatacctca 540

tcgccgcgcg ccgtgacgga aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc actggctgcg 600

ccgcagcggc agcagtttgt tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa ccaccgcatc 660

cgcgcggcgg tgccggcaga ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg cggagtgtat 720

ggcacggcaa atgactatgc cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat tgtgttggcc 780

gtctacaccc gggcgcctaa caaggatgac aagtacagcg aggccgtcat cgccgctgcg 840

gctagactcg cgctcgaggg attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga aaatcatcta 900

ttggcccacc accgccgccc ttgcgggcgg catggattac caaccactgt cacatttagg 960

<210> 7

<211> 293

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 蛋白KPC-3的完整序列

<400> 7

Met Ser Leu Tyr Arg Arg Leu Val Leu Leu Ser Cys Leu Ser Trp Pro

1 5 10 15

Leu Ala Gly Phe Ser Ala Thr Ala Leu Thr Asn Leu Val Ala Glu Pro

20 25 30

Phe Ala Lys Leu Glu Gln Asp Phe Gly Gly Ser Ile Gly Val Tyr Ala

35 40 45

Met Asp Thr Gly Ser Gly Ala Thr Val Ser Tyr Arg Ala Glu Glu Arg

50 55 60

Phe Pro Leu Cys Ser Ser Phe Lys Gly Phe Leu Ala Ala Ala Val Leu

65 70 75 80

Ala Arg Ser Gln Gln Gln Ala Gly Leu Leu Asp Thr Pro Ile Arg Tyr

85 90 95

Gly Lys Asn Ala Leu Val Pro Trp Ser Pro Ile Ser Glu Lys Tyr Leu

100 105 110

Thr Thr Gly Met Thr Val Ala Glu Leu Ser Ala Ala Ala Val Gln Tyr

115 120 125

Ser Asp Asn Ala Ala Ala Asn Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gly Gly Pro

130 135 140

Ala Gly Leu Thr Ala Phe Met Arg Ser Ile Gly Asp Thr Thr Phe Arg

145 150 155 160

Leu Asp Arg Trp Glu Leu Glu Leu Asn Ser Ala Ile Pro Gly Asp Ala

165 170 175

Arg Asp Thr Ser Ser Pro Arg Ala Val Thr Glu Ser Leu Gln Lys Leu

180 185 190

Thr Leu Gly Ser Ala Leu Ala Ala Pro Gln Arg Gln Gln Phe Val Asp

195 200 205

Trp Leu Lys Gly Asn Thr Thr Gly Asn His Arg Ile Arg Ala Ala Val

210 215 220

Pro Ala Asp Trp Ala Val Gly Asp Lys Thr Gly Thr Cys Gly Val Tyr

225 230 235 240

Gly Thr Ala Asn Asp Tyr Ala Val Val Trp Pro Thr Gly Arg Ala Pro

245 250 255

Ile Val Leu Ala Val Tyr Thr Arg Ala Pro Asn Lys Asp Asp Lys Tyr

260 265 270

Ser Glu Ala Val Ile Ala Ala Ala Ala Arg Leu Ala Leu Glu Gly Leu

275 280 285

Gly Val Asn Gly Gln

290

<210> 8

<211> 34

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 表位区(231-264)

<400> 8

Gly Asp Lys Thr Gly Thr Cys Gly Val Tyr Gly Thr Ala Asn Asp Tyr

1 5 10 15

Ala Val Val Trp Pro Thr Gly Arg Ala Pro Ile Val Leu Ala Val Tyr

20 25 30

Thr Arg

Claims

1.一种检测生物样品中可能存在的来自产碳青霉烯酶的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的一种或多种OXA碳青霉烯酶的方法，所述方法包括以下步骤：

-提供支持物(3)，

-在所述支持物(3)上固定与一种或多种所述碳青霉烯酶(10)的一个或多个第一表位区相互作用的一种或多种捕获试剂(5)，

-提供与所述碳青霉烯酶(10)的一个或多个第二表位区相互作用的一种或多种检测试剂(7)，所述检测试剂(7)直接或间接地与标签(9)连接以形成一种或多种检测缀合物(11)，

-提供包含或不包含所述碳青霉烯酶(10)的待测样品以进行检测，

-使所述样品与一种或多种捕获试剂(5)接触，

-揭示所述样品中存在的碳青霉烯酶(10)被所述检测试剂(7)的特异性结合，

其中所述捕获试剂(5)或者所述捕获试剂(5)和所述检测试剂(7)这两者对于选自下列的氨基酸序列或其片段是特异性的，并且与所述氨基酸序列或其片段结合：

SEQ ID NO：3：IRAKTGYSTRIEPKIGWW，或

SEQ ID NO：3的包含RIEP的氨基酸序列在内的至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个连续氨基酸的片段。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测试剂(7)与所述捕获试剂(5)中的一种或多种具有相同的性质并且结合相同的碳青霉烯酶表位区。

3.根据权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：

-将一种或多种对照试剂(6)固定在支持物上以与一种或多种对照检测试剂(8)相互作用，

-提供一种或多种对照检测试剂(8)以与所述对照试剂(6)相互作用并结合，所述对照检测试剂(8)直接或间接地与标签(9)连接以形成一种或多种对照检测缀合物(12)。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述捕获试剂(5)、检测试剂(7)和/或对照试剂(6)选自单克隆抗体、多克隆抗体、抗体的部分、纳米抗体、α体、微抗体、affiline、affimer、fynomer、affitin或其混合物。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述对照检测试剂(8)是单克隆抗体或多克隆抗体。

6.根据权利要求3所述的方法，其中所述检测试剂(7)和/或对照检测试剂(8)的标签(9)选自金属胶体和胶乳颗粒。

7.根据权利要求1所述的方法，还包括区分OXA-163型碳青霉烯酶和OXA-48型碳青霉烯酶的步骤。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中所述支持物选自由试纸条或横流装置组成的组。

9.一种免疫色谱检测装置(1)，其包含：

支持物(3)，其包含与一种或多种碳青霉烯酶的一个或多个第一表位区相互作用的一种或多种捕获试剂(5)，及

与所述碳青霉烯酶的一个或多个第二表位区相互作用的一种或多种检测试剂(7)，所述检测试剂(7)直接或间接连接至标签(9)以形成一种或多种检测缀合物(11)，

SEQ ID NO：3：IRAKTGYSTRIEPKIGWW，或

10.根据权利要求9所述的免疫色谱检测装置(1)，其还包含与一种或多种对照检测试剂(8)相互作用并结合的一种或多种对照试剂(6)，所述检测试剂(8)直接或间接地连接至标签(9)以形成一种或多种对照缀合物(12)。

11.根据权利要求10所述的免疫色谱检测装置(1)，其中所述检测试剂(7)和/或所述对照检测试剂(8)的标签(9)选自金属胶体和胶乳颗粒。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的免疫色谱检测装置(1)，其是试纸条或横流装置。

13.根据权利要求9至12中任一项所述的免疫色谱检测装置(1)用于检测和/或鉴定生物样品中的来自产碳青霉烯酶的肠杆菌科的OXA碳青霉烯酶的用途。