KR20110096940A - 신속 면역크로마토그라피법을 이용한 신종 인플루엔자 진단 키트 - Google Patents

신속 면역크로마토그라피법을 이용한 신종 인플루엔자 진단 키트 Download PDF

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Abstract

신속 면역크로마토그라피법을 이용하여 A형 신종 인플루엔자 바이러스(Influenza A, H1N1)를 진단할 수 있는 진단 키트가 개시된다. 상기 신종 인플루엔자 진단 키트는 신종 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA) 항원에 대한 항체를 포함한다. 여기서, 상기 헤마글루티닌(HA) 항원에 대한 항체는 다공성 멤브레인 패드에 고정되어 있으며, 상기 신종 인플루엔자 진단 키트는 육안 또는 센서를 이용하여 감지할 수 있는 시그널을 발생시키는 라벨에 신종 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA) 항원에 대한 항체를 접합시킨 항체-라벨 접합체를 함유하는 접합체 패드를 더욱 포함하는 것이 바람직하다.

Description

신속 면역크로마토그라피법을 이용한 신종 인플루엔자 진단 키트{Diagnostic kit for influenza virus H1N1 using rapid immunochromatography}
본 발명은 신종 인플루엔자 진단 키트에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 신속 면역크로마토그라피법(Immunochromatography)을 이용하여 A형 신종 인플루엔자 바이러스(Influenza A, H1N1)를 진단할 수 있는 진단 키트에 관한 것이다.
신종 인플루엔자 바이러스(Influenza A, H1N1)는, 인플루엔자 바이러스의 일종으로서, 사람, 조류 및 돼지 인플루엔자 바이러스의 유전물질이 혼합된 새로운 종류의 바이러스이다. 현재까지 보고된 바에 의하면, 신종 인플루엔자 바이러스는 확산속도가 빠르지만, 대다수 환자들에게서 경미한 증상만을 유발하고, 또한 계절인플루엔자와 비슷한 수준의 치명률을 나타낸다. 하지만, 대부분의 사람들이 신종 인플루엔자 바이러스에 대한 면역력이 없어, 대규모 유행의 가능성을 배재할 수 없으므로, 세계 각국과 WHO에서는 이에 대한 대책에 만전을 기하고 있다. 신종 인플루엔자의 증상은, 대부분 전형적인 인플루엔자 유사증상(influenza-like illness, ILI)을 보이지만, 전형적인 ILI 외에도, 중증 폐렴, 패혈증, 다발성 장기부전에 이르기까지 다양한 스펙트럼의 임상 양상을 나타내기도 하며, 열이 없는 경우도 있다. 신종 인플루엔자 확진 환자는 발열, 오한, 두통, 상기도 증상(기침, 인후통, 콧물, 호흡곤란), 근육통, 관절통, 피로감 등의 증상을 나타나며, 계절 인플루엔자와는 달리 약 25%의 환자에서 구토, 설사 등의 소화기증상을 동반하는 것으로 알려져 있다. 대부분의 건강한 신종인플루엔자 환자는, 항바이러스제 치료 없이도 1주일 이내에 자연 치유된다. 신종인플루엔자 환자의 치사율은 국가마다 다양하나, 현재 선진국에서는 0.2% 이하로 매우 낮으며, 중증질환 및 사망으로 진행되는 사례의 대부분(60 내지 70%)은 만성질환, 임신부, 영유아 등 고위험군에서 발생된다. 신종인플루엔자의 주된 전파 경로는 호흡기 비말전파, 접촉전파 등으로서, 계절인플루엔자 바이러스의 전파양상과 유사하다. 예를 들면, 감염된 사람이 기침이나 재채기를 할 때, 바이러스를 포함하는 물방울(비말)이 입에서 배출되어 보통 1~2미터를 날아가, 다른 사람의 손에 묻거나 직접 호흡기 또는 눈으로 들어가 전파된다. 또한, 신종인플루엔자 바이러스가 묻은 물체에 손이 닿고, 손에 묻은 바이러스가 다시 호흡기나 눈으로 들어가서 전파되기도 한다.
인플루엔자 바이러스는 1931년 Shope에 의해 돼지에서 처음 분리되었고, 사람 인플루엔자는 1933년 Smith, Andrews 및 Laidlow에 의해 처음 분리되었다. 인플루엔자 바이러스는 오르소믹소바이러스(Orthomyxovirus)과에 속하고, 단일가닥 RNA를 유전물질로 가지며, 서로 다른 8개의 RNA 분절로부터 여러 종류의 단백질이 만들어진다. 인플루엔자 바이러스의 주요 단백질로는, 바이러스 외피를 둘러싸고 있는 HA(Hemagglutinin)와 NA(Neuraminidase), RNA와 결합한 핵단백질인 NP(Nucleoprotein), 폴리머라제(polymerase) 역할을 하는 PB2, PB1, PA, 표피를 구성하고 있는 M(Matrix) 단백질이 있다. 형태학적으로, 인플루엔자 바이러스는, 평균 약 80 내지 120 nm의 직경을 가지며, 외부에 돌기가 있는 구형 입자 형태이지만, 유정란, 감수성 세포 등에서 분리된 직후의 바이러스는 약 400 nm 길이의 필라멘트 형태를 가지는 경우도 있다. 비리온은 외막(Envelope)을 가지며, 에테르, 열, pH 등에 민감한 특징이 있다. 인플루엔자 바이러스는 항원의 변이가 빈번하고 많은 아형이 존재하므로, 세계보건기구에서 제안한 표기 방법으로 구분한다. 2009년에 유행하고 있는 신종인플루엔자 바이러스의 경우, HA, NP, NS 유전자는 북미 지역의 돼지인플루엔자 바이러스에서, PB2, PA 유전자는 북미 지역의 조류인플루엔자 바이러스에서, PB1 유전자는 사람인플루엔자 바이러스 A(H3N2)에서, NA, M 유전자는 유럽 돼지인플루엔자 바이러스에서 유래한 것으로 추정된다.
현재, 신종 인플루엔자 바이러스의 감염 진단은 바이러스의 분리와 바이러스 핵산 검출 및 면역크로마토그라피법을 이용한 신속항원검사 등으로 수행된다. 신종인플루엔자 바이러스의 분리는 환자의 시료를 매딘-다비 케이나인 키드니(Madin-Darby canine kidney: MDCK) 세포에 접종하여 혈구응집능이 있는 바이러스를 확인함으로서 수행되고, 바이러스 핵산의 검출은 실시간(Real time) RT-PCR법으로 수행된다. 최근 국내외 병원에서 주로 이용되는 면역크로마토그라피법은, 사람 인플루엔자 바이러스 항원 래피드 검사 키트를 이용하는 것으로서, 이와 같은 검사 키트로는 종래의 계절 인플루엔자와 신종 인플루엔자를 감별 진단할 수 없는 단점이 있다. 따라서, 신종인플루엔자 바이러스에 특이적인 신속 면역크로마토그라피 검사 키트의 개발이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은, 사람의 코 또는 인후 분비물로부터, A형 신종 인플루엔자 바이러스 감염 여부를 신속하게 진단할 수 있는 진단 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 일반 병원, 의원 등에서, 특별한 검사 장비 없이도, 신종 인플루엔자 바이러스 감염 유무를 단시간에 용이하게 진단할 수 있는, 신속 면역크로마토그라피법을 이용한 신종 인플루엔자 진단 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 신종 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA) 항원에 대한 항체를 포함하는 신종 인플루엔자(H1N1) 진단 키트를 제공한다. 여기서, 상기 헤마글루티닌(HA) 항원에 대한 항체는 기탁 번호 KCLRF-BP-00228 및/또는 KCLRF-BP-00229로 기탁된 잡종 세포주에 의하여 생성되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 헤마글루티닌(HA) 항원에 대한 항체는 다공성 멤브레인 패드에 고정되어 있으며, 상기 신종 인플루엔자(H1N1) 진단 키트는 육안 또는 센서를 이용하여 감지할 수 있는 시그널을 발생시키는 라벨에 신종 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA) 항원에 대한 항체를 접합시킨 항체-라벨 접합체를 함유하는 접합체 패드를 더욱 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 신종 인플루엔자 진단 키트는, 사람의 코 또는 인후 분비물을 검체로 사용하고, 신속 면역크로마토그라피법을 이용하여, 특별한 검사 장비 없이, 현장에서 간편하고 신속하게, 신종 인플루엔자 바이러스 감염여부를 진단 할 수 있다.
도 1a 및 1b는 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 신종 인플루엔자 진단 키트의 측면도 및 평면 사진.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 신종 인플루엔자 진단 키트에 검체를 적용시킨 결과를 보여주는 사진.
본 발명에 따른 신종 인플루엔자 진단 키트는, A형 신종 인플루엔자 바이러스의 특이적인 항원인 헤마글루티닌(HA)에 대한 항체를 포함하며, 신속 면역크로마토그라피법을 이용하여, 검체(검사 재료)인 사람의 코 또는 인후 분비물 중의 신종 인플루엔자 바이러스 존재 여부를 신속하게 검사한다.
도 1a 및 1b는 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 신종 인플루엔자 진단 키트의 측면도 및 평면 사진이다. 도 1a 및 1b에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 신종 인플루엔자 진단 키트(10)는, 신종 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA) 항원에 대한 항체가 고정된 검사선(16a)이 형성되어 있는 다공성 멤브레인 패드(16)를 포함한다. 또한, 필요에 따라, 본 발명에 따른 신종 인플루엔자 진단 키트는, 액상 검체를 수용하는 검체 패드(12), 육안 또는 센서를 이용하여 감지할 수 있는 시그널을 발생시키는 라벨(예를 들면, 금)을 신종 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA) 항원에 대한 항체에 접합시킨 항체-라벨 접합체를 함유하는 접합체 패드(14), 액상 검체를 최종적으로 수용하는 흡습 패드(18) 등을 더욱 포함할 수 있으며, 이러한 패드(12, 14, 16, 18)들은 연결 부위가 서로 중첩된 형태로 플라스틱 지지체(20)의 상부에 연속적으로 배열되어 스트립을 형성할 수 있다. 즉, 상기 다공성 멤브레인 패드(16)의 양단에는 진단될 액상 검체를 수용하는 검체 패드(12) 및 상기 다공성 멤브레인 패드(16)를 통과한 액상 검체를 최종적으로 수용하는 흡습 패드(18)가 더욱 형성되어 있을 수 있다.
본 발명에 따른 신종 인플루엔자 진단 키트를 제조하기 위해서는, 먼저, A형 신종 인플루엔자 바이러스에 특이적인 헤마글루티닌(HA) 항원을 분리 및 정제하고, 상기 항원에 대한 단일클론 항체를 제조한다. 면역크로마토그라피법으로, A형, B형, 및 신종 인플루엔자 바이러스의 존재 여부를 동시에 감별 진단하기 위해서는, 멤브레인 패드(16)의 검사선 A(도 2의 "A형" 선), 검사선 B(도 2의 "B형" 선), 검사선 H1N1(도 2의 "신종"선 및 도 1의 16a) 위치에, 각각 A형 인플루엔자에 공통적인 뉴클레오프로테인(NP) 항체, B형 인플루엔자에 공통적인 뉴클레오프로테인(NP) 항체 및 신종 인플루엔자 바이러스에 특이적인 헤마글루티닌(HA) 항체를 흡착시킨다. 즉, 멤브레인 패드(16)에는, A형 인플루엔자 바이러스에 공통적인 항체, B형 인플루엔자 바이러스에 공통적인 항체 및 신종 인플루엔자 바이러스에만 특이적인 항체가 각각 일정한 위치에 흡착되어 있다. 본 발명에 따른 진단 키트에 사용될 수 있는 멤브레인(membrane)은 통상의 진단 스트립 물질로 이루어질 수 있으며, 예를 들면, 니트로셀룰로우즈, 셀룰로우즈, 셀룰로우즈 아세테이트, 폴리에틸렌 등의 각종 합성 중합체로 이루어질 수 있고, 바람직하게는 니트로셀룰로우즈로 이루어진다. 다음으로, 금 입자에도 각각의 항체를 접합시켜, 항체-금 접합체를 만들고, 이들을 일정 비율로 혼합하여, 패드에 흡착(함침) 및 건조시켜, 항체-금 접합체 패드(14)를 만들고, 외부로부터 검체를 받아들여, 멤브레인 패드(16) 내부로 침투되도록 하는 검체 패드(12) 및 멤브레인 패드(16)에서 반응하지 않은 시료들을 흡수하는 흡습 패드(18)를 준비한다. 여기서, 상기 항체-금 접합체가 함침되는 패드(14, 모재)는 폴리에스테르, 유리섬유 등으로 이루어지고, 상기 검체 패드(12) 및 흡습 패드(18)는 셀룰로우즈로 이루어지며, 상기 검체 패드(12)는 계면활성제 처리되어 있는 것이 바람직하다. 다음으로, 건조된 항체-금 접합체 패드(14)와 검체 패드(12)를 중첩하여 멤브레인 패드(16)에 부착하고, 필요에 따라, 스톱라인 (stop-line) 표시용 스티커를 부착하며, 멤브레인 패드(16)의 반대편 위치에는 흡습 패드(18)를 부착시켜, 도 1에 도시된 바와 같은 테스트 스트립을 제조한다.
본 발명에 따른 진단 키트를 이용한 신종 인플루엔자의 진단 과정은 다음과 같다. 먼저, 추출용액(예를 들면, 약 300㎕)이 담겨 있는 테스트 튜브에, 사람의 코 또는 인후 분비물이 채취된 스왑(Swab)을 넣고 충분히 추출한 후, 테스트 스트립(10)의 화살표가 아래로 가도록 테스트 스트립(10)을 테스트 튜브에 넣으면, 검체 중에 존재하는 A형, B형 또는 신종 인플루엔자 바이러스가 금 입자에 부착된 각각의 항체와 반응하면서, 모세관 현상에 의해서, 멤브레인 패드(16) 위로 전개된다. 이때, 검체 중에, 해당 바이러스 항원이 존재하면, 검체 중의 바이러스 항원과 금-입자에 접합된 항체가 반응하여 결합하고, 상기 바이러스 항원이 멤브레인 패드(167)에 흡착된 항체(16a)와 다시 반응하여, 해당 위치에 금-입자에 의한 보라색 밴드를 형성한다. 대조선(도 2의 c) 위치에는, 항-마우스 IgG를 흡착시켜, 검체 중의 바이러스 항원의 존재 여부에 무관하게, 마우스 IgG가 흡착된 금-입자와 대조선의 항-마우스 IgG가 항상 반응하여 보라색 밴드를 나타내도록 되어 있다. 또한, 반응하지 않은 검체는 흡습패드(18)에 스며들어, 검사창의 멤브레인이 깨끗한 흰색으로 나타나도록 함으로서, 검사선(16a)에 형성되는 밴드를 쉽게 판독할 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 즉, 검체 중에 신종 인플루엔자 바이러스가 일정량 이상 존재하면, A형 인플루엔자 바이러스에 공통적인 항원에 대한 단일클론 항체가 흡착된 검사선 A 위치, 신종 인플루엔자 바이러스 특이 항원에 대한 단일클론 항체가 흡착된 검사선 H1N1 위치, 및 대조선 위치에 보라색 밴드를 나타낸다. 한편, 검체 중에 신종 인플루엔자 바이러스가 존재하지 않으면, 대조선 위치에만 보라색 밴드가 형성된다.
본 발명에 있어서, "단클론 항체"란 단일한 항원성 부위(단일 에피토프)에 대해서 지시되어 이와 특이적 결합을 하는 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 단클론 항체는 A형 신종 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA)에 특이적으로 결합하는 단백질 분자이다. 또한, 본 발명의 단클론 항체는, A형 신종 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA)에 특이적으로 결합하는 상기 단클론 항체의 기능성 단편들도 포함한다. 여기서, 항체의 "기능성 단편" 이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 항체의 단편 또는 가변영역을 의미한다. 본 발명에 따른 진단 키트에는, 신종 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA) 항원에 대한 항체 뿐만 아니라, 면역학적 분석의 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다. 이러한 도구 및 시약으로는, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 라벨(표지 물질), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함될 수 있다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 가용성 담체로서, 생리학적 완충액, 예를 들어 PBS를 사용할 수 있고, 불용성 담체로는, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 등을 사용할 수 있다. 항원-항체 복합체 형성은 조직면역 염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블럿(Western Blotting), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion assay) 등으로 분석될 수 있다. 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하는 라벨에는 금 입자 외에도, 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자, 방사선 동위원소 등이 사용될 수 있다.
이하, 본 발명에 대한 이해를 돕기 위하여, 바람직한 실시예를 제공한다. 그러나, 본 발명이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 신종 인플루엔자 진단용 항체 제조
(1) 헤마글루티닌(HA) 항원 정제
국내에서 분리된 신종 인플루엔자 바이러스(A/Korea/01/2009 (H1N1) pdm)로부터 헤마글루티닌(HA) 항원을 농축 및 정제하기 위하여, 다음과 같이, S. Kodiballi 등(1993)의 방법을 이용하였다. 먼저, 신종 인플루엔자 바이러스를 β-프로피오락톤(propiolactone)으로 불활화시키고, 4,000xg에서 30분간 1차 원심분리한 후, 상층액을 2차로 70,000xg에서 3시간 동안 초원심분리(L8-70M, Beckman, USA)하였다. 원심분리된 펠렛(pellet)을 수크로오즈(sucrose)에 재부유시키고(sucrose양의 1/25배), 수크로오즈 밀도 구배 초원심분리(sucrose density gradient ultracentrifugation, 100,000xg, 90분)를 수행한 다음, 혈구응집능을 보이는 분획(fraction)을 분리하였다. 이렇게 농축된 바이러스 분획에 5%(w/v) n-옥틸-b-D-글루코피라노시드(n-octyl-b-D-gluco pyranoside)를 첨가하고 22℃에서 2시간 처리하여 바이러스를 파괴(disruption)시켰다. 그 후, 70,000xg에서 90분간 원심분리하고, 얻어진 펠렛을 0.1M NaCl로 용해시킨 후, 다시 10,000xg에서 30분간 원심분리하여, 신종 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA)을 분리하였다.
(2) 신종 인플루엔자 바이러스에 공통적인 항체 제조
상기 단계에서 정제된 항원을 면역원으로 사용하여 BALB/c 마우스에 면역시켰다. 이후, 마우스의 비장 세포를 분리하여 골수종 세포(myeloma cell)와 접합시켜, 신종 인플루엔자 바이러스 항원에 대한 단클론 항체를 분비하는 잡종 세포주를 ELISA 방법으로 선별하고, 단계 희석 방법으로 단세포군을 확립하였다. 그 결과 얻어진 세포주를 2010. 02. 19 자로 한국세포주연구재단(KCLRF, Korean Cell Line Research Foundation)에 기탁하였다(기탁번호: KCLRF-BP-00228 및 KCLRF-BP-00229). 이들 세포주를 대량 배양하여 BALB/c 마우스 복강에 접종하여, 항체가 다량 함유된 복수를 얻고 프로틴(protein) A/G 겔(gel)을 이용하여 IgG 항체를 정제하였다. 얻어진 항체는, A형 신종 인플루엔자 바이러스에 특이적인 헤마글루티닌(HA) 항원을 면역원으로 하여 제조된 마우스 단일클론 항체이다.
실시예 2. 진단스트립의 제조
(1) 멤브레인 코팅공정
니트로셀룰로우즈 멤브레인의 검사선 "A" 위치에 A형 인플루엔자 바이러스에 공통적인 뉴클레오프로테인(NP) 항원에 대한 항체를 코팅하고, 검사선 "B" 위치에 B형 인플루엔자 바이러스에 공통적인 뉴클레오프로테인(NP) 항원에 대한 항체를 코팅하고, 검사선 "H1N1" 위치에는 신종 인플루엔자 바이러스에 특이적인 헤마글루티닌(HA) 항원에 대한 항체를 코팅하고, 대조선 "C" 위치에는 산양 항 마우스 항체를 각각 코팅하였다. 여기서, 상기 헤마글루티닌(HA) 항원에 대한 항체는, PBS(phosphate buffered saline)를 이용하여 1mg/ml 농도로 희석하여, 멤브레인의 검사선 "H1N1" 위치에 코팅하였다.
(2) 항체-금 접합체 제조 공정
A형 인플루엔자 바이러스에 공통적인 뉴클레오프로테인(NP) 항원에 대한 항체, B형 인플루엔자 바이러스에 공통적인 뉴클레오프로테인(NP) 항원에 대한 항체 및 신종 인플루엔자 바이러스에 특이적인 헤마글루티닌(HA)에 대한 항체를 금 콜로이드(Gold colloid)와 각각 결합시켰다. 구체적으로, 염화금을 시트르산 나트륨 용액으로 환원시켜, 532nm에서의 흡광도가 10± 1이 되도록, 약 40nm 크기의 금 입자를 제조하였다. 상기 금 입자를 PEG(poly(ethylene glycol)) 용액으로 안정화시킨 후, 정제된 A형 인플루엔자 바이러스에 공통적인 NP 항원에 대한 항체, B형 인플루엔자 바이러스에 공통적인 NP 항원에 대한 항체 및 신종 인플루엔자 바이러스에 특이적인 HA 항원에 대한 항체를 각각 일정 비율(예를 들면, 10㎍/㎖)로 혼합하고, 폴리에스테르 또는 유리 섬유에 함침 및 건조시켜, 금-패드를 제조하였다. 상기 금-입자에 결합된 헤마글루티닌(HA)에 대한 항체는 실시예 1의 (2)와 동일한 방법으로 제조하였다.
(3) 흡습 패드 제조 및 스트립 조립
상기 니트로셀룰로오스 멤브레인 상단에 건조된 흡습 패드를 부착하여, 니트로셀룰로오스 멤브레인을 통과한 반응 용액이 잘 흡수될 수 있도록 하였다.
실시예 3. 신속 면역크로마토그라피법에 의한 신종 인플루엔자의 진단
검체 희석액이 담긴 테스트 튜브에 검체(사람의 코 또는 인후 분비물)를 넣고, 실시예 2에서 제조한 진단스트립(테스트 스트립)을 넣어 반응시킨다. 이때, 검체 중에 신종 인플루엔자 바이러스가 일정량 이상 존재하면, 금-접합체 패드의 금 입자에 접합되어 있는 A형 인플루엔자 바이러스 공통 항체, 신종 인플루엔자 바이러스 특이 항체와 1차 반응하며, 이후 면역크로마토그라피법 원리에 의해, 검체가 멤브레인을 따라 이동하면서, 멤브레인의 검사선 "A" 및 "H1N1" 위치에 있는 다른 단일 클론의 A형 인플루엔자 바이러스 공통 뉴클레오프로테인 항체 및 신종 인플루엔자 바이러스 특이 헤마글루티닌 항체와 2차적으로 결합하여, 항체-항원-항체 복합체를 형성하여, 대조선, 검사선 "A" 및 "H1N1"의 3개의 보라색 밴드가 나타나거나, 대조선과 검사선 "H1N1"의 2개의 보라색 밴드를 나타낸다. 한편, 신종 인플루엔자 또는 A형 인플루엔자 음성인 경우에는, 대조선에서만 보라색 밴드를 나타낸다. 도 2는 본 발명의 신종 인플루엔자 진단 키트에 다양한 검체를 적용시킨 결과를 보여주는 사진으로서, 좌측으로부터 첫 번째 진단키트는 인플루엔자 음성(대조선 C만 발색), 2번째 진단 키트는 A형 인플루엔자 양성(A선만 발색), 3번째 진단 키트는 신종 인플루엔자 양성, 4번째 진단 키트는 신종 인플루엔자 양성, 5번째 진단 키트는 B형 인플루엔자 양성인 경우의 진단 결과를 보여준다.
실시예 4. 신종 인플루엔자 진단 효능 시험
(1) 신종 인플루엔자 바이러스 검출 한계 시험
신종 인플루엔자 바이러스의 검출 한계를 시험하기 위하여, 신종 인플루엔자 바이러스의 농도를 희석하면서, 실시예 3의 신종 인플루엔자 진단과 혈구응집반응 시험을 각각 실시하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다. 구체적으로, 혈구응집반응 역가(Hemagglutination Titer)는, U형 바닥(bottom)의 96 웰 플레이트(well plate)의 전체 웰(well)에 PBS(pH7.2)를 50ul씩 첨가하고, 1번 웰(well)에 신종 인플루엔자 바이러스를 50ul 첨가한 후, 2배 단계 희석하였다. 그 후, 1% 닭 적혈구 부유액을 50ul 첨가하고 잘 흔든 다음, 실온에서 40분간 정치하였다. 혈구응집반응 역가는 적혈구를 응집시키는 최고 희석배수로 결정하였다. 하기 표 1로부터, 본 발명에 따른 신종 인플루엔자 진단 키트는 혈구응집반응 1 HAU 인 신종 인플루엔자 바이러스를 1/16 HAU까지 검출할 수 있음을 알 수 있다(HAU: Hemagglutinin Unit).
희석 배수 실시예 3의 신종 인플루엔자 진단 결과 혈구응집반응 결과
21 (1 HAU) + +
22 (1/2 HAU) + -
23 (1/4 HAU) + -
24 (1/8 HAU) + -
25 (1/16 HAU) + -
26 (1/32 HAU) - -
(2) 민감도와 특이도 시험
본 발명의 실시예 2에 따라 제조된 진단 스트립의 민감도와 특이도를 6개 시·도 보건환경연구원 및 그 지역 인플루엔자 감시병원 실험실의 협조로 시험하였다. 감시병원에 내원하는 신종 인플루엔자 의심환자 391명으로부터 검체를 채취하여, 실시예 2에 따라 제조된 진단 스트립 및 Applied Biosystems사의 실시간(Real time) RT-PCR 방법으로 신종 인플루엔자 감염 여부를 진단하여, 검출율을 비교하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 실시간 RT-PCR에 의해 양성으로 확인된 검체 159건을 실시예 2의 진단 스트립으로 검사한 결과 108건이 양성으로 나타났다. 또한, 실시간 RT-PCR에 의해 음성으로 확인된 검체 232건을 실시예 2의 진단 스트립으로 검사한 결과 1건이 양성으로, 나머지 231건이 음성으로 나타났다. 따라서, 본 발명 실시예 2의 진단 스트립의 민감도는 67.9%, 특이도는 99.6%였다.
신종 인플루엔자 진단 시약 Real time RT-PCR
양성 음성 합계

본 진단 키트
 양성 108 1 109
음성 51 231 282
합계 159 232 391
(3) 교차반응 시험
A형 및 B형 인플루엔자 바이러스 패널(panel), 그 외 바이러스 및 세균 패널을 이용하여 교차반응 시험을 실시하였으며, 그 결과를 표 3 내지 5에 나타내었다. 표 3으로부터, A형 및 B형 인플루엔자 바이러스를 2배 희석하여 시험한 결과, 돼지 인플루엔자 바이러스 이외에는 교차 반응을 일으키지 않으며, 표 4 및 5로부터 인플루엔자 이외 바이러스 및 세균을 10배, 100배, 1,000배, 10,000배 희석하여 시험하여도 교차 반응을 일으키지 않음을 알 수 있다.
번호 바이러스 이름
HAU		 결과
신종 H1N1 A B
1 Seasonal A/H1N1
(A/PR/8/34)		 27 - + -
2 Seasonal A/H1N1
(A/Brisbane/59/2007)		 27 - + -
3 Seasonal A/H1N1
(A/Solomon Islands/3/2006)		 28 - + -
4 Seasonal A/H1N1
(A/New Caledonis/20/99)		 27 - + -
5 Swine A/H1N1 26 +/- + -
6 A/H2N2 27 - + -
7 A/H3N2 26 - + -
8 A/H3N5 27 - + -
9 A/H3N8 25 - + -
10 A/H4N6 27 - + -
11 A/H5N3 26 - + -
12 A/H6N5 27 - + -
13 A/H7N1 24 - + -
14 A/H8N4 26 - + -
15 A/H9N2 28 - + -
16 A/H10N7 27 - + -
17 A/H10N9 28 - + -
18 A/H11N6 28 - + -
19 A/H11N8 27 - + -
20 B 형 25 - - +
패널 균주명 스트레인 농도 희석배수
1:10 1:102 1:103 1:104






바
이
러
스		 Adenovirus 3 GB 1mg/ml - - - -
Adenovirus 6 Tonsil 99 1.2mg/ml - - - -
Adenovirus 21 AV-1645/128 1mg/ml - - - -
CMV Towne 1.5mg/ml - - - -
Echovirus 2 Cornelis 1.3mg/ml - - - -
Echovirus 5 Noyce 0.9mg/ml - - - -
Echovirus 11 Gregory 1mg/ml - - - -
Herpes simplex virus 1 F 0.25mg/ml - - - -
Herpes simplex virus 2 G 0.115mg/ml - - - -
Mumps virus Enders 1.8mg/ml - - - -
Parainfluenza Virus 1 Sendai 1.5mg/ml - - - -
Parainfluenza Virus 2 CA/Greer 3.9mg/ml - - - -
Parainfluenza Virus 3 C243 1.93mg/ml - - - -
Respiratory Syncytial virus A-2 1mg/ml - - - -
Respiratory Syncytial virus Long 0.42mg/ml - - - -

패널
균주명
농도		 희석배수
1:10 1:102 1:103 1:104









세균		 Bordetella pertussis 1x108cells/ml - - - -
Enterococcus faecalis 1x108cells/ml - - - -
Escherichia coli 1x108cells/ml - - - -
Haemophilus influenzae 1x108cells/ml - - - -
Klebsiella pneumoniae 1x108cells/ml - - - -
Legionella pneumophila 1x108cells/ml - - - -
Mycobacterium avium 1x108cells/ml - - - -
Mycobacterium intracellulare 1x108cells/ml - - - -
Mycobacterium tuberculosis 1x108cells/ml - - - -
Mycoplasma pneumoniae 1x108cells/ml - - - -
Neisseria gonorrhoeae 1x108cells/ml - - - -
Neisseria meningitidis 1x108cells/ml - - - -
Proteus vulgaris 1x108cells/ml - - - -
Pseudomonas aeruginosa 1x108cells/ml - - - -
Staphylococcus aureus 1x108cells/ml - - - -
Staphylococcus pneumoniae 1x108cells/ml - - - -
Staphylococcus pyogenes 1x108cells/ml - - - -
한국세포주연구재단 KCLRFBP00228 20100219 한국세포주연구재단 KCLRFBP00229 20100219

Claims (7)

  1. 신종 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA) 항원에 대한 항체를 포함하는 신종 인플루엔자(H1N1) 진단 키트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 헤마글루티닌(HA) 항원에 대한 항체는 기탁 번호 KCLRF-BP-00228 및/또는 KCLRF-BP-00229로 기탁된 잡종 세포주에 의하여 생성되는 것인, 신종 인플루엔자(H1N1) 진단 키트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 헤마글루티닌(HA) 항원에 대한 항체는 다공성 멤브레인 패드에 고정되어 있는 것인, 신종 인플루엔자(H1N1) 진단 키트.
  4. 제3항에 있어서, 육안 또는 센서를 이용하여 감지할 수 있는 시그널을 발생시키는 라벨에 신종 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(HA) 항원에 대한 항체를 접합시킨 항체-라벨 접합체를 함유하는 접합체 패드를 더욱 포함하는, 신종 인플루엔자(H1N1) 진단 키트.
  5. 제3항에 있어서, 상기 다공성 멤브레인 패드의 양단에는 진단될 액상 검체를 수용하는 검체 패드 및 상기 다공성 멤브레인 패드를 통과한 액상 검체를 최종적으로 수용하는 흡습 패드가 더욱 형성되어 있는 것인, 신종 인플루엔자(H1N1) 진단 키트.
  6. 제3항에 있어서, 상기 다공성 멤브레인 패드에는 A형 인플루엔자에 공통적인 뉴클레오프로테인(NP) 항체 및 B형 인플루엔자에 공통적인 뉴클레오프로테인(NP) 항체가 더욱 고정되어 있는 것인, 신종 인플루엔자(H1N1) 진단 키트.
  7. 제5항에 있어서, 상기 액상 검체는 사람의 코 또는 인후 분비물인 것인, 신종 인플루엔자(H1N1) 진단 키트.
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