KR20160005020A - 개선된 분석 방법 - Google Patents

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KR20160005020A
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아나히트 아그반얀
엘리 엔. 글레저
존 켄튼
조지 시갈
마틴 스텐젤린
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메소 스케일 테크놀러지즈, 엘엘시
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Abstract

본 발명은 결합 분석에서 결합 특이성 및 성능을 개선하는 방법에 관한 것이다.

Description

개선된 분석 방법{IMPROVED ASSAY METHODS}
관련 출원의 교차참조
2013년 3월 13일자로 출원된 미국 가출원 제61/779,050호 및 2013년 12월 23일자로 출원된 미국 가출원 제61/919,887호(각각의 개시내용은 전체로서 본원에 참고로 도입됨)를 참조한다.
발명의 분야
본 발명은 면역분석을 수행하는 개선된 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 면역분석에서 신호를 증폭하고 이 방법에서 사용된 면역분석 복합체를 고착시키도록 디자인된다.
샘플에서 관심있는 분석물의 민감한 측정을 위해 결합 반응, 예를 들면, 항원-항체 반응, 핵산 혼성화 및 수용체-리간드 반응을 이용하는 기법들에 대한 방대한 문헌들이 발표되어 왔다. 많은 생화학적 결합 시스템에서 고도의 특이성은 기초 연구, 인간 및 수의학 진단, 환경 모니터링 및 산업적 검사를 포함하는 다양한 상업적 분야에서 가치있는 많은 분석 방법들 및 시스템들에 이르게 하였다. 관심있는 분석물의 존재는 결합 반응에의 분석물의 참여를 직접적으로 측정함으로써 측정될 수 있다. 일부 방법들에서, 이 참여는 하나 이상의 결합 물질에 부착된 관찰가능한 표지의 측정을 통해 표시될 수 있다.
샌드위치 면역분석 포맷(format)이 많은 적용분야에서 뛰어난 민감성 및 특이성을 제공하지만, 일부 분석물들은 통상적인 면역분석 기법에 의해 검출되기에는 너무 낮은 농도로 존재한다. 샌드위치 면역분석의 성능은 검출 항체의 비-특이적 결합 및 높은 해리속도 항체를 포함하는 샌드위치 복합체의 불안정성에 의해 제한될 수도 있다. 그러나, 민감성 및 특이성을 개선하기 위해 통상적인 면역분석 기법을 변경시키고자 하는 노력은 분석의 민감성 및 특이성에 크게 영향을 미칠 수 있는 각각의 단계에서의 비효율성에 의해 방해될 수 있는 보다 더 복잡한 노동 집약적인 프로토콜을 종종 초래한다. 예를 들면, 다수의 결합 사건들 및/또는 반응들을 요구하는 복잡한 분석에서, 어느 한 사건 또는 반응이 최적 미만인 경우, 전체 분석의 민감성 및 특이성은 나빠질 수 있다. 민감성을 개선하고 비-특이적 결합을 감소시키고 샌드위치 복합체의 안정성을 개선함으로써 샌드위치 면역분석 성능을 개선하는 신규 기법이 필요하다.
본 발명은 하기 구체적인 실시양태들을 예상한다. 당업자는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본원에 기재된 실시양태들에 대한 다양한 변형, 추가 및 변경을 만들 수 있다. 이러한 변형, 추가 및 변경은 하기 특허청구범위 내에 속한다.
실시양태 (1): 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 방법으로서, 상기 분석물을 (i) 고착 시약(anchoring reagent)과 분석물에 대한 포획 시약(capture reagent)을 포함하는 표면 상의 포획 시약, 및 (ii) 핵산 프로브에 연결된, 분석물에 대한 검출 시약에 결합시킴으로써, 상기 포획 시약, 상기 분석물 및 상기 검출 시약을 포함하는 복합체를 상기 표면 상에 형성하는 단계; 상기 프로브를 연장하여, 상기 고착 시약에 결합하는 고착 영역을 포함하는 연장된 서열을 형성하는 단계; 상기 연장된 서열을 상기 고착 시약에 결합시키는 단계; 및 상기 표면에 결합된 연장된 서열의 양을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 (1)에서, 포획 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐(hapten), 에피토프, 미미토프(mimitope) 또는 앱타머(aptamer)일 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 포획 시약은 항체이다. 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머일 수 있고, 구체적인 실시양태에서 검출 시약은 항체이다. 실시양태 (1)의 한 구체적인 예에서, 포획 시약 및 검출 시약은 분석물에 대한 항체이다. 고착 시약은 올리고뉴클레오티드 서열, 앱타머, 앱타머 리간드, 항체, 항원, 리간드, 수용체, 햅텐, 에피토프 또는 미메토프를 포함하고, 임의적으로 고착 영역은 앱타머를 포함할 수 있고 고착 시약은 앱타머 리간드를 포함할 수 있다. 고착 영역은 핵산 서열을 포함할 수 있고, 고착 시약은 DNA 결합 단백질을 포함할 수 있다. 고착 시약은 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 고착 시약은 상보적 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 고착 영역은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
실시양태 (1)의 결합 단계는 고착 영역과 고착 시약 사이에 삼중 나선을 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 결합 단계 전에 고착 영역을 변성시켜 단일 가닥 서열을 노출시키는 단계; 결합 단계 전에 고착 영역을 헬리카제(helicase) 활성에 노출시키는 단계; 및/또는 결합 단계 전에 고착 영역을 뉴클레아제(nuclease) 처리에 노출시키는 단계를 추가로 포함할 수도 있다. 이 실시양태에서, 고착 영역은 하나 이상의 햅텐-변경된 염기를 포함할 수 있고, 고착 시약은 상기 햅텐에 대해 특이적인 하나 이상의 항체를 포함할 수 있고/있거나; 고착 영역은 하나 이상의 리간드-변경된 염기를 포함할 수 있고 고착 시약은 상기 리간드에 대해 특이적인 하나 이상의 수용체를 포함할 수 있다. 연장된 서열은 하나 이상의 검출 서열을 추가로 포함할 수 있고, 측정 단계는 연장된 서열을 하나 이상의 검출 서열에 상보적인 복수의 표지된 프로브들과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있고/있거나; 연장된 서열은 하나 이상의 변경된 염기를 포함할 수 있고, 측정 단계는 연장된 서열을 하나 이상의 변경된 염기에 결합할 수 있는 복수의 검출가능한 모이어티들(moieties)과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있고/있거나; 연장된 서열은 하나 이상의 표지된 염기를 포함할 수 있고, 측정 단계는 하나 이상의 표지된 염기의 존재를 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 실시양태에서, 하나 이상의 변경된 염기는 앱타머, 앱타머 리간드, 항체, 항원, 리간드, 수용체, 햅텐, 에피토프 또는 미메토프를 포함하고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 하나 이상의 변경된 염기의 결합 파트너 및 검출가능한 표지를 포함한다. 하나 이상의 변경된 염기는 스트렙타비딘을 포함할 수 있고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 바이오틴 및 검출가능한 표지를 포함하고/하거나; 하나 이상의 변경된 염기는 바이오틴을 포함할 수 있고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 스트렙타비딘 및 검출가능한 표지를 포함하고/하거나; 하나 이상의 변경된 염기는 아비딘을 포함할 수 있고 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 바이오틴 및 검출가능한 표지를 포함하고/하거나; 하나 이상의 변경된 염기는 바이오틴을 포함할 수 있고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 아비딘 및 검출가능한 표지를 포함한다.
실시양태 (1)의 제1 단계는 분석물을 하기 순서로 하기 종들: (i) 표면 상의 포획 시약, 및 (ii) 분석물에 대한 검출 시약에 결합시키는 단계를 포함할 수 있거나; 실시양태 (1)의 제1 단계는 분석물을 하기 순서로 하기 종들: (i) 분석물에 대한 검출 시약, 및 (ii) 표면 상의 포획 시약에 결합시키는 단계를 포함할 수 있고/있거나; 제1 단계는 분석물을 동시에 또는 실질적으로 동시에 하기 종들: (i) 표면 상의 포획 시약, 및 (ii) 분석물에 대한 검출 시약에 결합시키는 단계를 포함할 수 있다.
실시양태 (1)의 연장 단계는 프로브를 주형 핵산 서열에 결합시키고 상기 프로브를 중합효소 연쇄 반응으로 연장하는 단계; 및/또는 프로브를 주형 핵산 서열에 결합시켜 환형 핵산 주형을 형성하고 환형 주형을 롤링 서클(rolling circle) 증폭으로 연장하는 단계를 포함할 수 있다. 이 실시양태에서, 연장된 프로브는 프로브 연장 후 표면 상에 위치한 상태로 남아있을 수 있다. 따라서, 복합체는 연장 단계 후 표면에 결합된 상태로 남아있을 수 있고, 예를 들면, 연장된 프로브는 표면 상의 복합체 위치의 10 내지 100 ㎛ 이내의 위치에서 고착 시약에 결합된다.
실시양태 (1)의 연장 단계는 PCR(중합효소 연쇄 반응), LCR(리가제(Ligase) 연쇄 반응), SDA(가닥 치환 증폭), 3SR(자체-지속 합성 반응) 또는 등온 증폭 방법을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 연장 단계는 등온 증폭 방법, 예를 들면, 헬리카제 의존적 증폭 또는 롤링 서클 증폭(RCA)을 포함할 수 있다.
실시양태 (1)에서 언급된 표면은 입자 및/또는 멀티-웰 플레이트의 웰을 포함할 수 있다. 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 상기 표면 상의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치한다. 표면이 플레이트의 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 웰 내의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치하고/하거나; 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상의 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 한 실시양태에서, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 웰 내의 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상에서 10 내지 100 nm 이내에 존재할 수 있다. 표면은 전극을 포함할 수 있고, 측정 단계는 전압 파형을 전극에 인가하여 전기화학발광 신호를 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 임의적으로 상기 방법은 전극 상에 입자를 수집하는 단계 및 전압 파형을 상기 전극에 인가하여 전기화학발광 신호를 생성하는 단계를 포함한다.
실시양태 (1)의 측정 단계는 연장된 서열을 검출가능한 표지를 갖는 검출 프로브에 결합시키는 단계; 상기 검출가능한 표지를 측정하는 단계; 및 측정치를 샘플 중의 분석물의 양과 상호관련시키는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 이때 상기 검출 프로브는 연장된 서열의 영역에 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 검출가능한 표지는 광 산란, 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생체발광, 인광, 방사성, 자기장 또는 이들의 조합의 측정에 의해 측정될 수 있다. 실시양태 (1)의 구체적인 예에서, 검출가능한 표지는 ECL 표지이고, 측정 단계는 ECL 신호를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
실시양태 (2): 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 키트로서, 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획 내에 (a) (i) 분석물에 대한 포획 시약 및 (ii) 고착 시약을 포함하는 표면; 및 (b) 핵산 프로브에 연결된, 분석물에 대한 검출 시약을 포함하는 키트.
실시양태 (2)의 고착 시약은 올리고뉴클레오티드 서열, 앱타머, 앱타머 리간드, 항체, 항원, 리간드, 수용체, 햅텐, 에피토프 또는 미메토프를 포함할 수 있고, 포획 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머를 포함할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 포획 시약은 항체를 포함할 수 있고/있거나, 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머를 포함할 수 있다. 상기 키트의 구체적인 실시양태에서, 검출 시약은 항체이다.
실시양태 (2)의 키트의 표면은 입자 및/또는 멀티-웰 플레이트의 웰을 포함할 수 있다. 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치한다. 키트의 표면이 웰의 플레이트인 경우, 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 웰 내의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치하고/하거나; 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상의 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 키트의 구체적인 예에서, 표면은 웰이고, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 웰 내의 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상에서 10 내지 100 nm 이내에 존재할 수 있다. 나아가, 키트의 표면은 전극을 포함할 수 있다.
실시양태 (3): 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 방법으로서, (a) 상기 분석물을 (i) 고착 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 고착 시약과 분석물에 대한 포획 시약을 포함하는 표면 상의 포획 시약, 및 (ii) 핵산 프로브에 연결된, 분석물에 대한 검출 시약에 결합시킴으로써, 상기 포획 시약, 상기 분석물 및 상기 검출 시약을 포함하는 복합체를 상기 표면 상에 형성하는 단계; (b) 상기 프로브를 연장하여, 고착 서열에 상보적인 고착 서열 상보체를 포함하는 연장된 서열을 형성하는 단계; (c) 상기 고착 서열을 고착 서열 상보체에 혼성화시키는 단계; 및 (d) 상기 표면에 결합된 연장된 서열의 양을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 (3)에서, 포획 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머일 수 있고, 구체적인 예에서 포획 시약은 항체이다. 마찬가지로, 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머이고, 실시양태 (3)의 구체적인 예에서 검출 시약은 항체이다. 실시양태 (3)의 한 예에서, 포획 시약 및 검출 시약은 분석물에 대한 항체이다. 고착 올리고뉴클레오티드 서열은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 연장된 서열은 하나 이상의 검출 서열을 추가로 포함할 수 있고, 측정 단계는 연장된 서열을 하나 이상의 검출 서열에 상보적인 복수의 표지된 프로브들과 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있고; 대안적으로 또는 추가로, 연장된 서열은 하나 이상의 변경된 염기를 추가로 포함할 수 있고, 측정 단계는 연장된 서열을 하나 이상의 변경된 염기에 결합할 수 있는 복수의 검출가능한 모이어티들과 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 구체적인 예에서, 연장된 서열은 하나 이상의 표지된 염기를 추가로 포함할 수 있고, 측정 단계는 하나 이상의 표지된 염기의 존재를 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 하나 이상의 변경된 염기는 앱타머, 앱타머 리간드, 항체, 항원, 리간드, 수용체, 햅텐, 에피토프 또는 미메토프를 포함하고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 하나 이상의 변경된 염기의 결합 파트너 및 검출가능한 표지를 포함한다. 하나 이상의 변경된 염기는 스트렙타비딘을 포함할 수 있고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 바이오틴 및 검출가능한 표지를 포함하고/하거나; 하나 이상의 변경된 염기는 바이오틴을 포함하고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 스트렙타비딘 및 검출가능한 표지를 포함하고/하거나; 하나 이상의 변경된 염기는 아비딘을 포함하고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 바이오틴 및 검출가능한 표지를 포함하고/하거나; 하나 이상의 변경된 염기는 바이오틴을 포함하고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 아비딘 및 검출가능한 표지를 포함한다.
실시양태 (3)의 단계 (a)는 분석물을 하기 순서로 하기 종들: (i) 표면 상의 포획 시약, 및 (ii) 분석물에 대한 검출 시약에 결합시키는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 단계 (a)는 분석물을 하기 순서로 하기 종들: (i) 분석물에 대한 검출 시약, 및 (ii) 표면 상의 포획 시약에 결합시키는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 단계 (a)는 분석물을 동시에 또는 실질적으로 동시에 하기 종들: (i) 표면 상의 포획 시약, 및 (ii) 분석물에 대한 검출 시약에 결합시키는 단계를 포함할 수 있다.
실시양태 (3)의 연장 단계는 프로브를 주형 핵산 서열에 결합시키고 상기 프로브를 중합효소 연쇄 반응으로 연장하는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 연장 단계는 프로브를 주형 핵산 서열에 결합시켜 환형 핵산 주형을 형성하고 환형 주형을 롤링 서클 증폭으로 연장하는 단계를 포함할 수 있다. 연장된 프로브는 프로브 연장 후 표면 상에 위치한 상태로 남아있을 수 있고, 예를 들면, 복합체는 연장 단계 후 표면에 결합된 상태로 남아있다. 한 예에서, 연장된 프로브는 표면 상의 복합체 위치의 10 내지 100 ㎛ 이내의 위치에서 고착 시약에 결합된다. 이 구체적인 실시양태에서, 연장 단계는 PCR(중합효소 연쇄 반응), LCR(리가제 연쇄 반응), SDA(가닥 치환 증폭), 3SR(자체-지속 합성 반응) 또는 등온 증폭 방법을 포함할 수 있다. 예를 들면, 연장 단계는 등온 증폭 방법, 예를 들면, 헬리카제 의존적 증폭 또는 롤링 서클 증폭(RCA)을 포함할 수 있다.
실시양태 (3)의 표면은 입자 및/또는 멀티-웰 플레이트의 웰을 포함할 수 있다. 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 상기 표면 상의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치한다. 표면이 플레이트의 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 웰 내의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치한다. 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상의 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 표면이 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 웰 내의 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상에서 10 내지 100 nm 이내에 존재할 수 있다. 구체적인 예에서, 표면은 전극을 포함할 수 있고, 측정 단계는 전압 파형을 전극에 인가하여 전기화학발광 신호를 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 전극 상에 입자를 수집하는 단계 및 전압 파형을 상기 전극에 인가하여 전기화학발광 신호를 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 측정 단계는 연장된 서열을 검출가능한 표지를 갖는 검출 프로브에 결합시키는 단계; 상기 검출가능한 표지를 측정하는 단계; 및 측정치를 샘플 중의 분석물의 양과 상호관련시키는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 이때 상기 검출 프로브는 연장된 서열의 영역에 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 이 실시양태에서, 검출가능한 표지는 광 산란, 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생체발광, 인광, 방사성, 자기장 또는 이들의 조합의 측정에 의해 측정된다. 예를 들면, 검출가능한 표지는 ECL 표지이고, 측정 단계는 ECL 신호를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
실시양태 (4): 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 키트로서, 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획 내에 (a) (i) 분석물에 대한 포획 시약, 및 (ii) 고착 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 고착 시약을 포함하는 표면; 및 (b) 핵산 프로브에 연결된, 분석물에 대한 검출 시약을 포함하는 키트.
실시양태 (4)의 키트는 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머를 포함하는 포획 시약을 포함한다. 구체적인 예에서, 포획 시약은 항체를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머를 포함할 수 있고, 구체적으로 검출 시약은 항체를 포함할 수 있다.
실시양태 (4)의 키트는 입자 및/또는 멀티-웰 플레이트의 웰을 포함할 수 있는 표면을 포함한다. 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치한다. 표면이 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 웰 내의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치한다. 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상의 동일한 결합 도메인 상에 위치하고, 예를 들면, 표면이 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 웰 내의 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 예를 들면, 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상에서 10 내지 100 nm 이내에 존재한다. 실시양태 (4)의 표면은 전극을 포함할 수 있다.
실시양태 (5): 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 방법으로서, (a) 분석물을 (i) 고착 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 고착 시약과 분석물에 대한 포획 시약을 포함하는 표면 상의 포획 시약, (ii) 제1 핵산 프로브에 연결된, 분석물에 대한 제1 검출 시약, 및 (iii) 제2 핵산 프로브에 연결된, 분석물에 대한 제2 검출 시약에 결합시킴으로써, 결합 시약, 분석물, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약을 포함하는 복합체를 상기 표면 상에 형성하는 단계; (b) 제1 프로브 및 제2 프로브가 인접할 것을 요구하는 연장 과정을 이용하여 제2 프로브를 연장함으로써 고착 서열에 상보적인 고착 서열 상보체를 포함하는 연장된 서열을 형성하는 단계; (c) 상기 고착 서열을 상기 고착 서열 상보체에 혼성화시키는 단계; 및 (d) 상기 표면에 결합된 연장된 서열의 양을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 (5)의 포획 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머일 수 있다. 구체적인 예에서, 포획 시약은 항체이다. 마찬가지로, 제1 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머이고, 구체적인 예에서 제1 검출 시약은 항체이다. 제2 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머일 수 있고; 구체적인 예에서, 제2 검출 시약은 항체이다. 보다 구체적으로, 포획 시약, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 분석물에 대한 항체이다.
실시양태 (5)에서, 고착 올리고뉴클레오티드 서열은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이 실시양태에서, 연장된 서열은 하나 이상의 검출 서열을 추가로 포함할 수 있고, 측정 단계는 연장된 서열을 하나 이상의 검출 서열에 상보적인 복수의 표지된 프로브들과 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 연장된 서열은 하나 이상의 변경된 염기도 포함할 수 있고, 측정 단계는 연장된 서열을 하나 이상의 변경된 염기에 결합할 수 있는 복수의 검출가능한 모이어티들과 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 연장된 서열은 하나 이상의 표지된 염기를 추가로 포함할 수 있고, 측정 단계는 하나 이상의 표지된 염기의 존재를 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 하나 이상의 변경된 염기는 앱타머, 앱타머 리간드, 항체, 항원, 리간드, 수용체, 햅텐, 에피토프 또는 미메토프를 포함할 수 있고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 하나 이상의 변경된 염기의 결합 파트너 및 검출가능한 표지를 포함한다. 예를 들면, 하나 이상의 변경된 염기는 스트렙타비딘을 포함하고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 바이오틴 및 검출가능한 표지를 포함하고/하거나; 하나 이상의 변경된 염기는 바이오틴을 포함하고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 스트렙타비딘 및 검출가능한 표지를 포함하고/하거나; 하나 이상의 변경된 염기는 아비딘을 포함하고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 바이오틴 및 검출가능한 표지를 포함하고/하거나; 하나 이상의 변경된 염기는 바이오틴을 포함하고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 아비딘 및 검출가능한 표지를 포함한다.
실시양태 (5)의 단계 (a)는 분석물을 하기 순서로 하기 종들: (i) 표면 상의 포획 시약; 및 (ii) 분석물에 대한 검출 시약에 결합시키는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 단계 (a)는 분석물을 하기 순서로 하기 종들: (i) 분석물에 대한 검출 시약, 및 (ii) 표면 상의 포획 시약에 결합시키는 단계를 포함할 수 있거나; 단계 (a)는 분석물을 동시에 또는 실질적으로 동시에 하기 종들: (i) 표면 상의 포획 시약, 및 (ii) 분석물에 대한 검출 시약에 결합시키는 단계를 포함할 수 있다.
실시양태 (5)의 연장 단계는 프로브를 주형 핵산 서열에 결합시키고 상기 프로브를 중합효소 연쇄 반응으로 연장하는 단계를 포함할 수 있다. 연장 단계는 프로브를 주형 핵산 서열에 결합시켜 환형 핵산 주형을 형성하고 환형 주형을 롤링 서클 증폭으로 연장하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 연장된 프로브는 프로브 연장 후 표면 상에 위치한 상태로 남아있을 수 있고, 예를 들면, 복합체는 연장 단계 후 표면에 결합된 상태로 남아있다. 연장된 프로브는 표면 상의 복합체 위치의 10 내지 100 ㎛ 이내의 위치에서 고착 시약에 결합될 수 있다. 연장 단계는 PCR(중합효소 연쇄 반응), LCR(리가제 연쇄 반응), SDA(가닥 치환 증폭), 3SR(자체-지속 합성 반응) 또는 등온 증폭 방법을 포함할 수 있다. 구체적인 예에서, 연장 단계는 등온 증폭 방법, 예를 들면, 헬리카제 의존적 증폭 또는 롤링 서클 증폭(RCA)을 포함할 수 있다.
실시양태 (5)의 연장 과정은 단계 (a)에서 형성된 복합체를, (i) 제2 프로브에 상보적인 내부 서열 및 (ii) 제1 프로브의 비-중첩 영역에 상보적인 2개의 말단 서열들을 포함하는 연결제(connector) 서열과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 연결제 올리고뉴클레오티드의 2개의 말단 서열들을 결찰시켜 제1 프로브 및 제2 프로브 둘 다에 혼성화되는 환형 표적 서열을 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 연장 과정은 실시양태 (5)의 단계 (a)에서 형성된 복합체를, 제1 프로브의 제1 영역 및 제2 프로브의 제1 영역에 상보적인 제1 연결제 프로브 서열을 포함하는 제1 연결제 올리고뉴클레오티드 서열, 및 제1 프로브의 제2 비-중첩 영역 및 제2 프로브의 제2 비-중첩 영역에 상보적인 제2 프로브 서열을 포함하는 제2 연결제 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계; 및 임의적으로, 제1 연결제 올리고뉴클레오티드와 제2 연결제 올리고뉴클레오티드를 결찰시켜 제1 프로브 및 제2 프로브 둘 다에 혼성화되는 환형 표적 서열을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
실시양태 (5)의 표면은 입자 및/또는 멀티-웰 플레이트의 웰을 포함할 수 있다. 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치한다. 표면이 플레이트의 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 웰 내의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치한다. 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수도 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상의 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 표면이 플레이트의 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 웰 내의 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상에서 10 내지 100 nm 이내에 존재할 수 있다. 구체적인 예에서, 표면은 전극을 포함할 수 있고, 측정 단계는 전압 파형을 전극에 인가하여 전기화학발광 신호를 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 임의적으로 실시양태 (5)의 방법은 전극 상에 입자를 수집하는 단계 및 전압 파형을 전극에 인가하여 전기화학발광 신호를 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
실시양태 (5)의 측정 단계는 연장된 서열을 검출가능한 표지를 갖는 검출 프로브에 결합시키는 단계; 검출가능한 표지를 측정하는 단계; 및 측정치를 샘플 중의 분석물의 양과 상호관련시키는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 이때 검출 프로브는 연장된 서열의 영역에 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 검출가능한 표지는 광 산란, 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생체발광, 인광, 방사성, 자기장 또는 이들의 조합의 측정에 의해 측정될 수 있다. 구체적인 예에서, 검출가능한 표지는 ECL 표지이고, 측정 단계는 ECL 신호를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
실시양태 (6): 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 키트로서, 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획 내에 (a) (i) 분석물에 대한 포획 시약 및 (ii) 고착 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 고착 시약을 포함하는 표면; (b) 제1 핵산 프로브에 연결된, 분석물에 대한 제1 검출 시약; 및 (c) 제2 핵산 프로브에 연결된, 분석물에 대한 제2 검출 시약을 포함하는 키트.
실시양태 (6)의 포획 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머를 포함할 수 있고, 구체적인 예에서 포획 시약은 항체를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 제1 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머를 포함할 수 있고, 구체적인 예에서 제1 검출 시약은 항체를 포함할 수 있다. 유사하게, 제2 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머를 포함할 수 있고, 구체적인 예에서 제2 검출 시약은 항체를 포함할 수 있다.
실시양태 (6)의 표면은 입자 및/또는 멀티-웰 플레이트의 웰을 포함할 수 있다. 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치한다. 표면이 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 웰 내의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치한다. 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상의 동일한 결합 도메인 상에 위치하고/하거나; 표면이 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 웰 내의 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상에서 10 내지 100 nm 이내에 존재할 수 있다. 구체적인 예에서, 표면은 전극을 포함할 수 있다.
실시양태 (7): 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 방법으로서, (a) 상기 분석물을 (i) 고착 시약과 포획 시약을 포함하는 표면 상의 분석물에 대한 포획 시약, (ii) 제1 인접 프로브를 포함하는, 분석물에 대한 제1 검출 시약, 및 (iii) 제2 인접 프로브를 포함하는, 분석물에 대한 제2 검출 시약에 결합시킴으로써, 포획 시약, 분석물, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약을 포함하는 검출 복합체를 상기 표면 상에 형성하는 단계; (b) 단계 (a)에서 형성된 검출 복합체를, (i) 제2 인접 프로브에 상보적인 내부 서열 및 (ii) 제1 인접 프로브의 비-중첩 영역에 상보적인 2개의 말단 서열들을 포함하는 연결제 서열과 접촉시키는 단계; (c) 상기 연결제 서열을 제1 인접 프로브 및 제2 인접 프로브에 혼성화시키는 단계; (d) 연결제 올리고뉴클레오티드의 2개의 말단 서열들을 결찰시켜 제1 인접 프로브 및 제2 인접 프로브 둘 다에 혼성화되는 환형 표적 서열을 형성하는 단계; (e) 제2 인접 프로브를 표적 서열의 롤링 서클 증폭으로 연장하여, 고착 시약에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 앰플리콘(amplicon)을 생성하는 단계; (f) 상기 앰플리콘을 상기 고착 시약에 결합시키는 단계; 및 (g) 상기 표면 상의 앰플리콘의 양을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 (8): 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 방법으로서, (a) 상기 분석물을 (i) 고착 시약과 포획 시약을 포함하는 표면 상의 분석물에 대한 포획 시약, (ii) 제1 인접 프로브를 포함하는, 분석물에 대한 제1 검출 시약, 및 (iii) 제2 인접 프로브를 포함하는, 분석물에 대한 제2 검출 시약에 결합시킴으로써, 포획 시약, 분석물, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약을 포함하는 검출 복합체를 상기 표면 상에 형성하는 단계; (b) 단계 (a)에서 형성된 검출 복합체를 제1 연결제 올리고뉴클레오티드 및 제2 연결제 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계로서, 이때 (i) 제1 연결제의 제1 말단 및 제2 연결제의 제1 말단이 제1 인접 프로브의 2개의 비-중첩 영역들에 상보적이고, (ii) 제1 연결제의 제2 말단 및 제2 연결제의 제2 말단이 제1 인접 프로브의 2개의 비-중첩 영역들에 상보적인 것인 단계; (c) 제1 연결제 올리고뉴클레오티드 및 제2 연결제 올리고뉴클레오티드를 제1 인접 프로브 및 제2 인접 프로브에 혼성화시키는 단계; (d) 제1 연결제 올리고뉴클레오티드와 제2 연결제 올리고뉴클레오티드를 결찰시켜 제1 인접 프로브 및 제2 인접 프로브 둘 다에 혼성화되는 환형 표적 서열을 형성하는 단계; (e) 제2 인접 프로브를 표적 서열의 롤링 서클 증폭으로 연장하여, 고착 시약에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 앰플리콘을 생성하는 단계; (f) 상기 앰플리콘을 상기 고착 시약에 결합시키는 단계; 및 (g) 상기 표면 상의 앰플리콘의 양을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 (7) 및 (8)의 포획 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머일 수 있고, 구체적인 예에서 포획 시약은 항체이다. 유사하게, 제1 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머일 수 있고, 예를 들면, 제1 검출 시약은 항체이다. 추가로, 제2 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머이고, 예를 들면, 제2 검출 시약은 항체이다. 실시양태 (7) 및 (8)의 구체적인 예에서, 포획 시약, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 분석물에 대한 항체이다.
실시양태 (7) 및 (8)의 고착 시약은 올리고뉴클레오티드, 앱타머, 앱타머 리간드, 항체, 항원, 리간드, 수용체, 햅텐, 에피토프 또는 미메토프를 포함할 수 있다. 한 예에서, 결합 도메인은 앱타머를 포함할 수 있고, 고착 시약은 앱타머 리간드를 포함할 수 있다. 결합 도메인은 핵산 서열을 포함할 수 있고, 고착 시약은 DNA 결합 단백질을 포함할 수 있고/있거나; 고착 시약은 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 앰플리콘은 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
실시양태 (7) 및 (8)의 앰플리콘은 하나 이상의 검출 서열을 추가로 포함할 수 있고, 측정 단계는 연장된 서열을 하나 이상의 검출 서열에 상보적인 복수의 표지된 프로브들과 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 나아가, 앰플리콘은 하나 이상의 변경된 염기를 추가로 포함할 수 있고, 측정 단계는 연장된 서열을 하나 이상의 변경된 염기에 결합할 수 있는 복수의 검출가능한 모이어티들과 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 추가로, 앰플리콘은 하나 이상의 표지된 염기를 추가로 포함할 수 있고, 측정 단계는 하나 이상의 표지된 염기의 존재를 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 하나 이상의 변경된 염기는 앱타머, 앱타머 리간드, 항체, 항원, 리간드, 수용체, 햅텐, 에피토프 또는 미메토프를 포함할 수 있고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 하나 이상의 변경된 염기의 결합 파트너 및 검출가능한 표지를 포함한다. 하나 이상의 변경된 염기는 스트렙타비딘을 포함할 수 있고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 바이오틴 및 검출가능한 표지를 포함하고/하거나; 하나 이상의 변경된 염기는 바이오틴을 포함할 수 있고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 스트렙타비딘 및 검출가능한 표지를 포함하고/하거나; 하나 이상의 변경된 염기는 아비딘을 포함할 수 있고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 바이오틴 및 검출가능한 표지를 포함하고/하거나; 하나 이상의 변경된 염기는 바이오틴을 포함할 수 있고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 아비딘 및 검출가능한 표지를 포함한다.
실시양태 (7) 및 (8)의 단계 (a)는 분석물을 하기 순서로 하기 종들: (i) 표면 상의 포획 시약; 및 (ii) 분석물에 대한 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약에 결합시키는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 단계 (a)는 분석물을 하기 순서로 하기 종들: (i) 분석물에 대한 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약; 및 (ii) 표면 상의 포획 시약에 결합시키는 단계를 포함할 수 있다. 추가로, 단계 (a)는 분석물을 동시에 또는 실질적으로 동시에 하기 종들: (i) 표면 상의 포획 시약; 및 (ii) 분석물에 대한 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약에 결합시키는 단계를 포함할 수 있다.
실시양태 (7) 및 (8)의 앰플리콘은 프로브 연장 후 표면 상에 위치한 상태로 남아있을 수 있다. 복합체는 연장 단계 후 표면에 결합된 상태로 남아있을 수 있다. 예를 들면, 앰플리콘은 표면 상의 복합체 위치의 10 내지 100 ㎛ 이내의 위치에서 고착 시약에 결합된다.
실시양태 (7) 및 (8)의 표면은 입자 및/또는 멀티-웰 플레이트의 웰을 포함할 수 있다. 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 상기 표면 상의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치한다. 표면이 플레이트의 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 웰 내의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치한다. 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상의 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 표면이 플레이트의 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 웰 내의 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 구체적인 예에서, 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상에서 10 내지 100 nm 이내에 존재한다.
추가로, 표면은 전극을 포함할 수 있고, 측정 단계는 전압 파형을 전극에 인가하여 전기화학발광 신호를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 이 실시양태들((7) 및 (8))에서, 상기 방법은 전극 상에 입자를 수집하는 단계 및 전압 파형을 상기 전극에 인가하여 전기화학발광 신호를 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 측정 단계는 앰플리콘을, 검출가능한 표지를 갖는 검출 프로브에 결합시키는 단계; 상기 검출가능한 표지를 측정하는 단계; 및 측정치를 샘플 중의 분석물의 양과 상호관련시키는 단계를 포함할 수 있고, 이때 상기 검출 프로브는 앰플리콘의 영역에 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 검출가능한 표지는 광 산란, 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생체발광, 인광, 방사성, 자기장 또는 이들의 조합의 측정에 의해 측정된다. 예를 들면, 검출가능한 표지는 ECL 표지이고, 측정 단계는 ECL 신호를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
실시양태 (9): 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 키트로서, 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획 내에 (a) (i) 분석물에 대한 포획 시약, 및 (ii) 고착 시약을 포함하는 표면; (b) 제1 인접 프로브를 포함하는, 분석물에 대한 제1 검출 시약; (c) 제2 인접 프로브를 포함하는, 분석물에 대한 제2 검출 시약; 및 (d) (i) 제2 인접 프로브에 상보적인 내부 서열 및 (ii) 제1 인접 프로브의 비-중첩 영역에 상보적인 2개의 말단 서열들을 포함하는 연결제 서열을 포함하는 키트.
실시양태 (10): 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 키트로서, 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획 내에 (a) (i) 분석물에 대한 포획 시약, 및 (ii) 고착 시약을 포함하는 표면; (b) 제1 인접 프로브를 포함하는, 분석물에 대한 제1 검출 시약; (c) 제2 인접 프로브를 포함하는, 분석물에 대한 제2 검출 시약; 및 (d) (i) 제1 연결제 올리고뉴클레오티드 및 (ii) 제2 연결제 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 이때 (x) 제1 연결제의 제1 말단 및 제2 연결제의 제1 말단이 제1 인접 프로브의 2개의 비-중첩 영역들에 상보적이고 (y) 제1 연결제의 제2 말단 및 제2 연결제의 제2 말단이 제1 인접 프로브의 2개의 비-중첩 영역들에 상보적인 것인 키트.
실시양태 (9) 및 (10)의 포획 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머를 포함할 수 있다. 구체적인 예에서, 포획 시약은 항체를 포함할 수 있다. 제1 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머를 포함할 수 있고, 구체적인 예에서 제1 검출 시약은 항체를 포함할 수 있다. 제2 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머를 포함할 수 있고, 구체적인 예에서 제2 검출 시약은 항체를 포함할 수 있다.
실시양태 (9) 및 (10)의 표면은 입자 및/또는 멀티-웰 플레이트의 웰을 포함할 수 있다. 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치한다. 표면이 플레이트의 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 웰 내의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치한다. 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상의 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 표면이 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 웰 내의 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 구체적인 예에서, 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상에서 10 내지 100 nm 이내에 존재한다.
실시양태 (9) 및 (10)의 표면은 전극을 포함할 수 있다.
실시양태 (11): 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 방법으로서, (a) 상기 분석물을 (i) 고착 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 고착 시약과 포획 시약을 포함하는 표면 상의 분석물에 대한 포획 시약, (ii) 제1 인접 프로브를 포함하는, 분석물에 대한 제1 검출 시약, 및 (iii) 제2 인접 프로브를 포함하는, 분석물에 대한 제2 검출 시약에 결합시킴으로써, 포획 시약, 분석물, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약을 포함하는 검출 복합체를 상기 표면 상에 형성하는 단계; (b) 단계 (a)에서 형성된 검출 복합체를 (i) 제2 인접 프로브에 상보적인 내부 서열, (ii) 제1 인접 프로브의 비-중첩 영역에 상보적인 2개의 말단 서열들 및 (iii) 고착 서열과 일치하는 서열을 포함하는 연결제 서열과 접촉시키는 단계; (c) 상기 연결제 서열을 제1 인접 프로브 및 제2 인접 프로브에 혼성화시키는 단계; (d) 연결제 올리고뉴클레오티드의 2개의 말단 서열들을 결찰시킴으로써 제1 인접 프로브 및 제2 인접 프로브 둘 다에 혼성화되는 환형 표적 서열을 형성하는 단계; (e) 제2 인접 프로브를 표적 서열의 롤링 서클 증폭으로 연장하여, 고착 서열에 상보적인 복수의 고착 서열 상보체들을 포함하는 앰플리콘을 생성하는 단계; (f) 고착 서열을 고착 서열 상보체들 중 하나에 혼성화시키는 단계; 및 (g) 표면 상의 앰플리콘의 양을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 (12): 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 방법으로서, (a) 상기 분석물을 (i) 고착 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 고착 시약과 포획 시약을 포함하는 표면 상의 분석물에 대한 포획 시약, (ii) 제1 인접 프로브를 포함하는, 분석물에 대한 제1 검출 시약, 및 (iii) 제2 인접 프로브를 포함하는, 분석물에 대한 제2 검출 시약에 결합시킴으로써, 포획 시약, 분석물, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약을 포함하는 검출 복합체를 상기 표면 상에 형성하는 단계; (b) 단계 (a)에서 형성된 검출 복합체를 제1 연결제 올리고뉴클레오티드 및 제2 연결제 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계로서, 이때 (i) 제1 연결제의 제1 말단 및 제2 연결제의 제1 말단이 제1 인접 프로브의 2개의 비-중첩 영역들에 상보적이고, (ii) 제1 연결제의 제2 말단 및 제2 연결제의 제2 말단이 제1 인접 프로브의 2개의 비-중첩 영역들에 상보적이고, (iii) 제1 연결제 및/또는 제2 연결제가 고착 서열과 일치하는 서열도 포함하는 것인 단계; (c) 제1 연결제 올리고뉴클레오티드 및 제2 연결제 올리고뉴클레오티드를 제1 인접 프로브 및 제2 인접 프로브에 혼성화시키는 단계; (d) 제1 연결제 올리고뉴클레오티드와 제2 연결제 올리고뉴클레오티드를 결찰시켜 제1 인접 프로브 및 제2 인접 프로브 둘 다에 혼성화되는 환형 표적 서열을 형성하는 단계; (e) 제2 인접 프로브를 표적 서열의 롤링 서클 증폭으로 연장하여, 고착 서열에 상보적인 복수의 고착 서열 상보체들을 포함하는 앰플리콘을 생성하는 단계; (f) 고착 서열을 고착 서열 상보체들 중 하나에 혼성화시키는 단계; 및 (g) 표면 상의 앰플리콘의 양을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 (11) 및 (12)의 포획 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머이다. 구체적인 예에서, 포획 시약은 항체이다. 제1 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머이고, 구체적인 예에서 제1 검출 시약은 항체이다. 마찬가지로, 제2 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머이고, 구체적인 예에서 제2 검출 시약은 항체이다. 한 예에서, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 분석물에 대한 항체이다.
실시양태 (11) 및 (12)의 앰플리콘은 하나 이상의 검출 서열을 추가로 포함할 수 있고, 측정 단계는 연장된 서열을 하나 이상의 검출 서열에 상보적인 복수의 표지된 프로브들과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 나아가, 앰플리콘은 하나 이상의 변경된 염기를 포함할 수도 있고, 측정 단계는 연장된 서열을 하나 이상의 변경된 염기에 결합할 수 있는 복수의 검출가능한 모이어티들과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 앰플리콘은 하나 이상의 표지된 염기를 추가로 포함하고, 측정 단계는 하나 이상의 표지된 염기의 존재를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 하나 이상의 변경된 염기는 앱타머, 앱타머 리간드, 항체, 항원, 리간드, 수용체, 햅텐, 에피토프 또는 미메토프를 포함하고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 하나 이상의 변경된 염기의 결합 파트너 및 검출가능한 표지를 포함한다. 하나 이상의 변경된 염기는 스트렙타비딘을 포함할 수 있고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 바이오틴 및 검출가능한 표지를 포함하고/하거나; 하나 이상의 변경된 염기는 바이오틴을 포함할 수 있고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 스트렙타비딘 및 검출가능한 표지를 포함하고/하거나; 하나 이상의 변경된 염기는 아비딘을 포함할 수 있고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 바이오틴 및 검출가능한 표지를 포함하고/하거나; 하나 이상의 변경된 염기는 바이오틴을 포함할 수 있고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 아비딘 및 검출가능한 표지를 포함한다.
실시양태 (11) 및 (12)의 단계 (a)는 분석물을 하기 순서로 하기 종들: (i) 표면 상의 포획 시약; 및 (ii) 분석물에 대한 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약에 결합시키는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 단계 (a)는 분석물을 하기 순서로 하기 종들: (i) 분석물에 대한 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약; 및 (ii) 표면 상의 포획 시약에 결합시키는 단계를 포함할 수 있다. 추가로, 단계 (a)는 분석물을 동시에 또는 실질적으로 동시에 하기 종들: (i) 표면 상의 포획 시약; 및 (ii) 분석물에 대한 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약에 결합시키는 단계를 포함할 수 있다.
실시양태 (11) 및 (12)의 앰플리콘은 프로브 연장 후 표면 상에 위치한 상태로 남아있을 수 있고, 임의적으로 복합체는 연장 단계 후 표면에 결합된 상태로 남아있다. 예를 들면, 앰플리콘은 표면 상의 복합체 위치의 10 내지 100 ㎛ 이내의 위치에서 고착 시약에 결합된다.
실시양태 (11) 및 (12)의 표면은 입자 및/또는 멀티-웰 플레이트의 웰을 포함할 수 있다. 임의적으로, 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 상기 표면 상의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치한다. 표면이 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 웰 내의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치한다. 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상의 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 표면이 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 웰 내의 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상에서 10 내지 100 nm 이내에 존재할 수 있다.
실시양태 (11) 및 (12)의 표면은 전극을 포함할 수 있고, 측정 단계는 전압 파형을 전극에 인가하여 전기화학발광 신호를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 임의적으로, 실시양태 (11) 및 (12)는 전극 상에 입자를 수집하는 단계 및 전압 파형을 상기 전극에 인가하여 전기화학발광 신호를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 측정 단계는 앰플리콘을, 검출가능한 표지를 갖는 검출 프로브에 결합시키는 단계, 상기 검출가능한 표지를 측정하는 단계 및 측정치를 샘플 중의 분석물의 양과 상호관련시키는 단계를 포함할 수도 있고, 이때 상기 검출 프로브는 앰플리콘의 영역에 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 검출가능한 표지는 광 산란, 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생체발광, 인광, 방사성, 자기장 또는 이들의 조합의 측정에 의해 측정될 수 있다. 한 예에서, 검출가능한 표지는 ECL 표지이고, 측정 단계는 ECL 신호를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
실시양태 (11) 및 (12)의 샘플은 하나 이상의 분석물 분자를 포함할 수 있고, 표면은 표면 상에 위치한 복수의 해상가능한 결합 영역들에 걸쳐 분포된 하나 이상의 분석물 분자에 대한 복수의 포획 시약들을 포함할 수 있고, 상기 방법은 (x) 하나 이상의 분석물 분자를 표면 상의 하나 이상의 포획 시약에 결합시키는 단계; (y) 각각의 결합 영역에서 분석물 분자의 존재 또는 부재를 확인하는 단계; 및 (z) 분석물 분자를 함유하는 결합 영역의 수 및/또는 분석물 분자를 함유하지 않는 분석물 도메인의 수를 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 측정 단계는 표면으로부터의 광학 신호를 영상화하여 복수의 화소를 포함하는 영상, 및 상기 영상 내의 하나 이상의 화소에 대한 각각의 해상가능한 결합 영역 맵(maps)을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 해상가능한 결합 영역은 어레이의 요소일 수 있고/있거나, 상기 해상가능한 결합 영역은 개별 입자를 격리하도록 구성된다. 각각의 해상가능한 결합 영역은 100 nl 미만의 부피를 갖는 개별 나노-웰일 수 있고, 예를 들면, 이때 99% 이상의 결합 영역은 0개 또는 1개의 분석물 분자를 함유하고/하거나, 약 95% 이상의 결합 영역은 0개 또는 1개의 분석물 분자를 함유하고/하거나, 약 80% 이상의 결합 영역은 0개 또는 1개의 분석물 분자를 함유하고/하거나, 약 50% 이상의 결합 영역은 0개 또는 1개의 분석물 분자를 함유한다. 실시양태 (11) 및 (12)에서 샘플 중의 분석물 분자의 농도는 적어도 부분적으로 하나 이상의 또는 하나의 분석물 분자를 함유하는 결합 영역의 수의 보정 곡선, 포아송(Poisson) 분포 분석 및/또는 가우스(Gaussian) 분포 분석을 이용함으로써 측정될 수 있다.
실시양태 (11) 및 (12)에서, 샘플은 하나 이상의 분석물 분자를 포함할 수 있고, 표면은 분석물 분자에 대한 복수의 결합 시약들을 각각 포함하는 복수의 입자들을 포함할 수 있고, 이때 상기 복수의 입자들은 복수의 해상가능한 결합 영역들에 걸쳐 분포되어 있고, 상기 방법은 (i) 하나 이상의 분석물 분자를 표면 상의 하나 이상의 결합 시약에 결합시키는 단계, (ii) 해상가능한 결합 영역의 어레이에 걸쳐 복수의 입자들을 분포시키는 단계, 및 (iii) 분석물 분자를 함유하는 결합 영역의 수 및/또는 분석물 분자를 함유하지 않는 결합 영역의 수를 확인하기 위해 각각의 해상가능한 결합 영역에서 분석물 분자의 존재 또는 부재를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
실시양태 (13): 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 키트로서, 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획 내에 (a) (i) 분석물에 대한 포획 시약, 및 (ii) 고착 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 고착 시약을 포함하는 표면; (b) 제1 인접 프로브를 포함하는, 분석물에 대한 제1 검출 시약; (c) 제2 인접 프로브를 포함하는, 분석물에 대한 제2 검출 시약; 및 (d) (i) 제2 인접 프로브에 상보적인 내부 서열 및 (ii) 제1 인접 프로브의 비-중첩 영역에 상보적인 2개의 말단 서열들을 포함하는 연결제 서열을 포함하는 키트.
실시양태 (14): 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 키트로서, 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획 내에 (a) (i) 분석물에 대한 포획 시약, 및 (ii) 고착 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 고착 시약을 포함하는 표면; (b) 제1 인접 프로브를 포함하는, 분석물에 대한 제1 검출 시약; (c) 제2 인접 프로브를 포함하는, 분석물에 대한 제2 검출 시약; 및 (d) (i) 제1 연결제 올리고뉴클레오티드 및 (ii) 제2 연결제 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 이때 (x) 제1 연결제의 제1 말단 및 제2 연결제의 제1 말단이 제1 인접 프로브의 2개의 비-중첩 영역들에 상보적이고 (y) 제1 연결제의 제2 말단 및 제2 연결제의 제2 말단이 제1 인접 프로브의 2개의 비-중첩 영역들에 상보적인 것인 키트.
실시양태 (13) 및 (14)의 포획 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머를 포함할 수 있고, 예를 들면, 상기 포획 시약은 항체를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 제1 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머를 포함할 수 있고, 예를 들면, 상기 제1 검출 시약은 항체를 포함할 수 있다. 유사하게, 제2 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머를 포함할 수 있고, 예를 들면, 상기 제2 검출 시약은 항체를 포함할 수 있다.
실시양태 (13) 및 (14)의 표면은 입자 및/또는 멀티-웰 플레이트의 웰을 포함할 수 있다. 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 상기 표면 상의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치한다. 표면이 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 웰 내의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치한다. 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상의 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 표면이 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 웰 내의 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상에서 10 내지 100 nm 이내에 존재할 수 있고, 임의적으로 표면은 전극을 포함할 수 있다.
실시양태 (15): 샘플에서 분석물을 검출하는 방법으로서, (a) 분석물을 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약에 결합시킴으로써, 분석물, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약을 각각 포함하는 검출 복합체를 형성하는 단계로서, 이때 제1 검출 시약이 제1 검출가능한 표지를 갖고 제2 검출 시약이 제2 검출가능한 표지를 갖는 것인 단계; (b) 대다수의 반응기들이 하나 이하의 분석물을 함유하도록 복수의 반응기들에 걸쳐 분석물을 분할하는 단계; 및 (c) 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지를 함유하는 반응기의 수를 카운팅함으로써 분석물 분자의 수를 검출하는 단계를 포함할 수 있는 방법. 이 실시양태 (15)에서, 제1 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머일 수 있고, 예를 들면, 상기 제1 검출 시약은 항체이다. 마찬가지로, 제2 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머일 수 있고, 예를 들면, 상기 제2 검출 시약은 항체이다. 구체적인 예에서, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 분석물에 대한 항체이다.
실시양태 (15)의 단계 (a)는 상기 분석물 및 상기 검출 시약들을 포함하는 용액을 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 단계 (b)는 동일한 용기에서 비결합된 제1 검출 시약 및 비결합된 제2 검출 시약을 발견할 가능성이 10분의 1 미만이도록 복수의 반응기들에 걸쳐 상기 용액을 분할하는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 실시양태 (15)의 단계 (a)는 상기 분석물 및 상기 검출 시약들을 포함하는 용액을 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 단계 (b)는 동일한 용기에서 비결합된 제1 검출 시약 및 비결합된 제2 검출 시약을 발견할 가능성이 100분의 1 미만이도록 복수의 반응기들에 걸쳐 상기 용액을 분할하는 단계를 포함할 수 있다. 추가로, 실시양태 (15)의 단계 (a)는 상기 분석물 및 상기 검출 시약들을 포함하는 용액을 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 단계 (b)는 동일한 용기에서 비결합된 제1 검출 시약 및 비결합된 제2 검출 시약을 발견할 가능성이 1000분의 1 미만이도록 복수의 반응기들에 걸쳐 상기 용액을 분할하는 단계를 포함할 수 있다. 나아가, 실시양태 (15)의 단계 (a)는 상기 분석물 및 상기 검출 시약들을 포함하는 용액을 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 단계 (b)는 동일한 용기에서 비결합된 제1 검출 시약 및 비결합된 제2 검출 시약을 발견할 가능성이 10000분의 1 미만이도록 복수의 반응기들에 걸쳐 상기 용액을 분할하는 단계를 포함할 수 있다.
실시양태 (16): 샘플에서 분석물을 검출하는 방법으로서, (a) 분석물을 포획 시약, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약에 결합시킴으로써, 포획 시약, 분석물, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약을 각각 포함하는 검출 복합체를 형성하는 단계로서, 이때 (i) 상기 제1 검출 시약이 제1 검출가능한 표지를 갖고 제2 검출 시약이 제2 검출가능한 표지를 갖고, (ii) 포획 시약이 표면 상에 존재하는 것인 단계; (b) 대다수의 반응기들이 하나 이하의 분석물을 함유하도록 복수의 반응기들에 걸쳐 분석물을 분할하는 단계; 및 (c) 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지를 함유하는 반응기의 수를 카운팅함으로써 분석물 분자의 수를 검출하는 단계를 포함하는 방법. 이 실시양태에서, 포획 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머일 수 있고, 예를 들면, 포획 시약은 항체이다. 마찬가지로, 제1 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머일 수 있고, 예를 들면, 상기 제1 검출 시약은 항체이다. 나아가, 제2 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머일 수 있고, 예를 들면, 상기 제2 검출 시약은 항체이다. 예를 들면, 포획 시약, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 분석물에 대한 항체이다.
실시양태 (16)의 단계 (b)는 동일한 용기에서 비결합된 제1 검출 시약 및 비결합된 제2 검출 시약을 발견할 가능성이 10분의 1 미만이도록 복수의 반응기들에 걸쳐 상기 용액을 분할하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 나아가, 실시양태 (16)의 단계 (b)는 동일한 용기에서 비결합된 제1 검출 시약 및 비결합된 제2 검출 시약을 발견할 가능성이 100분의 1 미만이도록 복수의 반응기들에 걸쳐 상기 용액을 분할하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 실시양태 (16)의 단계 (b)는 동일한 용기에서 비결합된 제1 검출 시약 및 비결합된 제2 검출 시약을 발견할 가능성이 1000분의 1 미만이도록 복수의 반응기들에 걸쳐 상기 용액을 분할하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 추가로, 실시양태 (16)의 단계 (b)는 동일한 용기에서 비결합된 제1 검출 시약 및 비결합된 제2 검출 시약을 발견할 가능성이 10000분의 1 미만이도록 복수의 반응기들에 걸쳐 상기 용액을 분할하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
실시양태 (16)의 검출 복합체에서 포획 시약은 포획 시약을 분석물에 결합시키기 전에 표면 상에 존재할 수 있거나; 상기 검출 복합체에서 포획 시약은 포획 시약을 표면 상에 고정시키기 전에 분석물에 결합한다. 한 예에서, 포획 시약은 표적화 모이어티를 포함할 수 있고, 표면은 표적화 모이어티 상보체를 포함할 수 있다. 표적화 모이어티 및 표적화제 결합 파트너는 하기 결합 쌍들로부터 선택된다: 아비딘-바이오틴, 스트렙타비딘-바이오틴, 수용체-리간드, 항체-항원 및 핵산-핵산 상보체.
실시양태 (16)의 표면은 입자이고, 임의적으로 포획 시약은 복수의 입자들 상에 고정되고, 분석물의 분할은 분석물을 포획 시약에 결합시키고 입자를 복수의 반응기들 내로 분할함으로써 달성된다. 포획 시약은 복수의 입자들 상에 고정될 수 있고, 분석물의 분할은 입자들을 복수의 반응기들 내로 분할한 후 분석물을 포획 시약에 결합시킴으로써 달성된다.
실시양태 (16)은 복수의 입자들을 복수의 반응기들 내로 분할하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 이때 상기 복수의 입자들은 표적화 모이어티를 포함하고, 포획 시약은 표적화 모이어티 상보체를 포함하고, 분석물의 분할은 표적화 모이어티 상보체를 표적화 모이어티에 결합시킴으로써 달성된다. 실시양태 (16)은 분할 단계 전에 및/또는 분할 단계 후에 입자를 세척하는 단계를 포함할 수도 있다.
실시양태 (16)의 표면은 반응기들 중 하나 내에 위치할 수 있다. 이 실시양태에서, 포획 시약은 복수의 반응기들의 표면 상에 고정될 수 있고, 분석물의 분할은 분석물을 포획 시약에 결합시킴으로써 달성된다. 임의적으로, 반응기는 그 위에 고정된 표적화 모이어티를 갖는 표면을 갖고, 포획 시약은 표적화 모이어티 상보체를 포함하고, 분석물의 분할은 표적화 모이어티 상보체를 표적화 모이어티에 결합시킴으로써 달성된다. 이 구체적인 예에서, 상기 방법은 검출 단계 전에 반응기를 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
실시양태 (16)의 복수의 반응기들은 나노-웰의 어레이를 포함할 수 있다. 복수의 반응기들은 10,000개 이상의 반응기들을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 반응기는 100 nl 미만의 부피를 갖는다. 임의적으로, 50% 미만의 반응기들이 검출 시 분석물을 함유하고/하거나, 10% 미만의 반응기들이 검출 시 분석물을 함유하고/하거나, 1% 미만의 반응기들이 검출 시 분석물을 함유하고/하거나, 0.1% 미만의 반응기들이 검출 시 분석물을 함유한다.
실시양태 (16)의 한 양태에서, 제1 검출가능한 표지는 커플링된 효소 반응 시스템의 제1 효소이고, 제2 검출가능한 표지는 커플링된 효소 반응 시스템의 제2 효소이고, 단계 (d)는 상기 반응 시스템의 하나 이상의 기질을 첨가하는 단계, 상기 효소 반응 시스템의 생성물을 생성하는 단계 및 상기 생성물을 함유하는 반응기를 카운팅하는 단계를 포함할 수 있다. 이 실시양태에서, 상기 생성물은 제1 효소와 제2 효소가 가깝게 인접할 때에만 생성될 수 있고, 예를 들면, 제1 효소와 제2 효소는 서로 200 nM 이내에 존재하거나, 제1 효소와 제2 효소는 서로 50 nM 이내에 존재한다. 예를 들면, 제1 효소는 옥시다제(oxidase)이고, 제2 효소는 퍼록시다제(peroxidase)이고, 기질은 옥시다제 기질 및 표지된 앰플렉스 레드(Amplex Red) 또는 루미놀(luminol) 유도체를 포함한다. 이 실시양태에서, 옥시다제는 글루코스 옥시다제일 수 있고, 옥시다제 기질은 글루코스이다. 한 실시양태에서, 검출 복합체에서 제1 효소 및 제2 효소에 의해 촉매작용된 반응은 표지된 앰플렉스 레드 또는 루미놀이 표면 상에 고정되게 하고, 임의적으로 상기 방법은 표면 상의 표지된 앰플렉스 레드 또는 루미놀을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 표지된 앰플렉스 레드 또는 루미놀은 임의적으로 바이오틴-앰플렉스 레드 또는 루미놀이고, 상기 방법은 표지된 스트렙타비딘을 첨가하는 단계 및 스트렙타비딘 상의 표지를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
실시양태 (16)의 단계 (d)는 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지가 동일한 분석물 분자에 결합될 때 생성된 인접성 의존적 신호를 측정하는 단계, 및 인접성 의존적 신호를 생성하는 반응기의 수를 카운팅하는 단계를 포함할 수 있고, 예를 들면, 상기 인접성 의존적 신호는 PLA-RCA에 의해 생성된다. 예를 들면, 제1 검출가능한 표지는 FRET 공여자일 수 있고, 검출가능한 표지는 FRET 수용자이고, 인접성 의존적 신호는 FRET 공여자를 여기시키고 FRET 수용자로부터의 방사를 측정함으로써 측정된다. 한 예에서, 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지는 독립적으로 측정될 수 있다. 임의적으로, 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지는 분광성 면에서 서로 상이한 발광 표지들이다. 한 예에서, 제1 검출가능한 표지는 제1 기질과 반응하여 제1 신호를 생성하는 제1 효소이고, 제2 검출가능한 표지는 제2 기질과 반응하여 상이한 제2 신호를 생성하는 제2 효소이고, 실시양태 (16)의 단계 (d)는 제1 효소 기질 및 제2 효소 기질을 첨가하는 단계, 및 제1 신호 및 제2 신호가 생성되는 반응기의 수를 카운팅하는 단계를 포함할 수 있다. 제1 신호 및 제2 신호는 상이한 분광성을 갖는 흡광도의 변화일 수 있다. 임의적으로, 제1 신호 및 제2 신호는 상이한 분광성을 갖는 발광 신호이다. 제1 효소 및 제2 효소는 예를 들면, 포스파타제(phosphatase), 설파타제(sulfatase), 갈락토시다제(galactosidase), 글루쿠로니다제(glucuronidase) 및 이들의 조합으로부터 선택된 가수분해효소일 수 있고, 제1 기질 및 제2 기질은 포스페이트, 설페이트, 갈락토사이드 및 글루쿠로나이드-변경된 안정화된 디옥세탄, 4-메틸움벨리페릴(methylumbelliferyl), 플루오레세인(fluorescein), 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 구체적인 예에서, 제1 효소 및 제2 효소는 호스라디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase), 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase) 및 알칼리성 포스파타제(alkaline phosphatase)로부터 선택된다. 실시양태 (16)의 검출 단계는 광 산란, 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 발광, 방사성, 자기장 또는 이들의 조합을 통한 검출을 포함할 수 있다.
실시양태 (17): 샘플에서 분석물을 검출하는 키트로서, 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획 내에 (a) 제1 검출가능한 표지를 포함하는 제1 검출 시약; (b) 제2 검출가능한 표지를 포함하는 제2 검출 시약; 및 (c) 하나 이하의 분석물 분자를 함유하도록 구성된 복수의 반응기들을 포함하는 키트.
실시양태 (18): 샘플에서 분석물을 검출하는 키트로서, 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획 내에 (a) 제1 검출가능한 표지를 포함하는 제1 검출 시약; (b) 제2 검출가능한 표지를 포함하는 제2 검출 시약; (c) 포획 시약을 포함하는 표면; 및 (d) 하나 이하의 분석물 분자를 함유하도록 구성된 복수의 반응기들을 포함하는 키트.
실시양태 (17) 및 (18)의 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프, 앱타머 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 한 예에서, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 항체를 포함한다. 포획 항체는 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머를 포함할 수 있고, 예를 들면, 포획 항체는 항체를 포함할 수 있다. 한 예에서, 포획 시약은 표적화 모이어티를 포함할 수 있고, 표면은 표적화 모이어티 상보체를 포함할 수 있고, 예를 들면, 표적화 모이어티 및 표적화제 결합 파트너는 하기 결합 쌍들로부터 선택된다: 아비딘-바이오틴, 스트렙타비딘-바이오틴, 수용체-리간드, 항체-항원 및 핵산-핵산 상보체.
실시양태 (17) 및 (18)의 표면은 입자일 수 있고, 예를 들면, 포획 시약은 복수의 입자들 상에 고정된다. 대안적으로, 표면은 반응기들 중 하나 내의 위치이고, 예를 들면, 포획 시약은 복수의 반응기들의 표면 상에 고정된다. 임의적으로, 반응기는 그 위에 고정된 표적화 모이어티를 갖는 표면을 갖고, 포획 시약은 표적화 모이어티 상보체를 포함한다. 복수의 반응기들은 나노-웰의 어레이, 또는 유중수 에멀전 내에 분산된 수적(water droplets)을 포함할 수 있다. 복수의 반응기들은 10,000개 이상의 반응기들을 포함할 수 있고, 임의적으로 복수의 반응기에서 반응기는 100 nl 미만의 부피를 갖는다.
실시양태 (17) 및 (18)의 키트에서, 제1 검출가능한 표지는 커플링된 효소 반응 시스템의 제1 효소일 수 있고, 제2 검출가능한 표지는 커플링된 효소 반응 시스템의 제2 효소이고, 상기 키트는 하나 이상의 추가 바이알, 용기 또는 구획 내에 반응 시스템의 하나 이상의 기질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 제1 효소는 옥시다제이고, 제2 효소는 퍼록시다제이고, 기질은 옥시다제 기질 및 표지된 앰플렉스 레드 또는 루미놀 유도체를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 옥시다제는 글루코스 옥시다제이고, 옥시다제 기질은 글루코스이다. 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지는 인접성 의존적 시스템의 성분일 수 있고, 예를 들면, 제1 검출가능한 표지는 FRET 공여자이고, 검출가능한 표지는 FRET 수용자이다. 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지는 독립적으로 측정될 수 있다. 임의적으로, 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지는 분광성 면에서 서로 상이한 발광 표지들이다.
실시양태 (17) 및 (18)의 키트에서, 제1 검출가능한 표지는 제1 기질과 반응하여 제1 신호를 생성하는 제1 효소이고, 제2 검출가능한 표지는 제2 기질과 반응하여 상이한 제2 신호를 생성하는 제2 효소이고, 상기 키트는 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획 내에 제1 효소 기질 및 제2 효소 기질을 포함할 수 있다. 임의적으로, 제1 신호 및 제2 신호는 상이한 분광성을 갖는 흡광도의 변화이다. 한 예에서, 제1 신호 및 제2 신호는 상이한 분광성을 갖는 발광 신호이다. 제1 효소 및 제2 효소는 가수분해효소일 수 있다. 한 예에서, 제1 효소 및 제2 효소는 포스파타제, 설파타제, 갈락토시다제, 글루쿠로니다제 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 제1 기질 및 제2 기질은 포스페이트, 설페이트, 갈락토사이드 및 글루쿠로나이드-변경된 안정화된 디옥세탄, 4-메틸움벨리페릴, 플루오레세인, 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 임의적으로, 제1 효소 및 제2 효소는 호스라디쉬 퍼록시다제, 베타-갈락토시다제 및 알칼리성 포스파타제로부터 선택된다.
실시양태 (19): (a) 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 방법으로서, (a) 분석물을 포획 시약, 제1 검출가능한 표지를 갖는 제1 검출 시약 및 제2 검출가능한 표지를 갖는 제2 검출 시약에 결합시켜 복합체를 형성하는 단계로서, 이때 상기 복합체에서 포획 시약이 표면 상에 고정되는 것인 단계; (b) 제1 검출 시약과 제2 검출 시약을 교차연결하여 교차연결된 생성물을 형성하는 단계; (c) 교차연결된 생성물을 표면으로부터 용출물 내로 방출하는 단계; 및 (d) 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지 둘 다를 포함하는 개별 교차연결된 생성물을 상기 용출물에서 카운팅하는 단계를 포함하는 방법. 이 예 (19)에서, 포획 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머이고, 구체적인 예에서 포획 시약은 항체이다. 마찬가지로, 제1 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머일 수 있고, 구체적인 예에서 제1 검출 시약은 항체이다. 나아가, 제2 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머이고, 구체적으로 제2 검출 시약은 항체일 수 있다. 한 구체적인 예에서, 포획 시약, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 분석물에 대한 항체이다.
실시양태 (19)는 교차연결제를 첨가하여 제1 검출 시약과 제2 검출 시약을 교차연결하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 예를 들면, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 반응성 모이어티를 포함하고, 교차연결제는 반응성 모이어티를 연결하는 다작용성 교차연결제이다. 예를 들면, 반응성 모이어티는 아민, 티올, 하이드라지드, 알데하이드, 에스테르, 요오도아세트아미드, 말레이미드, 클릭 화학(click chemistry) 시약 및 이들의 조합을 포함한다. 교차연결제는 아민, 티올, 하이드라지드, 알데하이드, 에스테르, 요오도아세트아미드, 말레이미드, 클릭 화학 시약 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 결합 모이어티를 포함할 수 있고, 교차연결제는 결합 모이어티의 다가 결합 파트너이다. 한 예에서, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 동물 종의 항체이고, 교차연결제는 동물 종의 항체를 표적화하는 다가 항-종 항체이다. 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 바이오틴을 포함할 수 있고, 교차연결제는 스트렙타비딘이고/이거나; 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 스트렙타비딘을 포함하고, 교차연결제는 바이오틴이고/이거나; 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 스트렙타비딘에 연결되고, 교차연결제는 복수의 바이오틴 분자들을 포함하는 중합체이고/이거나; 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 각각 제1 핵산 프로브 및 제2 핵산 프로브를 포함하고, 교차연결제는 제1 핵산 프로브에 상보적인 서열 및 제2 핵산 프로브에 상보적인 별도의 서열을 포함할 수 있는 올리고뉴클레오티드이다.
실시양태 (19)의 표면은 입자, 반응기, 예를 들면, 튜브 또는 앰플을 포함할 수 있고/있거나, 상기 표면은 멀티-웰 플레이트의 웰을 포함할 수 있다. 실시양태 (19)의 방법은 입자를 수집하는 단계 및 입자를 세척하여 불순물을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 임의적으로 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지는 광 산란, 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생체발광, 인광, 방사성, 자기장 또는 이들의 조합의 측정에 의해 측정된다. 구체적인 예에서, 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지는 ECL 표지를 포함하고, 카운팅 단계는 ECL 신호를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
실시양태 (20): 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 키트로서, 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획 내에 (a) 고정된 포획 시약을 포함하는 표면; (b) 제1 검출가능한 표지를 갖는 제1 검출 시약; (c) 제2 검출가능한 표지를 갖는 제2 검출 시약; 및 (d) 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약과 반응하는 교차연결제를 포함하는 키트.
실시양태 (20)의 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 반응성 모이어티를 포함할 수 있고, 교차연결제는 반응성 모이어티를 연결하는 다작용성 교차연결제이다. 반응성 모이어티는 아민, 티올, 하이드라지드, 알데하이드, 에스테르, 요오도아세트아미드, 말레이미드, 클릭 화학 시약 및 이들의 조합을 포함할 수 있고; 교차연결제는 아민, 티올, 하이드라지드, 알데하이드, 에스테르, 요오도아세트아미드, 말레이미드, 클릭 화학 시약 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 실시양태 (20)의 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 결합 모이어티를 포함할 수 있고, 교차연결제는 결합 모이어티의 다가 결합 파트너이고, 예를 들면, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 동물 종의 항체이고, 교차연결제는 동물 종의 항체를 표적화하는 다가 항-종 항체이고; 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 바이오틴을 포함하고, 교차연결제는 스트렙타비딘이고/이거나; 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 스트렙타비딘을 포함하고, 교차연결제는 바이오틴이고/이거나; 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 스트렙타비딘에 연결되고, 교차연결제는 복수의 바이오틴 분자들을 포함하는 중합체이고/이거나; 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 각각 제1 핵산 프로브 및 제2 핵산 프로브를 포함하고, 교차연결제는 제1 핵산 프로브에 상보적인 서열 및 제2 핵산 프로브에 상보적인 별도의 서열을 포함할 수 있다.
실시양태 (20)의 표면은 입자, 멀티-웰 플레이트의 웰, 반응기, 예를 들면, 튜브 또는 앰플을 포함할 수 있다. 추가로, 상기 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약은 표면 상의 상이한 결합 도메인 상에 위치한다. 표면이 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약은 웰 내의 상이한 결합 도메인 상에 위치한다. 표면은 전극을 포함할 수도 있다.
실시양태 (21): 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 방법으로서, (a) 분석물을 포획 시약, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약에 결합시켜 복합체를 형성하는 단계로서, 이때 상기 제1 검출 시약이 제1 검출가능한 표지 및 제1 핵산 프로브를 포함할 수 있고 제2 검출 시약이 제2 검출가능한 표지 및 제2 핵산 프로브를 포함할 수 있고, 상기 복합체에서 포획 시약이 표면 상에 고정되는 것인 단계; (b) (i) 제1 프로브를 제2 프로브에 혼성화시키거나, (ii) 제1 프로브 및 제2 프로브를 제1 프로브 및 제2 프로브에 상보적인 영역을 갖는 제3 핵산에 혼성화시키거나, (iii) 제1 프로브와 제2 프로브를 결찰시킴으로써 제1 검출 시약과 제2 검출 시약을 교차연결하는 단계; (c) 교차연결된 생성물을 표면으로부터 용출물 내로 방출하는 단계; 및 (d) 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지 둘 다를 포함하는 개별 교차연결된 생성물을 상기 용출물에서 카운팅하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 (21)의 포획 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머일 수 있고, 예를 들면, 포획 시약은 항체이다. 마찬가지로, 제1 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머이고, 예를 들면, 제1 검출 시약은 항체이고; 제2 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머일 수 있고, 예를 들면, 제2 검출 시약은 항체이다. 구체적인 예에서, 포획 시약, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 분석물에 대한 항체이다.
실시양태 (21)의 표면은 입자, 반응기, 예를 들면, 튜브 또는 앰플, 또는 멀티-웰 플레이트의 웰을 포함할 수 있다. 실시양태 (21)의 방법은 입자를 수집하는 단계 및 입자를 세척하여 불순물을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지는 광 산란, 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생체발광, 인광, 방사성, 자기장 또는 이들의 조합의 측정에 의해 측정될 수 있다. 구체적인 예에서, 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지는 ECL 표지를 포함하고, 카운팅 단계는 ECL 신호를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
실시양태 (22): 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 키트로서, 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획 내에 (a) 고정된 포획 시약을 포함하는 표면; (b) 제1 검출가능한 표지 및 제1 핵산 프로브를 갖는 제1 검출 시약; (c) 제2 검출가능한 표지 및 제2 핵산 프로브를 갖는 제2 검출 시약; 및 (d) 제1 핵산 프로브 및 제2 핵산 프로브에 상보적인 영역을 갖는 제3 핵산을 포함하는 키트.
실시양태 (22)의 표면은 입자, 멀티-웰 플레이트의 웰, 또는 반응기, 예를 들면, 튜브 또는 앰플을 포함할 수 있다. 상기 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약은 표면 상의 상이한 결합 도메인 상에 위치하고; 표면이 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약은 웰 내의 상이한 결합 도메인 상에 위치한다. 표면은 임의적으로 전극을 포함할 수 있다.
실시양태 (23): 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 방법으로서, (a) 상기 분석물을 포획 시약, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약에 결합시켜 복합체를 형성하는 단계로서, 이때 상기 제1 검출 시약이 제1 핵산 프로브를 포함할 수 있고 제2 검출 시약이 제2 핵산 프로브를 포함할 수 있고, 상기 복합체에서 포획 시약이 표면 상에 고정되는 것인 단계; (b) 제2 핵산 프로브를 연장하여, 검출가능한 표지를 포함하는 연장된 서열을 형성하는 단계로서, 이때 연장이 복합체에서 제1 핵산 프로브 및 제2 핵산 프로브의 공존(co-localization)에 의존하는 것인 단계; (c) 연장된 서열을 표면으로부터 용출물 내로 방출하는 단계; 및 (d) 상기 용출물에서 개별 연장된 서열을 카운팅하는 단계를 포함하는 방법. 이 실시양태에서, 포획 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머이다. 구체적인 예에서, 포획 시약은 항체이다. 마찬가지로, 제1 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머이고, 구체적인 예에서 제1 검출 시약은 항체이다. 제2 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머이고, 구체적으로 제2 검출 시약은 항체이다. 구체적인 예에서, 포획 시약, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 분석물에 대한 항체이다.
실시양태 (23)의 표면은 입자, 반응기, 예를 들면, 튜브 또는 앰플, 또는 멀티-웰 플레이트의 웰을 포함할 수 있다. 실시양태 (23)의 방법은 입자를 수집하는 단계 및 입자를 세척하여 불순물을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
실시양태 (23)의 표지는 광 산란, 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생체발광, 인광, 방사성, 자기장 또는 이들의 조합의 측정에 의해 측정될 수 있다. 구체적인 예에서, 표지는 ECL 표지를 포함할 수 있고, 카운팅 단계는 ECL 신호를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
실시양태 (23)의 연장 단계는 프로브를 주형 핵산 서열에 결합시키고 상기 프로브를 중합효소 연쇄 반응으로 연장하는 단계를 포함할 수 있다. 연장 단계는 제1 프로브를 주형 핵산 서열에 결합시켜 환형 핵산 주형을 형성하고 환형 주형을 롤링 서클 증폭으로 연장하는 단계도 포함할 수 있다. 연장 단계는 제1 프로브를 주형 핵산 서열에 결합시키고 제2 프로브를 주형 서열에 결합시키고 상기 제1 프로브와 상기 제2 프로브를 결찰시키는 단계를 포함할 수 있다. 임의적으로, 표지는 형광 표지이고, 개별 연장된 서열의 카운팅은 단일 분자 형광 검출을 포함할 수 있고, 예를 들면, 형광 상관관계 분광법 및/또는 형광 교차-상관관계 분광법을 포함할 수 있다. 단일 분자 형광 검출은 모세관을 통해 용출물을 유동시키는 단계, 광원을 모세관 내의 부피에 집중시켜 호출 대역(interrogation zone)을 생성하는 단계, 및 상기 호출 대역을 광 검출기로 관찰하여 상기 호출 대역을 통한 형광 분자의 통과를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 단일 분자 형광 검출은 모세관을 통해 용출물을 유동시키는 단계, 광원을 상기 모세관 내의 부피에 집중시켜 호출 대역을 생성하는 단계, 및 상기 호출 대역을 광 검출기로 관찰하여 상기 호출 대역을 통한 형광 분자의 통과를 검출하는 단계도 포함할 수 있다.
실시양태 (24): 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 방법으로서, (a) 분석물을 포획 시약, 제1 검출가능한 표지를 갖는 제1 검출 시약 및 제2 검출가능한 표지를 갖는 제2 검출 시약에 결합시켜 복합체를 형성하는 단계로서, 이때 상기 복합체에서 상기 포획 시약이 표면 상에 고정되는 것인 단계; (b) 고정된 포획 시약을 표면으로부터 용출물 내로 해리시켜 형성된 복합체를 상기 표면으로부터 방출하는 단계; 및 (c) 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지 둘 다를 포함하는 개별 생성물을 상기 용출물에서 카운팅하는 단계를 포함하는 방법. 이 실시양태에서, 포획 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머이고, 예를 들면, 포획 시약은 항체이고; 제1 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머이고, 예를 들면, 제1 검출 시약은 항체이고; 제2 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머이고, 예를 들면, 제2 검출 시약은 항체이고; 구체적인 예에서 포획 시약, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 분석물에 대한 항체이다.
실시양태 (24)의 표면은 입자, 반응기, 예를 들면, 튜브 또는 앰플, 또는 멀티-웰 플레이트의 웰을 포함할 수 있다. 실시양태 (24)의 방법은 입자를 수집하는 단계 및 입자를 세척하여 불순물을 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지는 광 산란, 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생체발광, 인광, 방사성, 자기장 또는 이들의 조합의 측정에 의해 측정될 수 있고, 구체적인 실시양태에서 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지는 ECL 표지를 포함하고, 카운팅 단계는 ECL 신호를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
실시양태 (25): 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 방법으로서, (a) 상기 분석물을 (i) 분석물에 대한 포획 시약을 포함하는 표면 상의 포획 시약, (ii) 제1 핵산 프로브에 연결된, 분석물에 대한 제1 검출 시약, 및 (iii) 제2 핵산 프로브에 연결된, 분석물에 대한 제2 검출 시약에 결합시킴으로써, 결합 시약, 분석물, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약을 포함하는 복합체를 상기 표면 상에 형성하는 단계; (b) 제1 프로브 및 제2 프로브가 인접할 것을 요구하는 연장 과정을 이용하여 제2 프로브를 연장하여, 연장된 서열을 형성하는 단계; 및 (c) 상기 표면에 결합된 연장된 서열의 양을 측정하는 단계를 포함하는 방법. 이 실시양태에서, 포획 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머이고, 예를 들면, 포획 시약은 항체이고; 제1 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머이고, 예를 들면, 제1 검출 시약은 항체이고; 제2 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머이고, 예를 들면, 제2 검출 시약은 항체이고; 구체적인 예에서 포획 시약, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 분석물에 대한 항체이다.
실시양태 (25)의 연장된 서열은 하나 이상의 검출 서열을 포함할 수 있고, 측정 단계는 연장된 서열을 하나 이상의 검출 서열에 상보적인 복수의 표지된 프로브들과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있고/있거나; 연장된 서열은 하나 이상의 변경된 염기를 포함할 수 있고, 측정 단계는 연장된 서열을 하나 이상의 변경된 염기에 결합할 수 있는 복수의 검출가능한 모이어티들과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있고/있거나; 연장된 서열은 하나 이상의 표지된 염기를 포함할 수 있고, 측정 단계는 하나 이상의 표지된 염기의 존재를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 하나 이상의 변경된 염기는 앱타머, 앱타머 리간드, 항체, 항원, 리간드, 수용체, 햅텐, 에피토프 또는 미메토프를 포함하고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 하나 이상의 변경된 염기의 결합 파트너 및 검출가능한 표지를 포함한다. 하나 이상의 변경된 염기는 스트렙타비딘을 포함할 수 있고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 바이오틴 및 검출가능한 표지를 포함하고/하거나; 하나 이상의 변경된 염기는 바이오틴을 포함하고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 스트렙타비딘 및 검출가능한 표지를 포함하고/하거나; 하나 이상의 변경된 염기는 아비딘을 포함하고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 바이오틴 및 검출가능한 표지를 포함하고/하거나; 하나 이상의 변경된 염기는 바이오틴을 포함하고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 아비딘 및 검출가능한 표지를 포함한다.
실시양태 (25)의 단계 (a)는 분석물을 하기 순서로 하기 종들: (i) 표면 상의 포획 시약, 및 (ii) 분석물에 대한 검출 시약에 결합시키는 단계; 분석물을 하기 순서로 하기 종들: (i) 분석물에 대한 검출 시약, 및 (ii) 표면 상의 포획 시약에 결합시키는 단계; 또는 분석물을 동시에 또는 실질적으로 동시에 하기 종들: (i) 표면 상의 포획 시약, 및 (ii) 분석물에 대한 검출 시약에 결합시키는 단계를 포함할 수 있다. 연장 단계는 프로브를 주형 핵산 서열에 결합시키고 상기 프로브를 중합효소 연쇄 반응으로 연장하는 단계; 또는 프로브를 주형 핵산 서열에 결합시켜 환형 핵산 주형을 형성하고 상기 환형 주형을 롤링 서클 증폭으로 연장하는 단계를 포함할 수 있다. 이 실시양태에서, 연장된 프로브는 프로브 연장 후 표면 상에 위치한 상태로 남아있을 수 있고, 예를 들면, 복합체는 연장 단계 후 표면에 결합된 상태로 남아있다. 연장 단계는 PCR(중합효소 연쇄 반응), LCR(리가제 연쇄 반응), SDA(단일 치환 증폭), 3SR(자체-지속 합성 반응) 또는 등온 증폭 방법을 포함할 수 있다. 구체적인 예에서, 연장 단계는 등온 증폭 방법, 예를 들면, 헬리카제 의존적 증폭 또는 롤링 서클 증폭(RCA)을 포함할 수 있다.
실시양태 (25)의 연장 과정은 단계 (a)에서 형성된 복합체를, (i) 제2 프로브에 상보적인 내부 서열 및 (ii) 제1 프로브의 비-중첩 영역들에 상보적인 2개의 말단 서열들을 포함하는 연결제 서열과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 과정은 연결제 올리고뉴클레오티드의 상기 2개의 말단 서열들을 결찰시켜 제1 프로브 및 제2 프로브 둘 다에 혼성화되는 환형 표적 서열을 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 실시양태 (25)의 연장 과정은 단계 (a)에서 형성된 복합체를, 제1 프로브의 제1 영역 및 제2 프로브의 제1 영역에 상보적인 제1 연결제 프로브 서열을 포함하는 제1 연결제 올리고뉴클레오티드 서열, 및 제1 프로브의 제2 비-중첩 영역 및 제2 프로브의 제2 비-중첩 영역에 상보적인 제2 프로브 서열을 포함하는 제2 연결제 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계도 포함할 수 있다. 상기 과정은 제1 연결제 올리고뉴클레오티드와 제2 연결제 올리고뉴클레오티드를 결찰시켜 제1 프로브 및 제2 프로브 둘 다에 혼성화되는 환형 표적 서열을 형성하는 단계도 포함할 수 있다.
실시양태 (25)의 표면은 입자 또는 멀티-웰 플레이트의 웰을 포함할 수 있다. 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약(들)은 상기 표면 상의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치한다. 표면이 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약(들)은 웰 내의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치한다. 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약(들)은 표면 상의 동일한 결합 도메인 상에 위치하고; 표면이 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약(들)은 웰 내의 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 표면은 전극을 포함할 수 있고, 측정 단계는 전압 파형을 전극에 인가하여 전기화학발광 신호를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 임의적으로 전극 상에 입자를 수집하는 단계 및 전압 파형을 상기 전극에 인가하여 전기화학발광 신호를 생성하는 단계를 포함한다. 측정 단계는 연장된 서열을 검출가능한 표지를 갖는 검출 프로브에 결합시키는 단계, 상기 검출가능한 표지를 측정하는 단계 및 측정치를 샘플 중의 분석물의 양과 상호관련시키는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 이때 상기 검출 프로브는 연장된 서열의 영역에 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 검출가능한 표지는 광 산란, 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생체발광, 인광, 방사성, 자기장 또는 이들의 조합의 측정에 의해 측정될 수 있다. 구체적인 예에서, 검출가능한 표지는 ECL 표지이고, 측정 단계는 ECL 신호를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
실시양태 (26): 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 키트로서, 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획 내에 (a) 분석물에 대한 포획 시약을 포함하는 표면; (b) 제1 핵산 프로브에 연결된, 분석물에 대한 제1 검출 시약; 및 (c) 제2 핵산 프로브에 연결된, 분석물에 대한 제2 검출 시약을 포함하는 키트.
실시양태 (26)의 포획 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머를 포함할 수 있고, 예를 들면, 포획 시약은 항체를 포함할 수 있고; 제1 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머를 포함할 수 있고, 예를 들면, 제1 검출 시약은 항체를 포함할 수 있고; 제2 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머를 포함할 수 있고, 예를 들면, 제2 검출 시약은 항체를 포함할 수 있고; 표면은 입자 및/또는 멀티-웰 플레이트의 웰을 포함할 수 있다. 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약(들)은 상기 표면 상의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치하고; 표면이 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약(들)은 웰 내의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치한다. 임의적으로, 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약(들)은 표면 상의 동일한 결합 도메인 상에 위치하고; 표면이 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약(들)은 웰 내의 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 표면은 전극을 포함할 수 있다.
실시양태 (1) 내지 (26)의 표면은 분석 용기, 예를 들면, 시험관, 큐벳(cuvette), 유동 셀, FACS 세포 분류기, 카트리지, 또는 멀티-웰 플레이트의 웰의 내부 표면을 포함할 수 있다. 상기 표면은 슬라이드, 분석 칩 또는 분석 어레이; 핀, 프로브, 비드 또는 여과 매질; 또는 측류 매질, 예를 들면, 여과 막을 포함할 수도 있다.
실시양태 (27): 하나 이상의 분석물 분자를 포함하는 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 방법으로서, (a) 상기 샘플을 표면 상에 위치한 복수의 해상가능한 결합 영역들을 포함하는 표면과 접촉시키는 단계로서, 이때 각각의 해상가능한 결합 영역이 샘플 중의 하나 이상의 분석물 분자에 대한 복수의 포획 시약들을 포함하는 것인 단계; (b) 하나 이상의 분석물 분자를 (i) 상기 표면 상의 하나 이상의 포획 시약, (ii) 제1 검출가능한 표지를 포함하는, 분석물에 대한 제1 검출 시약, 및 (iii) 제2 검출가능한 표지를 포함하는, 분석물에 대한 제2 검출 시약에 결합시킴으로써, 포획 시약, 분석물, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약을 포함하는 검출 복합체를 상기 표면 상의 해상가능한 결합 도메인 상에서 형성하는 단계로서, 이때 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지가 상이한 표지 화합물인 단계; (c) 각각의 결합 영역에서 분석물 분자의 존재 또는 부재를 확인하는 단계; 및 (d) 분석물 분자를 함유하는 결합 영역의 수 및/또는 분석물 분자를 함유하지 않는 결합 영역의 수를 확인하는 단계를 포함하는 방법. 확인 단계는 표면으로부터의 광학 신호를 영상화하여 복수의 화소를 포함하는 영상, 및 상기 영상 내의 하나 이상의 화소에 대한 각각의 해상가능한 결합 영역 맵을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 해상가능한 결합 영역은 어레이의 요소일 수 있고/있거나, 개별 입자를 격리하도록 구성될 수 있다. 각각의 해상가능한 결합 영역은 100 nl 미만의 부피를 갖는 개별 나노-웰일 수 있고/있거나, 99% 이상의 결합 영역은 0개 또는 1개의 분석물 분자를 함유하거나, 약 95% 이상의 결합 영역은 0개 또는 1개의 분석물 분자를 함유하거나, 약 80% 이상의 결합 영역은 0개 또는 1개의 분석물 분자를 함유하거나, 약 50% 이상의 결합 영역은 0개 또는 1개의 분석물 분자를 함유한다. 샘플 중의 분석물 분자의 농도는 적어도 부분적으로 하나 이상의 분석물 분자를 함유하는 결합 영역의 수의 보정 곡선, 포아송 분포 분석 및/또는 가우스 분포 분석을 이용함으로써 측정될 수 있다.
실시양태 (27)의 표면은 분석물 분자에 대한 복수의 포획 시약들을 각각 포함하는 복수의 입자들을 포함할 수 있고, 이때 상기 복수의 입자들은 복수의 해상가능한 결합 영역들에 걸쳐 분포되고, 상기 방법은 (i) 하나 이상의 분석물 분자를 표면 상의 하나 이상의 포획 시약, 및 하나 이상의 분석물 분자 각각에 대한 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약에 결합시키는 단계로서, 이때 상기 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약이 각각 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지를 포함하는 것인 단계; (ii) 복수의 입자들을 해상가능한 결합 영역의 어레이에 걸쳐 분포시키는 단계; 및 (iii) 분석물 분자를 함유하는 결합 영역의 수 및/또는 분석물 분자를 함유하지 않는 결합 영역의 수를 확인하기 위해 각각의 해상가능한 결합 영역에서 분석물 분자의 존재 또는 부재를 확인하는 단계를 포함할 수 있고, 이때 임의적으로 각각의 해상가능한 결합 영역은 100 nl 미만의 부피를 갖는 개별 나노-웰이고/이거나, 99% 이상의 결합 영역은 0개 또는 1개의 분석물 분자를 함유하고/하거나, 약 95% 이상의 결합 영역은 0개 또는 1개의 분석물 분자를 함유하고/하거나, 약 80% 이상의 결합 영역은 0개 또는 1개의 분석물 분자를 함유하고/하거나, 약 50% 이상의 결합 영역은 0개 또는 1개의 분석물 분자를 함유한다.
실시양태 (27)에서 포획 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머이고, 예를 들면, 포획 시약은 항체이고; 제1 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머이고, 예를 들면, 제1 검출 시약은 항체이고; 제2 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머이고, 예를 들면, 제2 검출 시약은 항체이다. 구체적인 예에서, 포획 시약, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 분석물에 대한 항체이다.
실시양태 (27)의 단계 (a)는 분석물을 하기 순서로 하기 종들: (i) 표면 상의 포획 시약, 및 (ii) 분석물에 대한 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약에 결합시키는 단계; 분석물을 하기 순서로 하기 종들: (i) 분석물에 대한 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약, 및 (ii) 표면 상의 포획 시약에 결합시키는 단계; 또는 분석물을 동시에 또는 실질적으로 동시에 하기 종들: (i) 표면 상의 포획 시약, 및 (ii) 분석물에 대한 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약에 결합시키는 단계를 포함할 수 있다.
실시양태 (27)의 표면은 입자 또는 멀티-웰 플레이트의 웰을 포함할 수 있다. 구체적인 예에서, 표면은 전극을 포함할 수 있고, 확인 단계는 전압 파형을 전극에 인가하여 전기화학발광 신호를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 실시양태 (27)의 방법은 전극 상에 입자를 수집하는 단계 및 전압 파형을 상기 전극에 인가하여 전기화학발광 신호를 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 제1 검출가능한 표지는 광 산란, 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생체발광, 인광, 방사성, 자기장 또는 이들의 조합의 측정에 의해 측정되고/되거나; 제2 검출가능한 표지는 광 산란, 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생체발광, 인광, 방사성, 자기장 또는 이들의 조합의 측정에 의해 측정된다. 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지는 독립적으로 측정될 수 있고, 한 예에서 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지는 분광성 면에서 서로 상이한 발광 표지이다.
실시양태 (27)의 표면은 분석 용기, 예를 들면, 시험관, 큐벳, 유동 셀, FACS 세포 분류기, 카트리지, 또는 멀티-웰 플레이트의 웰의 내부 표면을 포함할 수 있다. 상기 표면은 슬라이드, 분석 칩 또는 분석 어레이; 핀, 프로브, 비드 또는 여과 매질; 또는 측류 매질, 예를 들면, 여과 막을 포함할 수도 있다.
실시양태 (28): 하나 이상의 분석물 분자를 포함하는 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 키트로서, (a) 샘플 중의 하나 이상의 분석물 분자에 대한 복수의 포획 시약을 각각 포함하는, 표면 상에 위치한 복수의 해상가능한 결합 영역들을 포함하는 표면; (b) 제1 검출가능한 표지를 포함하는, 분석물에 대한 제1 검출 시약; 및 (c) 제2 검출가능한 표지를 포함하는, 분석물에 대한 제2 검출 시약을 포함하고, 이때 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지가 상이한 표지 화합물인 키트.
실시양태 (28)의 해상가능한 결합 영역이 어레이의 요소일 수 있고/있거나 개별 입자를 격리하도록 구성될 수 있다. 각각의 해상가능한 결합 영역은 임의적으로 100 nl 미만의 부피를 갖는 개별 나노-웰이다. 표면은 분석물 분자에 대한 복수의 포획 시약들을 각각 포함하는 복수의 입자들을 포함할 수 있고, 이때 복수의 입자들은 복수의 해상가능한 결합 영역들에 걸쳐 분포되고, 키트는 하나 이상의 분석물 분자 각각에 대한 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약을 포함할 수 있고, 이때 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 각각 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지를 포함한다.
실시양태 (28)의 포획 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머이고, 예를 들면, 포획 시약은 항체이고; 제1 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머이고, 예를 들면, 제1 검출 시약은 항체이고; 제2 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머이고, 예를 들면, 제2 검출 시약은 항체이다. 구체적인 예에서, 포획 시약, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 분석물에 대한 항체이다.
실시양태 (28)의 표면은 입자 또는 멀티-웰 플레이트의 웰을 포함할 수 있다. 구체적인 예에서, 표면은 전극을 포함할 수 있고, 확인 단계는 전압 파형을 전극에 인가하여 전기화학발광 신호를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 제1 검출가능한 표지는 광 산란, 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생체발광, 인광, 방사성, 자기장 또는 이들의 조합의 측정에 의해 측정되고/되거나; 제2 검출가능한 표지는 광 산란, 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생체발광, 인광, 방사성, 자기장 또는 이들의 조합의 측정에 의해 측정된다. 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지는 독립적으로 측정될 수 있고, 한 예에서 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지는 분광성 면에서 서로 상이한 발광 표지이다.
실시양태 (28)의 표면은 분석 용기, 예를 들면, 시험관, 큐벳, 유동 셀, FACS 세포 분류기, 카트리지, 또는 멀티-웰 플레이트의 웰의 내부 표면을 포함할 수 있다. 상기 표면은 슬라이드, 분석 칩 또는 분석 어레이; 핀, 프로브, 비드 또는 여과 매질; 또는 측류 매질, 예를 들면, 여과 막을 포함할 수도 있다.
실시양태 (29): 샘플에서 HIV p24를 검출하는 방법으로서, (a) HIV p24를 (i) 고착 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 고착 시약과 HIV p24에 대한 포획 시약을 포함하는 표면 상의 포획 시약, (ii) 제1 핵산 프로브에 연결된, HIV p24에 대한 제1 검출 시약, 및 (iii) 제2 핵산 프로브에 연결된, HIV p24에 대한 제2 검출 시약에 결합시킴으로써, 결합 시약, HIV p24, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약을 포함하는 복합체를 상기 표면 상에 형성하는 단계; (b) 제1 프로브와 제2 프로브가 인접할 것을 요구하는 연장 과정을 이용하여 제2 프로브를 연장하여, 고착 서열에 상보적인 고착 서열 상보체를 포함하는 연장된 서열을 형성하는 단계; (c) 상기 고착 서열을 상기 고착 서열 상보체에 혼성화시키는 단계; 및 (d) 상기 표면에 결합된 연장된 서열의 양을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 (29)의 포획 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머일 수 있다. 구체적인 예에서, 포획 시약은 항체이다. 마찬가지로, 제1 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머이고, 구체적인 예에서 제1 검출 시약은 항체이다. 제2 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머일 수 있고, 구체적인 예에서 제2 검출 시약은 항체이다. 보다 구체적으로, 포획 시약, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 HIV p24에 대한 항체이다.
실시양태 (29)에서, 고착 올리고뉴클레오티드 서열은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이 실시양태에서, 연장된 서열은 하나 이상의 검출 서열을 포함할 수 있고, 측정 단계는 연장된 서열을 하나 이상의 검출 서열에 상보적인 복수의 표지된 프로브들과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 연장된 서열은 하나 이상의 변경된 염기도 포함할 수 있고, 측정 단계는 연장된 서열을 하나 이상의 변경된 염기에 결합할 수 있는 복수의 검출가능한 모이어티들과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 연장된 서열은 하나 이상의 표지된 염기를 추가로 포함할 수 있고, 측정 단계는 하나 이상의 표지된 염기의 존재를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 하나 이상의 변경된 염기는 앱타머, 앱타머 리간드, 항체, 항원, 리간드, 수용체, 햅텐, 에피토프 또는 미메토프를 포함할 수 있고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 하나 이상의 변경된 염기의 결합 파트너 및 검출가능한 표지를 포함한다. 예를 들면, 하나 이상의 변경된 염기는 스트렙타비딘을 포함하고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 바이오틴 및 검출가능한 표지를 포함하고/하거나; 하나 이상의 변경된 염기는 바이오틴을 포함하고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 스트렙타비딘 및 검출가능한 표지를 포함하고/하거나; 하나 이상의 변경된 염기는 아비딘을 포함하고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 바이오틴 및 검출가능한 표지를 포함하고/하거나; 하나 이상의 변경된 염기는 바이오틴을 포함하고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 아비딘 및 검출가능한 표지를 포함한다.
실시양태 (29)의 단계 (a)는 HIV p24를 하기 순서로 하기 종들: (i) 표면 상의 포획 시약, 및 (ii) HIV p24에 대한 검출 시약에 결합시키는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 단계 (a)는 HIV p24를 하기 순서로 하기 종들: (i) HIV p24에 대한 검출 시약, 및 (ii) 표면 상의 포획 시약에 결합시키는 단계를 포함할 수 있거나; 단계 (a)는 HIV p24를 동시에 또는 실질적으로 동시에 하기 종들: (i) 표면 상의 포획 시약, 및 (ii) HIV p24에 대한 검출 시약에 결합시키는 단계를 포함할 수 있다.
실시양태 (29)의 연장 단계는 프로브를 주형 핵산 서열에 결합시키고 상기 프로브를 중합효소 연쇄 반응으로 연장하는 단계를 포함할 수 있다. 연장 단계는 프로브를 주형 핵산 서열에 결합시켜 환형 핵산 주형을 형성하고 환형 주형을 롤링 서클 증폭으로 연장하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 연장된 프로브는 프로브 연장 후 표면 상에 위치한 상태로 남아있을 수 있고, 예를 들면, 복합체는 연장 단계 후 표면에 결합된 상태로 남아있다. 연장된 프로브는 표면 상의 복합체 위치의 10 내지 100 ㎛ 이내의 위치에서 고착 시약에 결합될 수 있다. 연장 단계는 PCR(중합효소 연쇄 반응), LCR(리가제 연쇄 반응), SDA(가닥 치환 증폭), 3SR(자체-지속 합성 반응) 또는 등온 증폭 방법을 포함할 수 있다. 구체적인 예에서, 연장 단계는 등온 증폭 방법, 예를 들면, 헬리카제 의존적 증폭 또는 롤링 서클 증폭(RCA)을 포함할 수 있다.
실시양태 (29)의 연장 과정은 단계 (a)에서 형성된 복합체를, (i) 제2 프로브에 상보적인 내부 서열 및 (ii) 제1 프로브의 비-중첩 영역들에 상보적인 2개의 말단 서열들을 포함하는 연결제 서열과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 연결제 올리고뉴클레오티드의 2개의 말단 서열들을 결찰시켜 제1 프로브 및 제2 프로브 둘 다에 혼성화되는 환형 표적 서열을 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 연장 과정은 실시양태 (29)의 단계 (a)에서 형성된 복합체를, 제1 프로브의 제1 영역 및 제2 프로브의 제1 영역에 상보적인 제1 연결제 프로브 서열을 포함하는 제1 연결제 올리고뉴클레오티드 서열, 및 제1 프로브의 제2 비-중첩 영역 및 제2 프로브의 제2 비-중첩 영역에 상보적인 제2 프로브 서열을 포함하는 제2 연결제 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계; 및 임의적으로, 제1 연결제 올리고뉴클레오티드와 제2 연결제 올리고뉴클레오티드를 결찰시켜 제1 프로브 및 제2 프로브 둘 다에 혼성화되는 환형 표적 서열을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
실시양태 (29)의 표면은 입자 및/또는 멀티-웰 플레이트의 웰을 포함할 수 있다. 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치한다. 표면이 플레이트의 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 웰 내의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치한다. 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수도 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상의 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 표면이 플레이트의 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 웰 내의 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상에서 10 내지 100 nm 이내에 존재할 수 있다. 구체적인 예에서, 표면은 전극을 포함할 수 있고, 측정 단계는 전압 파형을 전극에 인가하여 전기화학발광 신호를 생성하는 단계를 포함할 수 있고, 임의적으로 실시양태 (29)의 방법은 전극 상에 입자를 수집하는 단계 및 전압 파형을 전극에 인가하여 전기화학발광 신호를 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
실시양태 (29)의 측정 단계는 연장된 서열을 검출가능한 표지를 갖는 검출 프로브에 결합시키는 단계, 검출가능한 표지를 측정하는 단계, 및 측정치를 샘플 중의 p24의 양과 상호관련시키는 단계를 포함할 수 있고, 이때 검출 프로브는 연장된 서열의 영역에 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 검출가능한 표지는 광 산란, 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생체발광, 인광, 방사성, 자기장 또는 이들의 조합의 측정에 의해 측정될 수 있다. 구체적인 예에서, 검출가능한 표지는 ECL 표지이고, 측정 단계는 ECL 신호를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
실시양태 (30): 샘플에서 HIV p24를 검출하는 키트로서, 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획 내에 (a) (i) HIV p24에 대한 포획 시약 및 (ii) 고착 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 고착 시약을 포함하는 표면; (b) 제1 핵산 프로브에 연결된, HIV p24에 대한 제1 검출 시약; 및 (c) 제2 핵산 프로브에 연결된, HIV p24에 대한 제2 검출 시약을 포함하는 키트.
실시양태 (30)의 포획 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머를 포함할 수 있고, 구체적인 예에서 포획 시약은 항체를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 제1 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머를 포함할 수 있고, 구체적인 예에서 제1 검출 시약은 항체를 포함할 수 있다. 유사하게, 제2 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머를 포함할 수 있고, 구체적인 예에서 제2 검출 시약은 항체를 포함할 수 있다.
실시양태 (30)의 표면은 입자 및/또는 멀티-웰 플레이트의 웰을 포함할 수 있다. 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치한다. 표면이 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 웰 내의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치한다. 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상의 동일한 결합 도메인 상에 위치하고/하거나; 표면이 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 웰 내의 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상에서 10 내지 100 nm 이내에 존재할 수 있다. 구체적인 예에서, 표면은 전극을 포함할 수 있다.
실시양태 (31): 샘플에서 HIV p24를 검출하는 방법으로서, (a) HIV p24를 (i) 고착 시약과 포획 시약을 포함하는 표면 상의 HIV p24에 대한 포획 시약, (ii) 제1 인접 프로브를 포함하는, HIV p24에 대한 제1 검출 시약, 및 (iii) 제2 인접 프로브를 포함하는, HIV p24에 대한 제2 검출 시약에 결합시킴으로써, 포획 시약, HIV p24, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약을 포함하는 검출 복합체를 상기 표면 상에 형성하는 단계; (b) 단계 (a)에서 형성된 검출 복합체를, (i) 제2 인접 프로브에 상보적인 내부 서열 및 (ii) 제1 인접 프로브의 비-중첩 영역에 상보적인 2개의 말단 서열들을 포함하는 연결제 서열과 접촉시키는 단계; (c) 상기 연결제 서열을 제1 인접 프로브 및 제2 인접 프로브에 혼성화시키는 단계; (d) 연결제 올리고뉴클레오티드의 2개의 말단 서열들을 결찰시켜 제1 인접 프로브 및 제2 인접 프로브 둘 다에 혼성화되는 환형 표적 서열을 형성하는 단계; (e) 제2 인접 프로브를 표적 서열의 롤링 서클 증폭으로 연장하여, 고착 시약에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 앰플리콘을 생성하는 단계; (f) 상기 앰플리콘을 상기 고착 시약에 결합시키는 단계; 및 (g) 상기 표면 상의 앰플리콘의 양을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 (32): 샘플에서 HIV p24를 검출하는 방법으로서, (a) HIV p24를 (i) 고착 시약과 포획 시약을 포함하는 표면 상의 HIV p24에 대한 포획 시약, (ii) 제1 인접 프로브를 포함하는, HIV p24에 대한 제1 검출 시약, 및 (iii) 제2 인접 프로브를 포함하는, HIV p24에 대한 제2 검출 시약에 결합시킴으로써, 포획 시약, HIV p24, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약을 포함하는 검출 복합체를 상기 표면 상에 형성하는 단계; (b) 단계 (a)에서 형성된 검출 복합체를 제1 연결제 올리고뉴클레오티드 및 제2 연결제 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계로서, 이때 (i) 제1 연결제의 제1 말단 및 제2 연결제의 제1 말단이 제1 인접 프로브의 2개의 비-중첩 영역들에 상보적이고, (ii) 제1 연결제의 제2 말단 및 제2 연결제의 제2 말단이 제1 인접 프로브의 2개의 비-중첩 영역들에 상보적인 것인 단계; (c) 제1 연결제 올리고뉴클레오티드 및 제2 연결제 올리고뉴클레오티드를 제1 인접 프로브 및 제2 인접 프로브에 혼성화시키는 단계; (d) 제1 연결제 올리고뉴클레오티드와 제2 연결제 올리고뉴클레오티드를 결찰시켜 제1 인접 프로브 및 제2 인접 프로브 둘 다에 혼성화되는 환형 표적 서열을 형성하는 단계; (e) 제2 인접 프로브를 표적 서열의 롤링 서클 증폭으로 연장하여, 고착 시약에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 앰플리콘을 생성하는 단계; (f) 상기 앰플리콘을 상기 고착 시약에 결합시키는 단계; 및 (g) 상기 표면 상의 앰플리콘의 양을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
실시양태 (31) 및 (32)의 포획 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머이고, 구체적인 예에서 포획 시약은 항체이다. 유사하게, 제1 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머이고, 예를 들면, 제1 검출 시약은 항체이다. 추가로, 제2 검출 시약은 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머이고, 예를 들면, 제2 검출 시약은 항체이다. 실시양태 (31) 및 (32)의 구체적인 예에서, 포획 시약, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 HIV p24에 대한 항체이다.
실시양태 (31) 및 (32)의 고착 시약은 올리고뉴클레오티드 서열, 앱타머, 앱타머 리간드, 항체, 항원, 리간드, 수용체, 햅텐, 에피토프 또는 미메토프를 포함할 수 있다. 한 예에서, 결합 도메인은 앱타머를 포함할 수 있고, 고착 시약은 앱타머 리간드를 포함할 수 있다. 결합 도메인은 핵산 서열을 포함할 수 있고, 고착 시약은 DNA 결합 단백질을 포함할 수 있고/있거나; 고착 시약은 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 앰플리콘은 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
실시양태 (31) 및 (32)의 앰플리콘은 하나 이상의 검출 서열을 포함할 수 있고, 측정 단계는 연장된 서열을 하나 이상의 검출 서열에 상보적인 복수의 표지된 프로브들과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 나아가, 앰플리콘은 하나 이상의 변경된 염기를 추가로 포함할 수 있고, 측정 단계는 연장된 서열을 하나 이상의 변경된 염기에 결합할 수 있는 복수의 검출가능한 모이어티들과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 추가로, 앰플리콘은 하나 이상의 표지된 염기를 추가로 포함할 수 있고, 측정 단계는 하나 이상의 표지된 염기의 존재를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 하나 이상의 변경된 염기는 앱타머, 앱타머 리간드, 항체, 항원, 리간드, 수용체, 햅텐, 에피토프 또는 미메토프를 포함할 수 있고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 하나 이상의 변경된 염기의 결합 파트너 및 검출가능한 표지를 포함한다. 하나 이상의 변경된 염기는 스트렙타비딘을 포함할 수 있고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 바이오틴 및 검출가능한 표지를 포함하고/하거나; 하나 이상의 변경된 염기는 바이오틴을 포함할 수 있고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 스트렙타비딘 및 검출가능한 표지를 포함하고/하거나; 하나 이상의 변경된 염기는 아비딘을 포함할 수 있고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 바이오틴 및 검출가능한 표지를 포함하고/하거나; 하나 이상의 변경된 염기는 바이오틴을 포함할 수 있고, 복수의 검출가능한 모이어티들은 각각 아비딘 및 검출가능한 표지를 포함한다.
실시양태 (31) 및 (32)의 단계 (a)는 HIV p24를 하기 순서로 하기 종들: (i) 표면 상의 포획 시약; 및 (ii) HIV p24에 대한 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약에 결합시키는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 단계 (a)는 HIV p24를 하기 순서로 하기 종들: (i) HIV p24에 대한 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약; 및 (ii) 표면 상의 포획 시약에 결합시키는 단계를 포함할 수 있다. 추가로, 단계 (a)는 HIV p24를 동시에 또는 실질적으로 동시에 하기 종들: (i) 표면 상의 포획 시약; 및 (ii) HIV p24에 대한 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약에 결합시키는 단계를 포함할 수 있다.
실시양태 (31) 및 (32)의 앰플리콘은 프로브 연장 후 표면 상에 위치한 상태로 남아있다. 복합체는 연장 단계 후 표면에 결합된 상태로 남아있을 수 있다. 예를 들면, 앰플리콘은 표면 상의 복합체 위치의 10 내지 100 ㎛ 이내의 위치에서 고착 시약에 결합된다.
실시양태 (31) 및 (32)의 표면은 입자 및/또는 멀티-웰 플레이트의 웰을 포함할 수 있다. 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 상기 표면 상의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치한다. 표면이 플레이트의 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 웰 내의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치한다. 표면은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상의 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 표면이 플레이트의 웰인 경우, 웰은 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함할 수 있고, 포획 시약 및 고착 시약은 웰 내의 동일한 결합 도메인 상에 위치한다. 구체적인 예에서, 포획 시약 및 고착 시약은 표면 상에서 10 내지 100 nm 이내에 존재한다.
추가로, 표면은 전극을 포함할 수 있고, 측정 단계는 전압 파형을 전극에 인가하여 전기화학발광 신호를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 이 실시양태들((31) 및 (32))에서, 상기 방법은 전극 상에 입자를 수집하는 단계 및 전압 파형을 상기 전극에 인가하여 전기화학발광 신호를 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 측정 단계는 앰플리콘을 검출가능한 표지를 갖는 검출 프로브에 결합시키는 단계, 상기 검출가능한 표지를 측정하는 단계, 및 측정치를 샘플 중의 분석물의 양과 상호관련시키는 단계를 포함할 수 있고, 이때 상기 검출 프로브는 앰플리콘의 영역에 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 검출가능한 표지는 광 산란, 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생체발광, 인광, 방사성, 자기장 또는 이들의 조합의 측정에 의해 측정된다. 예를 들면, 검출가능한 표지는 ECL 표지이고, 측정 단계는 ECL 신호를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
도 1a 내지 1c는 면역분석에서 고착 시약의 사용을 예시한다. 도 1a는 포획 시약, 관심있는 분석물, 및 핵산 프로브를 포함하는 검출 시약을 포함하는 검출 복합체에 결합하여 이 복합체를 안정화시키기 위한 고착 시약의 사용을 보여준다. 핵산 프로브는 고착 시약에 결합하도록 연장된다. 도 1b에서, 고착 시약은 검출 시약 상에서 형성되는 연장된 서열의 일부에 상보적인 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 도 1c는 핵산 프로브를 각각 포함하는 2개의 검출 시약들이 분석물을 결합시키는 데에 사용되는 구체적인 실시양태를 보여준다. 검출 시약 상의 프로브는 한 연장된 프로브와 고착 올리고뉴클레오티드 서열의 혼성화를 가능하게 하는 증폭 과정으로 처리된다.
도 2a는 고착 시약을 보유하는 표면 상에 형성된 면역복합체가 복수의 검출가능한 종들을 상기 면역복합체에 부착된 연장된 서열 내에 도입하기 위한 PLA-RCA 과정으로 처리되는 구체적인 실시양태를 보여준다. 도 2b 및 2c는 연결 올리고뉴클레오티드의 2개의 대안적 구성이다.
도 3은 올리고뉴클레오티드를 단백질에 부착시키는 한 방법을 보여준다.
도 4a는 표면에 결합된 복합체가 포획 시약, 분석물 및 2개의 검출 시약(연결제 프로브에 결찰되어 롤링 서클 증폭에 의해 증폭되는 환형 DNA 주형을 형성하는 각각 제1 인접 프로브 및 제2 인접 프로브에 부착됨) 사이에 형성되는 본 발명의 바람직한 실시양태를 예시한다. Circ-1, 서열번호 4; Circ-2, 서열번호 5; PP1, 서열번호 1(절두된 폴리-A 꼬리); PP2, 서열번호 2. 도 4a는 분석 방법이 진행될 때 형성되는 앰플리콘의 서열에 상보적인 고착 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 증폭 시약도 포함한다. 도 4b는 검출 올리고뉴클레오티드 서열, 앰플리콘의 불활성 영역, 및 제2 인접 프로브에 혼성화되는 부분 PP2를 갖는 환형 DNA 주형 Circ-1의 예시적 서열(서열번호 4)을 보여준다. 도 4c는 P1b+P1a(서열번호 1) 및 P2a+P2b(서열번호 2)에 혼성화된 Circ-1(서열번호 4) 및 Circ-2(서열번호 5)를 사용하는 실시양태를 도식적으로 보여준다.
도 5, 및 도 6a 및 6b는 롤링 서클 증폭에 의해 증폭될 수 있는 앰플리콘을 생성하는 대안적인 방법을 예시한다.
도 7은 샌드위치 복합체에서 각각의 인접 프로브의 일부가 각각의 절편(segment)에 혼성화된 짧은 RNA 가닥에 의해 일시적으로 보호되는 대안적 실시양태를 예시한다. 이 가닥은 인접 프로브들이 서로 혼성화되고 쇄가 연장되도록 효소에 의해 제거된다.
도 8은 인접 프로브들이 포획 시약 및 검출 시약에 부착되고 각각의 인접 프로브의 일부가 도 7에 대해 전술된 바와 같이 그에 혼성화된 짧은 RNA 가닥에 의해 일시적으로 보호되는 추가 실시양태를 보여준다.
도 9는 실시예 1에 기재된 방법을 이용함으로써 수행된 IL-10 분석에 대한 보정 곡선을 보여준다.
도 10a 및 10b는 고착 시약을 사용한 경우(a) 및 고착 시약을 사용하지 않은 경우(b) 형광 현미경관찰 영상을 보여준다.
도 11a는 결찰 부위 1 또는 2를 포함하는 단일 선형 연결제 올리고뉴클레오티드 서열의 구성, 및 분석에서 이 연결제들의 사용을 보여준다. Circ-1, 서열번호 4; Circ-2, 서열번호 5; 인접 프로브 1, 서열번호 1; 인접 프로브 2, 서열번호 2. 도 11b는 Circ-1과 Circ-2의 조합을 사용한 분석을, 결찰 부위 1을 갖는 단일 선형 연결제 올리고뉴클레오티드 서열 또는 결찰 부위 2를 갖는 단일 선형 연결제 올리고뉴클레오티드 서열을 사용한 분석을 비교한다.
도 12는 실시예 1 및 6에 기재된 방법을 이용함으로써 수행된 HIV p24 분석에 대한 보정 곡선을 보여준다.
도 13은 실시예 1 및 6에 기재된 방법을 이용하여 혈청전환 패널을 분석한 결과를 보여준다.
본원에서 달리 정의되어 있지 않은 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 용어 및 기술 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥이 달리 요구하지 않은 한, 단수형 용어는 복수형 용어를 포함할 것이고, 복수형 용어는 단수형 용어를 포함할 것이다. "하나" 및 "한"은 이의 하나 또는 하나 초과(즉, 하나 이상)의 문법적 목적어를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들면, "한 요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
본 발명은 (i) 표적 분석물과 분석에서 사용된 하나 이상의 분석물 결합 시약 사이에 형성된 검출 복합체를 고착시키는 단계; 및/또는 (ii) 표지된 검출 복합체로부터 신호를 증폭하는 단계를 포함하는 개선된 면역분석 방법을 포함한다. 고착은 낮은 결합 친화성 상호작용 및/또는 고분자량 표지(들) 또는 표지 부위(들)를 포함하는 복합체를 안정화시키는 데에 사용될 수 있다. 신호 증폭은 연장된 프로브를, 다수의 표지들 또는 검출 표지 부위들을 함유하는 결합 복합체에 부착시켜 각각의 개별 검출 복합체에 대한 검출가능한 신호를 증폭함으로써 달성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 다수의 표지들 또는 검출 표지 부위들을 포함하는 연장된 프로브를 검출 복합체에 부착시키는 단계, 및 상기 복합체를 표면에 고착시켜 상기 복합체가 표면 상에 보유되게 하는 단계를 포함한다. 이 변경된 분석 방법은 극도로 낮은 수의 결합 사건, 심지어 개별 분석물-결합 시약 복합체를 검출하는 데에 사용될 수 있다. 기본 방식은 면역분석으로 제한되지 않고, 다른 클래스의 결합 시약을 사용하는 결합 분석을 수행하는 데에 이용될 수 있다.
결합 분석을 개선하는 데에 이용될 수 있는 한 방법은 관심있는 분석물을 포함하는 검출 복합체를 표면에 부착시키고 상기 검출 복합체를 안정화시키기 위한 표면-결합된 고착 시약의 사용이다. 이 방식은 검출 복합체를 형성하는 시약들 사이의 낮은 결합 친화성을 극복하고/하거나 후속 프로세싱 전에 상기 복합체가 표면으로부터 해리되는 것을 방지하는 데에 이용될 수 있다. 결합 분석에서 고착 시약의 사용은 도 1a에 예시되어 있다. 표면(101)은 분석물 A에 결합하는 포획 시약(102), 및 고착 시약(103)을 포함한다. 하나 이상의 단계에서, 분석물은 포획 시약에 결합되고, 분석물은 검출 시약(104)에도 결합되고, 이때 상기 검출 시약은 핵산 프로브(105)에 연결되어 있다. 분석물은 동시에 또는 실질적으로 동시에 포획 시약 및 검출 시약에 결합될 수 있거나, 분석물은 포획 시약 및 검출 시약 각각에 순차적으로(어느 한 순서로) 결합될 수 있다. 따라서, 포획 시약, 분석물 및 검출 시약을 포함하는 복합체(106)가 표면 상에 형성된다. 프로브는 고착 시약에 결합하는 고착 영역을 포함하는 연장된 서열(107)을 형성하도록 연장된다. 연장된 서열은 고착 시약에 결합되고, 표면에 결합된 연장된 서열의 양이 측정된다.
결합 분석 분야에서 숙련된 자는 본 방법에서 사용될 수 있는 포획 시약 및 동반 결합 파트너의 범위를 용이하게 인식할 것이다. 이러한 쌍의 비-한정적 목록은 (어느 한 순서로) 수용체/리간드 쌍, 항체/항원, 천연 또는 합성 수용체/리간드 쌍, 햅텐/항체 쌍, 항원/항체 쌍, 에피토프/항체 쌍, 미미토프/항체 쌍, 앱타머/표적 분자 쌍, 혼성화 파트너, 및 인터칼레이터(intercalater)/표적 분자 쌍을 포함한다. 한 실시양태에서, 결합 분석은 관심있는 분석물에 대한 포획 시약 및/또는 검출 시약으로서 항체 또는 다른 수용체 단백질을 사용한다. 용어 "항체"는 (항체 서브유닛의 시험관내 재조합에 의해 조립된 하이브리드 항체를 비롯한) 온전한 항체 분자, 항체 단편, 및 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 재조합 단백질 구축물(예를 들면, 문헌(Porter, R. R. and Weir, R. C. J. Cell Physiol., 67 (Suppl); 51-64 (1966)) 및 문헌(Hochman, 1. Inbar, D. and Givol, D. Biochemistry 12: 1130 (1973))에 기재된 바와 같음)뿐만 아니라, 예를 들면, 검출가능한 표지의 도입에 의해 화학적으로 변경된 항체 구축물도 포함한다.
마찬가지로, 고착 시약 및 상응하는 고착 구성원 또는 영역은 임의의 적합한 결합 쌍, 예를 들면, 수용체/리간드 쌍, 항체/항원, 천연 또는 합성 수용체/리간드 쌍, 햅텐/항체 쌍, 항원/항체 쌍, 에피토프/항체 쌍, 미미토프/항체 쌍, 앱타머/표적 분자 쌍, 혼성화 파트너, 인터칼레이터/표적 분자 쌍, 및 정전기 전하에 의해 결합된 표면 및 고착 시약의 사용을 포함할 수 있다. 예를 들면, 고착 시약은 올리고뉴클레오티드 서열, 앱타머, 앱타머 리간드, 항체, 항원, 리간드, 수용체, 햅텐, 에피토프 또는 미메토프일 수 있고, 상응하는 고착 영역은 각각 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열, 앱타머 리간드, 앱타머, 항원, 항체, 수용체, 리간드 또는 항체를 포함할 수 있다. 한 구체적인 실시양태에서, 고착 영역은 올리고뉴클레오티드 서열이고, 고착 시약은 DNA 결합 단백질을 포함한다. 대안적으로, 고착 영역이 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 서열인 경우, 고착 시약은 인터칼레이터를 포함할 수 있다. 추가 실시양태에서, 고착 영역은 하나 이상의 변경된 올리고뉴클레오티드 염기를 포함할 수 있고, 상응하는 고착 시약은 고착 영역 상의 변경된 염기에 결합하는 하나 이상의 모이어티를 포함한다. 예를 들면, 변경된 염기는 햅텐 또는 리간드를 포함할 수 있고, 상응하는 고착 시약은 햅텐 또는 리간드에 대해 특이적인 각각 하나 이상의 항체 또는 리간드를 포함한다. 나아가, 고착 영역은 검출 복합체를 검출하는 데에 사용될 수 있는 복수의 표지된 뉴클레오티드 염기들을 포함할 수 있다.
도 1b에 도식화된 구체적인 실시양태에서, 표면-결합된 고착 시약은 검출 복합체를 표면에 고착시키는 데에 사용되는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 고착 올리고뉴클레오티드 서열은 검출 복합체에 부착되는 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열에 결합한다. 이 실시양태에서, 표면(108)은 분석물 A에 결합하는 포획 시약(109), 및 고착 올리고뉴클레오티드 서열(111)을 포함하는 고착 시약(110)을 포함한다. 하나 이상의 단계에서, 분석물은 포획 시약에 결합되고 분석물은 검출 시약(112)에도 결합되고, 이때 상기 검출 시약은 핵산 프로브(113)에 연결되어 있다. 도 1(a)에 대해 전술된 바와 같이, 분석물은 동시에 또는 실질적으로 동시에 포획 시약 및 검출 시약에 결합될 수 있거나, 분석물은 포획 시약 및 검출 시약 각각에 순차적으로(어느 한 순서로) 결합될 수 있다. 따라서, 결합 시약, 분석물 및 검출 시약을 포함하는 복합체(114)가 표면 상에 형성된다. 프로브는 고착 서열에 상보적인 고착 서열 상보체를 포함하는 연장된 서열(115)을 형성하도록 연장된다. 고착 서열은 고착 서열 상보체에 혼성화되고, 표면에 결합된 연장된 서열의 양이 측정된다.
검출 복합체는 예를 들면, 분석물에 대한 분석의 특이성을 향상시키기 위해 하나 이상의 검출 시약을 포함할 수 있다. 다수의 검출 시약들의 사용은 예를 들면, 검출 시약들 각각이 분석물에 인접하면 검출가능한 신호를 방사하도록 분석이 디자인된 경우, 또는 분석물에 결합된 단일 검출 시약으로부터의 신호가 분석물에 결합된 다수의 검출 시약들로부터 방사된 신호와 구별될 수 있는 경우 분석의 특이성을 향상시킬 수 있다. 이러한 분석의 한 실시양태는 도 1c에 나타나 있다. 표면(116)은 분석물 A에 결합하는 포획 시약(117), 및 고착 올리고뉴클레오티드 서열(119)을 포함하는 고착 시약(118)을 포함한다. 하나 이상의 단계에서, 분석물은 포획 시약에 결합되고, 분석물은 2개(또는 이보다 많은 수)의 검출 시약들(각각 120 및 121) 각각에 결합하고, 이때 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약 각각은 핵산 프로브(122 및 123, 각각 제1 핵산 프로브 및 제2 핵산 프로브)에 연결된다. 분석물은 동시에 또는 실질적으로 동시에, 또는 순차적인 단계적 방식으로 포획 시약 및 검출 시약에 결합될 수 있다. 따라서, 포획 시약, 분석물, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약을 포함하는 복합체(124)가 표면 상에 형성된다. 제1 프로브와 제2 프로브가 서로 인접할 것을 요구하는 연장 과정을 이용하여 제1 프로브를 연장하여, 고착 서열에 상보적인 고착 서열 상보체를 포함하는 연장된 서열(125)을 형성한다. 끝에서 두 번째 단계에서, 고착 서열은 고착 서열 상보체에 혼성화되고, 표면에 결합된 연장된 서열의 양이 측정된다.
도 1c에 도식화된 방법의 구체적인 실시양태는 도 2a에 나타나 있고, 이때 고착 시약은 검출 복합체를 표면에 부착시키는 데에 사용되고, 검출 복합체에 부착된 프로브는 고착 시약에 결합하는 연장된 영역을 생성하도록 연장된다. 이 실시양태에서, 인접 프로브에 결합된 2개의 검출 시약들을 사용하여 복합체를 검출한다. 상기 방법은 검출 시약을 연결제 서열과 연결한 후 상기 연결제 서열을 결찰시켜 환형 표적 서열을 형성하고 롤링 서클 증폭으로 증폭하여 고착 시약에 결합하는 앰플리콘을 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 표면(201)은 포획 시약(202) 및 고착 시약(203)을 포함한다. 하나 이상의 단계에서, 분석물은 포획 시약, 제1 인접 프로브(205)를 포함하는 제1 검출 시약(204), 및 제2 인접 프로브(207)를 포함하는 제2 검출 시약(206)에 결합됨으로써, 표면 상에서 검출 복합체(208)를 형성한다. 검출 복합체는 제1 인접 프로브의 비-중첩 영역에 상보적인 말단 서열 및 제2 인접 프로브의 비-중첩 영역에 상보적인 말단 서열을 각각 포함하는 2개의 연결제 서열들(209a 및 209b)과 접촉된다. 상기 연결제 서열들은 제1 인접 프로브 및 제2 인접 프로브에 혼성화되고, 연결제 올리고뉴클레오티드들의 말단 서열들은 결찰되어 제1 인접 프로브 및 제2 인접 프로브 둘 다에 혼성화되는 환형 표적 서열(210)을 형성한다. 제2 인접 프로브는 롤링 서클 혼성화에 의해 연장되어 고착 시약에 결합하는 결합 시약을 포함하는 앰플리콘을 생성하고, 표면에 결합된 앰플리콘의 양이 측정된다. 제1 인접 프로브는 제1 프로브의 연장을 방해하도록 캡핑될 수 있거나 다른 방식으로 변경될 수 있다. (대안적 실시양태에서, 제1 인접 프로브는 연장되고, 제2 인접 프로브는 연장을 방해하도록 캡핑될 수 있거나 다른 방식으로 변경될 수 있다). 도 2a에 도식화된 실시양태에서, 앰플리콘은 앰플리콘에 혼성화되고 표면에 결합된 앰플리콘의 양을 측정하는 데에 사용되는 표지된 검출 프로브에 상보적인 2개 이상의 검출 서열도 포함한다. (도 2a에 도식화되지 않은) 대안적 실시양태에서, 연장 과정은 앰플리콘에 상보적인 하나 이상의 표지된 프로브를 첨가하지 않고 표면 상에서 앰플리콘을 직접적으로 검출하는 데에 사용되는 표지된 뉴클레오티드 염기를 앰플리콘 내로 도입한다. 도 2b는 제1 연결제 올리고뉴클레오티드 및 제2 연결제 올리고뉴클레오티드(각각 209a 및 209b)를 보이는 연결제 서열들의 성분들을 개략적으로 나타내고, 이때 제1 연결제의 제1 말단(C1(E1)) 및 제2 연결제의 제1 말단(C2(E1))은 제1 인접 프로브의 2개의 비-중첩 영역들에 상보적이고, 제1 연결제의 제2 말단(C1(E2)) 및 제2 연결제의 제2 말단(C2(E2))은 제2 인접 프로브의 2개의 비-중첩 영역들에 상보적이다. 제1 연결제 및 제2 연결제는 제1 인접 프로브 및 제2 인접 프로브에 혼성화되고, 제1 연결제와 제2 연결제는 결찰되어 제1 인접 프로브 및 제2 인접 프로브 둘 다에 혼성화되는 환형 표적 서열을 형성한다.
도 2c는 연결제의 대안적 실시양태를 보여준다. 연결제 서열(211)은 제2 인접 프로브에 상보적인 내부 서열(CIS) 및 제1 인접 프로브의 비-중첩 영역들에 상보적인 2개의 말단 서열들(각각 CE1 및 CE2)을 포함한다. 이 실시양태에서, 롤링 서클 증폭을 위한 환형 표적 서열을 형성하기 위해 1개의 결찰 사건만이 필요하지만(즉, 제1 인접 프로브에 혼성화된 말단 CE1과 CE2의 결찰), 프라이밍/연장이 제2 인접 프로브로부터 비롯되기 때문에, 2개의 인접 프로브들의 인접성에 대한 요구가 유지된다. 바람직하게는, 제1 인접 프로브는 제1 프로브의 연장을 방해하도록 캡핑되거나 다른 방식으로 변경된다.
그 후, 제2 인접 프로브는 환형 표적 서열의 롤링 서클 증폭에 의해 연장되어 고착 시약에 결합하는 결합 영역을 포함하는 앰플리콘을 생성하고, 표면에 결합된 앰플리콘의 양이 측정된다.
제1 인접 프로브 및 제2 인접 프로브의 서열은 당업자에게 공지된 방법에 의해 디자인될 수 있다. 예를 들면, 각각의 프로브는 길이에 있어서 대략 20개 내지 50개의 염기, 바람직하게는 길이에 있어서 25개 내지 40개의 염기, 가장 바람직하게는 길이에 있어서 약 30개 내지 35개의 염기를 갖는다. 제1 인접 프로브 및 제2 인접 프로브는 본원에 기재된 과정에서 사용된 하나 이상의 연결제 서열 또는 이의 일부에 상보적인 서열도 포함한다. 한 실시양태에서, 검출 복합체는 제1 인접 프로브의 비-중첩 영역에 상보적인 말단 서열 및 제2 인접 프로브의 비-중첩 영역에 상보적인 말단 서열을 각각 포함하는 2개의 연결제 서열들(209a 및 209b)과 접촉된다. 따라서, 이 실시양태에서, 제1 인접 프로브 및 제2 인접 프로브는 상기 연결제들의 말단 서열에 상보적인 비-중첩 영역을 각각 포함한다. 대안적으로, 1개의 연결제만이 사용될 수 있고, 연결제 서열(211)은 제2 인접 프로브에 상보적인 내부 서열(CIS) 및 제1 인접 프로브의 비-중첩 영역에 상보적인 2개의 말단 서열들(각각 CE1 및 CE2)을 포함한다. 따라서, 이 실시양태에서, 제1 인접 프로브는 연결제의 2개의 말단 서열들(각각 CE1 및 CE2)에 상보적인 비-중첩 영역을 포함하고, 제2 인접 프로브는 연결제의 내부 서열(CIS)에 상보적인 서열을 포함한다. 제1 인접 프로브는 제1 프로브의 연장을 방해하도록 캡핑될 수 있거나 다른 방식으로 변경될 수 있다. (대안적 실시양태에서, 제1 인접 프로브는 연장되고, 제2 인접 프로브는 연장을 방해하도록 캡핑될 수 있거나 다른 방식으로 변경될 수 있다.)
따라서, 도 1 및 2에 예시된 실시양태들은 결합 분석이 고착 시약을 도입하도록 변경될 수 있고/있거나 검출 복합체로부터의 신호가 증폭될 수 있다는 것을 입증한다. 바람직한 실시양태에서, 고착 시약 및 신호 증폭 방법은 결합 분석에서 사용된다. 대안적으로, 단지 하나의 방법 또는 다른 방법이 향상된 결합 분석을 달성하는 데에 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 고착 시약이 누락되어 있는 도 1 및 2에 기재된 신호 증폭 방법을 이용하는 분석을 포함한다.
고착 시약이 표면에 직접적으로 또는 간접적으로(예를 들면, 결합 반응을 통해) 결합된 고착 서열을 포함하는 실시양태에서, 공유부착 방법 및 비-공유부착 방법을 비롯한 당분야에서 확립된 올리고뉴클레오티드 고정 방법을 이용하여 고착 시약을 생성할 수 있다. 한 실시양태에서, 고착 시약은 고착 서열에 연결된 또는 다른 방식으로 결합된 단백질을 포함한다. 이 실시양태에서, 표면 상에 (공유적으로 또는 비-공유적으로) 고정될 수 있고 고착 올리고뉴클레오티드에 의해 변경될 수 있는 임의의 단백질이 사용될 수 있다. 비-한정적 예로는 스트렙타비딘, 아비딘 또는 소 혈청 알부민(BSA)이 있다. 바람직한 실시양태에서, 고착 시약은 BSA를 포함한다. 단백질은 고착 올리고뉴클레오티드에 의해 변경될 수 있고 공지된 방법을 이용하여, 예를 들면, 도 3에 예시된 바와 같이 잘 확립된 이종이작용성 교차연결제인 설포석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(설포-SMCC)를 사용함으로써 표면에 부착될 수 있다. SMCC의 N-하이드록시석신이미드(NHS) 기와 소 혈청 알부민(BSA)의 반응은 BSA를 티올 반응성 말레이미드 기로 표지한다. 그 다음, 말레이미드 기는 티올-변경된 올리고뉴클레오티드와 반응하여 안정한 티오에테르 결합을 통해 연결된 BSA-올리고뉴클레오티드 접합체를 형성한다. 한 구체적인 예에서, 어레이는 일련의 BSA-올리고뉴클레오티드 접합체들을 흑연질 탄소 표면, 바람직하게는 스크린 인쇄된 탄소 잉크 전극 상에 인쇄함으로써 형성된다. 대안적으로, 단백질이 아비딘 또는 스트렙타비딘인 경우, 고착 서열은 바이오틴에 연결될 수 있고 바이오틴-아비딘 또는 바이오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통해 고정된 아비딘 또는 스트렙타비딘에 연결될 수 있다.
고착 시약에 부착된 고착 올리고뉴클레오티드는 연장 과정 동안 발생된 연장된 서열(또는 앰플리콘)에 혼성화될 임의의 서열일 수 있다. 고착 올리고뉴클레오티드는 표면과 상보적(혼성화) 영역 사이의 링커 서열로서 사용되어 표면으로부터 상보적 영역을 연장하는 비-상보적 영역(예를 들면, 폴리(A) 서열)도 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 인접 또는 검출 프로브("불활성" 영역)와의 결합과 관련되지 않은 앰플리콘의 영역에 대한 혼성화 서열이 선택된다. 보다 더 구체적인 실시양태에서, 앰플리콘의 불활성 영역의 전체 길이에 상보적인 혼성화 서열(바람직하게는 길이에 있어서 약 25개의 뉴클레오티드를 가짐)이 단독으로, 또는 예를 들면, 길이에 있어서 최대 30개의 뉴클레오티드를 갖는 폴리(A) 아암(arm)과 함께 포함된다. 바람직하게는, 고착 올리고뉴클레오티드는 (i) (앰플리콘의 불활성 영역에 대한 전체 길이 상보체, 길이에 있어서 25개의 뉴클레오티드)-(20개의 뉴클레오티드를 갖는 폴리(A) 아암); 및 (ii) (앰플리콘의 불활성 영역의 일부에 대한 상보체, 길이에 있어서 15개의 뉴클레오티드)-(30개의 뉴클레오티드를 갖는 폴리(A) 아암)로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 인접 결찰 증폭(PLA)을 수행하여 제2 인접 프로브를 연장한다. 도 2a 내지 2c에 대해 전술된 바와 같이, 2개의 인접 프로브들을 포함하는 복합체는 하나 이상의 연결제 올리고뉴클레오티드(209a-209b 및 211)와 접촉되고, 혼성화된 연결제 서열들의 결찰은 환형의 롤링 서클 증폭(RCA)으로 제2 인접 프로브를 연장하는 데에 사용되는 환형 올리고뉴클레오티드를 형성한다. 인접 결찰 증폭에 적합한 프로브 디자인 및 증폭 조건은 당분야에서 잘 확립되어 있다. 본 발명의 독특한 양태는 고착 시약에서 사용되는 서열과 동일한 서열이 연결제들 중 하나에 포함된다는 것이다. 제2 인접 프로브의 연장 동안, 연장된 영역은 고착 시약에 혼성화되는 고착 서열의 상보체를 포함함으로써 샌드위치 복합체를 안정화시키고 제2 인접 프로브의 해리를 방해한다. 연장된 제2 인접 프로브는 표면 상의 분석물의 양을 측정하기 위해 측정될 수 있는 검출가능한 표지를 (예를 들면, RCA 연장 반응 동안 표지된 뉴클레오티드의 포함에 의해) 함유할 수 있다. 대안적으로, 검출가능한 표지를 포함하는 복수의 표지된 프로브들이 첨가되고 연장된 제2 인접 프로브에 혼성화되고, 표면에 결합된 분석물의 양이 측정된다.
PCR(중합효소 연쇄 반응), LCR(리가제 연쇄 반응), SDA(가닥 치환 증폭), 3SR(자체-지속 합성 반응), 및 등온 증폭 방법, 예를 들면, 헬리카제 의존적 증폭 및 롤링 서클 증폭(RCA)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 적합한 증폭 기법을 이용하여 연장된 서열(또는 앰플리콘)을 생성할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, RCA는 민감성, 다중화, 동역학 범위 및 확장성의 관점에서 상당한 장점을 갖기 때문에 사용된다. RCA를 위한 기법은 당분야에서 공지되어 있다(예를 들면, 문헌(Baner et al, Nucleic Acids Research, 26:5073 5078, 1998; Lizardi et al., Nature Genetics 19:226, 1998; Schweitzer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:10113 119, 2000; Faruqi et al., BMC Genomics 2:4, 2000; Nallur et al., Nucl. Acids Res. 29:e118, 2001; Dean et al. Genome Res. 11:1095 1099, 2001; Schweitzer et al., Nature Biotech. 20:359 365, 2002); 및 미국 특허 제6,054,274호, 제6,291,187호, 제6,323,009호, 제6,344,329호 및 제6,368,801호 참조). 선형 RCA(LRCA) 및 기하급수적 RCA(ERCA)를 비롯한 RCA의 여러 상이한 변법들이 공지되어 있다. RCA는 환형 주형의 수천 카피들을 생성하고, 이때 카피들의 쇄는 원래의 표적 DNA에 부착되어 표적의 공간적 해상 및 신호의 신속한 증폭을 가능하게 한다. RCA는 (i) 단일 표적 분자의 검출; (ii) 단백질로부터의 신호, 및 DNA 및 RNA로부터의 신호의 증폭; (iii) 고체 표면 상에서 증폭된 분자의 위치의 확인; (iv) 많은 상이한 표적들의 동시적인 측정; 및 (v) 용액상 또는 고체상에서의 하나 이상의 표적의 분석을 용이하게 한다. 검출 복합체를 사용한 RNA 생성물의 공간적 위치 확인은 다중화된 결합 분석을 어레이 또는 입자-기초 포맷으로 수행할 때 특히 유리하다.
고착 시약 및 신호 증폭 과정 둘 다가 사용되는 본 발명의 구체적인 실시양태는 도 4a에 도식화되어 있다. 도 4a는 표면(401) 상에서 포획 시약(402), 분석물(403) 및 2개의 검출 시약들(304 및 305)(각각 제1 인접 프로브(406)(PP1, 서열번호 1) 및 제2 인접 프로브(407)(PP2, 서열번호 2)를 포함함) 사이에 형성된 복합체를 도식화한다. 각각 Circ-1 및 Circ-2에 혼성화되는 상기 두 인접 프로브들이 상기 복합체에 존재할 때 상기 2개의 인접 프로브들 사이에 가교를 생성하는 제1 연결제 올리고뉴클레오티드 Circ-1(408)(서열번호 4) 및 제2 연결제 올리고뉴클레오티드 Circ-2(409)(서열번호 5)가 첨가된다. 결합된 연결제 프로브들은 각각 결찰 부위 1 및 2(410 및 411)에서 결찰되어 환형 DNA 주형(412)을 형성한다. 환형 DNA 주형을 롤링 서클 증폭으로 증폭하여 제2 인접 프로브를 연장함으로써 하나 이상의 검출 서열(413) 및 고착 올리고뉴클레오티드 서열 상보체(414)(부분적 고착 서열 상보체(415)를 포함함)를 포함하는 앰플리콘을 생성한다. (포획 모이어티(417)에 부착된) 고착 올리고뉴클레오티드 서열(416)과 이의 상보체는 혼성화되고, 복수의 검출 프로브들은 복수의 검출 프로브 서열들에 혼성화되고, 표면에 결합된 분석물의 양이 측정된다(표시되어 있지 않으나, 도 1(a)에 예시되어 있음). 도 4b는 제1 인접 프로브에 혼성화되도록 디자인된 부분(PP1), 검출 올리고뉴클레오티드 서열, (고착 올리고뉴클레오티드 서열에 전체적으로 또는 부분적으로 결합하는 데에 사용될 수 있는) 앰플리콘의 불활성 영역, 및 (제2 인접 프로브에 혼성화되도록 디자인된) 부분 PP2를 갖는 제1 환형 DNA 주형 Circ-1(408)(서열번호 4)의 예시적 서열을 보여준다. (서열번호 4 및 서열번호 5의 서열들을 포함하는) 환형 DNA 주형을 롤링 서클 증폭으로 증폭하여 복수의 검출 서열들(각각 418 및 419)을 포함하는 앰플리콘을 생성하는 추가 실시양태는 도 4c에 도식화되어 있다. 본원에 개시된 서열을 변경시키지 않으면서, 도면, 예컨대, 도 4c에 개시된 인접 프로브 PP1 및 PP2의 폴리-A 꼬리를 도면에 구체적으로 표시된 알라닌 반복부의 수에서 개시된 PP1 및/또는 PP2 서열에 비해 변경시킬 수 있다는 것을 이해해야 한다.
도 4a에 도식화된 본 발명의 추가 실시양태에서, 포획 모이어티(417)에 부착된 고착 올리고뉴클레오티드 서열(416)은 자유 3' 말단을 갖는 프라이머로서 작용할 수 있다. 이 실시양태에서, 제2 인접 프로브는 검출 서열(413)에 상보적인 서열을 포함한다.
RCA 또는 임의의 적합한 증폭 방법에 의해 증폭되는 표적 서열을 생성하는 또 다른 방법은 도 5에 예시되어 있다. 이 실시양태에서, 각각의 인접 프로브는 루핑된 헤어핀 구조물로 폴딩될 수 있다. 이 헤어핀 구조물의 형성은 재조합 신호를 함유하는 단일 가닥 루프 및 이중 가닥 부분을 생성한다. 2개의 헤어핀 구조물들의 재조합을 유도하여 전술된 바와 같이 추후에 RCA로 처리되는 환형 DNA 주형을 형성하기 위해 재조합효소(recombinase)가 첨가된다. 앰플리콘은 표지되고 임의적으로 고착 시약에 고착되고, 분석물이 검출된다. 이 실시양태의 핵심 요소는 서열 특이적 재조합 부위를 함유하는 DNA의 부위 특이적 재조합을 촉매작용하는 재조합효소의 능력이다. 예를 들면, 박테리오파지 P1로부터의 Cre 재조합효소는 loxP 부위를 함유하는 부위에서 재조합을 촉매작용하고, 다른 비-한정적 예로는 플립파제(Flippase)(flp, 효모로부터 유래됨), Hin(살모넬라), 및 Cre의 조작된(진화된) 버전인 Tre가 있으나 이들로 한정되지 않는다. 이 대안적 방법은 추가 성분, 예컨대, 올리고뉴클레오티드 주형, ATP 및 dNPT들의 첨가를 요구하지 않는다. 이 실시양태에서, loxP(재조합) 부위는 바람직하게는 비-대칭성을 가짐으로써 정상 평형을 원하는 재조합된 생성물의 형성 쪽으로 이동시키도록 변경된다. 이것은 도 5에 예시되어 있고, 이때 재조합 부위는 명/암 음영으로 표시되어 있다.
나아가, 도 6a는 RCA 또는 임의의 적합한 증폭 방법에 의해 증폭되는 표적 서열을 생성하는 또 다른 방법을 예시한다. 검출 시약에 부착된 인접 프로브들 각각은 Cre 재조합효소에 의한 2개의 올리고뉴클레오티드들 사이의 부위 특이적 재조합을 가능하게 함으로써, loxP 부위를 플랭킹하는 한 인접 프로브의 5' 부분 및 다른 인접 프로브의 3' 부분으로 구성된 새로운 올리고뉴클레오티드 서열의 형성을 야기하는 loxP 부위를 포함한다. 그 후, 새로 생성된 표적 서열은 전술된 바와 같이 임의의 적합한 방법으로 증폭될 수 있고 표지될 수 있고 임의적으로 고착될 수 있고 검출될 수 있다. 도 6a는 증폭을 위한 작동가능한 요소로서 T7 RNA 중합효소 프로모터를 사용하는 이 실시양태를 예시한다. 다른 RNA 중합효소 부위, 예컨대, 인접 프로브의 3' 또는 5' 부분에 연결된 T3 및 SP6이 이 방법에서 사용되기에 동등하게 적합하다는 것도 이해될 것이다. 이 실시양태에서, loxP(재조합) 부위는 바람직하게는 비-대칭성을 가짐으로써 정상 평형을 원하는 재조합된 생성물의 형성 쪽으로 이동시키도록 변경된다. 도 6b에 나타낸 바와 같이, 상기 방법을 이용하여 RCA에서 사용될 수 있는 환형 DNA 주형을 생성할 수도 있다.
본 발명은 분석물을 검출하는 방법으로서, 분석물을 표면 상의 포획 시약 및 2개의 검출 시약들에 결합시켜 검출 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 이 방법은 검출 복합체를 측정하는 단계를 포함하고, 이때 측정 방법은 2개의 검출 시약들 중 하나만을 포함하는 복합체에 비해 검출 시약들 둘 다를 포함하는 복합체를 우선적으로 측정한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 상기 복합체를 형성한 후 검출 시약을 가교연결하는 단계 및 가교연결된 시약을 검출하는 단계를 포함한다. 임의의 적합한 가교연결 화학반응을 이용하여 검출 복합체의 성분들을 연결할 수 있다. 예를 들면, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 반응성 모이어티들을 연결하는 다작용성 가교연결제의 첨가에 의해 반응하고 연결되는 반응성 모이어티들을 포함할 수 있다. 이 실시양태에서, 반응성 모이어티 및 가교연결제는 아민, 티올, 하이드라지드, 알데하이드, 에스테르, 요오도아세트아미드, 말레이미드, 클릭 화학 시약 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 결합 모이어티를 포함할 수 있고, 가교연결제는 결합 모이어티의 다가 결합 파트너이다. 이 실시양태의 여러 비-한정적 예로는 하기 실시양태들이 있다: (a) 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 동물 종의 항체이고, 가교연결제는 동물 종의 항체를 표적화하는 다가 항-종 항체이거나; (b) 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 바이오틴을 포함하고, 가교연결제는 스트렙타비딘이거나(또는 역의 경우도 가능); (c) 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 스트렙타비딘에 연결되고, 가교연결제는 복수의 바이오틴 분자들을 포함하는 중합체이거나(또는 역의 경우도 가능); (d) 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 각각 제1 핵산 프로브 및 제2 핵산 프로브를 포함하고, 가교연결제는 제1 핵산 프로브에 상보적인 서열 및 제2 핵산 프로브에 상보적인 별도의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드이다.
구체적인 실시양태에서, 샘플 중의 관심있는 분석물은 분석물을 고정된 포획 시약, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약에 결합시켜 복합체를 형성함으로써 검출될 수 있고, 이때 제1 검출 시약은 제1 검출가능한 표지 및 제1 핵산 프로브를 포함하고, 제2 검출 시약은 제2 검출가능한 표지 및 제2 핵산 프로브를 포함한다. 이 실시양태에서, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 (i) 제1 프로브를 제2 프로브에 혼성화시키거나, (ii) 제1 프로브 및 제2 프로브를, 제1 프로브 및 제2 프로브에 상보적인 영역을 갖는 제3 핵산에 혼성화시키거나, (iii) 제1 프로브와 제2 프로브를 결찰시킴으로써 교차연결된다.
교차연결된 생성물은 표면에 결합되면 검출될 수 있거나, 임의적으로 교차연결된 생성물은 표면으로부터 용출물 내로 방출된 후 검출될 수 있다. 이와 관련하여, 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지 둘 다를 포함하는 개별 교차연결된 생성물만이 용출물에서 카운팅된다. 임의의 적합한 검출 방법을 이용하여 용출물에서 표지의 존재를 검출할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 표지는 형광 분자이고, 용출물에 존재하는 표지된 교차연결된 생성물은 단일 분자 형광 검출, 예를 들면, 형광 상관관계 분광법 및/또는 형광 교차-상관관계 분광법에 의해 카운팅된다. 이 실시양태에서, 단일 분자 형광 검출은 모세관을 통해 용출물을 유동시키고 광원을 모세관 내의 부피에 집중시켜 호출 대역을 생성하고 상기 호출 대역을 광 검출기로 관찰하여 상기 호출 대역을 통한 형광 분자의 통과를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 검출 방법은 제1 표지와 관련된 제1 형광 신호 및 제2 표지와 관련된 제2 형광 신호를 검출하는 단계, 및 두 신호들이 호출 대역으로부터 검출될 때 검출 사건을 카운팅하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 한 표지는 형광 공명 에너지 전달(FRET) 공여자이고, 다른 표지는 FRET 수용자이고, 검출 방법은 호출 대역에서 FRET 공여자를 여기시키는 단계 및 FRET 수용자로부터의 형광 신호를 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 샘플 중의 분석물은 분석물을 고정된 포획 시약, 제1 핵산 프로브를 포함하는 제1 검출 시약 및 제2 핵산 프로브를 포함하는 제2 검출 시약에 결합시켜 복합체를 형성하고; 제2 핵산 프로브를 연장하여, 검출가능한 표지를 포함하는 연장된 서열을 형성하고(이때, 연장은 상기 복합체에서 제1 핵산 프로브와 제2 핵산 프로브의 공존에 의존함); 연장된 서열을 표면으로부터 용출물 내로 방출하고; 상기 용출물에서 개별 연장된 서열을 카운팅함으로써 검출될 수 있다. 연장 단계는 프로브를 주형 핵산 서열에 결합시키는 단계 및 프로브를 중합효소 연쇄 반응으로 연장하는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 연장 단계는 제1 프로브를 주형 핵산 서열에 결합시켜 환형 핵산 주형을 형성하는 단계 및 상기 환형 주형을 롤링 서클 증폭으로 연장하는 단계를 포함한다. 연장 단계는 제1 프로브를 주형 핵산 서열에 결합시키는 단계, 제2 프로브를 주형 서열에 결합시키는 단계 및 제1 프로브와 제2 프로브를 결찰시키는 단계도 포함할 수 있다.
포획 시약을 사용하는 본 발명의 방법에서, 포획 시약은 고체상에 직접적으로 고정될 수 있거나 이차 결합 시약, 예컨대, 후술된 표적화 시약을 통해 간접적으로 고정될 수 있다. 예를 들면, 포획 시약은 고체상 상의 고정된 표적화 시약 상보체에 결합하는 표적화 시약에 연결될 수 있거나 이러한 표적화 시약을 포함할 수 있다. 표적화 시약과 그의 상보체의 결합은 직접적인 결합일 수 있거나(예를 들면, 표적화 시약은 스트렙타비딘일 수 있고, 상보체는 바이오틴일 수 있음) 가교제를 통한 간접적인 결합일 수 있다(예를 들면, 표적화 시약 및 상보체는 바이오틴일 수 있고, 가교제는 다가 바이오틴 결합 수용체, 예컨대, 스트렙타비딘일 수 있음). 한 실시양태에서, 표적화제 및 그의 상보체는 제1 올리고뉴클레오티드 및 상보적 올리고뉴클레오티드, 수용체-리간드 쌍, 항원-항체 쌍, 햅텐-항체 쌍, 에피토프-항체 쌍, 미메토프-항체 쌍, 앱타머-표적 분자 쌍, 혼성화 파트너, 또는 인터칼레이터-표적 분자 쌍을 포함한다. 분석에서 사용되는 표적화제 및 상보체는 분석에 의해 측정된 분석물에 대한 포획 시약 또는 검출 시약과 관련된 표적화제 및 상보체가 분석에 의해 측정된 다른 분석물에 대한 포획 시약 또는 검출 시약과 관련된 표적화제 및 상보체와 실질적으로 교차반응하지 않도록 선택된다. 예를 들면, (그의 관련된 표적화제 및 표적화제 상보체를 통한) 결합 시약과 그의 관련된 결합 도메인의 결합은 다른 분석물(및 제시되는 상이한 표적화제 상보체)과 관련된 결합 도메인과 그의 결합보다 실질적으로 더 커야 한다. 바람직하게는, 분석물에 대한 포획 시약 또는 검출 시약과 다른 분석물과 관련된 결합 도메인의 결합에 대한 교차반응성은 정확한 결합 도메인과의 결합에 비해 1% 미만, 보다 바람직하게는 0.1% 미만, 보다 바람직하게는 0.01% 미만이다. 바람직한 실시양태에서, 표적화제/표적화제 상보체는 상보적 서열을 포함하는 한 쌍의 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 표적화제 및 그의 상보체는 표적화제를 그의 상보체에 혼성화시키기에 충분한 조건 하에서 접촉된다.
표적화제가 사용되는 경우, 분석 방법에서 사용되는 포획 시약이 고체상에 고정될 때에 대한 어느 정도의 유연성이 존재한다. 한 실시양태에서, 표적화제-표적화제 상보체 상호작용을 통해 고체상에 미리 고정된 포획 시약이 사용자에게 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 표적화제에 연결된 포획 시약 및 고정된 표적화제 상보체를 지지하는 고체상이 별도의 성분으로서 제공된다. 따라서, 분석 방법은 (직접적으로 또는 가교제의 사용을 통해) 표적화제를 그의 상보체에 결합시킴으로써, 포획 시약을 고체상에 고정시키는 단계를 추가로 포함한다. 이 단계는 검출 복합체의 형성과 관련된 단계 전에, 이러한 단계와 동시에, 또는 이러한 단계 후에 수행될 수 있다.
결합 분석 분야로부터의 통상적인 표면을 비롯한 매우 다양한 표면들이 본 발명의 방법에서 사용되기에 적합하다. 표면은 중합체(예를 들면, 폴리스티렌 및 폴리프로필렌), 세라믹, 유리 및 복합 물질(예를 들면, 탄소-중합체 복합물, 예컨대, 탄소-기제 잉크)을 비롯한 다양한 상이한 물질들로부터 만들어질 수 있다. 적합한 표면은 거시적 물체의 표면, 예컨대, 분석 용기(예를 들면, 시험관, 큐벳, 유동 셀, FACS 세포 분류기, 카트리지, 멀티-웰 플레이트의 웰 등), 슬라이드, 분석 칩(예컨대, 유전자 또는 단백질 칩 측정에서 사용되는 분석 칩), 핀 또는 프로브, 비드, 여과 매질, 측류 매질(예를 들면, 측류 시험 스트립에서 사용되는 여과 막) 등의 내부 표면을 포함한다.
적합한 표면은 다른 종류의 입자-기초 분석에서 통상적으로 사용되는 입자(콜로이드 또는 비드를 포함하나 이들로 한정되지 않음), 예를 들면, 자석, 폴리프로필렌 및 라텍스 입자, 고체상 합성에서 전형적으로 사용되는 물질, 예를 들면, 폴리스티렌 및 폴리아크릴아미드 입자, 및 크로마토그래피 적용분야에서 전형적으로 사용되는 물질, 예를 들면, 실리카, 알루미나, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌도 포함한다. 상기 물질은 섬유, 예컨대, 탄소 원섬유일 수도 있다. 미세입자는 무생물일 수 있거나, 대안적으로 생물의 생물학적 물질, 예컨대, 세포, 바이러스, 세균 등을 포함할 수 있다. 본 방법에서 사용되는 입자는 하나 이상의 포획 또는 검출 시약에 부착되기에 적합하고 예를 들면, 원심분리, 중력, 여과 또는 자기 수집을 통해 수집될 수 있는 임의의 물질로 구성될 수 있다. 포획 또는 검출 시약에 부착될 수 있는 매우 다양한 상이한 종류의 입자들이 결합 분석에서의 사용을 위해 시판된다. 이들은 비-자기 입자뿐만 아니라 입자가 자기장에 의해 수집될 수 있게 하는 자기화가능한 물을 포함하는 입자도 포함한다. 한 실시양태에서, 입자는 전도성 물질 및/또는 반전도성 물질, 예를 들면, 콜로이드성 금 입자로 구성된다. 미세입자는 매우 다양한 크기 및 형태를 가질 수 있다. 예를 들면 비-한정적으로, 미세입자는 5 nm 내지 100 ㎛의 크기를 가질 수 있다. 바람직하게는, 미세입자는 20 nm 내지 10 ㎛의 크기를 갖는다. 입자는 구형, 타원형, 막대-유사 형태 등일 수 있거나 형태에서 불규칙할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 입자는 입자의 혼합물에서 특정 입자 또는 입자 하위집단을 확인할 수 있도록 암호화될 수 있다. 이러한 암호화된 입자는 결합 분석을 위한 고체상 지지체로서 입자를 사용하는 분석의 다중화를 가능하게 하기 위해 사용되고 있다. 한 방법에서, 입자는 하나 이상의 형광 염료를 포함하도록 제조되고, 입자의 특정 집단은 하나 이상의 파장에서의 형광 방사의 강도 및/또는 상대적 강도에 기초하여 확인된다. 이 방법은 루미넥스(Luminex) xMAP 시스템(예를 들면, 미국 특허 제6,939,720호 참조) 및 벡톤 딕킨슨 사이토메트릭(Becton Dickinson Cytometric) 비드 어레이 시스템에서 사용되고 있다. 대안적으로, 입자는 다른 물성, 예컨대, 크기, 형태, 새겨진 광학 패턴 등에서의 차이를 통해 암호화될 수 있다. 입자의 혼합물 또는 세트로 제공된 하나 이상의 입자는 입자 광학 성질, 크기, 형태, 새겨진 광학 패턴 등에 의해 상기 혼합물 중의 다른 입자로부터 구별될 수 있도록 암호화될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 복수의 상이한 분석물들을 이 분석물들에 대한 복수의 포획 시약들에 결합시킴으로써, 다중화된 포맷으로 사용될 수 있고, 이때 암호화가 특정 비드에 대한 포획 시약(및 분석물 표적)을 확인하도록 포획 분석물을 암호화된 비드 상에 고정시킨다. 상기 방법은 (본원에 기재된 검출 방법을 이용하여) 결합된 분석물을 갖는 비드의 수를 카운팅하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 개별 분석 신호가 각각의 결합 도메인 상에서 생성되고 각각의 결합 도메인으로부터 측정되도록 예를 들면, 결합 도메인이 개별 어레이 요소인 결합 어레이 또는 결합 도메인이 개별 비드인 비드 세트에서와 같이 검출 복합체 및/또는 포획 시약을 하나 이상의 고체상 상의 상이한 개별 결합 도메인들에 직접적으로 또는 간접적으로 결합시킬 수 있다. 상이한 분석물들에 대한 포획 시약이 상이한 결합 도메인들에 고정되는 경우, 상기 도메인들에 결합된 상이한 분석물들은 독립적으로 측정될 수 있다. 이러한 실시양태의 한 예에서, 결합 도메인은 관심있는 분석물에 결합하는 포획 시약의 개별 도메인을 하나 이상의 표면 상에 고정시킴으로써 제조된다. 임의적으로, 표면(들)은 샘플을 보유하거나 샘플이 통과되는 용기(예를 들면, 유동 셀, 웰, 큐벳 등)의 하나 이상의 경계를 부분적으로 한정할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 개별 결합 도메인은 전기화학 또는 전기화학발광 분석에서 사용되는 전극 상에서 형성된다. 복수의 결합 도메인들을 포함하는 표면 상에서 전기화학발광을 이용한 분석물의 다중화된 측정은 메소 스케일 디아그노스틱스 엘엘씨(Meso Scale Diagnostics, LLC)의 멀티-어레이(MULTI-ARRAY)® 및 섹터(SECTOR)® 이미저 제품 생산 라인에서 이용되고 있다(예를 들면, 전체로서 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제7,842,246호 및 제6,977,722호 참조).
추가로, 검출 복합체 및/또는 포획 시약은 전술된 바와 같이 임의적으로 상이한 개별 결합 도메인들을 포함하는 전극 표면에 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 전극 표면은 멀티-웰 플레이트 및/또는 유동 셀의 성분일 수 있다. 전극은 전도성 물질, 예를 들면, 금속, 예컨대, 금, 은, 백금, 니켈, 강철, 이리듐, 구리, 알루미늄, 전도성 알로우(allow) 등을 포함할 수 있다. 전극은 산화물로 코팅된 금속, 예를 들면, 산화알루미늄으로 코팅된 알루미늄도 포함할 수 있다. 전극은 동일한 또는 상이한 물질로 만들어질 수 있는 작업 전극 및 대향 전극, 예를 들면, 금속 대향 전극 및 탄소 작업 전극을 포함할 수 있다. 한 구체적인 실시양태에서, 전극은 탄소-기제 물질, 예컨대, 탄소, 탄소 블랙, 흑연성 탄소, 탄소 나노튜브, 탄소 원섬유, 흑연, 그래핀(graphene), 탄소 섬유 및 이들의 혼합물을 포함한다. 한 실시양태에서, 전극은 탄소 원소, 예를 들면, 흑연, 탄소 블랙, 탄소 나노튜브 등을 포함한다. 유리하게는, 전극은 전도성 탄소-중합체 복합물, 매트릭스에 분산된 전도성 입자(예를 들면, 탄소 잉크, 탄소 페이스트, 금속 잉크, 그래핀 잉크), 및/또는 전도성 중합체를 포함할 수 있다. 본 발명의 한 구체적인 실시양태는 탄소, 예를 들면, 탄소 층, 및/또는 탄소 잉크의 스크린-인쇄된 층을 포함하는 전극(예를 들면, 작업 전극 및/또는 대향 전극)을 갖는 분석 모듈, 바람직하게는 멀티-웰 플레이트이다.
본 발명은 개별 검출 복합체를 검출하고 카운팅하는 방법을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 표면은 샘플에 존재하는 하나 이상의 분석물 분자에 대한 복수의 포획 시약들을 포함할 수 있고, 상기 복수의 포획 시약들은 표면 상에 위치한 복수의 해상가능한 결합 영역들에 걸쳐 분포되어 있다. 측정을 수행하고 분석하기 위해 사용된 조건 하에서 "해상가능한 결합 영역"은 추가 개별 결합 사건이 일어나는 또 다른 영역으로부터 해상될 수 있고 구별될 수 있는, 개별 결합 사건과 관련된 최소 표면 영역이다. 따라서, 상기 방법은 하나 이상의 분석물 분자를 표면 상의 하나 이상의 포획 시약에 결합시키는 단계, 표면 상의 복수의 해상가능한 결합 영역들에서 분석물 분자의 존재 또는 부재를 확인하는 단계, 및 분석물 분자를 함유하는 해상가능한 결합 영역의 수 및/또는 분석물 분자를 함유하지 않는 분석물 도메인의 수를 확인하는 단계로 구성된다.
해상가능한 결합 영역은 전체적으로 또는 부분적으로 광학적으로 호출될 수 있고, 즉 각각의 개별 해상가능한 결합 영역은 개별적으로 광학적으로 호출될 수 있고/있거나, 복수의 해상가능한 결합 영역들을 포함하는 전체 표면은 영상화될 수 있고, 그 영상 내의 하나 이상의 화소 또는 화소 군은 개별 해상가능한 결합 영역으로 맵핑될 수 있다. 해상가능한 결합 영역은 복수의 미세입자 내의 미세입자일 수도 있다. 그의 광학 특징에서의 변화를 나타내는 해상가능한 결합 영역은 통상적인 광학 검출 시스템에 의해 확인될 수 있다. 검출된 종(예를 들면, 형광 물질의 종류 등) 및 작동 파장에 따라, 특정 파장용으로 디자인된 광학 필터가 해상가능한 결합 영역의 광학 호출을 위해 사용될 수 있다. 광학 호출이 사용되는 실시양태에서, 시스템은 하나 초과의 광원, 및/또는 광원의 파장 및/또는 강도를 조절하기 위한 복수의 필터를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 해상가능한 결합 영역들로부터의 광학 신호는 CCD 카메라를 이용함으로써 포착된다. 영상을 포착하는 데에 사용될 수 있는 카메라 영상화 시스템의 다른 비-한정적 예로는 당업자에게 공지되어 있을 전하 주입 장치(CID), 상보적 산화금속 반도체(CMOS) 장치, 과학적 CMOS(sCMOS) 장치 및 시간 지연 적분(TDI) 장치가 있다. 일부 실시양태에서, 광다이오드 또는 광전증배관(PMT)과 커플링된 스캐닝 거울 시스템이 영상화를 위해 사용될 수 있다.
상기 방법의 측정 단계는 표면(또는 이의 일부)으로부터의 광학 신호를 영상화하여 복수의 화소들로 구성된 영상을 생성하는 단계를 포함할 수 있고, 이때 각각의 해상가능한 결합 영역은 상기 영상 내의 하나 이상의 화소 또는 화소 군으로 맵핑된다. 결합 사건(검출 복합체)을 표시하는 신호를 갖는 화소 또는 화소 세트를 확인하기 위한 영상 분석은 당분야에서 인정된 방법, 예를 들면, 형광 현미경관찰 영상에서 표지된 생물학적 구조물을 확인하고 카운팅하는 데에 이용될 수 있는 수많은 영상 분석 알고리즘 및 소프트웨어를 이용함으로써 달성될 수 있다. 한 실시양태에서, 대규모 신호 구배를 제거하기 위해 영상을 여과한 후, 절편화 역치를 이용하여 영상을 이원 영상으로 전환한다. 역치를 초과하는 강도의 인접 영역을 확인함으로써 해상가능한 결합 영역을 발견한다. 결합 도메인은 크기 및 강도 요건을 충족시키는 경우 결합 사건으로서 분류된다.
한 실시양태에서, 해상가능한 결합 영역은 어레이의 요소이다. 바람직한 실시양태에서, 어레이는 마이크로-웰 또는 나노-웰, 예를 들면, 단일 기판의 개별 오목부 또는 웰의 어레이이다. 바람직하게는, 웰의 부피는 100 nl 미만, 바람직하게는 50 nl 미만이다. 한 실시양태에서, 웰의 부피는 대략 10 al 내지 100 pl이다. 임의적으로, 웰은 미세입자를 보유하도록 구성될 수 있다.
한 실시양태에서, 기판 상에 위치하고 분석 동안 처리되는 해상가능한 결합 영역의 50% 이상이 0개 또는 1개의 분석물 분자를 함유한다. 바람직하게는, 해상가능한 결합 영역의 80% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상이 0개 또는 1개의 분석물 분자를 함유한다. 샘플 중의 분석물 분자의 농도는 적어도 부분적으로 하나 이상의 분석물 분자를 함유하는 결합 영역의 수의 보정 곡선, 포아송 분포 분석 및/또는 가우스 분포 분석을 이용함으로써 측정된다. 구체적인 실시양태에서, 표면은 분석물 분자에 대한 복수의 포획 시약들을 각각 포함하는 복수의 입자들을 포함하고, 상기 복수의 입자들은 복수의 해상가능한 결합 영역들(예를 들면, 마이크로-웰 또는 나노-웰의 어레이)에 걸쳐 분포한다. 따라서, 상기 방법은 (i) 하나 이상의 분석물 분자를 표면 상의 하나 이상의 포획 시약에 결합시키는 단계, (ii) 복수의 입자들을 해상가능한 결합 영역의 어레이에 걸쳐 분포시키는 단계; 및 (iii) 분석물 분자를 함유하는 결합 도메인의 수 및/또는 분석물 분자를 함유하지 않는 결합 도메인의 수를 확인하기 위해 각각의 해상가능한 결합 영역에서 분석물 분자의 존재 또는 부재를 확인하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법들 중 하나 이상의 방법을 이용하여 한정된 부피에서 분석물을 검출하는 것이 유리할 수도 있다. 이 실시양태들에서, 샘플 중의 분석물 분자를, 구별가능한 표지를 각각 보유하는 한 쌍의 검출 시약에 결합시키고, 대다수의 반응기들이 1개 이하의 분석물을 함유하도록 분석물을 복수의 위치들, 예를 들면, 웰 또는 반응기(본원에서 "반응기"로서 지칭됨), 기판, 예를 들면, 플레이트, 접시, 칩, 광학 섬유 등에 걸쳐 분할한다. 이 방법은 사용자가 분석물에 부착된 구별가능한 표지 각각을 함유하는 반응기의 수를 카운팅함으로써 분석물 분자를 검출할 수 있게 한다. 일부 경우, 처리되는 복수의 반응기들은 하나 이상의 분석물 분자를 함유할 수 있는(예를 들면, 하나 이상의 분석물 분자와 관련되어 있을 수 있거나 임의의 분석물 분자와 관련되어 있지 않을 수 있는) 반응기의 총량의 일부 또는 본질적으로 전부이다. 하기 공개된 미국 특허출원들 및 국제 특허출원을 참조한다: 미국 특허출원 공보 제20070259448호; 미국 특허출원 공보 제20070259385호; 미국 특허출원 공보 제20070259381호; 및 국제 특허출원 제PCT/US07/019184호. 이 공보들 각각의 개시내용은 본원에 참고로 도입된다. 반응기의 적어도 일부가 처리될 수 있고, 하나 이상의 분석물 분자 또는 입자를 함유하는 반응기의 수/백분율을 표시하는 측정이 수행될 수 있다. 일부 경우, 유체 샘플 중의 분석물 분자의 농도의 측정치는 상기 수/백분율에 기초하여 결정될 수 있다.
한정된 부피에서 분석물 분자를 검출할 수 있게 하는 구체적인 실시양태에서, 분석물을 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약에 결합시켜 검출 복합체를 형성함으로써 샘플 중의 분석물을 검출할 수 있다. 각각의 검출 복합체는 분석물, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약을 포함하고, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 각각 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지를 갖는다. 검출 복합체는 동시에, 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 형성될 수 있다. 대다수의 반응기들이 1개 미만의 검출 복합체를 함유하도록 검출 복합체를 복수의 반응기들에 걸쳐 분할하고, 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지 각각을 함유하는 반응기의 수를 카운팅함으로써 분석물 분자의 수를 검출한다. 바람직하게는, 동일한 용기에서 비결합된 제1 검출 시약 및 비결합된 제2 검출 시약을 검출할 가능성이 약 10분의 1 미만이도록, 바람직하게는 약 100분의 1 미만이도록, 보다 바람직하게는 약 1000분의 1 미만이도록, 가장 바람직하게는 약 10,000분의 1 미만이도록 검출 복합체를 복수의 반응기들에 걸쳐 분할한다. 검출 복합체가 지지체 상의 개별 반응기 내로 분리되도록, 예를 들면, 검출 복합체의 일부를 복수의 반응기들에 걸쳐 분취하고/하거나 검출 복합체를 포함하는 용액을 복수의 반응기들에 걸쳐 유동시킴으로써 수동으로 검출 복합체를 복수의 반응기들에 걸쳐 분할한다(즉, 부분 또는 일부로 나누거나 분리한다).
추가 실시양태에서, (a) 분석물을 표면에 결합된 포획 시약, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약에 결합시켜 검출 복합체를 형성함으로써 샘플 중의 분석물을 검출할 수 있고, 이때 (i) 각각의 검출 복합체는 포획 시약, 분석물, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약을 포함하고, (ii) 제1 검출 시약은 제1 검출가능한 표지를 갖고 제2 검출 시약은 제2 검출가능한 표지를 갖는다. 성분들을 임의의 순서로 첨가함으로써, 예를 들면, 성분들을 동시에 또는 실질적으로 동시에 접촉시키거나 각각의 성분을 순차적으로 첨가하여 검출 복합체를 단계적 방식으로 구축함으로써 검출 복합체를 형성할 수 있다. 대다수의 반응기들이 1개 미만의 분석물을 함유하도록 검출 복합체를 복수의 반응기들에 걸쳐 분할하고, 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지를 함유하는 반응기의 수를 카운팅함으로써 분석물 분자의 수를 검출한다. 각각의 단계 후에 및 검출 단계 전에 세척을 이용하거나 이용하지 않으면서 상기 방법을 수행할 수 있다.
표면은 입자일 수 있고, 임의적으로 복수의 포획 시약들이 입자 또는 복수의 입자들 상에 고정된다. 이 실시양태에서, 분할 단계는 다수의 방식으로 수행될 수 있다: (i) 포획 시약을 복수의 입자들 상에 고정시키고, 분석물을 포획 시약에 결합시키고 입자들을 복수의 반응기들 내로 분할함으로써 분석물의 분할을 달성하거나; (ii) 포획 시약을 복수의 입자들 상에 고정시키고, 입자들을 복수의 반응기들 내로 분할한 후 분석물을 포획 시약에 결합시킴으로써 분석물의 분할을 달성한다.
복수의 반응기들은 유중수 에멀전에 분산된 수적도 포함할 수 있다. 최대 100 ㎛의 직경 및 거의 1 nl의 부피를 갖는 소적을 갖는 에멀전을 만들 수 있다. 높은 용량, 즉 에멀전 1 ㎖ 당 1010개 초과의 소적, 에멀전의 제조 용이성 및 넓은 범위의 조건들에 걸쳐 그의 높은 안정성 때문에 에멀전은 생화학적 분석을 구획화하는 이상적인 수단이 된다. 각각의 수적은 독립적인 반응기로서 작용하고, 임의적으로 입자에 부착된 검출 복합체는 복수의 수적들에 걸쳐 분할될 수 있다.
대안적으로, 표면은 반응기들 중 하나 내의 위치이고, 예를 들면, 반응기가 플레이트의 웰인 경우, 표면은 플레이트의 웰들 중 하나 내의 도메인 또는 영역일 수 있다. 이 실시양태에서, 포획 시약을 복수의 반응기들의 도메인 또는 영역 상에 고정시킬 수 있고, 분석물 분자를 포획 시약에 결합시킴으로써 분할 단계를 달성한다. 또 다른 실시양태에서, 복수의 반응기들은 그에 고정된 표적화 모이어티를 갖는 영역을 포함하고, 포획 시약은 표적화 모이어티 상보체를 포함하고, 표적화 모이어티 상보체를 복수의 반응기들 내에 위치한 표적화 모이어티에 결합시킴으로써 분할 단계를 달성한다. 추가 실시양태에서, 본원에 기재된 결합 분석은 예를 들면, 샘플 중의 분석물의 농도를 증가시키고/시키거나 분석의 성능을 방해할 수 있는, 샘플에 존재할 수 있는 외래 물질의 농도를 감소시킴으로써 분석 성능을 개선하기 위한 예비-농축 단계도 포함할 수 있다. 이것은 (a) 관심있는 분석물을 포함하는 샘플을 이 분석물에 결합하는 제1 결합 시약에 연결된 입자와 접촉시켜 상기 제1 결합 시약에 결합된 분석물을 포함하는 복합체를 형성하고; (b) 상기 복합체를 수집하고; (c) 상기 샘플의 비결합된 성분을 상기 복합체로부터 분리하고; (d) 상기 복합체를 방출함으로써 수행될 수 있다. 이 예비-농축 방법은 본원에 기재된 결합 분석이 분석 성능을 방해할 불순물을 제거하기 위해 수행되기 전에 수행될 수 있다. 이와 관련하여, 그의 개시내용이 본원에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공보 제2010/0261292호를 참조한다.
본 발명의 방법에 의해 분석될 수 있는 샘플의 예로는 식품 샘플(식품 추출물, 식물 균질화물, 음료 등을 포함함), 환경 샘플(예를 들면, 토양 샘플, 환경 쓰레기, 수집된 환경 에어로졸, 환경 수건, 물 여과액 등), 산업 샘플(예를 들면, 산업 생산 공정으로부터의 출발 물질, 생성물 또는 중간체), 인간 임상 샘플, 수의학 샘플 및 생물학적 유래의 다른 샘플이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 분석될 수 있는 생물학적 샘플은 대변, 점막 면봉, 생리학적 샘플, 및/또는 세포의 현탁액을 함유하는 샘플을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 생물학적 샘플의 구체적인 예로는 혈액, 혈청, 혈장, 대변, 점막 면봉, 조직 흡입물, 조직 균질화물, 세포 배양물 및 세포 배양 상청액(진핵 세포 및 원핵 세포의 배양물을 포함함), 소변, 침, 객담 및 뇌척수 샘플이 있다.
본 발명의 방법을 이용하여 측정할 수 있는 분석물은 단백질, 독소, 핵산, 미생물, 바이러스, 세포, 진균, 포자, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지단백질, 다당류, 약물, 호르몬, 스테로이드, 영양분, 대사물질 및 상기 분자들의 임의의 변경된 유도체, 또는 상기 분자들 중 하나 이상의 분자 또는 이들의 조합을 포함하는 임의의 복합체를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 샘플에서 관심있는 분석물의 수준은 질환 또는 질환 상태를 표시할 수 있거나, 단순히 환자가 그 분석물에 노출되었는지를 표시할 수 있다.
본 발명의 분석은 샘플 중의 1개 이상, 예를 들면, 2개 이상의 분석물의 농도를 측정하는 데에 사용될 수 있다. 따라서, 2개 이상의 분석물은 동일한 샘플에서 측정될 수 있다. 동일한 샘플에서 측정될 수 있는 분석물의 패널은 예를 들면, 질환 상태 또는 생리학적 상태와 관련된 분석물 또는 활성에 대한 분석의 패널을 포함한다. 일부 이러한 패널은 사이토카인 및/또는 그의 수용체(예를 들면, TNF-알파, TNF-베타, IL1-알파, IL1-베타, IL2, IL4, IL6, IL-10, IL-l2, IFN-y 등 중 하나 이상), 성장인자 및/또는 그의 수용체(예를 들면, EGF, VGF, TGF, VEGF 등 중 하나 이상), 남용 약물, 치료 약물, 비타민, 병원체 특이적 항체, 자가-항체(예를 들면, Sm, RNP, SS-A, SS-알파, J0-1 및 Scl-70 항원에 대해 유도된 하나 이상의 항체), 알레르겐 특이적 항체, 종양 마커(예를 들면, CEA, PSA, CA-125 II, CA 15-3, CA 19-9, CA 72-4, CYFRA 21-1, NSE, AFP 등 중 하나 이상), 울혈성 심장 질환 및/또는 급성 심근경색을 비롯한 심장 질환의 마커(예를 들면, 트로포닌(Troponin) T, 트로포닌 I, 트로포닌 C, 미요글로빈, CKMB, 미엘로퍼록시다제(myeloperoxidase), 글루타티온 퍼록시다제, β-나트륨이뇨 단백질(BNP), 알파-나트륨이뇨 단백질(ANP), 엔도텔린, 알도스테론, C-반응성 단백질(CRP) 등 중 하나 이상), 항상성과 관련된 마커(예를 들면, 피브린 단량체, D-이량체, 트롬빈-항트롬빈 복합체, 프로트롬빈 단편 1 및 2, 항-인자 Xa 등 중 하나 이상), 급성 간염 바이러스 감염의 마커(예를 들면, A형 간염 바이러스에 대한 IgM 항체, B형 간염 코어 항원에 대한 IgM 항체, B형 간염 표면 항원, C형 간염 바이러스에 대한 항체 등 중 하나 이상), 알쯔하이머병의 마커(알파-아밀로이드, 베타-아밀로이드, Aβ 42, Aβ 40, Aβ 38, Aβ 39, Aβ 37, Aβ 34, tau-단백질 등), 골다공증의 마커(예를 들면, 교차연결된 Nor C-텔로펩티드, 총 데옥시피리디놀린, 자유 데옥시피리디놀린, 오스테오칼신, 알칼리성 포스파타제, I형 콜라겐의 C-말단 전구펩티드, 골 특이적 알칼리성 포스파타제 등 중 하나 이상), 가임 상태 또는 가임 관련 장애의 마커(예를 들면, 에스트라디올, 프로게스테론, 여포 자극 호르몬(FSH), 황체형성 호르몬(LH), 프로락틴, hCG, 테스토스테론 등 중 하나 이상), 갑상선 장애의 마커(예를 들면, 갑상선 자극 호르몬(TSH), 총 T3, 자유 T3, 총 T4, 자유 T4 및 역 T3 중 하나 이상), 및 전립선암의 마커(예를 들면, 총 PSA, 자유 PSA, 복합체화된 PSA, 전립선 산 포스파타제, 크레아틴 키나제 등 중 하나 이상)의 패널을 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태는 특정 질환 상태 또는 생리학적 상태와 관련된 1개 이상, 2개 이상, 4개 이상, 또는 10개 이상의 분석물(예를 들면, 패널로 함께 분류된 분석물들, 예컨대, 상기 나열된 분석물들; 예를 들면, 갑상선 장애의 진단에 유용한 패널은 예를 들면, 갑상선 자극 호르몬(TSH), 총 T3, 자유 T3, 총 T4, 자유 T4 및 역 T3 중 하나 이상을 포함할 수 있음)의 측정을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 패널은 전통적인 샘플 매트릭스 내에 미량으로 존재하는 하나 이상의 분석물, 예를 들면, 약 100 fg/㎖ 미만의 농도, 바람직하게는 약 10 fg/㎖ 미만의 농도로 분석물을 포함한다. 패널에 포함될 수 있는 분석물의 비-한정적 목록은 예를 들면, IL-17, IL-21, IL-31, Ab-38, Ab-40, Ab-42, Ab-39, Ab-43, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Abeta 올리고머, C-펩티드, IL-13, IL-17A, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, INF-g, PSA, PSAc, Tau, 인-Tau, TNFa, 트로포닌 I, 심장 트로포닌 T, 트로포닌 C, VEGF, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, EPO, LC3B, 알부민, CHO-P, 이. 콜라이 HCP, IgA, IgE, IgG, IgG1, IgG4, IgM, NSO-P, Per-C6, 잔류 단백질 A, IgG2, IgG3, IgG4, AFP, CA125, 활성 캐스파제(Caspase)-3, CXCL11/I-TAC, ErbB2/HER2, HGFR/o-MET, IFN-베타, MMP1, MMP2, MMP3, MMP9, 베타-NGF, TFF3, TIMP1, Kim-1, 알파-2 마크로글로불린, D-이량체, ICAM-1, 미엘로퍼록시다제, 미요글로빈, PAI-1, PCSK9, 플라스미노겐, 레닌(renin)/프로레닌(prorenin), tPA, CXCL1/GRO-알파, CCL2/MCP1, CCL3/MIP-1알파, CCL4/MIP-1베타, CCL5/Rantes, CRP, CXCL9/MIG, CXCL10/IL-10, G-CSF, GM-CSF, IFN-알파, IFN-감파, IL1-알파, IL1-베타, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL12(p70), IL13, IL15, IL18, IL-22, IL-23, IL-33, c-MET, 아디포넥틴(adiponectin), FGF21, GLP-1, 성장호르몬, IGF1, IGF2, 인슐린, 렙틴(leptin), 프로락틴, HIV p24, HB-EGF, AKT, 인-AKT, 및 이들의 조합을 포함한다.
추가로, 본원에 기재된 방법 및 키트는 항미생물 내성 마커(PBP2a/mecA(스타필로코커스 아우레우스(S. aureus), 그람 양성), TEM1(이. 콜라이(E. coli), 그람 음성))에 대한 단일 유기체 민감성을 검출하기 위한 면역분석에서 사용될 수 있다. 이 분석은 그람 양성 세균 및 그람 음성 세균 둘 다에서 이 부류의 분석물을 검출하는 데에 사용될 수 있다. 반코마이신(vancomycin), 베타-락탐(beta-lactam), 카바페넴(carbapenem), 아미노글리코사이드(aminoglycoside) 및 마크롤라이드(macrolide) 항생제에 대한 항미생물 내성과 관련된 하기 표적 단백질들 중 하나 이상의 표적 단백질이 상기 분석에 포함될 수 있다: erm 패밀리, vanA, vanB, aac(6')-aph(2"), KPC, NDM, OXA-48, VIM, OXA-23 유사, OXA-40 유사, OXA-58 유사, CTX-M-1 및 CTX-M-9 패밀리의 ESBL 유전자, 및 이들의 조합.
추가로, 본원에 기재된 방법 및 키트는 하기 부류의 생체마커들 중 하나 이상의 생체마커를 검출하기 위한 면역분석에서 사용될 수 있다: 사이토카인, 순환 종양 특이적 단백질, 하나 이상의 감염성 질환과 관련된 단백질, 세포내 마커 등, 및 이들의 조합.
구체적인 실시양태에서, 패널은 전통적인 샘플 매트릭스 내에 미량으로 존재하는 하나 이상의 분석물, 예를 들면, 약 100 fg/㎖ 미만의 농도, 바람직하게는 약 10 fg/㎖ 미만의 농도로 분석물을 포함한다. 패널은 바람직하게는 하기 분석물들 중 하나 이상을 포함한다: IL-17, IL-21, IL-31, IL-22, IL-23, IL-33, 심장 트로포닌 T 및 이들의 조합. 구체적인 실시양태에서, 샘플에서 검출되는 분석물의 농도는 0.01 fM 내지 100 fM, 0.03 fM 내지 50 fM, 또는 0.03 fM 내지 10 fM의 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 정확히 측정될 수 있는 샘플 중의 분석물 분자의 농도는 약 100 fM 미만, 약 10 fM 미만, 약 3 fM 미만, 약 1 fM 미만, 약 0.3 fM 미만, 약 0.1 fM 미만, 약 0.03 fM 미만, 또는 그 미만이다. 샘플 중의 분석물 분자의 측정된 농도가 샘플 중의 분석물 분자의 실제 농도의 약 20% 이내에 있는 경우 샘플 중의 분석물 분자의 농도는 실질적으로 정확히 측정된 것으로 간주될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 중의 분석물 분자의 측정된 농도는 샘플 중의 분석물 분자의 실제 농도의 약 10% 이내, 약 3% 이내 또는 약 1% 이내에 있을 수 있다. 분석에 대한 검출 한계는 배경 신호보다 2.5 이상의 표준 편차만큼 높은 신호를 제공하는 농도이고, 바람직하게는 분석은 샘플에서 대략 10개 내지 10,000개의 분자, 또는 샘플에서 100개 내지 5,000개의 분자, 또는 샘플에서 100개 내지 1,000개의 분자를 검출할 수 있다.
추가 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 최근의 노출 및/또는 감염으로 인해 미량으로 존재하는 분석물을 검출하는 데에 이용될 수 있다. 다양한 질환 또는 상태, 예를 들면, 암, 세균 감염, 예를 들면, 바실러스 안쓰라시스(Bacillus anthracis)(탄저병), 바이러스 감염, 예를 들면, HIV, 간염, HPV 등, 독소 노출, 예를 들면, 리신, 보툴리늄 독소 A, B 또는 E 등의 초기 진단은 이용가능한 기술, 예컨대, ELISA의 검출 한계(LOD)가 질환의 발병을 표시할 수 있는 미량으로 존재하는 단백질의 순환 농도보다 더 높다는 사실에 의해 제한된다. 패널은 전통적인 샘플 매트릭스 내에 미량으로 존재하는 하나 이상의 분석물, 예를 들면, 약 100 fg/㎖ 미만 또는 약 10 fg/㎖ 미만의 농도로 분석물을 포함할 수 있다. 패널에 포함될 수 있는 분석물의 비-한정적 목록은 예를 들면, HIVgp41, HIVgp120, HIVgp160, HIVp24, HIVp66, HIVp51, HIVp17, HIVp31, Tat, Nef, Viv, A형, B형, C형, D형 또는 E형 간염 항원, HPV 16형, 18형, 31형, 33형, 35형, 39형, 45형, 51형, 52형, 56형, 58형, 59형, 68형, 73형 및/또는 82형, HPV-E6 및 E7 단백질, IL-17, IL-21, IL-31, IL-22, IL-23, IL-33, 심장 트로포닌 T, 및 이들의 조합을 포함한다. 추가로, 패널은 최근의 질환 발병, 노출 및/또는 감염으로 인해 미량으로 존재할 수 있는 하기 분석물들 중 하나 이상의 분석물도 포함할 수 있다: Ab-38, Ab-40, Ab-42, Ab-39, Ab-43, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Abeta 올리고머, C-펩티드, IL-13, IL-17A, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, INF-g, PSA, Tau, 인-Tau, TNFa, 트로포닌 I, 심장 트로포닌 T, 트로포닌 C, VEGF, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, EPO, LC3B, 알부민, CHO-P, 이. 콜라이 HCP, IgA, IgE, IgG, IgG1, IgG4, IgM, NSO-P, Per-C6, 잔류 단백질 A, IgG2, IgG3, IgG4, AFP, CA125, 활성 캐스파제-3, CXCL11/I-TAC, ErbB2/HER2, HGFR/o-MET, IFN-베타, MMP1, MMP2, MMP3, MMP9, 베타-NGF, TFF3, TIMP1, Kim-1, 알파-2 마크로글로불린, D-이량체, ICAM-1, 미엘로퍼록시다제, 미요글로빈, PAI-1, PCSK9, 플라스미노겐, 레닌/프로레닌, tPA, CXCL1/GRO-알파, CCL2/MCP1, CCL3/MIP-1알파, CCL4/MIP-1베타, CCL5/Rantes, CRP, CXCL9/MIG, CXCL10/IL-10, G-CSF, GM-CSF, IFN-알파, IFN-감마, IL1-알파, IL1-베타, IL-3, IL-7, IL-12(p70), IL-13, IL-15, IL-18, c-MET, 아디포넥틴, FGF21, GLP-1, 성장호르몬, IGF1, IGF2, 인슐린, 렙틴, 프로락틴, HB-EGF, AKT, 인-AKT, 및 이들의 조합.
본 발명의 방법은 전술된 바와 같이 매우 다양한 생물학적 물질들 및 생화학적 물질들을 검출할 수 있도록 디자인된다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 혈액, 객담, 대변, 필터, 면봉 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 다양한 관련 임상 매트릭스 및 환경 매트릭스에서 생물전 물질("BWA")을 비롯한 병원성 및/또는 잠재적 병원성 바이러스, 세균 및 독소를 검출하는 데에 이용될 수 있다. 본 발명의 방법을 이용함으로써 (단독으로 또는 함께) 분석될 수 있는 병원체 및 독소의 비-한정적 목록은 다음과 같다: 바실러스 안쓰라시스(Bacillus anthracis)(탄저병), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis)(흑사병), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)(콜레라), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis)(야토병), 브루셀라(Brucella) 종(브루셀라병), 콕시엘라 부르네티이(Coxiella burnetii)(Q 열병), 리스테리아(listeria), 살모넬라(salmonella), 쉬겔라(shigella), 비브리오 콜레라, 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 부르크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei), 바리올라(variola) 바이러스(천연두)를 비롯한 오르쏘폭스(orthopox) 바이러스, 뇌염 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(VEE), 웨스턴 말 뇌염 바이러스(WEE), 이스턴 말 뇌염 바이러스(EEE), 알파바이러스, 출혈성 열병 바이러스, 아레나비리대(Arenaviridae), 번야비리대(Bunyaviridae), 필로비리대(Filoviridae), 플라비비리대(Flaviviridae), 에볼라(Ebola) 바이러스, 스타필로코커스 장독소(staphylococcal enterotoxins), 리신, 보툴리늄 독소(A, B, E), 클로스트리듐 보툴리늄(Clostridium botulinum), 마이코톡신(mycotoxin), 푸사륨(Fusarium), 마이로테슘(Myrotecium), 세팔로스포륨(Cephalosporium), 트리코데르마(Trichoderma), 버티시모노스포륨(Verticimonosporium), 스타키보트리스(Stachybotrys), 마비저(glanders), 밀 진균, 바실러스 글로비기이(Bacillus globigii), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 황우(yellow rain), 트리코테센 마이코톡신(trichothecene mycotoxins), 살모넬라 티피뮤륨(Salmonella typhimurium), 아플라톡신(aflatoxin), 제놉실라 체오피스(Xenopsylla cheopis), 디아마누스 몬타누스(Diamanus montanus), 백수(alastrim), 원두(monkeypox), 아레나바이러스(Arenavirus), 한타바이러스(Hantavirus), 라사(Lassa) 열병, 아르헨티나 출혈성 열병, 볼리비아 출혈성 열병, 리프티 계곡(Rift Valley) 열병 바이러스, 크림-콩고(Crimean-Congo) 바이러스, 한타바이러스, 마르부르그(Marburg) 출혈성 열병, 황열 바이러스, 뎅기열 바이러스, 인플루엔자(H5N1 조류 인플루엔자, 인플루엔자 A, 인플루엔자 A, H1 특이적, 인플루엔자 A, H3 특이적, 인플루엔자 A, H5 특이적, 인플루엔자 A, 2009-H1N1 특이적, 인플루엔자 B를 비롯한 인간 및 동물 변종을 포함함), RSV, 인간 면역결핍 바이러스 I 및 II(HIV I 및 II), A형 간염, B형 간염, C형 간염, 간염(비-A형, B형 또는 C형), 엔테로바이러스(Enterovirus), 엡스테인-바(Epstein-Barr) 바이러스, 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus), 헤르페스 심플렉스(herpes simplex) 바이러스, 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 네이세리아 고노르헤아(Neisseria gonorrheae), 트리코모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis), 인간 유두종 바이러스, 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 보렐리아 부르그도르페리(Borellia burgdorferi), 해모필루스(Haemophilus) 인플루엔자, 마이코플라스마 뉴모니아(Mycoplasma pneumoniae), 클라미도필라 뉴모니아(Chlamydophila pneumoniae), 레기오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 엔테로톡신 B(SEB), 애브린(Abrin), 시가 독소(Shiga Toxin) 1, 시가 독소 2, 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 클로스트리듐 디피사일(Clostridium difficile), 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis), 군 A 스트렙토코커스(streptococcus), 이. 콜라이 O157, 코로나바이러스(coronavirus), 콕사키(Coxsackie) A 바이러스, 리노바이러스(rhinovirus), 파라인플루엔자 바이러스, 호흡 세포융합 바이러스(RSV), 메타뉴모바이러스(metapneumovirus), 백시니아(vaccinia) 및 아데노바이러스(adenovirus).
본원에 기재된 결합 분석에 대한 개선은 결합 분석의 동력학적 범위, 즉 샘플의 희석 또는 농축 없이, 또는 유사한 결과를 제공하는 분석 조건(즉, 사용된 시약의 농도 등)의 변화 없이 시스템 또는 방법에 의해 정량될 수 있는 유체 샘플 중의 분석물 분자의 농도 범위를 확장하는 데에 사용될 수 있고, 이때 분석물 분자의 측정된 농도는 실질적으로 정확히 측정될 수 있다. 유체 샘플 중의 분석물 분자의 측정된 농도가 유체 샘플 중의 분석물 분자의 실제(예를 들면, 진짜) 농도의 약 10% 이내에 있는 경우, 유체 샘플 중의 분석물 분자의 농도는 실질적으로 정확히 측정된 것으로 간주될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유체 샘플 중의 분석물 분자의 측정된 농도는 실질적으로 정확히 측정되고, 이 실시양태에서 상기 측정된 농도는 유체 샘플 중의 분석물 분자의 실제 농도의 약 5% 이내, 약 4% 이내, 약 3% 이내, 약 2% 이내, 약 1% 이내, 약 0.5% 이내, 약 0.4% 이내, 약 0.3% 이내, 약 0.2% 이내 또는 약 0.1% 이내에 있다. 일부 경우, 측정된 농도의 측정치는 약 20% 이하, 약 15% 이하, 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하 또는 약 0.5% 이하의 수준만큼 진짜(예를 들면, 실제) 농도와 상이하다. 일부 실시양태에서, 선택된 분석 방법을 이용하여 공지된 농도의 유체 샘플 중의 분석물 분자의 농도를 측정하고 측정된 농도를 실제 농도와 비교함으로써 분석 방법의 정확성을 측정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 시스템 또는 방법은 약 1000(3 log), 약 10,000(4 log), 약 100,000(5 log), 약 350,000(5.5 log), 1,000,000(6 log), 약 3,500,000(6.5 log), 약 10,000,000(7 log), 약 35,000,000(7.5 log) 또는 약 100,000,000(8 log) 이상의 동력학적 범위에 걸쳐 유체 샘플 중의 분석물 분자의 농도를 측정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 실질적으로 정확히 측정될 수 있는 유체 샘플 중의 분석물 분자의 농도(예를 들면, 비공지된 농도)는 약 5000 fM(펨토몰) 미만, 약 3000 fM 미만, 약 2000 fM 미만, 약 1000 fM 미만, 약 500 fM 미만, 약 300 fM 미만, 약 200 fM 미만, 약 100 fM 미만, 약 50 fM 미만, 약 25 fM 미만, 약 10 fM 미만, 약 5 fM 미만, 약 2 fM 미만, 약 1 fM 미만, 약 500 aM(아토몰) 미만, 약 100 aM 미만, 약 10 aM 미만, 약 5 aM 미만, 약 1 aM 미만, 약 0.1 aM 미만, 약 500 zM(젭토몰) 미만, 약 100 zM 미만, 약 10 zM 미만, 약 5 zM 미만, 약 1 zM 미만, 약 0.1 zM 미만, 또는 그 미만이다. 일부 경우, 검출 한계(예를 들면, 용액에서 측정될 수 있는 분석물 분자의 최저 농도)는 약 100 fM, 약 50 fM, 약 25 fM, 약 10 fM, 약 5 fM, 약 2 fM, 약 1 fM, 약 500 aM(아토몰), 약 100 aM, 약 50 aM, 약 10 aM, 약 5 aM, 약 1 aM, 약 0.1 aM, 약 500 zM(젭토몰), 약 100 zM, 약 50 zM, 약 10 zM, 약 5 zM, 약 1 zM, 약 0.1 zM 이하, 또는 그 미만이다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 정확히 측정될 수 있는 유체 샘플 중의 분석물 분자 또는 입자의 농도는 약 5000 fM 내지 약 0.1 fM, 약 3000 fM 내지 약 0.1 fM, 약 1000 fM 내지 약 0.1 fM, 약 1000 fM 내지 약 0.1 zM, 약 100 fM 내지 약 1 zM, 약 100 aM 내지 약 0.1 zM 이하, 또는 그 미만이다. 검출 상한(예를 들면, 용액에서 측정될 수 있는 분석물 분자의 최고 농도)는 약 100 fM 이상, 약 1000 fM 이상, 약 10 pM(피코몰) 이상, 약 100 pM 이상, 약 1000 pM 이상, 약 10 nM(나노몰) 이상, 약 100 nM 이상, 약 1000 nM 이상, 약 10 μM 이상, 약 100 μM 이상, 약 1000 μM 이상, 약 10 mM 이상, 약 100 mM 이상, 약 1000 mM 이상, 또는 그 초과이다. 일부 실시양태에서, 측정된 유체 샘플 중의 분석물 분자 또는 입자의 농도는 약 50 x 10-15 M 미만, 약 40 x 10-15 M 미만, 약 30 x 10-15 M 미만, 약 20 x 10-15 M 미만, 약 10 x 10-15 M 미만 또는 약 1 x 10-15 M 미만이다.
일부 실시양태에서, 실질적으로 정확히 측정될 수 있는 샘플 중의 분석물 분자의 농도는 약 100 fM 미만, 약 10 fM 미만, 약 3 fM 미만, 약 1 fM 미만, 약 0.3 fM 미만, 약 0.1 fM 미만, 약 0.03 fM 미만, 또는 그 미만이다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 정확히 측정될 수 있는 샘플 중의 분석물 분자의 농도는 약 5000 fM 내지 약 0.1 fM, 약 3000 fM 내지 약 0.1 fM, 약 1000 fM 내지 약 0.1 fM, 약 1000 fM 내지 약 1 fM, 약 100 fM 내지 약 1 fM, 또는 약 100 fM 내지 약 0.1 fM이다. 샘플 중의 분석물 분자의 농도는 샘플 중의 분석물 분자의 측정된 농도가 샘플 중의 분석물 분자의 실제 농도의 약 20% 이내에 있는 경우 실질적으로 정확히 측정된 것으로 간주될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 중의 분석물 분자의 측정된 농도는 샘플 중의 분석물 분자의 실제 농도의 약 10% 이내, 약 3% 이내 또는 약 1% 이내에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 선택된 분석 방법을 이용하여 공지된 농도의 샘플 중의 분석물 분자의 농도를 측정함으로써 분석 방법의 정확성을 측정할 수 있다. 바람직하게는, 분석은 샘플에서 대략 10개 내지 10,000개의 분자, 바람직하게는 샘플에서 100개 내지 5,000개의 분자, 보다 바람직하게는 샘플에서 100개 내지 1,000개의 분자를 검출할 수 있다.
예를 들면, 동일한 포획 항체 및 2개의 검출 항체들 중 어느 하나, 및 동일한 표지 및 검출 기술을 이용하여 측정하였을 때, 본원에 기재된 분석 포맷의 사용은 검출 신호 및 분석 민감성을 통상적인 샌드위치 면역분석 기법에 비해 10배만큼 많이, 바람직하게는 50배 또는 100배만큼 많이, 또는 1,000배만큼 많이 개선할 수 있다. 바람직하게는, 본원에 기재된 분석 포맷의 사용은 검출 신호 및 분석 민감성을 표준 샌드위치 면역분석에 비해 100배만큼 많이 개선한다.
특히 민감한 광학 검출 기법에 커플링될 때 본 발명의 방법의 한 유리한 양태는 신호 증폭이 개별 결합 사건을 밝은 광점으로서 검출할 수 있게 한다는 것이다. 그 다음, (배경 노이즈(noise)로부터의 결합 사건의 개선된 구별을 제공함으로써 낮은 분석물 농도에 대한 보다 더 우수한 민감성을 제공할 수 있는) 개별 사건을 카운팅하거나, (높은 분석물 농도를 측정하기 위한 보다 더 우수한 동력학적 범위를 제공할 수 있는) 모든 결합 사건들에 대한 신호를 적분함으로써 신호의 정량을 수행할 수 있다.
본 발명의 방법은 다양한 분석 장치들 및/또는 포맷들에서 이용될 수 있다. 분석 장치는 예를 들면, 분석이 진행될 때 첨가되었거나 분석 모듈의 웰, 챔버 또는 분석 영역 내에 미리-적재된 분석 시약(표적화제 또는 다른 결합 시약을 포함할 수 있음)을 갖는 분석 모듈, 예컨대, 분석 플레이트, 카트리지, 멀티-웰 분석 플레이트, 반응기, 시험관, 큐벳, 유동 셀, 분석 칩, 측류 장치 등을 포함할 수 있다. 이 장치들은 특정 결합 분석, 예를 들면, 면역분석 또는 면역크로마토그래피 분석을 위해 다양한 분석 포맷들을 사용할 수 있다. 예시적인 분석 장치 및 포맷은 본원에 후술되어 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 건조 상태로 저장된 분석 시약을 사용할 수 있고, 분석 장치/키트는 건조 상태로 분석 시약을 유지하기 위한 건조제 물질을 추가로 포함할 수 있거나 구비할 수 있다. 분석 시약으로 미리-적재된 분석 장치는 저장 동안 뛰어난 안정성을 유지하면서 분석 측정의 속도를 크게 개선할 수 있고 분석 측정의 복잡성을 감소시킬 수 있다. 건조된 분석 시약은 건조된 후 분석에서 사용되기 전에 재구성될 수 있는 임의의 분석 시약일 수 있다. 이들은 결합 분석에서 유용한 결합 시약, 효소, 효소 기질, 표시제 염료, 및 관심있는 분석물을 검출하는 데에 사용될 수 있는 다른 반응성 화합물을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 분석 시약은 검출 기작에 직접적으로 관여하지 않으나 분석에서 보조 역할을 수행하는 물질(차단제, 안정화제, 세제, 염, pH 완충제, 보존제 등을 포함하나 이들로 한정되지 않음)도 포함할 수 있다. 시약은 자유 형태로 존재할 수 있거나, 분석 모듈 내의 구획(예를 들면, 챔버, 채널, 유동 셀, 웰 등)의 표면, 또는 콜로이드, 비드 또는 다른 미립자 지지체의 표면을 비롯한 고체상 상에 지지될 수 있다.
본 발명의 방법은 분석물의 양을 측정하는, 특히 고체상에 결합된 분석물의 양을 측정하는 다양한 방법들과 함께 이용될 수 있다. 이용될 수 있는 기법은 당분야에서 공지된 기법, 예컨대, 세포 배양-기초 분석, 결합 분석(응집 시험, 면역분석, 핵산 혼성화 분석 등을 포함함), 효소 분석, 비색 분석 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 다른 적합한 기법은 당업자에게 용이하게 자명할 것이다. 일부 측정 기법은 시각적 검사에 의해 측정될 수 있게 하고, 다른 측정 기법은 측정을 수행하기 위해 기계의 이용을 요구할 수 있거나 기계의 이용으로부터 이익을 얻을 수 있다.
분석물의 양을 측정하는 방법은 i) 분석물과 표면의 결합 후 표면에서 질량 또는 굴절 지수의 변화를 측정하는 기법(예를 들면, 표면 음파 기법, 표면 플라스몬 공명 센서, 타원편광 기법 등), ii) 질량 분광측정 기법(표면 상의 분석물을 측정할 수 있는 MALDI, SELDI 등과 같은 기법을 포함함), iii) 크로마토그래피 또는 전기영동 기법, iv) (분석물의 간섭 형광에 기초할 수 있는) 형광 기법 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 표지 부재 기법을 포함한다.
분석물의 양을 측정하는 방법은 분석물에 직접적으로 또는 (분석물의 표지된 결합 파트너의 사용을 통해) 간접적으로 부착될 수 있는 표지의 검출을 통해 분석물을 측정하는 기법도 포함한다. 적합한 표지는 직접적으로 가시화될 수 있는 표지(예를 들면, 시각적으로 관찰될 수 있는 입자, 및 측정가능한 신호, 예컨대, 광 산란, 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 방사성, 자기장 등을 생성하는 표지)를 포함한다. 사용될 수 있는 표지는 측정가능한 신호, 예컨대, 광 산란, 흡광도, 형광 등을 유발하는 화학적 활성을 갖는 효소 또는 다른 화학적 반응성 종도 포함한다. 표지로서의 효소의 사용은 ELISA, 효소 면역분석 또는 EIA로서도 지칭되는 효소-연결된 면역흡착 분석에서 잘 확립되어 있다. ELISA 포맷에서, 비공지된 양의 항원이 표면에 부착된 후, 특이적 항체가 항원에 결합할 수 있도록 상기 표면 상에서 세척된다. 이 항체는 효소에 연결되고, 효소에 의해 검출가능한 신호의 변화를 제공하는 생성물로 전환되는 물질이 최종 단계에서 첨가된다. 생성물의 형성은 기질에 비해 측정가능한 성질, 예컨대, 흡광도, 형광, 화학발광, 광 산란 등의 차이로 인해 검출될 수 있다. 본 발명에 따른 고체상 결합 방법과 함께 이용될 수 있는 일부(그러나, 전부가 아님) 측정 방법들은 비결합된 성분(예를 들면, 표지)을 고체상으로부터 제거하기 위한 세척 단계로부터 이익을 얻을 수 있거나 이러한 세척 단계를 요구할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 이러한 세척 단계를 포함할 수 있다.
한 쌍의 검출가능한 표지들을 사용하는 실시양태에서, 표지된 물질들은 독립적으로 검출될 수 있는 그들의 능력, 및/또는 한 쌍의 표지들이 서로 인접할 때, 즉 검출 복합체에서 관심있는 분석물에 직접적으로 또는 간접적으로 각각 결합되어 있을 때 함께 작용하여 검출가능한 신호를 생성하는 상기 물질들의 능력에 기초하여 선택된다. 한 실시양태에서, 제1 검출가능한 표지는 커플링된 효소 반응 시스템의 제1 효소이고, 제2 검출가능한 표지는 커플링된 효소 반응 시스템의 제2 효소이고, 상기 방법은 상기 반응 시스템의 하나 이상의 기질을 첨가하여 상기 효소 반응 시스템의 검출가능한 생성물을 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 검출가능한 생성물을 포함하는 반응기는 이 생성물을 포함하지 않는 반응기로부터 구별될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 제1 효소와 제2 효소가 가까이 인접할 때, 예를 들면, 200 nm 미만, 이상적으로 50 nm 미만 이내에 존재할 때에만 검출가능한 생성물이 생성된다. 한 실시양태에서, 제1 효소는 옥시다제, 예를 들면, 글루코스 옥시다제이고, 제2 효소는 퍼록시다제이고, 기질은 옥시다제 기질, 예를 들면, 글루코스, 및 표지된 티라마이드(tyramide), 앰플렉스 레드(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), 또는 루미놀 유도체(본원에서 표지된 반응성 유도체로서 총칭되고, 바람직한 실시양태에서 표지된 반응성 유도체는 앰플렉스 레드 또는 루미놀을 포함함)를 포함한다. 이 실시양태에서, 제1 효소는 기질과 반응하여 생성물을 생성하고, 이 생성물은 제2 효소와 반응하여 제2 생성물을 생성하고, 이 제2 생성물은 표지된 반응성 유도체와 반응하여 검출가능한 종을 생성한다. 바람직하게는, 검출 복합체에서 제1 효소 및 제2 효소에 의해 촉매작용된 반응은 표면 상에 존재하는 분석물 분자의 수를 측정하기 위해 측정될 수 있는 표지된 반응성 유도체를 표면 상에 고정시킨다. 한 실시양태에서, 표지된 반응성 유도체는 바이오틴-티라마이드이고, 상기 방법은 표지된 스트렙타비딘을 첨가하는 단계 및 스트렙타비딘 상의 표지를 측정하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 방법에서 사용될 수 있는 또 다른 인접성 의존적 표지 시스템은 FRET 쌍이고, 예를 들면, 제1 검출가능한 표지는 FRET 공여자이고 검출가능한 표지는 FRET 수용자이다. 형광 공명 에너지 전달(FRET)은 2개의 염료 분자들의 전자 여기된 상태들 사이의 거리 의존적 상호작용이고, 이때 여기는 광자의 방사 없이 공여자 분자로부터 수용자 분자로 전달된다. FRET의 효율은 이것을 생물학적 거대분자의 치수에 필적할만한 거리에 걸쳐 유용하게 만드는 분자간 분리의 역 6승에 의존한다. 이 표지 시스템에서, 인접성 의존적 신호는 FRET 공여자를 여기시키고 FRET 수용자로부터의 방사를 측정함으로써 측정된다. 공여자 분자 및 수용자 분자는 바람직하게는 가까이 인접하여, 예를 들면, 약 10 내지 100 옹스트롬 이내에 존재하고, 수용자의 흡수 분광은 바람직하게는 공여자의 형광 방사 분광과 중첩되고, 공여자 및 수용자 전이 쌍극자 배향은 대략 평행해야 한다. FRET 쌍의 비-한정적 목록은 하기 표 1에 제공되어 있다.
Figure pct00001
광학 현미경관찰, 예를 들면, 수용자 광퇴색, 공여자 광퇴색, 비 영상화, 감작된 방사 및 형광 수명 측정을 위한 다양한 FRET 검출 방법이 존재한다.
한 쌍의 검출 표지들을 사용하는 실시양태에서 사용될 수 있는 또 다른 적합한 표지 시스템은 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지가 독립적으로 측정될 수 있는 시스템이다. 예를 들면, 제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지는 분광성 면에서 서로 상이한 발광 표지일 수 있다. 대안적으로, 제1 검출가능한 표지는 제1 기질과 반응하여 제1 신호를 생성하는 제1 효소이고, 제2 검출가능한 표지는 제2 기질과 반응하여 상이한 제2 신호를 생성하는 제2 효소이고, 상기 방법은 제1 효소 기질 및 제2 효소 기질을 첨가하는 단계 및 제1 신호 및 제2 신호가 생성되는 반응기의 수를 카운팅하는 단계를 추가로 포함한다. 제1 신호 및 제2 신호는 흡광도의 변화, 및/또는 상이한 분광성을 갖는 발광 신호일 수 있다.
제1 검출가능한 표지 및 제2 검출가능한 표지가 제1 효소 및 제2 효소를 포함하는 경우, 이들은 각각 가수분해효소, 예를 들면, 포스파타제, 설파타제, 갈락토시다제, 글루쿠로니다제 또는 이들의 조합일 수 있으므로, 제1 기질 및 제2 기질은 포스페이트, 설페이트, 갈락토사이드 및 글루쿠로나이드-변경된 안정화된 디옥세탄, 4-메틸움벨리페릴, 플루오레세인 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 대안적으로, 제1 효소 및 제2 효소는 호스라디쉬 퍼록시다제, 베타-갈락토시다제 및 알칼리성 포스파타제로부터 선택된다.
대안적으로, 분석물 분자를 검출하는 데에 사용되는 표지는 단일 분자 형광 검출, 예를 들면, 형광 상관관계 분광법 및/또는 형광 교차-상관관계 분광법에서 사용될 수 있는 형광 종일 수 있다. 단일 분자 형광 검출은 모세관을 통해 검출가능한 종을 포함하는 용출물을 유동시키는 단계, 광원을 모세관 내의 부피에 집중시켜 호출 대역을 생성하는 단계, 및 상기 호출 대역을 광 검출기로 관찰하여 상기 호출 대역을 통한 형광 분자의 통과를 검출하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 샘플 중의 관심있는 분석물(들)은 전기화학발광-기초 분석 포맷, 예를 들면, 전기화학발광(ECL)-기초 면역분석을 이용함으로써 측정될 수 있다. ECL의 높은 민감성, 넓은 동력학적 범위 및 선택성은 의학 진단에 중요한 인자이다. 상업적으로 입수가능한 ECL 기계들은 뛰어난 성능을 입증하였고 그들의 현저한 민감성, 동력학적 범위, 정밀성 및 복잡한 샘플 매트릭스의 허용성을 비롯한 이유로 널리 사용되게 되었다. ECL을 방사하도록 유도될 수 있는 종(ECL 활성 종), 예를 들면, i) 금속이 예를 들면, VIII 족의 귀금속인 유기금속성 화합물(Ru 함유 및 Os 함유 유기금속성 화합물, 예컨대, 트리스-비피리딜-루테늄(RuBpy) 모이어티를 포함함), 및 ii) 루미놀 및 관련 화합물이 ECL 표지로서 사용되고 있다. ECL 표지와 함께 ECL 과정에 참여하는 종은 본원에서 ECL 공반응물로서 지칭된다. 통상적으로 사용되는 공반응물은 삼차 아민(예를 들면, 미국 특허 제5,846,485호 참조), 옥살레이트, 및 RuBpy로부터의 ECL을 위한 퍼설페이트 및 루미놀로부터의 ECL을 위한 과산화수소(예를 들면, 미국 특허 제5,240,863호 참조)를 포함한다. ECL 표지에 의해 발생된 광은 진단 절차에서 레포터 신호로서 사용될 수 있다(본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,238,808호(Bard et al.)). 예를 들면, ECL 표지는 결합 물질, 예컨대, 항체, 핵산 프로브, 수용체 또는 리간드에 공유적으로 커플링될 수 있고; 결합 상호작용에의 결합 시약의 참여는 ECL 표지로부터 방사된 ECL을 측정함으로써 모니터링될 수 있다. 대안적으로, ECL 활성 화합물로부터의 ECL 신호는 화학적 환경을 표시할 수 있다(예를 들면, ECL 공반응물의 형성 또는 파괴를 모니터링하는 ECL 분석을 기술하는 미국 특허 제5,641,623호 참조). ECL, ECL 표지, ECL 분석 및 ECL 분석을 수행하기 위한 기계에 대한 보다 많은 배경지식에 대해서는 미국 특허 제5,093,268호, 제5,147,806호, 제5,324,457호, 제5,591,581호, 제5,597,910호, 제5,641,623호, 제5,643,713호, 제5,679,519호, 제5,705,402호, 제5,846,485호, 제5,866,434호, 제5,786,141호, 제5,731,147호, 제6,066,448호, 제6,136,268호, 제5,776,672호, 제5,308,754호, 제5,240,863호, 제6,207,369호, 제6,214,552호 및 제5,589,136호; 및 공개된 PCT 특허출원 공보 제WO99/63347호, 제WO00/03233호, 제WO99/58962호, 제WO99/32662호, 제WO99/14599호, 제WO98/12539호, 제WO97/36931호 및 제WO98/57154호(이들 모두 본원에 참고로 도입됨)를 참조한다.
본 발명의 방법은 단일 또는 다중 포맷에 적용될 수 있고, 이때 단일 샘플에 대한 다수의 분석 측정이 수행될 수 있다. 본 발명과 함께 이용될 수 있는 다중 측정은 i) 다수의 센서의 사용을 수반하거나; ii) 표면 상의 위치에 기초하여 구별될 수 있는 개별 분석 도메인들을 표면(예를 들면, 어레이) 상에서 사용하거나; iii) 입자 성질, 예컨대, 크기, 형태, 색채 등에 기초하여 구별될 수 있는, 입자 상에 코팅된 시약의 사용을 수반하거나; iv) 광학 성질(예를 들면, 흡광도 또는 방사 분광)에 기초하여 구별될 수 있는 분석 신호를 생성하거나; v) 분석 신호의 일시적 성질(예를 들면, 신호의 시간, 빈도 또는 상)에 기초하는 다중 측정을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 샘플 중의 분석물 분자의 농도의 측정치는 적어도 부분적으로 측정된 파라미터와 보정 표준물의 비교에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 샘플 중의 분석물 분자의 농도의 측정치를 결정하기 위해 분석물 분자를 포함하는 결합 표면의 분율을 보정 곡선과 비교할 수 있다. 보정 곡선은 시험 샘플을 분석하는 데에 사용된 조건 하에서 공지된 농도의 복수의 표준화된 샘플들을 사용하여 분석을 완결함으로써 생성될 수 있다. 각각의 표준화된 샘플에 대한 분석물 분자의 검출/정량과 관련된 신호를 판독할 수 있으므로, 분석물 분자의 검출을 분석물 분자의 공지된 농도와 관련시키는 보정 곡선이 형성될 수 있다. 그 다음, 비공지된 농도의 분석물 분자를 포함하는 샘플에 대해 분석을 완결할 수 있고, 이 분석으로부터의 분석물 분자의 검출이 보정 곡선 상에서 작도될 수 있으므로, 샘플 중의 분석물 분자의 농도의 측정치가 결정될 수 있다.
광학 신호(예컨대, 형광, 화학발광 또는 전기화학발광)를 측정하기 위해 영상화 기법을 이용하는 특정 경우, 결합 사건은 밝은 광원점으로서 검출될 수 있다. 광원점의 표면 밀도가 낮은 경우(예를 들면, RxR 영역에서 광원점을 찾을 확률(이때, R은 검출 시스템의 공간적 해상도임)이 10% 미만인 경우), 임의의 관찰된 광원점은 단일 결합 사건으로 인한 것일 가능성이 있다. 이 조건들 하에서, 카운팅 사건은 가장 민감한 측정을 제공할 수 있다. 표면 밀도가 증가함에 따라 개별 결합 사건을 해상하고 카운팅하기가 점점 어려워진다. 이 조건들 하에서, 결합 표면에 걸쳐 광학 신호를 적분하는 것은 보다 정확한 측정을 제공한다.
본원에 기재된 방법이 당업자에게 공지된 다수의 면역분석 플랫폼에 적용될 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 면역분석 플랫폼의 다양한 특징들은 구체적인 플랫폼에 잘 맞도록 조절될 수 있으나, 이러한 조절은 당업자의 기술 내에 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 방법은 암호화된 입자를 사용하는 비드-기초 포맷에 적용될 수 있다. 이러한 시스템에서, 사용되는 비드는 자기 비드 또는 비-자기 비드일 수 있고, 비드의 표면은 포획 시약의 하나 이상의 카피를 포함하도록 변경된다. 이 시스템에서 사용되는 검출 시약은 한 쌍의 검출 시약들이다. 한 실시양태에서, 2개의 검출 시약들은 구별가능한 형광 표지를 포함한다. 대안적으로, 2개의 검출 시약들은 본원에 기재된 바와 같이 핵산 프로브에 의해 변경되고, 이 경우 면역분석 방법은 검출될 수 있는 각각의 검출 시약의 존재를 표시하는 증폭된 생성물을 생성하기 위해 연장 과정, 예를 들면, RCA-PLA를 포함한다. 검출 시약이 2개의 구별가능한 형광 표지를 포함하는 경우, 측정 단계는 비드를 유동 셀 내로 도입하는 단계, 및 비드가 자기 비드인 경우 비드를 유동 셀에서 포획하는 단계를 포함한다. 검출 시약이 핵산 프로브에 의해 변경되는 경우, 측정 단계는 비드 상에서 샌드위치 복합체를 형성하는 단계, RCA-PLA를 수행하는 단계 및 앰플리콘을 형광 표지된 검출 프로브로 표지하는 단계를 포함한다. 그 다음, 표지된 비드는 유동 셀 내로 도입되고, 비드가 자기 비드인 경우 비드는 유동 셀에서 포획된다. 각각의 실시양태에서, 분석은 형광 표지된 암호화된 비드의 확인에 기초하여 분광적으로 다중화될 수 있다. 각각의 실시양태에서 여기 광원 및 다중-색채 검출을 위한 방사 광 검출기를 사용하여 결합 사건을 검출할 수 있고, 정량은 검출가능한 표지들 둘 다를 갖는 비드, 또는 검출가능하게 표지된 연장 생성물을 포함하는 비드를 카운팅함으로써 달성되고, 또한 정량은 적분된 강도에 의해 달성되고, 예를 들면, 검출은 모든 결합 사건들에 대한 신호를 적분함으로써 달성된다. 따라서, 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획 내에 하기 성분들 중 하나 이상을 포함하는 키트가 전술된 방법과 함께 사용되기 위해 제공될 수 있다: (a) 포획 시약을 갖는 자기 또는 비-자기 비드; (b) 구별가능한 형광 표지를 갖는 2개의 검출 시약들; 및 (c) 분석 프로토콜을 위한 임의적 완충제 및/또는 희석제. 전술된 방법과 함께 사용될 수 있는 또 다른 키트는 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획 상에 하기 성분들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (a) 포획 시약을 갖는 자기 또는 비-자기 비드; (b) 핵산 프로브에 의해 변경된 2개의 검출 시약들(임의적으로, 검출 시약은 별도로 제공되고, 인접 프로브(1 및 2)는 검출 시약을 프로브로 변경시키기 위한 설명서와 함께 추가로 제공됨); 및 (c) 형광 표지된 프로브; 인접 프로브를 사용한 검출 시약의 변경을 위해 요구되는 임의적 시약; 분석 희석제, 보정제, 환형화 올리고뉴클레오티드, 결찰 혼합물 또는 이들의 성분, 예를 들면, 결찰 완충제, ATP, BSA, 트윈 20, T4 DNA 리가제; RCA 혼합물 또는 이의 성분, 예를 들면, BSA, 완충제, dNTP, 트윈 20, Phi29 DNA 중합효소.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 유동 셀에 의해 분석되고 비드에 기초하는 포맷에 적용될 수 있다. 이러한 시스템에서, 사용되는 비드는 자기 비드일 수 있고, 비드의 표면은 포획 시약의 하나 이상의 카피를 포함하도록 변경된다. 이 시스템에서 사용되는 검출 시약은 본원에 기재된 바와 같이 핵산 프로브에 의해 변경된 한 쌍의 검출 시약들이고, 이 경우 면역분석 방법은 검출될 수 있는 각각의 검출 시약의 존재를 표시하는 증폭된 생성물을 생성하기 위해 연장 과정, 예를 들면, RCA-PLA를 포함한다. 측정 단계는 비드 상에서 샌드위치 복합체를 형성하는 단계, RCA-PLA를 수행하는 단계 및 앰플리콘을 ECL-표지된 검출 프로브로 표지하는 단계를 포함한다. 그 다음, 표지된 비드는 유동 셀 내로 도입되고, 비드는 유동 셀에서 포획된다. 구체적으로, 자기 입자, 예를 들면, 비드를, 다양한 금속, 예를 들면, 백금을 포함할 수 있는 전극 표면으로 유인하기 위해 자기장이 적용된다. 전압 공급원을 이용하여 전압을 전극에 인가하고, 방사 광 검출기를 이용하여 결합 사건을 검출할 수 있고; 정량은 검출가능하게 표지된 연장 생성물을 갖는 비드를 카운팅함으로써 달성되고, 또한 정량은 적분된 강도에 의해 달성되고, 예를 들면, 검출은 모든 결합 사건들에 대한 신호를 적분함으로써 달성된다. 전술된 방법과 함께 사용될 수 있는 키트는 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획 상에 하기 성분들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (a) 포획 시약을 갖는 자기 비드; (b) 핵산 프로브에 의해 변경된 2개의 검출 시약들(임의적으로, 검출 시약은 별도로 제공되고, 인접 프로브(1 및 2)는 검출 시약을 프로브로 변경시키기 위한 설명서와 함께 추가로 제공됨); 및 (c) ECL 표지된 프로브; 인접 프로브를 사용한 검출 시약의 변경을 위해 요구되는 임의적 시약; 분석 희석제, 보정제, 환형화 올리고뉴클레오티드, 결찰 혼합물 또는 이들의 성분, 예를 들면, 결찰 완충제, ATP, BSA, 트윈 20, T4 DNA 리가제; RCA 혼합물 또는 이의 성분, 예를 들면, BSA, 완충제, dNTP, 트윈 20, Phi29 DNA 중합효소.
유동 셀에 의해 분석되고 비드에 기초하는 포맷의 구체적인 실시양태에서, 샘플을 바이오티닐화된 단일클론 분석물 특이적 포획 항체, 및 올리고뉴클레오티드에 각각 접합된 단일클론 분석물 특이적 항체들의 혼합물과 함께 항온처리하여 반응시킴으로써 샌드위치 복합체를 형성한다. 스트렙타비딘-코팅된 미세입자의 첨가 후, 상기 복합체는 바이오틴과 스트렙타비딘 사이의 상호작용을 통해 고체상에 결합되게 된다. 상기 혼합물에 결찰 혼합물을 첨가하고, 상기 혼합물을 결찰 혼합물과 함께 항온처리하고 세척하여 과량의 환형화 올리고뉴클레오티드를 제거하고 RCA 혼합물과 함께 항온처리한다. 혼합물을 세척하고 바이오틴-표지된 검출 프로브들의 혼합물을 첨가한다. 적합한 표지, 예를 들면, 발광, 화학발광 또는 전기화학발광 표지, 예를 들면, 설포-TAG를 도입하기 위해, 말단 바이오틴 표지를 갖는 검출 프로브를 합성하고 설포-TAG-표지된 스트렙타비딘에 미리 결합시킨다. 미세입자가 자기장에 의해 전극, 예를 들면, 금속 전극, 예컨대, 백금 전극의 표면 상에 포획되어 있는 측정 셀 내로 반응 혼합물을 흡입한다. 그 다음, 비결합된 물질을 적합한 세척 완충제, 예를 들면, 프로셀(ProCell)(TPA 함유 완충제)로 제거한다. 그 다음, 전압을 전극에 인가하여 광전증배관에 의해 측정되는 화학발광 방사를 유도한다. 전압의 인가 및 발생된 방사의 측정은 임의의 적합한 유동 셀, 예를 들면, (호프만-라 로슈 리미티드(Hoffmann-La Roche LTD.)로부터 입수가능한) 코바스(Cobas) 및/또는 일렉시스(Elecsys) 기계에서 수행될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 개별 분자를 디지털 카운팅하기 위해 모세관 유동을 이용하는 비드-기초 포맷에 적용될 수 있다. 이러한 시스템에서, 사용되는 비드는 자기 비드일 수 있고, 비드의 표면은 포획 시약의 하나 이상의 카피를 포함하도록 변경된다. 이 시스템에서 사용되는 검출 시약은 구별가능한 형광 표지를 포함하는 한 쌍의 검출 시약들이다. 측정 단계는 포획 시약, 분석물 및 검출 시약을 포함하는 샌드위치 복합체를 형성하는 단계, 검출 시약을 가교연결하는 단계, 검출 시약을 용출하는 단계 및 비드를 유동 셀 내로 도입하는 단계를 포함한다. 여기 광원 및 다중-색채 검출을 위한 방사 광 검출기를 이용하여 결합 사건을 검출할 수 있고, 정량은 유동 셀에서 2개의 형광단의 검출을 상호관련시킴으로써 달성되고, 또한 정량은 적분된 강도에 의해 달성되고, 예를 들면, 검출은 모든 결합 사건들에 대한 신호를 적분함으로써 달성된다. 전술된 방법과 함께 사용될 수 있는 키트는 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획 상에 하기 성분들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (a) 포획 시약을 갖는 자기 비드; (b) 구별가능한 형광 표지를 갖는 2개의 가교연결가능한 검출 시약들; 및 (c) 분석 프로토콜을 위한 임의적 완충제 및/또는 희석제.
나아가, 본원에 기재된 방법은 비드를 개별 나노-웰 내로 분리하는 단계를 포함하는 비드-기초 포맷에 적용될 수 있다. 이러한 시스템에서, 사용되는 비드는 자기 비드일 수 있고, 비드의 표면은 포획 시약의 하나 이상의 카피를 포함하도록 변경된다. 이 시스템에서 사용되는 검출 시약은 구별가능한 효소 표지를 포함하는 한 쌍의 검출 시약들이다. 측정 단계는 포획 시약, 분석물 및 검출 시약을 포함하는 샌드위치 복합체를 형성하는 단계 및 2개의 효소 표지를 위한 기질을 첨가하는 단계를 포함한다. 그 다음, 비드는 개별 나노-웰에서 포획된다. 분석은 상이한 분광성을 갖는 효소 생성물의 확인에 기초하여 분광적으로 다중화될 수 있다. 여기 광원 및 다중-색채 검출을 위한 방사 광 검출기를 이용하여 결합 사건을 검출할 수 있고, 정량은 효소 생성물들 둘 다를 함유하는 나노-웰을 카운팅함으로써 달성되고, 또한 정량은 적분된 강도에 의해 달성되고, 예를 들면, 검출은 모든 나노-웰들에 대한 신호를 적분함으로써 달성된다. 전술된 방법과 함께 사용될 수 있는 키트는 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획 상에 하기 성분들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (a) 포획 시약을 갖는 자기 비드; (b) 구별가능한 효소 표지에 의해 각각 변경된 2개의 검출 시약들, 예를 들면, 바이오티닐화된 검출 시약 및 햅텐-접합된 검출 시약; (c) 스트렙타비딘-베타 갈락토시다제, 항-햅텐-접합된 효소, 레소루핀(resorufin)-베타-d-갈락토피라노사이드; (d) 어레이, 예를 들면, 퀀테릭스(Quanterix) DVD 포맷 어레이; (e) 불화탄소 오일; 및 (f) 분석 프로토콜을 위한 임의적 완충제 및/또는 희석제. 이 구체적인 실시양태에서, 검출가능한 신호는 나노-웰 고민감성 시스템을 인접성-기초 검출 시스템과 병용함으로써 향상된다. 이 구체적인 실시양태는 특정 인접성-기초 검출 시스템을 이용함으로써 예시되어 있지만, 당업자는 본원에 기재된 다른 인접성-기초 검출 시스템, 예를 들면, FRET 공여자/수용자 시스템; 분광성 면에서 서로 상이한 발광 표지들; 또는 전술된 바와 같이 가수분해효소인 제1 효소 및 제2 효소, 및 수반되는 적절한 기질의 사용도 분석에서 검출가능한 신호를 향상시키는 데에 사용될 수 있다는 사실을 인식할 것이다.
추가로, 본원에 기재된 방법은 비드-어레이-기초 플랫폼에 적용될 수 있다. 이러한 시스템에서 사용되는 비드는 비-자기 비드일 수 있고, 비드의 표면은 포획 시약의 하나 이상의 카피를 포함하도록 변경된다. 이 시스템에서 사용되는 검출 시약은 제1 핵산 프로브 및 제2 핵산 프로브를 포함하는 한 쌍의 검출 시약들이다. 측정 단계는 포획 시약, 분석물 및 검출 시약을 포함하는 샌드위치 복합체를 형성하는 단계, 상기 프로브들 중 하나를 연장하여, 연장된 서열을 형성하는 단계로서, 이때 연장이 샌드위치 복합체에서 제1 프로브 및 제2 프로브의 공존에 의존하는 것인 단계, 연장된 서열을 형광 프로브로 표지하는 단계, 및 연장된 서열을 표면으로부터 용출물 내로 방출하는 단계를 포함한다. 여기 광원 및 다중-색채 검출을 위한 방사 광 검출기를 이용하여 결합 사건을 검출할 수 있고, 정량은 검출가능하게 표지된 개별 연장 생성물을 카운팅함으로써 달성되고, 또한 정량은 적분된 강도에 의해 달성되고, 예를 들면, 검출은 모든 결합 사건들에 대한 신호를 적분함으로써 달성된다. 전술된 방법과 함께 사용될 수 있는 키트는 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획 상에 하기 성분들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (a) 포획 시약을 갖는 비-자기 비드; (b) 핵산 프로브에 의해 변경된 2개의 검출 시약들(임의적으로, 검출 시약은 별도로 제공되고, 인접 프로브(1 및 2)는 검출 시약을 프로브로 변경시키기 위한 설명서와 함께 추가로 제공됨); 및 (c) 형광 표지된 프로브; 인접 프로브를 사용한 검출 시약의 변경을 위해 요구되는 임의적 시약; 분석 희석제, 보정제, 환형화 올리고뉴클레오티드, 결찰 혼합물 또는 이들의 성분, 예를 들면, 결찰 완충제, ATP, BSA, 트윈 20, T4 DNA 리가제; RCA 혼합물 또는 이의 성분, 예를 들면, BSA, 완충제, dNTP, 트윈 20, Phi29 DNA 중합효소.
본원에 기재된 개선된 결합 분석은 분석에서 사용된 성분들 세트를 포함하는 하나 이상의 키트를 사용함으로써 수행될 수 있다. 예를 들면, 샘플에서 분석물을 검출하는 데에 사용되는 키트는 고착 시약과 분석물에 대한 포획 시약을 포함하는 표면; 및 핵산 프로브에 연결된, 분석물에 대한 검출 시약을 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획 내에 포함한다. 이러한 키트는 고착 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 고착 시약을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있는 또 다른 키트는 고착 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 고착 시약과 분석물에 대한 포획 시약을 포함하는 표면; 제1 핵산 프로브에 연결된 제1 검출 시약; 및 제2 핵산 프로브에 연결된 제2 검출 시약을 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획 내에 포함한다.
본원에 기재된 결합 분석을 수행하기 위해 사용될 수 있는 또 다른 키트는 고착 시약과 분석물에 대한 포획 시약을 포함하는 표면; 제1 인접 프로브를 포함하는, 분석물에 대한 제1 검출 시약; 제2 인접 프로브를 포함하는, 분석물에 대한 제2 검출 시약; 및 (i) 제2 인접 프로브에 상보적인 내부 서열 및 (i) 제1 인접 프로브의 비-중첩 영역에 상보적인 2개의 말단 서열들을 포함하는 연결제 서열을 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획 내에 포함한다. 대안적으로, 키트는 고착 시약과 분석물에 대한 포획 시약을 포함하는 표면; 제1 인접 프로브를 포함하는, 분석물에 대한 제1 검출 시약; 제2 인접 프로브를 포함하는, 분석물에 대한 제2 검출 시약; 및 (i) 제1 연결제 올리고뉴클레오티드 및 (ii) 제2 연결제 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 이때 (x) 제1 연결제의 제1 말단 및 제2 연결제의 제1 말단은 제1 인접 프로브의 2개의 비-중첩 영역들에 상보적이고, (y) 제1 연결제의 제2 말단 및 제2 연결제의 제2 말단은 제1 인접 프로브의 2개의 비-중첩 영역들에 상보적이다. 추가로, 이 키트들 중 어느 하나 또는 둘 다에서 고착 시약은 고착 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
뿐만 아니라, 본원에 기재된 방법은 제1 검출가능한 표지를 포함하는 제1 검출 시약; 제2 검출가능한 표지를 포함하는 제2 검출 시약; 하나 이하의 분석물 분자를 함유하도록 구성된 복수의 반응기들; 및 임의적으로, 포획 시약을 포함하는 표면을 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획 내에 포함하는 키트를 사용함으로써 수행될 수 있다.
마지막으로, 본원에 기재된 방법을 이용하여 분석물을 검출하기 위한 키트는 고정된 포획 시약을 포함하는 표면; 제1 검출가능한 표지를 갖는 제1 검출 시약; 제2 검출가능한 표지를 갖는 제2 검출 시약; 및 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약과 반응하는 교차연결제를 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획 내에 포함할 수 있다. 교차연결제는 검출 시약에 부착된 반응성 모이어티를 연결하는 다작용성 교차연결제, 또는 검출 시약에 부착된 결합 모이어티의 다가 결합 파트너를 포함할 수 있다. 적합한 다작용성 교차연결제는 아민, 티올, 하이드라지드, 알데하이드, 에스테르, 요오도아세트아미드, 말레이미드, 클릭 화학 시약 및 이들의 조합을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 마찬가지로, 다가 결합 파트너의 한 예는 그 동물 종의 항체인 검출 시약을 표적화하는 다가 항-종 항체이다. 교차연결제는 동반 결합 파트너와 쌍을 형성할 때 검출 시약에 부착되는 스트렙타비딘, 아비딘 또는 바이오틴도 포함할 수 있다. 교차연결제는 키트의 성분에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된 핵산 프로브에 상보적인 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드일 수도 있다. 구체적인 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 사용되는 키트는 고정된 포획 시약을 포함하는 표면; 제1 검출가능한 표지 및 제1 핵산 프로브를 갖는 제1 검출 시약; 제2 검출가능한 표지 및 제2 핵산 프로브를 갖는 제2 검출 시약; 및 제1 핵산 프로브 및 제2 핵산 프로브에 상보적인 영역을 갖는 제3 핵산을 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획 내에 포함한다.
본원에 기재된 키트의 표면은 하나 이상의 분석물 분자에 대한 복수의 포획 시약들을 포함할 수 있고, 이때 상기 포획 시약은 표면 상에, 예를 들면, 어레이, 멀티-웰 플레이트, 또는 마이크로-웰 또는 나노-웰 플레이트 내에 위치한 복수의 해상가능한 결합 영역들 또는 반응기들에 걸쳐 분포되어 있다. 추가로, 표면은 분석물 분자에 대한 복수의 포획 시약들을 각각 포함하는 복수의 입자들도 포함할 수 있다.
전술된 키트는 하기 성분들 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다: 하나 이상의 추가 시약, 완충제, 중합효소, 리가제 및/또는 (표지된 또는 비표지된) dNTP. 추가로, 하나 이상의 검출 시약이 검출가능한 표지를 포함하는 경우, 키트는 키트에서 사용된 검출가능한 표지에 대한 공반응물도 포함할 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 검출 시약이 커플링된 효소 반응 시스템의 성분인 경우, 각각의 검출 시약은 제1 효소 및 제2 효소를 포함하고, 키트는 커플링된 효소 반응 시스템을 위한 하나 이상의 기질, 및 임의적으로 커플링된 효소 반응 시스템의 생성물에 결합하도록 구성된 표지된 성분을 하나 이상의 용기, 바이알 또는 구획 내에 추가로 포함한다. 예를 들면, 제1 효소는 옥시다제일 수 있고, 제2 효소는 퍼록시다제일 수 있고, 키트는 옥시다제 기질 및 표지된 티라마이드 유도체를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약은 인접성 의존적 검출 시스템의 성분, 예를 들면, FRET 공여자 및 FRET 수용자, 또는 분광성 면에서 서로 상이한 발광 표지들을 포함할 수 있다.
추가 대안적 실시양태
추가 실시양태는 도 7에 예시되어 있다. 패널 (a)의 샌드위치 면역분석 복합체에서 각각의 인접 프로브의 일부가 각각의 절편에 혼성화된 짧은 RNA 가닥에 의해 일시적으로 보호된다. 각각의 인접 프로브가 서로 혼성화될 수 있도록 RNA 가닥이 효소에 의해 제거되고, 쇄가 바이오티닐화된 dNTP들을 사용한 중합효소 연장에 의해 연장된다(패널 (b)). 쇄 내로 도입된 각각의 바이오티닐화된 염기는 검출가능한 표지로 표지된 스트렙타비딘에 결합된다(패널 (c)).
또 다른 방법은 도 8에 예시되어 있다. (패널 (a)에 나타낸 바와 같이) 인접 프로브가 고착 시약 및 검출 시약에 부착될 수 있거나, 전술된 바와 같이 각각의 인접 프로브가 2개의 검출 시약에 부착될 수 있다(표시되어 있지 않음). 도 7에 예시된 방법처럼, 각각의 인접 프로브의 일부가 각각의 절편에 혼성화된 짧은 RNA 가닥에 의해 일시적으로 보호된다. 각각의 인접 프로브가 서로 혼성화될 수 있도록 RNA 가닥이 효소에 의해 제거되고, 쇄가 바이오티닐화된 dNTP들을 사용한 중합효소 연장에 의해 연장된다(패널 (b)). 쇄 내로 도입된 각각의 바이오티닐화된 염기는 검출가능한 표지로 표지된 스트렙타비딘에 결합된다(패널 (c)).
실시예
실시예 1. 인접 결찰 및 롤링 서클 증폭을 위한 일반적인 프로토콜
인접 프로브 1 및 2를 100 ㎕ 완충제 중의 200 ㎍ 제1 검출 항체에 첨가하여 표적 분석물에 대한 한 쌍의 검출 항체들을 변경시키고, 1.74 ㎕의 23 mM 설포-SMCC를 첨가하고 150 mM 포스페이트 완충제에서 희석하고 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 자유 설포-SMCC를 크기 배제 크로마토그래피로 제거하였다. 검출 항체의 최종 농도는 2 mg/㎖이거나 이보다 약간 더 낮았다. 구십오(95) ㎕의 300 μM 티올-변경된 올리고뉴클레오티드(인접 프로브 1 및 2)를 실온에서 1시간 동안 5 ㎕의 100 mM 포스페이트 완충제 중의 1 mM DTT(0.5 mM EDTA, pH 8.4)로 환원시켰다. 인접 프로브 1 및 2의 서열은 다음과 같다:
티올-변경된 인접 프로브 1: SH-AAA AAA AAA AGA CGC TAA TAG TTA AGA CGC TTU UU(서열번호 1; 이때, 3개의 U 잔기들은 2' O-메틸 RNA임)
티올-변경된 인접 프로브 2: SH-AAA AAA AAA ATA TGA CAG AAC TAG ACA CTC TT(서열번호 2).
예를 들면, 3개의 스핀 컬럼을 따로 사용하여 과량의 설포-SMCC 및 DTT를 제거하고 공유접합을 위해 항체 및 DNA를 모았다. 용액을 혼합하면서 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 항체-인접 프로브 접합체를 예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피로 정제하여 비접합된 항체 및 올리고뉴클레오티드를 제거하였다.
MSD 멀티-스폿(MULTI-SPOT)® 플레이트를 적절한 MSD® 차단 용액으로 1시간 동안 차단하고 세척하였다. 플레이트 상의 각각의 결합 도메인은 포획 항체 및 고착 모이어티(BSA-올리고뉴클레오티드 접합체로서 고정됨, 이 올리고뉴클레오티드는 롤링 서클 앰플리콘에 대해 특이적이도록 선택됨)를 포함하였다. 본 실시예에서 사용된 고착 올리고뉴클레오티드의 서열은 5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAAAAAAAAAAAA-/3ThioMC3-D/-3'(서열번호 3)이었다. 이십오(25) ㎕의 각각의 분석 희석제 및 보정제, 또는 샘플(적절한 경우 희석됨)을 각각의 웰에 첨가하였다(50 ㎕ 총 부피를 발생시킴). 플레이트를 1시간 내지 3시간 동안 진탕하면서 항온처리하고 각각의 웰을 세척하였다. 전술된 바와 같이 제조된, 인접 프로브 1 및 2로 표지된 검출 항체의 용액을 각각의 웰에 첨가하고(웰 당 25 ㎕), 1시간 내지 2시간 동안 진탕하면서 항온처리하였다(대안적으로, 각각의 개별 검출 항체를 순차적으로 첨가할 수 있고, 이때 첨가할 때마다 첨가 후 1시간 동안 항온처리함). 하기 성분들을 포함하는 결찰 혼합물을 각각의 웰에 첨가하였다: (i) 환형화 올리고뉴클레오티드 1(4 nM), 환형화 올리고뉴클레오티드 2(4 nM), 결찰 완충제, ATP(1 mM), T4 DNA 리가제(0.15 U/㎕), 이때 각각의 환형화 올리고뉴클레오티드는 다음과 같았다:
Circ-1: 포스페이트-CTA TTA GCG TCC AGT GAA TGC GAG TCC GTC TAA GAG AGT AGT AGA GCA GCC GTC AAG AGT GTC TA(서열번호 4).
Circ-2: 포스페이트-GTT CTG TCA TAT TTA AGC GTC TTA A(서열번호 5).
플레이트를 실온에서 30분 동안 결찰 혼합물과 함께 항온처리하고 세척하여 과량의 환형화 올리고뉴클레오티드를 제거하고, 37℃에서 1.5시간 동안 RCA 혼합물과 함께 항온처리하였고, 이때 상기 RCA 혼합물은 RCA 완충제, dNTP(각각 250 μM) 및 Phi29 DNA 중합효소(0.125 U/㎖)를 함유하였다. 플레이트를 세척하고 검출 프로브의 혼합물을 첨가하고 37℃에서 30분 동안 항온처리하였고, 이때 상기 검출 프로브의 혼합물은 20 mM 트리스(Tris), 1 mM SDTA, 250 mM NaCl, 0.01% 트리톤(Triton), BSA(200 ㎍/㎖), 트윈 20(0.05%) 및 검출 프로브(6.25 nM)를 포함한다. 검출 프로브는 서열 CAG TGA ATG CGA GTC CGT CT(서열번호 6)이었다. 전기화학발광 표지 설포-TAG(메소 스케일 디아그노스틱스)를 도입하기 위해, 말단 바이오틴 표지를 갖는 검출 프로브를 합성하고 설포-TAG 표지된 스트렙타비딘에 미리 결합시켰다. 플레이트를 세척하고 150 ㎕의 MSD 판독 완충제로 충전시키고 MSD 섹터® 6000 판독기 상에서 즉시 판독하였다(메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery)(미국 메릴랜드주 록빌 소재)에 의해 공급된 플레이트 및 판독기).
이 일반적인 절차를 이용하여 하기 분석물들을 검출하였다: 트로포닌 I, Akt(총), 인-Akt(473), 인-Akt(308), 인플루엔자 A 핵단백질(NP), IL-12p40, IL-12p70, Abeta1-42, TNF-알파 모델 시스템을 사용한 가교 및 이소타이핑(isotyping) Ig 분석, B형 간염 표면 항원을 사용한 가교 및 이소타이핑 Ig 분석, 및 라임(Lyme) C6을 사용한 가교 및 이소타이핑 Ig 분석. 표준 샌드위치 면역분석에 비해 ECL 신호 및 분석 민감성의 증가는 분석들 사이에 상이하였지만, 100배만큼 높은 개선이 관찰되었다. 시험된 일부 분석들, 예를 들면, 트로포닌-I, Akt(총), IL-12p40, IL-12p70 및 Abeta1-42의 경우, 고착 모이어티의 존재는 증폭 단계 동안 검출 복합체의 해리를 방해함으로써 신호 및/또는 희석 선형성을 개선하였다. 전술된 절차에 따라 수행된 IL-10 분석에 대한 보정 곡선은 도 9에 제시되어 있다. 추가로, (하기) 표 2는 전술된 절차에 따라 수행된 대표적인 분석 세트(제2열, "3-AB RCA/PLA 분석")에 대한 LOD를 메소 스케일 디아그노스틱스(MSD)(미국 메릴랜드주 록빌 소재)로부터의 표준 2개 항체 면역분석 프로토콜(메소 스케일 디아그노스틱스 웹사이트 상에서 입수가능함)(제3열, "MSD V-Plex 2-AB 면역분석 프로토콜")에 대한 LOD와 비교하여 보여준다.
Figure pct00002
실시예 2. 고착 시약을 사용하거나 사용하지 않은 분석 프로토콜
MSD 7-스폿 멀티-스폿 플레이트를 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 트로포닌 I 포획 항체(220 ㎍/㎖)로 코팅하였다. 포획 항체를 앰플리콘에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드가 공유부착된 고착 모이어티 BSA(존재하는 경우 5 ㎍/㎖ 고착제)와 함께 스폿팅하였거나 이러한 고착 모이어티 없이 스폿팅하였다. 이십오(25) ㎕의 각각의 분석 희석제, 보정제, 또는 샘플(적절한 경우 희석됨)을 각각의 웰에 첨가하였다(총 50 ㎕). 플레이트를 2시간 동안 진탕하면서 항온처리하고 각각의 웰을 세척하였다. 전술된 바와 같이 제조된, 인접 프로브 1 및 2로 표지된 검출 항체의 용액을 각각의 웰에 첨가하고(웰 당 25 ㎕), 1시간 동안 진탕하면서 항온처리하였다. 결찰 혼합물을 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 30분 동안 결합 혼합물과 함께 항온처리하고 세척하여 과량의 환형화 올리고뉴클레오티드를 제거하고, 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 37℃에서 1.5시간 동안 RCA 혼합물과 함께 항온처리하였다. 플레이트를 세척하고 검출 프로브의 혼합물을 첨가하고 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 플레이트를 세척하고 150 ㎕의 MSD 판독 완충제로 충전하고 MSD 섹터® 6000 판독기 상에서 즉시 판독하였다. 형광 영상화를 위해 MSD 전극을 플레이트 상부로부터 제거하고 PBS 및 커버 슬립을 사용하여 젖은 상태로 유지하였다. 자일라(Zyla) 카메라, 20배 대물렌즈, 2x2 비닝(binning) 및 주문제작 필터 세트를 갖춘 현미경 상에서 2초 노출로 표면을 가시화하였다.
(하기) 표 3에 나타낸 바와 같이, ECL 값은 고착 시약의 존재 하에서 4배 내지 5배 더 높았고, 검출 한계는 3배 더 낮았다(보다 더 민감하였다).
Figure pct00003
도 10a 및 10b는 5 ㎍/㎖ 고착 시약을 갖는 플레이트 표면(패널 (a)) 및 고착 시약을 갖지 않는 플레이트 표면(패널 (b))의 형광 현미경관찰 영상을 보여준다. 상기 영상은 개별 결합 사건과 관련된 밝은 형광 스폿을 보여주고, 고착 시약의 존재 하에서의 RCA 증폭이 관찰가능한 결합 사건을 발생시키는 데에 있어서 보다 더 효율적이었다는 것을 확인시켜준다.
실시예 3. 1개의 연결제 올리고뉴클레오티드와 2개의 연결제 올리고뉴클레오티드의 비교
2개의 별개 결찰 부위를 갖는 2개의 연결제 올리고뉴클레오티드 대신에 1개의 결찰 부위를 갖는 단일 선형 연결제 올리고뉴클레오티드를 사용하여 실시예 2에 기재된 분석을 반복함으로써 환형 주형을 형성하였다. 도 11a에 나타낸 바와 같이, 결찰 부위 1 또는 결찰 부위 2에서 개방된 단일 선형 연결제 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 두 단일 선형 연결제 올리고뉴클레오티드들을 실시예 1 및 2에서 사용된 올리고뉴클레오티드들인 Circ-1과 Circ-2의 조합과 함께 나란히 시험하였다. 실시예 2에 기재된 프로토콜을 사용하였고, 추가로 단일 선형 연결제 올리고뉴클레오티드를 125 nM, 62.5 nM 및 31 nM 농도에서 시험한 반면, Circ-1 올리고뉴클레오티드와 Circ-2 올리고뉴클레오티드의 조합을 사용한 표준 분석을 125 nM에서 시험하였다. 도 11b에 나타낸 바와 같이, 2-부분 연결제 올리고뉴클레오티드 혼합물(Circ-1 및 Circ-2)과 거의 동일한 효율로 2개의 단일 선형 연결제 올리고뉴클레오티드들을 RCA 증폭 생성물 내로 성공적으로 도입하였다. 결찰 부위 1에서 개방된 단일 선형 연결제 올리고뉴클레오티드는 신호 강도, 비특이적 배경 및 전체 민감성에 기초할 때 상기 2-부분 연결제 혼합물에 필적할만한 성능을 가졌다. 예측된 바와 같이, 결찰 부위 2에서 개방된 단일 선형 연결제 올리고뉴클레오티드는 보다 더 높은 비특이적 배경 및 보다 더 낮은 민감성을 가졌다. 이 후자 경우, 결찰 및 프라이밍 둘 다가 인접 프로브 #1의 존재에만 의존하므로; 인접 증폭 방식의 특이성 이익들 중 일부가 상실되었다.
실시예 4. 대안적 인접 프로브, 고착제 올리고뉴클레오티드 및 연결제 서열을 사용하여 수행한 3-항체 분석
하기 대안적 시약 세트를 사용하되 실시예 1에 요약된 프로토콜을 이용하여 분석을 수행하였다:
Figure pct00004
표 5의 결과는 트로포닌의 농도가 500 pg/㎖이고 멀티-스폿 플레이트의 각각의 웰이 표 4에 나열된 세트들 중 하나로부터의 고착제 올리고뉴클레오티드를 갖는 1개의 포획 스폿을 포함하는 트로포닌 분석에 대한 결과이다. 상기 분석은 실시예 1에 기재된 농도와 동일한 농도로 1개의 인접 프로브(1) 및 1개의 인접 프로브(2)를 사용하였다. 세트 (a) 내지 (c)에 대한 비특이적 결합은 이 세트들이 실시예 1에 기재된 농도에 비해 9배 더 높은 농도의 검출 올리고뉴클레오티드-SA-STAG를 가졌기 때문에 더 높았다. 검출 올리고뉴클레오티드-SA-STAG의 보다 더 높은 농도는 실시예 1에서와 같이 SA-STAG 단독의 적정보다는 오히려 함께 미리 결합된 복합체의 적정으로부터 비롯되었다.
Figure pct00005
실시예 5. 추가 면역분석 플랫폼에 대해 수행된 3-항체 분석
(a) 암호화된 입자를 사용하는 비드-기초 면역분석 포맷
모든 분석 단계들을 96-웰 필터 플레이트에서 수행한다. (10 In의 Hg를 초과하지 않는) 진공 매니폴드를 사용하여 플레이트로부터 액체를 제거한다. 플레이트를 결코 뒤집지 않는다. 막히는 현상이 일어나는 경우, 끝이 뾰족한 15 ㎖ 원추형 튜브를 사용하여 막힌 웰 아래의 영역을 약하게 누른 후, 1 ㎖ 파스퇴르 피펫 고무 패킹을 사용하거나 엄지손가락으로 막힌 웰을 눌러 압력을 발생시킴으로써 막힘을 제거한다. 최종 흡입 단계 후, 종이 타월의 적층체 상에서 플레이트의 바닥을 가볍게 두드린 후 킴와이프(Kimwipe)로 필터 플레이트의 바닥을 가볍게 눌러 잔류 액체/소적을 제거한다.
세척 용액 제조: 20x 세척 용액 병의 전체 내용물을 285 ㎖의 탈이온수로 희석함으로써 1x 작업 세척 용액을 제조한다.
분석 표준물 제조: 동결건조된 표준물을 100% 분석 희석제(혈청 및 혈장 샘플) 또는 50% 분석 희석제/50% 조직 배양 배지(조직 배양 상청액)로 재구성한다; 재구성 부피: (i) 1개 바이알: 1 ㎖; (ii) 2개 바이알: 바이알 당 0.5 ㎖. 8분 내지 10분 동안 실온에서 재수화한다. 바이알(들)을 수회 가볍게 뒤집고 바이알을 추가 3분 내지 5분 동안 정치시켜 완전한 수화를 보장한다. 1개 초과의 표준물이 사용되는 경우, 동등한 부피의 각각의 표준물을 조합하고 약하게 혼합한다. 재구성된 표준물의 3배 연속 희석을 수행하여 7점 표준 곡선을 작성한다.
분석물 포획:
(1) 10x 포획 비드 스톡(stock)을 볼텍싱하고(30초) 초음파처리한다(30초). 포일로 감싼 튜브에서, 10x 포획 비드 스톡(웰 당 2.5 ㎕)을 작업 세척 용액(웰 당 25 ㎕, 약 2,000개 내지 5,000개 비드/분석)에서 희석한다. 보다 더 높은 다중화를 위해, 보유된 10x 포획 비드 스톡의 여분의 부피를 참작하여 작업 세척 용액의 부피를 조절한다.
(2) 표준물 및 샘플 웰을 200 ㎕의 작업 세척 용액으로 미리 적신다.
(3) 희석된 포획 비드 용액을 볼텍싱하고(30초) 초음파처리한다(30초). 25 ㎕를 즉시 각각의 분석 웰에 첨가한 후, 200 ㎕의 1x 세척 용액을 첨가한다. 흡입하고 200 ㎕의 작업 세척 용액으로 세척을 반복한다. 필요한 경우 필터 플레이트의 바닥을 가볍게 두드리고 누른다.
(4) 50 ㎕의 항온처리 완충제를 모든 분석 웰에 첨가한다.
(5) 100 ㎕의 표준물을 지정된 웰에 첨가한다. 샘플에 대해 지정된 웰의 경우, 50 ㎕의 분석 희석제에 이어서 50 ㎕의 샘플을 첨가한다. 플레이트를 덮고 궤도 플레이트 진탕기(500 내지 600 rpm) 상에서 실온에서 2시간 동안 항온처리한다. 모든 항온처리 동안 분석 플레이트를 불투명한 덮개로 덮어 광으로부터 보호한다. 궤도 진탕기의 반경에 따라 속도가 조절될 필요가 있을 수 있다.
분석물 검출
(6) 형광 표지된 검출 항체의 1x 혼합물을 제조한다: 10x 검출 항체 혼합물(웰 당 10 ㎕)을 희석제(웰 당 100 ㎕)로 희석한다. 혼합물은 관심있는 분석물에 대해 특이적인 한 쌍의 검출 항체들(알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 350(청색 형광 표지)으로 표지된 검출 항체, 및 알렉사 플루오르 594(적색 형광 표지)로 표지된 다른 검출 항체)(이 형광 표지들 각각은 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)(미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재; www.lifetechnologies.com)로부터 입수가능함)을 포함한다. 보다 더 높은 다중화를 위해, 요구된 10x 항체 혼합물 스톡의 여분의 부피를 참작하여 희석제의 부피를 조절한다. 분석 웰을 흡입하고 200 ㎕의 작업 세척 용액으로 2회 세척한다. 100 ㎕의 희석된 검출 항체 혼합물을 각각의 분석 웰에 첨가한다. 플레이트를 덮고 플레이트 진탕기(500 내지 600 rpm) 상에서 1시간 동안 항온처리한다.
분석 판독
(8) 분석 웰을 흡입하고 200 ㎕의 작업 세척 용액으로 3회 세척한다. 필터 플레이트의 바닥을 깨끗한 종이 타월로 건조하여 모든 잔류 소적들을 완전히 제거한다. 100 ㎕의 작업 세척 용액을 각각의 분석 웰에 첨가하고 플레이트를 2분 내지 3분 동안 플레이트 진탕기(500 내지 600 rpm) 상에 놓는다.
(9) 각각의 형광 표지에 대한 색채 채널을 포함하는 다중-색채 형광 입자 분석기(예컨대, FACS 시스템 또는 변경된 xMAP 기계)에서 비드 현탁액을 분석한다. 최대 민감성을 위해, 임의의 입자가 0개 또는 1개의 결합된 분석물만을 가질 가능성이 높은 조건 하에서 분석을 수행하고, 형광 표지들 둘 다를 포함하는 (입자 암호화에 기초하여) 주어진 분석물에 대해 특이적인 입자의 수를 카운팅함으로써 분석물의 양을 정량한다. 임의적으로, 암호가 비드 상의 포획 항체의 분석물 특이성을 표시하는 암호화된 비드, 및 각각의 분석물에 대한 추가 쌍의 검출 항체를 사용하여 다중 포맷으로 분석을 수행할 수 있다. 암호화가 확인된 경우, 분석기는 비드에 도입된 추가 형광 색채를 사용하는 xMAP에서와 같이 추가 색채를 측정하고 비드 암호를 확인하기 위한 추가 검출 채널을 가져야 한다.
(b) 핵산 프로브에 의해 변경된 2개의 검출 시약들을 사용하되, 고착 모이어티를 포함하는 암호화된 입자를 사용하는 비드-기초 면역분석 포맷
실시예 5(a)에 요약된 바와 같이, 모든 분석 단계들을 96-웰 필터 플레이트에서 수행한다. 세척 용액 및 분석 표준물을 실시예 5(a)에 기재된 바와 같이 제조하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 인접 프로브 1 및 2를 첨가하여 표적 분석물에 대한 한 쌍의 검출 항체들을 변경시킨다. 분석물을 실시예 5(a)에 기재된 바와 같이 포획 비드 상에서 포획한다. 포획 비드는 롤링 서클 앰플리콘에 대해 특이적이도록 선택된 올리고뉴클레오티드와 함께, BSA-올리고뉴클레오티드 접합체로서 비드 표면에 고정된 고착 모이어티를 포함한다. 사용된 고착 올리고뉴클레오티드의 서열은 서열번호 3이다.
이십오(25) ㎕의 분석 희석제, 보정제 또는 샘플(적절한 경우 희석됨)을 포획 비드의 혼합물과 혼합한다. 혼합물을 1시간 내지 3시간 동안 진탕하면서 항온처리하고 세척한다. 전술된 바와 같이 제조된, 인접 프로브 1 및 2로 표지된 검출 항체의 용액을 혼합물에 첨가하고 1시간 내지 2시간 동안 진탕하면서 항온처리한다(대안적으로, 각각의 개별 검출 항체를 순차적으로 첨가할 수 있고, 이때 첨가할 때마다 첨가 후 1시간 동안 항온처리한다). 실시예 1에 기재된 결찰 혼합물을 첨가한다. 혼합물을 37℃에서 30분 동안 결찰 혼합물과 함께 항온처리하고 세척하여 과량의 환형화 올리고뉴클레오티드를 제거하고, 37℃에서 1.5시간 동안 RCA 혼합물과 함께 항온처리하였고, 이때 상기 RCA 혼합물은 상기 실시예 1에 기재되어 있다. 혼합물을 세척하고, 플루오로세인-표지된 검출 프로브의 혼합물을 첨가하고 37℃에서 30분 동안 항온처리하였고, 이때 상기 검출 프로브의 혼합물은 전술되어 있다. 혼합물을 세척하고 입자를 다중-채널 형광 입자 분석기 내로 흡입한다.
(c) 비드-기초 포맷, 및 개별 나노-웰 내로의 포획 분석물 분자의 분리
샘플을 100 ㎕의 25% 소 혈청(2배 내지 4배 희석)에서 제조하고, 포획 항체로 코팅된 500K 비드(상자성 2.7 ㎛, 임의적으로 형광 암호화됨)를 샘플에 첨가한다. 샘플을 23℃에서 약 2시간 동안 항온처리한다. 샘플을 PBS(5X, 0.1% 트윈 20)로 3회 세척하고, 표지된 검출 항체의 혼합물(제1 바이오티닐화된 검출 항체 및 햅텐-접합된 항체를 포함하는 혼합물)을 첨가한다. 혼합물을 23℃에서 약 1시간 동안 항온처리한다. 혼합물을 PBS(5X, 0.1% 트윈-20)로 3회 세척하고, 효소 표지를 첨가하고, 스트렙타비딘-베타-갈락토시다제(40 pM), 항-햅텐-접합된 효소도 첨가하고, 혼합물을 23℃에서 약 30분 동안(또는 시모아(Simoa) 분석기에서 3분 동안) 항온처리한다. 혼합물을 PBS(5X, 0.1% 트윈-20)로 7회 세척하고, 효소 기질인 15 ㎕의 레소루핀-베타-d-갈락토피라노사이드(적재 완충제 중의 100 μM)를 첨가한다.
혼합물을 (원반 당 24개의 샘플을 갖는, 환형 올레핀 중합체로부터 제조된 DVD 포맷으로 퀀테릭스(Quanterix)에 의해 제공된) 나노-웰의 어레이 상으로 옮기고 2분간 침강(settle)시킨다. 상기 어레이를 완충제로 씻어내고, 상기 어레이를 불화탄소 오일로 밀봉하고 23℃에서 2분 내지 5분 동안 항온처리하고, 결과를 다중-색채 형광 이미저 상에서 판독한다. 영상 분석을 이용하여 두 형광 효소 생성물들을 함유하는 나노-웰의 수를 카운팅함으로써 샘플 중의 분석물의 농도와 상관관계를 갖는 값을 제공한다.
(d) 유동 셀에 의해 분석된 비드-기초 면역분석 포맷
제1 항온처리: 10 ㎕의 샘플, 바이오티닐화된 단일클론 분석물 특이적 포획 항체(2.6 mg/ℓ의 작업 용액), 및 올리고뉴클레오티드에 각각 접합된 단일클론 분석물 특이적 항체들의 혼합물(0.3 mg/ℓ의 작업 용액)을 반응시켜 샌드위치 복합체를 형성한다. 상기 단일클론 분석물 특이적 항체들의 혼합물은 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조되고, 상기 혼합물은 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 인접 프로브 1 및 2에 접합된 한 쌍의 항체들을 포함한다.
제2 항온처리: 스트렙타비딘-코팅된 미세입자(Dynal M280, 2.8 ㎛, 0.72 mg/㎖, 바이오틴에 대한 결합 용량 470 ng/mg)의 첨가 후, 복합체는 바이오틴과 스트렙타비딘 사이의 상호작용을 통해 고체상에 결합되게 된다. 실시예 1에 기재된 프로토콜에 따라 제조된 결찰 혼합물을 혼합물에 첨가한다. 상기 혼합물을 37℃에서 30분 동안 결찰 혼합물과 함께 항온처리하고 세척하여 과량의 환형화 올리고뉴클레오티드를 제거하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 RCA 혼합물과 함께 항온처리한다. 혼합물을 세척하고, 바이오틴-표지된 검출 프로브의 혼합물을 첨가하고 37℃에서 30분 동안 항온처리하고, 이때 상기 검출 프로브의 혼합물은 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된다. 전기화학발광 표지 설포-TAG(메소 스케일 디아그노스틱스)를 도입하기 위해, 말단 바이오틴 표지를 갖는 검출 프로브를 합성하고 설포-TAG-표지된 스트렙타비딘에 미리 결합시킨다.
미세입자가 자기장에 의해 전극의 표면 상으로 포획되어 있는 측정 셀 내로 반응 혼합물을 흡입한다. 그 다음, 비결합된 물질을 프로셀(TPA 함유 완충제)로 제거한다. 그 다음, 전압을 전극에 인가하여 광전증배관에 의해 측정되는 화학발광 방사를 유도한다. 2-점 보정에 의해 기계 특이적으로 발생된 보정 곡선 및 시약 바코드를 통해 제공된 마스터 곡선을 통해 결과를 확인한다.
실시예 6. HIV-1 P24의 검출
재료, 방법 및 결과:
실시예 1에 기재된 절차를 이용하여 HIV-1 p24를 검출하였다. (세라케어 라이프 사이언시스(Seracare Life Sciences)(www.seracarecatalog.com)로부터 입수가능한) HIV-1 혼합된 역가 성능 패널, (마찬가지로 세라케어 라이프 사이언시스로부터 입수가능한) HIV-1 혈청전환 패널, (프로메드디엑스 엘엘씨(ProMedDx, LLC)(www.promeddx.com)로부터 입수가능한) HIV 항체 양성 샘플, 및 (바이오리클라메이션(Bioreclamation)(www.bioreclamation.com)으로부터 입수가능한) 정상-일치된 샘플로부터 대략 64개의 혈청 또는 혈장 샘플을 시험하였다. 전술된 절차에 따라 수행된 HIV-1 p24 분석에 대한 보정 곡선은 도 12에 제시되어 있다. 분석에 대한 LOD는 1.3 fg/㎖인 것으로 발견되었고, LLOQ는 3.0 fg/㎖이었고, ULOQ는 37,500 fg/㎖이었다. 25 ㎕ 샘플에 대한 1.3 fg/㎖의 검출 한계는 대략 650개의 p24 분자들에 상응하고, 각각의 바이러스 입자(분자)는 대략 2000 카피의 p24 단백질을 생성한다.
혼합된 역가 성능 패널인 PRA204(B)는 상업적으로 입수가능한 분석(바이오메리유(bioMerieux), 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 및 젭토메트릭스(Zeptometrix))에 의해 측정될 때 HIV p24 항원에 대한 약한 양성 내지 강한 양성 반응성을 갖는 10개 표본의 세트로 구성되었다. 2개의 음성 표본들이 상기 패널에 포함되었다. 분석의 결과는 하기 표 6에 제시되어 있다:
Figure pct00006
대다수의 샘플들의 경우 HIV p24 수준은 높았고 ULOQ를 초과하였다. 10개의 양성 샘플들 전부가 검출될 수 있었고 상업적으로 입수가능한 p24 키트에 필적할만하였지만, 음성 샘플(상업적 분석에 기초할 때 각각 PRA204(B)-10 및 PRA204(B)-20)은 각각 대략 3 및 2 fg/㎖로 매우 낮았다.
혈청전환 패널의 분석에 대한 결과는 도 13에 제시되어 있다. 첫 번째 양성 샘플을 검출하는 시간의 추정된 지연, 및 PRB948 및 PRB962 패널로부터의 두 샘플들에서의 p24 수준이 PCR 키트와 비교되었을 때 3-항체 분석 포맷은 PCR만큼 민감한 것으로 발견되었고 다른 상업적 p24 분석보다 더 우수한 성능을 갖는다. 데이터는 표 7에 제시되어 있다:
Figure pct00007
결론:
최근에 HIV로 감염된 환자는 질환의 전염에 불균형적으로 기여한다. 바이러스 존재량은 감염 후 처음 수주 이내에 높고, 새로 감염된 환자는 자신이 감염되어 타인에게 질환을 전염시킬 수 있다는 것을 인식할 가능성이 없다. 따라서, 급성 HIV 감염의 초기 검출은 공중 건강을 위해 매우 중요하다. PCR 방법은 민감성 면에서 골드 표준이다: 이 방법은 혈청 또는 혈장 ㎖ 당 60개만큼 적은 수의 HIV RNA 카피(㎖ 당 30개 바이러스 입자)를 검출할 수 있다. 그러나, PCR 기술은 복잡하고 비싸므로, 모든 상황들에 적합하지는 않다. 면역분석은 보다 더 단순하고 저렴하지만, 현재 4세대 p24 면역분석의 검출 한계는 단지 약 10 pg/㎖, 또는 ㎖ 당 대략 2억5천만 개의 캡시드 단백질이다. 1개의 바이러스를 기준으로, 바이러스 당 약 2,000개의 p24 캡시드 단백질들이 존재한다는 사실에도 불구하고 이 면역분석은 PCR 시험보다 수천 배 덜 민감하다.
본원에 기재된 바와 같이, MSD의 멀티-어레이® 기술에 기초한 차세대 전기화학발광 분석 포맷이 개발되었고 그의 성능이 특징규명되었다. 이 신규 p24 면역분석에 대한 검출 한계는 대략 1 fg/㎖이었고 현재의 p24 면역분석보다 10,000배 더 민감하였다. 1 fg/㎖의 민감성은 본 발명자들의 25 ㎕ 샘플 부피에서 1개 미만의 바이러스 입자에 상응한다. 정량의 하한 및 상한은 각각 3 fg/㎖ 및 38,000 fg/㎖이었다. 플레이트 내의 CV는 7%이었고, 총 CV는 15%이었다. 스파이크(spike) 회수 및 희석 선형성은 80% 내지 120%이었다. p24는 32명의 명백히 건강한 공여자들의 혈청 또는 혈장에서 검출불가능하였다. p24 혼합된 역가 패널은 3-AB HIV p24 분석과 상업적인 p24 면역분석 사이의 우수한 상관관계를 보여주었다. 2개의 혈청전환 패널들이 시험되었다: 세라케어(SeraCare) PRB948(0일째 날 및 18일째 날, PCR 음성; 22일째 날 및 23일째 날, PCR 양성) 및 PRB962(0일째 날 및 2일째 날, PCR 음성; 7일째 날, 9일째 날, 14일째 날 및 17일째 날, PCR 양성). 두 경우에서, 3-AB HIV p24 분석은 모든 PCR 음성 샘플들에 대해 음성을 나타내었고 모든 PCR 양성 샘플들에 대해 양성을 나타내었고, 통상적인 p24 면역분석보다 충분히 먼저 감염을 검출하였다.
종합하건대, 본원에 기재된 3-AB HIV p24 분석은 p24 ELISA의 현재 한계보다 10,000배 더 민감하고 민감성 면에서 PCR 분석에 필적할만하다. 상기 분석은 특수 장치를 요구하지 않고 MESO™ 퀵플렉스(QuickPlex) SQ 120 및 섹터® 이미저 상에서 실행될 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 구체적인 실시양태에 의해 범위 면에서 한정되어서는 안 된다. 실제로, 본원에 기재된 변경 이외에 방법의 다양한 변경이 상기 설명 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 자명해질 것이다. 이러한 변경은 특허청구범위 내에 있다. 다양한 공개문헌들이 본원에서 인용되어 있고, 이들의 개시내용은 전체로서 참고로 도입된다.
참고문헌
Figure pct00008
Figure pct00009
SEQUENCE LISTING <110> MESO SCALE TECHNOLOGIES, LLC. <120> IMPROVED ASSAY METHODS <130> 29901-TR2 <150> 61/779,050 <151> 2013-03-13 <150> 61/919,887 <151> 2013-12-23 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Thiol-modified proximity probe 1 <220> <221> modified_base <222> (33)..(35) <223> um <400> 1 aaaaaaaaaa gacgctaata gttaagacgc ttuuu 35 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Thiol-modified proximity probe 2 <400> 2 aaaaaaaaaa tatgacagaa ctagacactc tt 32 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anchoring oligonucleotide <400> 3 aagagagtag tacagcagcc gtcaaaaaaa aaaaa 35 <210> 4 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Circ-1 <400> 4 ctattagcgt ccagtgaatg cgagtccgtc taagagagta gtagagcagc cgtcaagagt 60 gtcta 65 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Circ-2 <400> 5 gttctgtcat atttaagcgt cttaa 25 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Detection probe <400> 6 cagtgaatgc gagtccgtct 20 <210> 7 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Detection oligonucleotide <400> 7 acatcggtag tt 12 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Proximity oligonucleotide <220> <221> polyA_site <222> (1)..(10) <220> <221> modified_base <222> (34)..(34) <223> gm <220> <221> modified_base <222> (35)..(36) <223> um <400> 8 aaaaaaaaaa cactaagctg ttagtccatt accguuu 37 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Proximity oligonucleotide 2 <220> <221> polyA_site <222> (1)..(10) <400> 9 aaaaaaaaaa gctggaggtt cagacgattt tgcg 34 <210> 10 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Circ-1a <400> 10 aacagcttag tgacatcggt agttaacaga ttgatcttga cacatcggta gttcgcaaaa 60 tcgtc 65 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Circ-2a <400> 11 tgaacctcca gctttcggta atggact 27 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anchor oligonucleotide <400> 12 acagattgat cttgaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 35 <210> 13 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Proximity oligonucleotide 1 <220> <221> polyA_site <222> (1)..(10) <220> <221> modified_base <222> (34)..(34) <223> tm <220> <221> modified_base <222> (35)..(36) <223> um <400> 13 aaaaaaaaaa agagtccaga ggcaaagcgt gaatuuu 37 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promixity oligonucleotide 2 <220> <221> polyA_site <222> (1)..(10) <400> 14 aaaaaaaaaa gataaggaag gggccttagc gaca 34 <210> 15 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Circ-1b <400> 15 cctctggact ctacatcggt agtttggaac attttattct aacatcggta gtttgtcgct 60 aaggc 65 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Circ-2b <400> 16 cccttcctta tctttattca cgctttg 27 <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anchor oligonucleotide <400> 17 ggaacatttt attctaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 35 <210> 18 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Proximity oligonucleotide 1 <220> <221> polyA_site <222> (1)..(10) <220> <221> modified_base <222> (34)..(34) <223> tm <220> <221> modified_base <222> (35)..(36) <223> um <400> 18 aaaaaaaaaa aacaactccg attgcttgct tcttuuu 37 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Proximity oligonucleotide 2 <220> <221> polyA_site <222> (1)..(10) <400> 19 aaaaaaaaaa tagccctacg tgccctgcat agac 34 <210> 20 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Circ-1c <400> 20 atcggagttg ttacatcggt agttcgcgca ggtcgggaat tacatcggta gttgtctatg 60 caggg 65 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Circ-2c <400> 21 cacgtagggc tatttaagaa gcaagca 27 <210> 22 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anchor oligonucleotide <400> 22 gcgcaggtcg ggaataaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 35

Claims (68)

  1. 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 방법으로서,
    a. 상기 분석물을 (i) 고착 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 고착 시약과 분석물에 대한 포획 시약을 포함하는 표면 상의 포획 시약, (ii) 제1 핵산 프로브에 연결된, 분석물에 대한 제1 검출 시약, 및 (iii) 제2 핵산 프로브에 연결된, 분석물에 대한 제2 검출 시약에 결합시킴으로써, 결합 시약, 분석물, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약을 포함하는 복합체를 상기 표면 상에 형성하는 단계;
    b. 제1 프로브 및 제2 프로브가 인접할 것을 요구하는 연장 과정을 이용하여 제2 프로브를 연장하여, 고착 서열에 상보적인 고착 서열 상보체를 포함하는 연장된 서열을 형성하는 단계;
    c. 고착 서열을 고착 서열 상보체에 혼성화시키는 단계; 및
    d. 상기 표면에 결합된 연장된 서열의 양을 측정하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 포획 시약이 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐(hapten), 에피토프(epitope), 미미토프(mimitope) 또는 앱타머(aptamer)인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 포획 시약이 항체인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 제1 검출 시약이 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 제1 검출 시약이 항체인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 제2 검출 시약이 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 제2 검출 시약이 항체인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 포획 시약, 제1 검출 시약 및 제2 검출 시약이 분석물에 대한 항체인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 고착 올리고뉴클레오티드 서열이 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 고착 올리고뉴클레오티드 서열이 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 연장된 서열이 하나 이상의 검출 서열을 추가로 포함하고, 측정 단계가 연장된 서열을 하나 이상의 검출 서열에 상보적인 복수의 표지된 프로브들과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 연장된 서열이 하나 이상의 변경된 염기를 추가로 포함하고, 측정 단계가 연장된 서열을 하나 이상의 변경된 염기에 결합할 수 있는 복수의 검출가능한 모이어티들(moieties)과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 연장된 서열이 하나 이상의 표지된 염기를 추가로 포함하고, 측정 단계가 하나 이상의 표지된 염기의 존재를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 하나 이상의 변경된 염기가 앱타머, 앱타머 리간드, 항체, 항원, 리간드, 수용체, 햅텐, 에피토프 또는 미메토프를 포함하고, 복수의 검출가능한 모이어티들이 각각 하나 이상의 변경된 염기의 결합 파트너 및 검출가능한 표지를 포함하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 하나 이상의 변경된 염기가 스트렙타비딘을 포함하고, 복수의 검출가능한 모이어티들이 각각 바이오틴 및 검출가능한 표지를 포함하는 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 하나 이상의 변경된 염기가 바이오틴을 포함하고, 복수의 검출가능한 모이어티들이 각각 스트렙타비딘 및 검출가능한 표지를 포함하는 것인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 하나 이상의 변경된 염기가 아비딘을 포함하고, 복수의 검출가능한 모이어티들이 각각 바이오틴 및 검출가능한 표지를 포함하는 것인 방법.
  18. 제14항에 있어서, 하나 이상의 변경된 염기가 바이오틴을 포함하고, 복수의 검출가능한 모이어티들이 각각 아비딘 및 검출가능한 표지를 포함하는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 단계 (a)가 분석물을 하기 순서로 하기 종들: (i) 표면 상의 포획 시약; 및 (ii) 분석물에 대한 검출 시약에 결합시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 단계 (a)가 분석물을 하기 순서로 하기 종들: (i) 분석물에 대한 검출 시약; 및 (ii) 표면 상의 포획 시약에 결합시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 단계 (a)가 분석물을 동시에 또는 실질적으로 동시에 하기 종들: (i) 표면 상의 포획 시약; 및 (ii) 분석물에 대한 검출 시약에 결합시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  22. 제1항에 있어서, 연장 단계가 프로브를 주형 핵산 서열에 결합시키는 단계 및 프로브를 중합효소 연쇄 반응으로 연장하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  23. 제1항에 있어서, 연장 단계가 프로브를 주형 핵산 서열에 결합시켜 환형 핵산 주형을 형성하는 단계 및 환형 주형을 롤링 서클(rolling circle) 증폭으로 연장하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  24. 제1항에 있어서, 연장된 프로브가 프로브 연장 후 표면 상에 위치한 상태로 남아있는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 복합체가 연장 단계 후 표면에 결합된 상태로 남아있는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 연장된 프로브가 표면 상의 복합체 위치의 10 내지 100 ㎛ 이내의 위치에서 고착 시약에 결합되는 것인 방법.
  27. 제1항에 있어서, 연장 단계가 PCR(중합효소 연쇄 반응), LCR(리가제(Ligase) 연쇄 반응), SDA(가닥 치환 증폭), 3SR(자체-지속 합성 반응) 또는 등온 증폭 방법을 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 연장 단계가 등온 증폭 방법을 포함하는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 등온 증폭 방법이 헬리카제(helicase) 의존적 증폭 또는 롤링 서클 증폭(RCA)인 방법.
  30. 제1항에 있어서, 연장 과정이 단계 (a)에서 형성된 복합체를, (i) 제2 프로브에 상보적인 내부 서열 및 (ii) 제1 프로브의 비-중첩 영역에 상보적인 2개의 말단 서열들을 포함하는 연결제(connector) 서열과 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 연결제 올리고뉴클레오티드의 2개의 말단 서열들을 결찰시켜(ligating) 제1 프로브 및 제2 프로브 둘 다에 혼성화되는 환형 표적 서열을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  32. 제1항에 있어서, 연장 과정이 단계 (a)에서 형성된 복합체를, 제1 프로브의 제1 영역 및 제2 프로브의 제1 영역에 상보적인 제1 연결제 프로브 서열을 포함하는 제1 연결제 올리고뉴클레오티드 서열, 및 제1 프로브의 제2 비-중첩 영역 및 제2 프로브의 제2 비-중첩 영역에 상보적인 제2 프로브 서열을 포함하는 제2 연결제 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 제1 연결제 올리고뉴클레오티드와 제2 연결제 올리고뉴클레오티드를 결찰시켜 제1 프로브 및 제2 프로브 둘 다에 혼성화되는 환형 표적 서열을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  34. 제1항에 있어서, 표면이 입자를 포함하는 것인 방법.
  35. 제1항에 있어서, 표면이 멀티-웰 플레이트의 웰을 포함하는 것인 방법.
  36. 제1항에 있어서, 표면이 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함하고, 포획 시약 및 고착 시약이 표면 상의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치하는 것인 방법.
  37. 제35항에 있어서, 웰이 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함하고, 포획 시약 및 고착 시약이 웰 내의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치하는 것인 방법.
  38. 제1항에 있어서, 표면이 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함하고, 포획 시약 및 고착 시약이 표면 상의 동일한 결합 도메인 상에 위치하는 것인 방법.
  39. 제35항에 있어서, 웰이 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함하고, 포획 시약 및 고착 시약이 웰 내의 동일한 결합 도메인 상에 위치하는 것인 방법.
  40. 제1항에 있어서, 포획 시약 및 고착 시약이 표면 상에서 10 내지 100 nm 이내에 있는 것인 방법.
  41. 제1항에 있어서, 표면이 전극을 포함하고, 측정 단계가 전압 파형을 전극에 인가하여 전기화학발광 신호를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  42. 제34항에 있어서, 전극 상에 입자를 수집하는 단계, 및 전압 파형을 전극에 인가하여 전기화학발광 신호를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  43. 제1항에 있어서, 측정 단계가 연장된 서열을 검출가능한 표지를 갖는 검출 프로브에 결합시키는 단계, 검출가능한 표지를 측정하는 단계, 및 측정치를 샘플 중의 분석물의 양과 상호관련시키는 단계를 추가로 포함하고, 이때 상기 검출 프로브가 연장된 서열의 영역에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 검출가능한 표지가 광 산란, 흡광도, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 생체발광, 인광, 방사성, 자기장 또는 이들의 조합의 측정에 의해 측정되는 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 검출가능한 표지가 ECL 표지이고, 측정 단계가 ECL 신호를 측정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  46. 샘플에서 관심있는 분석물을 검출하는 키트로서, 하나 이상의 바이알, 용기 또는 구획 내에
    a. (i) 분석물에 대한 포획 시약 및 (ii) 고착 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 고착 시약을 포함하는 표면;
    b. 제1 핵산 프로브에 연결된, 분석물에 대한 제1 검출 시약; 및
    c. 제2 핵산 프로브에 연결된, 분석물에 대한 제2 검출 시약
    을 포함하는 키트.
  47. 제46항에 있어서, 포획 시약이 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머를 포함하는 것인 키트.
  48. 제47항에 있어서, 포획 시약이 항체를 포함하는 것인 키트.
  49. 제46항에 있어서, 제1 검출 시약이 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머를 포함하는 것인 키트.
  50. 제49항에 있어서, 제1 검출 시약이 항체를 포함하는 것인 키트.
  51. 제46항에 있어서, 제2 검출 시약이 항체, 항원, 리간드, 수용체, 올리고뉴클레오티드, 햅텐, 에피토프, 미미토프 또는 앱타머를 포함하는 것인 키트.
  52. 제46항에 있어서, 제2 검출 시약이 항체를 포함하는 것인 키트.
  53. 제46항에 있어서, 표면이 입자를 포함하는 것인 키트.
  54. 제46항에 있어서, 표면이 멀티-웰 플레이트의 웰을 포함하는 것인 키트.
  55. 제46항에 있어서, 표면이 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함하고, 포획 시약 및 고착 시약이 표면 상의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치하는 것인 키트.
  56. 제54항에 있어서, 웰이 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함하고, 포획 시약 및 고착 시약이 웰 내의 2개의 상이한 결합 도메인들 상에 위치하는 것인 키트.
  57. 제46항에 있어서, 표면이 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함하고, 포획 시약 및 고착 시약이 표면 상의 동일한 결합 도메인 상에 위치하는 것인 키트.
  58. 제54항에 있어서, 웰이 복수의 상이한 결합 도메인들을 포함하고, 포획 시약 및 고착 시약이 웰 내의 동일한 결합 도메인 상에 위치하는 것인 키트.
  59. 제46항에 있어서, 포획 시약 및 고착 시약이 표면 상에서 10 내지 100 nm 이내에 있는 것인 키트.
  60. 제46항에 있어서, 표면이 전극을 포함하는 것인 키트.
  61. 제1항에 있어서, 분석물이 항미생물 내성 마커인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 마커가 PBP2a/mecA(스타필로코커스 아우레우스(S. aureus), 그람 양성) 또는 TEM1(이. 콜라이(E. coli), 그람 음성)로부터 선택되는 것인 방법.
  63. 제61항에 있어서, 분석물이 반코마이신(vancomycin), 베타-락탐(beta-lactam), 카바페넴(carbapenem), 아미노글리코사이드(aminoglycoside) 및/또는 마크롤라이드(macrolide) 항생제에 대한 항미생물 내성과 관련된 단백질로부터 선택되는 것인 방법.
  64. 제63항에 있어서, 분석물이 erm 패밀리, vanA, vanB, aac(6')-aph(2"), KPC, NDM, OXA-48, VIM, OXA-23 유사, OXA-40 유사, OXA-58 유사, CTX-M-1 및 CTX-M-9 패밀리의 ESBL 유전자, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것인 방법.
  65. 제46항에 있어서, 분석물이 항미생물 내성 마커인 키트.
  66. 제65항에 있어서, 마커가 PBP2a/mecA(스타필로코커스 아우레우스, 그람 양성) 또는 TEM1(이. 콜라이, 그람 음성)로부터 선택되는 것인 키트.
  67. 제65항에 있어서, 분석물이 반코마이신, 베타-락탐, 카바페넴, 아미노글리코사이드 및/또는 마크롤라이드 항생제에 대한 항미생물 내성과 관련된 단백질로부터 선택되는 것인 키트.
  68. 제67항에 있어서, 분석물이 erm 패밀리, vanA, vanB, aac(6')-aph(2"), KPC, NDM, OXA-48, VIM, OXA-23 유사, OXA-40 유사, OXA-58 유사, CTX-M-1 및 CTX-M-9 패밀리의 ESBL 유전자, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것인 키트.
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