JP6834981B2 - 蛍光物質集積ナノ粒子およびそれを用いた標識剤 - Google Patents

Description

本発明は、蛍光物質集積ナノ粒子およびそれを用いた標識剤に関する。より詳しくは、本発明は、熱硬化性樹脂を母体とする蛍光物質集積ナノ粒子およびそれを用いた標識剤に関する。

医学的診断の１つとして、病理診断が行なわれている。病理診断では、人体から採取した検体組織から作製された病理標本を病理医が観察して病気を診断し、治療や手術の要否を臨床医に伝える。患者の状態と病理診断によって、内科系医師は薬物治療方針を決定し、外科系医師は手術を行うか否かを決定する。

がん・悪性腫瘍の病理診断では、病理標本における組織または細胞の形態の観察とともに、そこに含まれる特定のタンパク質の発現量や、染色体中の特定の遺伝子のコピー数を検査の対象とする場合がある。例えば、癌遺伝子の一種であるＨＥＲ２遺伝子（HER2/neu、c-erbB-2）および／またはＨＥＲ２遺伝子から産生される膜タンパク質であって癌細胞増殖因子の受容体として機能していると推定されるＨＥＲ２タンパクを定量し、所定の基準に従って評価することによって、乳癌患者の予後を診断したり、分子標的治療薬「トラスツズマブ」（商品名「ハーセプチン」（登録商標）、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体）による治療効果を予測したりする病理診断が広く行われている。

このようなタンパク質を対象とする検査法として代表的なものがＩＨＣ（免疫組織化学）法であり、遺伝子を対象とする検査法として代表的なものがＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション）法である。ＩＨＣ法では、目的とするタンパク質（抗原）に酵素標識された抗体を直接法または間接法により結合させた後、基質を反応させて発色させる方法（例えば、ペルオキシダーゼおよびジアミノベンジジンを用いるＤＡＢ染色法）、いわゆる免疫染色法によって検出することが一般的であった。また、ＦＩＳＨ法では、目的とする遺伝子に蛍光標識された核酸プローブをハイブリダイズさせることによって検出するが、従来は蛍光標識のために複数の蛍光色素分子を核酸プローブに連結する方法が一般的であった。

しかしながら、ＩＨＣ法におけるＤＡＢ染色のような酵素による染色も、染色濃度が温度・時間などの環境条件により大きく左右されるため、染色濃度から実際の抗原等の量を見積もることが難しいという課題があった。また、ＦＩＳＨ法における蛍光色素分子を用いた染色は、蛍光の輝度があまり高くないため蛍光顕微鏡による観察や撮像において視認しにくく、褪色も早いという課題があった。

そこで近年、病理診断における遺伝子またはタンパク質を標識するために、蛍光物質（蛍光色素、量子ドットなど）を集積させたナノサイズの粒子、すなわち蛍光物質集積ナノ粒子を用いる方法が提案され、実用化が進められている。蛍光物質集積ナノ粒子を用いてタンパク質または遺伝子を標識し、蛍光物質に適合する励起光を照射すると、蛍光物質集積ナノ粒子は、タンパク質または遺伝子の位置を正しく示す、輝度の高い輝点として観察することが可能であり、また褪色しにくいため比較的長時間にわたって観察や撮像が可能となる、という利点を有する。例えば、国際公開ＷＯ２０１２／０２９７５２号パンフレット（特許文献１）、国際公開ＷＯ２０１３／０３５７０３号パンフレット（特許文献２）などには、蛍光物質集積ナノ粒子を連結させた抗体を用いて免疫染色を行う方法が記載されている。また、国際公開ＷＯ２０１５／１４１８５６号パンフレット（特許文献３）には、蛍光物質集積ナノ粒子を連結させた核酸プローブを用いてＦＩＳＨ法を行うことが記載されている。

このような蛍光物質集積ナノ粒子に関しては、集積させる蛍光物質や、それらを集積させて粒子を形作る母体の材料（シリカ、熱硬化性樹脂、熱可塑性樹脂等）に着目しながら、より高性能の蛍光物質集積ナノ粒子を開発することが試みられている。

例えば、特表２００８−５４３９８２号公報（特許文献４）には、特定の製造方法により、有機蛍光色素等を内包する、粒子径が１０〜９５ｎｍであるメラミン・ホルムアルデヒド粒子が得られることが記載されている。蛍光色素としては、親水性の有機蛍光色素、例えばローダミン系、フルオレセイン系またはクマリン系の有機蛍光色素、あるいは８−ヒドロキシ−１，３，６−ピレントリスルホン酸三ナトリウム塩などが例示されている。

国際公開ＷＯ２０１４／１３６８８５号パンフレット（特許文献５）には、熱硬化性樹脂を母体とし、蛍光色素を集積したナノ粒子であって、熱硬化性樹脂と蛍光色素とが互いに逆の電荷の置換基を有しており、それらの置換基がイオン結合または共有結合している（同時に、粒径の変更係数が１５％以下である）ものが開示されている。熱硬化性樹脂の一例としては、正に荷電するアミノ基（ないしそれに類する部位）を有するメラミン樹脂が挙げられており、蛍光色素の一例としては、負に荷電するスルホ基を有するローダミン系または芳香族炭化水素系色素分子が挙げられている。このような蛍光色素集積ナノ粒子によれば、輝点の強度のバラツキが抑えられるとともに、ナノ粒子からの蛍光色素の滲み出しも防止され、蛍光シグナルの判定精度を改善することができると記載されている。

なお、特許文献５には「前記蛍光色素が、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、スクアリリウムまたは芳香族炭化水素系色素分子であることで、蛍光色素と樹脂の疎水性部分の相互作用により、置換基のイオン結合と共に、強固に色素分子と樹脂とを結合させることができる。」、「前記熱硬化性樹脂がメラミンを用いて形成され、前記蛍光色素がローダミンまたは芳香族炭化水素系色素分子であることにより、メラミン樹脂とローダミンまたは芳香族炭化水素系色素分子がそれぞれ有するベンゼン環同士の疎水性相互作用により、上述した置換基のイオン結合に加えて、より強固に色素分子と樹脂とを結合させることができる。」などと記載されている（段落［０１０１］、［０１０２］参照）。しかしながら、上記特定の蛍光色素であっても、無電荷である場合は、メチルエーテル化メチロールメラミン（ニカラックＭＸ−０３５）を単独重合させたメラミン樹脂（比較例４０等で引用する実施例１参照）、メチロール化度が４０〜７０％の尿素を単独重合させた尿素樹脂（比較例４１等で引用する実施例２参照）、または当該モノマーとキシレン樹脂（ニカノールＹ−５０）等との共重合体（比較例４２等で引用する実施例３参照）により集積化することには成功しておらず、得られたナノ粒子を免疫染色に用いても十分な輝度を有する輝点として観察できていない（比較例４０〜５１：段落［０１６０］表１）。つまり、特許文献５には、熱硬化性樹脂と蛍光色素とが互いに逆の電荷の置換基を有さない場合に、疎水性相互作用だけにより、疎水性蛍光色素を集積化して熱硬化性樹枝ナノ粒子を製造できることは具体的に開示されていない。

国際公開ＷＯ２０１２／０２９７５２号パンフレット 国際公開ＷＯ２０１３／０３５７０３号パンフレット 国際公開ＷＯ２０１５／１４１８５６号パンフレット 特表２００８−５４３９８２号公報 国際公開ＷＯ２０１４／１３６８８５号パンフレット

蛍光色素としては様々な化合物が知られているが、疎水性の高い蛍光色素には蛍光特性に優れているものが少なくない。しかしながら、そのような蛍光色素は疎水性の高さから、主に水溶液を用いた処理が行われる免疫染色法やＦＩＳＨ法において、タンパク質や核酸といった生体分子を標識するために単独で（集積化せず）利用することは困難である。また、疎水性の高い蛍光色素と、発光強度、耐光性、耐溶剤性などに優れた熱硬化性樹脂、例えばメチルアルキル化メチロールメラミン（メラミンのアミノ基にホルムアルデヒドを結合させた化合物であるメチロールメラミンの、水酸基の水素原子がメチル基に置換された化合物：−ＮＨ−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₃）を単独重合することで合成されるメラミン樹脂を用いて、蛍光物質集積ナノ粒子を調製しようとしても、やはり疎水性の高さのため粒子内に集積化しにくく、輝度の極めて低い、病理診断への実用化に適さない粒子しか得られなかった。特許文献４および５において、好適な熱硬化性樹脂ナノ粒子として実施例において具体的に開示されているのは、水溶性の蛍光色素を集積しているものか、荷電した置換基を利用して熱硬化性樹脂に蛍光色素をイオン結合または共有結合させたものばかりである。

また、蛍光物質としては、蛍光色素以外にも「量子ドット」（例えば半導体ＺｎＳｅからなる微粒子）が広く知られており、シリカを母体とすることにより量子ドットを集積化した蛍光物質集積ナノ粒子も製造されている（例えば特許文献１参照）。しかしながら、量子ドットの中にはＣｄＳｅのように表面が疎水的であり、有機溶媒（例えばデカン）に分散させた状態で保管されるものもある。そのような疎水的な量子ドットは、例えばシランカップリング剤およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような親水性高分子を用いた修飾により表面を親水化することも可能であるが、無修飾の（つまり疎水性の高い）状態に比べて発光強度が低下してしまうことが多い。疎水性の量子ドットを、シリカよりも耐光性等に優れたメラミン樹脂等の熱硬化性樹脂を母体として集積化した蛍光物質集積ナノ粒子は、未だに得られていない。

本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであって、タンパク質や核酸などの生体物質を標識した時に、その蛍光画像を用いて病理診断が行える程度の高い輝度を有する、疎水性の高い蛍光物質を集積した熱硬化性樹脂ナノ粒子を提供することを課題とする。

発明者らは、疎水性置換基（官能基）を有する原料を用いて合成された熱硬化性樹脂、例えば前述したメチル化メラミン樹脂の代わりにブチル化メラミン樹脂（メチル化メラミン樹脂のメチル基がブチル基に置換されたもの：−ＮＨ−ＣＨ₂−Ｏ−Ｃ₄Ｈ₉）を重合することで合成されるメラミン樹脂を母体として用いることにより、疎水性の高い蛍光物質を集積することができ、性能に優れた蛍光物質集積ナノ粒子が得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明に係る蛍光物質集積ナノ粒子は、疎水性蛍光物質を集積した、熱硬化性樹脂を母体とするナノ粒子であって、前記熱硬化性樹脂は疎水性置換基を有する原料から形成された構成単位を含み、前記疎水性の蛍光物質は少なくとも、前記熱硬化性樹脂の疎水性置換基との間に働く疎水性相互作用によって、前記ナノ粒子内に集積されていることを特徴とする。

また、本発明に係る標識剤は、上記の本発明に係る蛍光物質集積ナノ粒子と、その表面に連結された、目的とする生体関連物質と特異的に結合する物質とを含む（コンジュゲートである）ことを特徴とする。

本発明により、これまで高い発光強度などの特性を十分に活用できなかった疎水性の高い蛍光物質を用いて蛍光物質集積ナノ粒子を作製し、使用できるようになる。そのため、視認性（輝度、色調など）の質に優れた蛍光画像を用いて、信頼性の向上した病理診断を行えるようになる可能性がある。

―蛍光物質集積ナノ粒子―
本発明の蛍光物質集積ナノ粒子は、疎水性蛍光物質を集積した、熱硬化性樹脂を母体とするナノ粒子であって、熱硬化性樹脂が疎水性置換基を有する原料から形成された構成単位を含み、疎水性蛍光物質は熱硬化性樹脂の疎水性置換基との間に働く疎水性相互作用によって前記ナノ粒子内に集積されているものである。

「原料」は、熱硬化性樹脂の合成に用いられるモノマーのほか、例えばアルキルエーテル化されていてもよいメチロールメラミンや、メチロールキシレンのように、モノマーと架橋剤（ホルムアルデヒド）をあらかじめ部分的に反応させた化合物（プレポリマー、樹脂中間体）、その他熱硬化性樹脂の合成反応に応じて用いられる化合物を包含する。また、そのようなモノマー以外の原料は、モノマーの「誘導体」に相当する。

「疎水性蛍光物質は熱硬化性樹脂の疎水性置換基との間に働く疎水性相互作用によって前記ナノ粒子内に集積されている」ことは、後記実施例に示すように、疎水性蛍光物質と疎水性置換基を有する熱硬化性樹脂とを用いてナノ粒子を調製した場合に、疎水性蛍光物質と疎水性置換基を有さない熱硬化性樹脂とを用いてナノ粒子を調製した場合に比べて、生成するナノ粒子の蛍光の輝度が、例えば１０倍以上、好ましくは１００倍以上に増強されていることをもって推定することができる。蛍光物質集積ナノ粒子の製造工程では一般的に、熱硬化性樹脂の原料および疎水性蛍光物質は水溶液中で混合されるが、疎水性相互作用により熱硬化性樹脂の内部（水と接しない側）に多量の疎水性蛍光物質が集積しやすくなるため、そのような蛍光輝度の増強効果が達成できるものと考えられる。また、蛍光物質集積ナノ粒子が製造された後にあっては、水溶液（分散液）中で蛍光物質がナノ粒子から流出することを抑制するとともに、粒子内への水の浸入を防いで水による蛍光物質（蛍光色素）の分解を抑制することができるものと考えられる。

疎水性蛍光物質と熱硬化性樹脂の疎水性置換基との間には、少なくとも疎水性相互作用が働いているが、それ以外の非共有結合的な相互作用（イオン結合を除く。）がさらに働いていることを排除するものではない。

疎水性相互作用以外の相互作用としては、例えば、芳香環同士の間に働くスタッキング相互作用（π-π相互作用）が挙げられる。詳細は後述するが、熱硬化性樹脂が疎水性置換基としてアリール基、ヘテロアリール基などの芳香環を有し、蛍光物質もそのような芳香環を有する、ないし芳香環を分子構造の主要部（基本骨格）とする蛍光色素である場合、それらの芳香環同士の間にはスタッキング相互作用が働き、熱硬化性樹脂と蛍光物質との間により強力な相互作用が働くことによって、上述したような本発明の作用効果により一層優れ、長期間に亘って強い蛍光強度を維持することができるようになるものと考えられる。

蛍光物質集積ナノ粒子の粒子径は、用途に応じて適切な範囲に調節することができるが、例えば組織切片の生体物質の染色用の標識剤を調製するために用いられるのであれば、平均粒子径が通常は１０〜５００ｎｍであり、好ましくは５０〜２００ｎｍである。また、粒子径のばらつきを示す変動係数（ＣＶ）は、通常は２０％以下であり、好ましくは５〜１５％である。このような粒子径を有する蛍光物質集積ナノ粒子は、たとえば後述するような製造方法により得られる。

蛍光物質集積ナノ粒子の粒子径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し、蛍光標識用樹脂粒子の断面積を計測し、その計測値の面積を有する円を想定したときの円の直径（面積円相当径）とみなすことで測定することができる。蛍光物質集積ナノ粒子の集団の平均粒子径および変動係数は、十分な数（たとえば３００個）の蛍光物質集積ナノ粒子について上記のようにして粒子径を測定した後、平均粒子径はその算術平均として算出され、変動係数は式：１００×粒子径の標準偏差／平均粒子径、により算出される。

（蛍光物質）
本発明の蛍光物質集積ナノ粒子を構成する「蛍光物質」は、疎水性であり、疎水性置換基を有する熱硬化性樹脂によってナノ粒子が形成される際にそこに集積化できるものであれば、特に限定されるものではない。なお、本発明は本質的に、蛍光色素等の置換基またはその他の部位が有する正または負の電荷と、熱硬化性樹脂の置換基またはその他の部位が有するそれとは逆の電荷のイオン結合または共有結合を利用して作用効果を奏することを目的とした発明（ＷＯ２０１４／１３６８８５：特許文献５参照）とは相違するので、必要であれば、本発明で用いる蛍光物質は、熱硬化性樹脂の所定の部位とイオン結合を生じる程度の強さに荷電した置換基（例えばカルボキシル基、スルホ基、アミノ基）またはそれに類似する部位を有さず、熱硬化性樹脂の所定の部位と共有結合を生じる置換基またはその他の部位も有さないものに限定することができる。

疎水性蛍光物質の代表例としては、疎水性化合物（半導体）から形成される、蛍光色素および量子ドットが挙げられる。疎水性（脂溶性）の蛍光物質は、一般的に、水ではなく有機溶媒に溶解または分散させて取り扱われる種類のものである。

蛍光色素には、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、ペリレン系（ペリレンジイミド系）色素分子、ピレン系色素分子、オキサジン系（ベンゾフェノキサジン系）色素分子、アゾベンゼン系（アゾナフタレン系）色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、Ｃｙ（登録商標、ＧＥヘルスケア社製）系色素分子、ＤＹ系色素分子（登録商標、ＤＹＯＭＩＣＳ社製）、ＨｉＬｙｔｅ（登録商標、アナスペック社製）系色素分子、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標、サーモサイエンティフィック社製）系色素分子、ＡＴＴＯ（登録商標、ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社製）系色素分子、ＭＦＰ（登録商標、Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）系色素分子、ＦＭ系色素分子などが包含される。

本発明では、そのような公知の蛍光色素のうち疎水性ないし脂溶性のもの、例えばローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、ピレン系色素分子、ペリレンジイミド系色素分子、ベンゾフェノキサジン系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ系色素分子またはＦＭ系色素分子のうち疎水性のもの、あるいは細胞や組織における疎水的な部位（脂質等）の染色剤として用いられているベンゾフェノキサジン系色素分子などを、樹脂ナノ粒子に集積させる疎水性蛍光物質として用いることができる。具体例としては、ＢＯＤＩＰＹ系色素分子としてＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５；ＦＭ系色素分子としてＦＭ １−４３、ＦＭ １−４３ＦＸ、ＦＭ ４−６４、ＦＭ ４−６４ＦＸ；オキサジン系（ベンゾフェノキサジン系）色素分子としてナイルレッド、ナイルブルー；アゾベンゼン系（アゾナフタレン系）色素分子としてオイルレッドＯが挙げられる。これらの蛍光色素は、その分子構造の主要部（基本骨格）に芳香環が含まれており、疎水性の高い蛍光色素になりやすい（下記式（１）〜（８）参照）。また、蛍光色素は、熱硬化性樹脂について述べたものと同じような疎水性置換基を含んでいてもよい。蛍光色素１分子あたり疎水性置換基が２個以上含まれていると、熱硬化性樹脂が有する疎水性置換基との間で疎水性相互作用が働く部位が増し、その相互作用が安定的で強固なものとなるので好ましい。

量子ドットには、ＩＩ−ＶＩ族半導体量子ドット、ＩＩＩ−Ｖ族半導体量子ドット、ＩＶ族半導体量子ドット、さらにこれらの半導体量子ドットの表面をよりバンドギャップの広い別の半導体でコートしたコアシェル構造を有する半導体量子ドットなどが包含される。本発明では、そのような公知の量子ドットのうち疎水性のもの、例えばＩＩ−ＶＩ族半導体量子ドットであるＣｄＳｅやそのコアシェル構造物であるＣｄＳｅ／ＺｎＳなどを、ナノ粒子に集積させる疎水性蛍光物質として用いることができる。なお、有機溶液法によって作られる量子ドットは一般的に、疎水性の配位子が表面に付着することにより、疎水性の量子ドットとなる。

（熱硬化性樹脂）
本発明の蛍光物質集積ナノ粒子を構成する樹脂は、疎水性置換基を有する原料から形成された構成単位を含む熱硬化性樹脂であり、その疎水性置換基と疎水性蛍光物質との間に働く疎水性相互作用によって、疎水性蛍光物質を樹脂ナノ粒子内に集積化することができるものであれば、特に限定されるものではない。

熱硬化性樹脂の原料から形成された構成単位は、全てが疎水性置換基を有する原料から形成された構成単位（ａ）であってもよいし、疎水性置換基を有する原料から形成された構成単位（ａ）と、疎水性置換基を有さない原料から形成された構成単位（ｂ）の両方を含むものであってもよい。これらの構成単位（ａ）および（ｂ）の比率は、それぞれの原料の疎水性の強さや、疎水性相互作用により疎水性蛍光物質を集積化する効果、すなわち得られる蛍光物質集積樹脂粒子の輝度（発光強度）などの特性を考慮しながら適宜調節することができるが、例えば構成単位（ａ）および（ｂ）それぞれの原料の重量比として、（ａ）：（ｂ）＝３０：７０〜８０：２０、好ましくは４０：６０〜７０：３０とすることができる。構成単位（ａ）の疎水性置換基を有する原料の重量比が小さすぎると疎水性蛍光物質を集積化する効果が表れない場合があり、大きすぎると蛍光物質集積ナノ粒子の表面が疎水的になりすぎて分散媒（緩衝液等）中で凝縮しやすくなる。

なお、熱硬化性樹脂の原料から形成された構成単位に全てが疎水性置換基を有する原料から形成された構成単位（ａ）である場合、または疎水性置換基を有する原料から形成された構成単位（ａ）と疎水性置換基を有さない原料から形成された構成単位（ｂ）の両方を含むが前者の比率（原料の重量比）が比較的大きい場合は、分散媒中での凝集を防ぐために、蛍光物質集積ナノ粒子の表面を親水化する処理を施すことが好ましい。そのような親水化処理については後述する。

熱硬化性樹脂が有する疎水性置換基の種類および疎水性の高さは特に限定されるものではなく、組み合わせて用いる疎水性蛍光物質の性質などを考慮しながら、疎水的な性質を有することが知られている置換基の中から選択することができる。一般的には、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基などが疎水性置換基となり得る。本発明における疎水性置換基としては、例えば、炭素数４〜１０の、直鎖状、分岐鎖状または環状の、置換基を有していてもよい、アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基；ならびに炭素数６〜１５の、置換基をしていてもよい、アリール基およびヘテロアリール基からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましい。このうち、より強力で安定的な疎水性相互作用を生み出すことができることから、アリール基、特にフェニル基がより好ましい。

本発明で用いることのできる熱硬化性樹脂としては、例えば、メラミン、グアナミン、アニリン、尿素、フェノール、キシレン、およびこれらの誘導体からなる群から選択され、疎水性置換基を有する原料を含む、１種または２種以上の原料から形成された構成単位を含む熱硬化性樹脂が好ましい。上記熱硬化性樹脂は、換言すれば、メラミン、グアナミン、アニリン、尿素、フェノール、キシレン、およびこれらの誘導体からなる群から選択され、疎水性置換基を有する原料を含む、１種または２種以上の原料を原料として用いることにより製造することができるものである。メラミン、グアナミン、アニリン、尿素、フェノール、キシレン、およびこれらの誘導体はいずれも、ホルムアルデヒド等のアルデヒドと反応して付加重合する。これらの原料は、いずれか１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい、つまり熱硬化性樹脂は、いずれか１種の原料から形成される構成単位を含む単独重合体であってもよいし、２種以上の原料から形成される構成単位を含む共重合体であってもよい。また、熱硬化性樹脂を製造するための原料は、その全てが上記所定の群から選択される原料であってもよいし、上記所定の群から選択される原料とその他の原料との混合物であってもよい。

本発明における熱硬化性樹脂は、より好ましくは、メラミン、グアナミンおよびこれらの誘導体からなる群から選択された少なくとも１種の原料から形成される構成単位を含む（またはからなる）熱硬化性樹脂、つまりメラミン樹脂、グアナミン樹脂またはメラミン・グアナミン共重合体である。メラミン、グアナミンおよびこれらの誘導体のうち、疎水性置換基を有するものとしては、例えば、ブチルエーテル化メチロールメラミン、ベンゾグアナミン、ブチルエーテル化メチロールグアナミン、ブチルエーテル化メチロールベンゾグアナミン（下記式（９）〜（１２）参照。式（９）〜（１２）中、Ｒはそれぞれ独立にＨ、−ＣＨ₂ＯＨまたは−ＣＨ₂ＯＲ'を表し（ただし、少なくとも１つは−ＣＨ₂ＯＲ'でなくてはならない）、Ｒ'はブチル基等の疎水性置換基を表す。）などを例示できる。

メラミン（１,３,５-トリアジン-２,４,６-トリアミン）は、トリアジン環（Ｃ₃Ｎ₃Ｈ₆）に３つのアミノ基（−ＮＨ₂）が結合している化合物であり、メラミンとホルムアルデヒドの重縮合反応物はメラミン樹脂としてよく知られた熱硬化性樹脂である。メラミンとホルムアルデヒドを反応させると、まず１つのメラミンのアミノ基にホルムアルデヒドが付加してメチロール化し（−ＮＨ−ＣＨ₂ＯＨ）、続いてそこに他のメラミンのアミノ基が反応して脱水縮合によりメチレン化し（−ＮＨ−ＣＨ₂−ＮＨ−）、その結果メラミンのアミノ基同士がホルムアルデヒド（メチレン基）で架橋された三次元網目構造が形成され、熱硬化性樹脂となる。また、メラミン樹脂は一般的には、あらかじめメラミンのアミノ基の一部または全部にホルムアルデヒドを反応させてメチロール化させた化合物、つまり３つのアミノ基が有する合計６個の水素原子のうち１〜６個の水素原子がメチロール基に置換されたメチロールメラミンを調製しておき、この化合物を加熱して重縮合することにより合成される。さらに、メチロールは水中における安定性が低いため、メチロールメラミンのメチロール基をメタノール、ブタノール等のアルコールによってエーテル化した（−ＮＨ−ＣＨ₂Ｏ−Ｒ：Ｒはアルキル基、例えばメチル基、ブチル基）アルキルエーテル化メチロールメラミンも、上記のようなメラミン樹脂の合成方法における原料として用いられている（なお、アルキルエーテル化メチロールメラミン商品名として、例えばアルキル基がメチル基の場合に「メチル化メラミン」、ブチル基の場合に「ブチル化メラミン」などの略称も用いられている）。メタノールによってエーテル化したメチルエーテルメチロールメラミンは水溶性で水に容易に溶解するのに対し、ブタノールによってエーテル化したブチルエーテルメチロールメラミンは疎水性（脂溶性）で有機溶媒中に容易に溶解する。

本発明において、アルキルエーテル化メチロールメラミンに導入されているアルキル基は、熱硬化性樹脂が有すべき疎水性置換基となり得る。例えば、炭素数４のアルキル基であるブチル基が複数導入されたブチルエーテル化メチロールメラミンを用いてメラミン樹脂を合成した場合、通常は、ブチルエーテル化したメチロール基の一部は未反応のままメラミン樹脂中に残存するので、疎水性置換基としてブチル基を有するメラミン樹脂が得られる。

グアナミン（１,３,５-トリアジン-２,４-ジアミン）は、トリアジン環に２つのアミノ基が結合している化合物であり、トリアジン環の６位にアルキル基、フェニル基等の各種の置換基が導入された６−置換グアナミン（例えばフェニル基で置換されているベンゾグアナミン）も知られている。メラミンと同様、グアナミンおよびその誘導体（６−置換グアナミンを含む。）も、ホルムアルデヒドと重縮合反応してグアナミン樹脂を形成する。また、グアナミン樹脂の原料として、アルキルエーテル化メチロールグアナミンも用いられている。

本発明において、メラミンと同様、グアナミンおよび６−置換グアナミンについても、アルキルエーテル化メチロールグアナミンおよびアルキルエーテル化メチロール６−置換グアナミンに導入されているアルキル基は、熱硬化性樹脂が有すべき疎水性置換基となり得る。さらに、６−置換グアナミンのうちベンゾグアナミンのように疎水性置換基（この例ではフェニル基）で置換されている化合物については、その疎水性置換基（置換基）も熱硬化性樹脂が有すべき疎水性置換基となり得る。熱硬化性樹脂の原料は、例えばブチルエーテル化メチロールベンゾグアナミンのように、疎水性置換基を１分子中に２つ、またはそれ以上有するものであってもよい。

本発明の熱硬化性樹脂の原料としては、フェノール、キシレン、アニリンおよびその誘導体のように、ベンゼン環に所定の置換基（フェノールは−ＯＨ、キシレンは２つの−ＣＨ₃、アニリンは−ＮＨ₂）および任意でその他の置換基を有する原料を用いることもできる。これらの原料が有するベンゼン環も、熱硬化性樹脂が有すべき疎水性置換基となり得る。さらに、その他の置換基としてアルキル基やアリール基等の疎水性置換基が導入された誘導体については、それらの置換基も熱硬化性樹脂が有すべき疎水性置換基となり得る。

（蛍光物質集積ナノ粒子の製造方法）
本発明の蛍光物質集積ナノ粒子は、集積化させる蛍光物質が疎水性である点で、一般的にそれが親水性であることが多い従来の蛍光物質集積ナノ粒子とやや相違するが、基本的には母体として熱硬化性樹脂を用いる場合の従来の蛍光物質集積ナノ粒子と同様の方法、典型的には乳化重合法により製造することができる。

例えば、熱硬化性樹脂としてメラミン樹脂を用いる場合、基本的に、疎水性蛍光物質と、メラミン樹脂の原料（例えば粉末状のメチロールメラミン）と、必要に応じてその他の添加剤等とを混合し、加熱をすることにより重合反応を進行させる。メラミン樹脂の重合反応が進行するにつれて、粒子が形成されるとともに、そこに疎水性蛍光物質が取り込まれ、集積化される。本発明では、メラミン樹脂の原料は、疎水性置換基を有する少なくとも１種の原料を含む必要がある。２種以上の原料を併用する場合、原料中の比率（モル比）が、生成する熱硬化性樹脂におけるそれぞれの原料から形成された構成単位の比率（モル比）となる。

重合反応の条件（温度、時間等）は、樹脂の種類、原料の組成などを考慮しながら適切に設定することができる。メラミン樹脂等の熱硬化性樹脂の合成については、反応温度は通常７０〜２００℃、反応時間は通常２０〜１２０分間である。なお、反応温度は蛍光物質、特に蛍光色素の性能が低下しない温度（耐熱温度範囲内）とすることが適切である。加熱は複数の段階に分けて行ってもよく、例えば、相対的に低温で一定時間反応させた後、昇温して相対的に高温で一定時間反応させるようにしてもよい。蛍光色素の耐熱温度は、ローダミン系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、スクアリリウム系色素分子などでは約２００℃、ピレン系色素分子、ペリレン系色素分子などでは約３００℃以上である。

重合反応の終了後は、得られた蛍光物質集積ナノ粒子の分散液から、遠心分離等により余剰の樹脂原料、蛍光色素、その他の添加剤などの不純物（それらを含む上澄み）を除去し、蛍光物質集積ナノ粒子（沈殿物）を回収して、洗浄すればよい、不純物の除去には遠心分離などの操作によって、蛍光物質集積ナノ粒子の洗浄には、超純水中での超音波照射および再分散などの操作によって行うことができる。蛍光物質集積ナノ粒子の再分散液の上澄み中に、蛍光物質や熱硬化性樹脂に由来する吸光および／または蛍光が見られなくなるまで、遠心分離、上澄み除去、超純水への再分散などどの一連の洗浄操作を複数回繰り返し行うことが適切である。

その他の熱硬化性樹脂を用いる場合であっても、原料および反応条件を適宜変更しながら、上記のメラミン樹脂を用いる場合と同様の方法で、またはその他の公知の方法で（例えばＷＯ２０１４／１３６８８５：特許文献５参照）、製造することができる。

（親水化処理）
熱硬化性樹脂の重合工程の後、前述したように蛍光物質集積ナノ粒子の表面を親水化したい場合は、そのための親水化処理を行ってもよい。蛍光物質集積ナノ粒子表面の親水化処理は公知の手法を用いて行うことができるが、シランカップリング剤を利用して、蛍光物質集積ナノ粒子の表面にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の親水性高分子を連結することが好ましい。

例えば、本発明で用いられる代表的な熱硬化性樹脂であるメラミン樹脂の合成には、メチロール基（−ＣＨ₂ＯＨ）および／またはメチル基等のアルキル基が疎水性置換基として導入された置換メチロール基（−ＣＨ₂ＯＲ）がアミノ基に結合しているメチロールメラミンが用いられる。合成反応後、そのようなメチロールメラミンのメチロール基が有する水酸基（−ＯＨ）、および／または置換メチロール基から生成する水酸基が、蛍光体集積ナノ粒子の表面に露出する。ここで、アルコキシ基と、アミノ基等の官能基とを有するシランカップリング剤は、一方でアルコキシ基によってメラミン樹脂の水酸基に結合することができ、他方でアミノ基等の官能基によって、アミノ基との反応性を有する官能基、例えばＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド）基があらかじめ末端に導入されたＰＥＧと結合することができる。したがって、まずメラミン樹脂を母体とする蛍光物質集積ナノ粒子にシランカップリング剤を反応させ、続いて所定のＮＨＳ基が導入されたＰＥＧを反応させることにより、蛍光物質集積ナノ粒子の表面をＰＥＧで修飾し、親水性を賦与することができる。熱硬化性樹脂が有する官能基とシランカップリング剤が有するアルコキシ基との組み合わせ、およびシランカップリング剤が有する官能基と親水性高分子に導入される官能基との組み合わせは、上記の例示に限定されるものではなく、適切な反応が起きるものであれば様々な組み合わせを採用することができる。

なお、次に述べるように、蛍光物質集積ナノ粒子を用いて標識剤を調製する際に、蛍光物質集積ナノ粒子と生体関連結合性物質（抗体等）とを連結するために、ＰＥＧ等の親水性高分子を含むリンカー（一端にシランカップリング剤との反応性を有する官能基が導入され、もう一端に生体関連結合性物質が有する官能基との反応性を有する官能基が導入されたもの）を用いて蛍光物質集積ナノ粒子の表面を処理する場合は、その処理によって蛍光物質集積ナノ粒子の表面を親水化することができる。

（蛍光物質集積ナノ粒子の用途）
本発明の蛍光物質集積ナノ粒子の用途は特に限定されるものではなく、公知の蛍光物質集積ナノ粒子と同様、様々な用途を想定することができるが、典型的には、次に述べるような標識剤を調製するために用いることができる。

―標識剤―
本発明の標識剤は、本発明の蛍光物質集積ナノ粒子と、その表面に連結された生体関連結合性物質とを含む。本発明では、疎水性の蛍光物質が熱硬化性樹脂を母体とするナノ粒子に集積されているが、標識剤の調製方法および用途は基本的に、公知の標識剤と同様である。より詳細な事項や具体的な実施形態は、後述する本明細書の実施例のほか、例えば、主に免疫染色法に用いられる標識剤について記載されているＷＯ２０１２／０２９７５２（特許文献１）、ＷＯ２０１３／０３５７０３（特許文献２）、ＷＯ２０１４／１３６８８５（特許文献５）や、主にＦＩＳＨ法に用いられる標識剤について記載されているＷＯ２０１５／１４１８５６（特許文献３）などを参照することができる。

（生体関連結合性物質）
生体関連結合性物質は、標識剤の用途、すなわちタンパク質、核酸などの標識対象とする生体物質に対してどのようにして標識剤を直接的または間接的に結合させるかに応じて、様々な物質を用いることができる。例えば、特定のタンパク質と特異的に結合する抗体（一次抗体）、その一次抗体に結合する抗体（二次抗体）、その二次抗体に結合する抗体（三次抗体）、特定の塩基配列を有する核酸とハイブリダイズする核酸プローブ、ビオチンおよびアビジン（天然のアビジンに限らず、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等のアビジン類縁体を包含する。）、ハプテン（ジニトロフェノール、ジゴキシゲニン、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）など）および抗ハプテン抗体などが挙げられる。

（標識剤の製造方法）
蛍光物質集積ナノ粒子と生体関連結合性物質とが連結した標識剤の製造方法は特に限定されるものではなく、公知の様々な手法を利用することができる。例えば、試薬等を用いて蛍光物質集積ナノ粒子の表面と生体関連結合性物質のそれぞれに反応性官能基を導入し、これらの官能基同士を結合させることにより、生体関連結合性物質が共有結合した蛍光物質集積ナノ粒子を作製することができる。また、生体関連結合性物質と蛍光物質集積ナノ粒子とを直接共有結合させるのではなく、生体関連結合性物質と蛍光物質集積ナノ粒子との間（つまりそれらが有する官能基同士の間）に、ある程度の分子長を有するリンカー、好ましくはポリエチレングリコール等の親水性高分子を含むリンカーを介在させてもよい。反応性官能基の組み合わせの例としては、ＮＨＳエステル基−アミノ基、チオール基−マレイミド基の組み合わせ等を例示することができる。例えば、（i）シランカップリング剤を用いて蛍光物質集積ナノ粒子の表面にアミノ基を導入し、（ii）一方でストレプトアビジンにＮ−ヒドロキシスクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテートを反応させて、ストレプトアビジンが有するアミノ基の先に、アセチル基で保護されたチオール基を導入し、（iii）クロスリンカーとして、一端にアミノ基と反応するＮＨＳ基を有し、他端にチオール基と反応するマレイミド基を有するポリエチレングリコール鎖を用意し、（iv）蛍光物質集積ナノ粒子表面のアミノ基と、クロスリンカーのＮＨＳ基を反応させて共有結合させ、（v）次いでストレプトアビジンのチオール基を脱保護した後、クロスリンカーのマレイミド基と反応させることにより、ストレプトアビジンで修飾された蛍光体集積ナノ粒子が得られる。

（標識体の用途）
本発明の標識剤の用途は特に限定されるものではなく、公知の標識剤と同様、様々な用途を想定することができる。典型的には、病理標本を作製するために、組織切片に含まれる特定のタンパク質、核酸その他の生体物質を蛍光標識するために、本発明の標識剤を用いることができる。蛍光物質集積ナノ粒子にどのような生体関連結合性物質を連結させたかにより、標識剤を直接、目的とするタンパク質（抗原）または核酸（遺伝子）に結合させて標識したり、１次抗体−２次抗体間の反応、アビジン−ビオチン間の反応、ハプテン−抗ハプテン抗体間の反応などを介して間接的に標識したり、様々な実施形態に対応することができる。

一例として、生体関連結合性物質としてのストレプトアビジンと蛍光物質集積ナノ粒子とが連結された標識剤は、次のようにして用いることができる。まず、蛍光標識の対象とするタンパク質に対して一次抗体を結合させ、次にその一次抗体にビオチンで修飾された二次抗体を結合させた後、ストレプトアビジンが連結された標識剤をそのビオチンに結合させる。また、蛍光標識の対象とする核酸（遺伝子）に、ビオチンで修飾した核酸プローブを結合させた後、ストレプトアビジンが連結された標識剤をそのビオチンに結合させることもできる。このように、蛍光物質集積ナノ粒子とビオチンまたはアビジンとが連結された標識剤は、アビジン−ビオチンの結合を介して、対象とする生体物質に間接的に結合して、蛍光標識することができる（アビジン−ビオチン法）。

［実施例１］疎水性蛍光色素（ＢＯＤＩＰＹ）を集積した、疎水性置換基を持つメラミン樹脂ナノ粒子
［１−１］疎水性置換基を持つ樹脂原料を用いたメラミン樹脂ナノ粒子の製造
疎水性蛍光色素「ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３」（ライフテクノロジーズ社）１０ｍｇを水２２ｍＬに加え、さらに乳化重合用乳化剤「エマルゲン（登録商標）４３０」（ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王株式会社）の５％水溶液を２ｍＬ加えた。この混合液をホットスターラー上で撹拌しながら７０℃まで昇温させた後、そこにメラミン樹脂の原料として、メチル化メラミン樹脂（メチルエーテル化メチロールメラミン：疎水性置換基なし）「ＭＸ−０３５」（株式会社三和ケミカル）０．３２ｇとｎ−ブチル化メラミン樹脂（ブチルエーテル化メチロールメラミン：疎水性置換基あり）「Ｌ−１２７−６０」（ＤＩＣ株式会社）０．３２ｇを含む混合メラミン樹脂原料を加えた。さらに、混合液に界面活性剤としてドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学株式会社）の１０％水溶液を１０００μＬ加え、７０℃で５０分間、加熱しながら撹拌し、その後９０℃に昇温して２０分間、加熱しながら撹拌することで、上記疎水性蛍光色素を集積したメラミン樹脂ナノ粒子を調製した。

得られた分散液を遠心分離機「マイクロ冷却遠心機３７４０」（久保田商事株式会社）にて２００００Ｇで１０分間遠心分離した。上澄みを除去した後、余剰の蛍光色素や樹脂原料等の不純物を除くための洗浄処理として、超純水を加えて超音波照射し、粒子を再分散させた。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による洗浄を５回繰り返した。

［１−２］メラミン樹脂ナノ粒子の表面修飾
上記の工程により得られたメラミン樹脂ナノ粒子０．１ｍｇをエタノール１．５ｍＬ中に分散し、アミノプロピルトリメトキシシラン（ＬＳ−３１５０、信越化学工業社製）２μＬを加え、８時間反応させることにより、樹脂粒子の表面に存在するヒドロキシル基をアミノ基に変換する表面アミノ化処理を行った。

次に、２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有するリン酸緩衝液生理的食塩水（ＰＢＳ）を用いて、表面アミノ化処理後のメラミン樹脂ナノ粒子分散液の濃度を３ｎＭに調整した。濃度調整した分散液に対して、終濃度が１０ｍＭとなるように、ＳＭ（ＰＥＧ）１２（スクシンイミジル−[(Ｎ−マレイミドプロピオンアミド)−ドデカエチレングリコール]エステル、サーモサイエンティフィック社製）を混合し、２０℃で１時間反応させることで、末端にマレイミド基を有するＰＥＧ鎖で修飾されたメラミン樹脂ナノ粒子（粒子１）を調製した。

得られた分散液を上記遠心分離機にて１００００Ｇで２０分間遠心分離した。上澄みを除去した後、２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳを加えて沈降物を分散させ、再度遠心分離した。同様の手順による洗浄を３回行った。

［１−３］チオール基で修飾したストレプトアビジンの調製
ストレプトアビジン（和光純薬工業株式会社）に、Ｎ−スクシミジル Ｓアセチルチオ酢酸（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート、略称：ＳＡＴＡ）を反応させた後、ゲル濾過を行って、チオール基で修飾されたストレプトアビジンを調製した。

［１−４］標識剤の調製
上記の工程で得られた、末端にマレイミド基を有するＰＥＧ鎖で修飾されたメラミン樹脂ナノ粒子と、チオール基で修飾したストレプトアビジンとを、２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中で混合し、室温で１時間反応させて、メラミン樹脂ナノ粒子のマレイミド基とストレプトアビジンのチオール基を結合させた。反応後、１０ｍＭメルカプトエタノールを添加して反応を停止させた。得られた分散液をφ＝０．６５μｍの遠心フィルターで濃縮した後、精製用ゲル濾過カラムを用いて未反応のストレプトアビジン等を除去して、ＰＥＧ鎖を介してストレプトアビジンが連結された疎水性蛍光色素集積メラミン樹脂ナノ粒子からなる標識剤（標識剤１）を調製した。

［実施例２］疎水性蛍光色素（ＢＯＤＩＰＹ）を集積した、疎水性置換基を持つメラミン・ベンゾグアナミン共重合体ナノ粒子
前記工程［１−１］において、前記混合メラミン樹脂原料の代わりに、メチル化メラミン樹脂（メチルエーテル化メチロールメラミン：疎水性置換基なし）「ＭＸ−０３５」（株式会社三和ケミカル）０．１５ｇおよびブチル化ベンゾグアナミン樹脂（ブチルエーテル化メチロールベンゾグアナミン：疎水性置換基あり）「ＴＤ−１２６」（ＤＩＣ株式会社）０．５５ｇを用い、それ以外は実施例１と同様にして、メラミン・ベンゾグアナミン共重合体ナノ粒子（粒子２）を調製し、さらにＰＥＧ鎖を介してストレプトアビジンが連結された疎水性蛍光色素集積メラミン・ベンゾグアナミン共重合体ナノ粒子からなる標識剤（標識剤２）を調製した。

［実施例３］疎水性蛍光色素（ＢＯＤＩＰＹ）を集積した、キシレン・フェノール共重合体ナノ粒子
疎水性蛍光色素「ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３」（ライフテクノロジーズ社）１０ｍｇを水２０ｍＬに加え、そこにキシレン・フェノール共重合体の原料として、フェノール変性レゾールタイプキシレン樹脂「ニカノールＰＲ−１４４０Ｍ」（フドー株式会社、フェノール変性レゾールタイプメチロールキシレン、反応様式が異なるオリゴマーの混合物であるが、一例として下記式（１３）参照）０．８０ｇおよびフェノール０．２０ｇをあらかじめ溶解させた、ドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学株式会社）の１０％水溶液を１０００μＬ加えた。この混合液を９０℃で２０分間、加熱しながら撹拌し、その後オートクレーブにて１２５℃で５分間加熱することで、上記疎水性蛍光色素を集積したキシレン・フェノール共重合体ナノ粒子（粒子３）を調製した。それ以降は実施例１と同様にして、ＰＥＧ鎖を介してストレプトアビジンが連結された疎水性蛍光色素集積キシレン・フェノール共重合体ナノ粒子からなる標識剤（標識剤３）を調製した。

［実施例４］半導体量子ドットを集積した、疎水性置換基を持つメラミン樹脂ナノ粒子
前記工程［１−１］において、前記蛍光色素の代わりに、半導体量子ドット「Ｑｄｏｔ（登録商標）５４５ ＩＴＫ Organic Quantum Dots」（インビトロジェン社）２００μＬを用い、それ以外は実施例１と同様にして、メラミン・ベンゾグアナミン共重合体ナノ粒子（粒子４）を調製し、さらにＰＥＧ鎖を介してストレプトアビジンが連結された半導体量子ドット集積メラミン樹脂からなる標識剤（標識剤４）を調製した。

［比較例１］疎水性置換基を持たないメラミン樹脂ナノ粒子
前記工程［１−１］において、前記混合メラミン樹脂原料の代わりに、メチル化メラミン樹脂（メチルエーテル化メチロールメラミン：疎水性置換基なし）「ＭＸ−０３５」（株式会社三和ケミカル）０．６５ｇを用い、それ以外は実施例１と同様にして、メラミン樹脂ナノ粒子を調製し（粒子５）、さらにＰＥＧ鎖を介してストレプトアビジンが連結されたメラミン樹脂ナノ粒子からなる標識剤（標識剤５）を調製した。

［評価１］標識剤分散液の蛍光強度の評価
実施例１〜４および比較例１で作製した標識剤１〜４および標識剤５のそれぞれを用いて、濃度が０．１ｎＭの水分散液を調製し、その蛍光強度を分光蛍光光度計「Ｆ−７０００」（株式会社日立ハイテクサイエンス）で測定した。

結果を下記表に示す。疎水性置換基を持つメラミン樹脂を用いて調製された標識剤１（実施例１）および疎水性置換基を持つメラミン・ベンゾグアナミン共重合体を用いて調製された標識剤２（実施例２）の蛍光強度は、疎水性置換基を持たないメラミン樹脂を用いて調製された標識剤５（比較例１）の蛍光強度に比べて遙かに高い。このことは、標識剤１を構成するメラミン樹脂ナノ粒子（粒子１）および標識剤２を構成するメラミン・ベンゾグアナミン共重合体ナノ粒子（粒子２）における疎水性蛍光色素（ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３）の集積量が、比較例１のメラミン樹脂ナノ粒子（粒子５）における集積量よりも極めて多いことを示唆しており、疎水性蛍光色素とメラミン樹脂の疎水性置換基との間に働く疎水性相互作用が疎水性蛍光色素の集積化に寄与していることが推定される。

標識剤１および２と同様に、疎水性置換基としてベンゼン環（フェニル基）を持つキシレン・フェノール共重合体を用いて調製された標識剤３（実施例３）の蛍光強度も、標識剤５（比較例１）よりも遙かに高く、キシレン・フェノール共重合体粒子（粒子３）によっても疎水性蛍光色素の集積化が行えているものと推定される。

さらに、疎水性蛍光色素に代えて疎水性半導体量子ドットを用いた標識剤４（実施例４）も、疎水性置換基を持つメラミン樹脂粒子（粒子４）において、疎水性半導体量子ドットの集積化が行えているものと推定される。なお、蛍光色素１分子よりも半導体量子ドット１粒子の方が蛍光強度が高いので、蛍光色素を集積化した実施例１〜３の標識剤（粒子）よりも半導体量子ドットを集積化した実施例４の標識剤（粒子）の方が、一層高い蛍光強度を発している。

［評価２］組織切片の染色に用いた標識剤の長期保存後の蛍光強度の評価
実施例１および実施例２で作製した標識剤１および標識剤２のそれぞれを用いて、また組織アレイスライドとして、乳がんの組織切片のスポットがアレイ上に配置されたスライド（US Biomax社、BR243）を用いて、以下の手順で組織切片を染色し、観察スライドとした。

（i）常法に従って、組織アレイスライドの脱パラフィン処理、親水化処理および抗原の賦活化処理を行った。その後、組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した。

（ii）１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で０．０５ｎＭに稀釈した抗ＨＥＲ２マウスモノクローナル抗体溶液を組織切片上に滴下し、２時間反応させた。その後、組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した。

（iii）１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で稀釈したビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体溶液を組織切片上に滴下し、３０分間反応させた。その後、組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した。

（iv）各標識剤を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で０．１ｎＭに稀釈した溶液を組織切片上に滴下し、２時間反応させた。その後、組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した。

（v）組織切片にマイヤーヘマトキシリン液を滴下し、５分間反応させて、ヘマトキシリン染色（核染色）を行った。その後、組織アレイスライドを流水（約４５℃）で３分間洗浄した。

（vi）組織切片に水系封入剤「Ｐｒｏｌｏｎｇ ｇｏｌｄ」（ライフテクノロジーズ社）を滴下し、カバーガラスを被せて封入した。このようにして調製された組織アレイスライドを観察スライドとした。

上記のようにして調製された観察スライドについて、まず封入処理の直後に、倒立蛍光顕微鏡（カールツァイス社）を用いて、励起光を照射して蛍光を発光させ、蛍光画像を取得した（励起光波長４８０〜５２０ｎｍ、蛍光波長５３０〜５６０ｎｍ、視野中心部付近の照射エネルギー９００Ｗ／ｃｍ²、露光時間４０００μ秒）。その後、観察スライドを冷蔵庫にて６ヶ月間保存し、それから再度、上記と同様にして蛍光画像を取得した。

封入直後および６ヶ月保存後の蛍光画像のそれぞれについて画像解析ソフト「Ｉｍａｇｅ−Ｊ」を用いて、画像中の各画素の輝度を算出し、標識剤で蛍光染色された部位の平均輝度を算出して「蛍光強度」とした。そして、封入直後の蛍光強度に対する、６ヶ月保存後の蛍光強度の相対値を算出した。

結果を下記表に示す。実施例１の標識剤１は、６ヶ月経過後も比較的高い蛍光強度を維持しているといえるが、実施例２の標識剤２はそれよりも一層、蛍光強度を維持する能力に優れているといえる。これは、実施例２の粒子２の母体を構成するブチルエーテル化メチロールベンゾグアナミンが、疎水性置換基としてブチル基に加えてフェニル基（ベンゼン環）を有しており、蛍光色素（ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３）の基本骨格をなす芳香環との間にπ−π相互作用（スタッキング相互作用）が働くため、疎水性置換基としてブチル基のみを有する実施例１の粒子１と比べて、母体と蛍光色素との相互作用がより強力になり、蛍光色素の流出や、粒子内に侵入した水による蛍光色素の分解が長期間に亘って抑えられているためであると考えられる。

Claims (5)

1. 疎水性蛍光物質を集積した、熱硬化性樹脂を母体とするナノ粒子であって、
   前記熱硬化性樹脂は疎水性置換基を有する原料から形成された構成単位を含み、
   前記疎水性蛍光物質は少なくとも、前記熱硬化性樹脂の疎水性置換基との間に働く疎水性相互作用によって、前記ナノ粒子内に集積されており、
   前記熱硬化性樹脂が、ブチルエーテル化メチロールメラミン、ベンゾグアナミン、ブチルエーテル化メチロールグアナミンおよびブチルエーテル化メチロールベンゾグアナミンからなる群から選択される少なくとも１種の原料から形成される構成単位を含むものであり、
   前記疎水性置換基が、
   炭素数４〜１０の、直鎖状、分岐鎖状または環状の、アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基；ならびに
   炭素数６〜１５の、アリール基およびヘテロアリール基
   からなる群より選ばれる少なくとも１種である、蛍光物質集積ナノ粒子。
2. 前記疎水性蛍光物質がさらに、前記熱硬化性樹脂の疎水性置換基との間に働くスタッキング相互作用によって前記ナノ粒子内に集積されている、請求項１に記載の蛍光物質集積ナノ粒子。
3. 前記疎水性置換基がフェニル基である、請求項１または２に記載の蛍光物質集積ナノ粒子。
4. 前記熱硬化性樹脂が、疎水性置換基を有する原料から形成された構成単位と、疎水性置換基を有さない原料から形成された構成単位の両方を含む熱硬化性樹脂である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の蛍光物質集積ナノ粒子。
5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の蛍光物質集積ナノ粒子と、その表面に連結された生体関連結合性物質とを含む、標識剤。