DE102005022370A1 - Nanoskalige fluoreszierende Melaminpartikel - Google Patents

Nanoskalige fluoreszierende Melaminpartikel Download PDF

Info

Publication number
DE102005022370A1
DE102005022370A1 DE102005022370A DE102005022370A DE102005022370A1 DE 102005022370 A1 DE102005022370 A1 DE 102005022370A1 DE 102005022370 A DE102005022370 A DE 102005022370A DE 102005022370 A DE102005022370 A DE 102005022370A DE 102005022370 A1 DE102005022370 A1 DE 102005022370A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
particles
nanoscale
streptavidin
melamine
formic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE102005022370A
Other languages
English (en)
Inventor
Armin KÜBELBECK
Juliane Riedel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Patent GmbH
Original Assignee
Merck Patent GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent GmbH filed Critical Merck Patent GmbH
Priority to DE102005022370A priority Critical patent/DE102005022370A1/de
Priority to JP2008510433A priority patent/JP2008543982A/ja
Priority to EP06724440A priority patent/EP1879934A1/de
Priority to PCT/EP2006/003598 priority patent/WO2006119845A1/de
Priority to KR1020077028740A priority patent/KR20080015437A/ko
Priority to US11/914,045 priority patent/US20080193758A1/en
Publication of DE102005022370A1 publication Critical patent/DE102005022370A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/02—Use of particular materials as binders, particle coatings or suspension media therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82B—NANOSTRUCTURES FORMED BY MANIPULATION OF INDIVIDUAL ATOMS, MOLECULES, OR LIMITED COLLECTIONS OF ATOMS OR MOLECULES AS DISCRETE UNITS; MANUFACTURE OR TREATMENT THEREOF
    • B82B1/00—Nanostructures formed by manipulation of individual atoms or molecules, or limited collections of atoms or molecules as discrete units
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G12/00—Condensation polymers of aldehydes or ketones with only compounds containing hydrogen attached to nitrogen
    • C08G12/02—Condensation polymers of aldehydes or ketones with only compounds containing hydrogen attached to nitrogen of aldehydes
    • C08G12/26—Condensation polymers of aldehydes or ketones with only compounds containing hydrogen attached to nitrogen of aldehydes with heterocyclic compounds
    • C08G12/30—Condensation polymers of aldehydes or ketones with only compounds containing hydrogen attached to nitrogen of aldehydes with heterocyclic compounds with substituted triazines
    • C08G12/32—Melamines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G12/00—Condensation polymers of aldehydes or ketones with only compounds containing hydrogen attached to nitrogen
    • C08G12/02—Condensation polymers of aldehydes or ketones with only compounds containing hydrogen attached to nitrogen of aldehydes
    • C08G12/40—Chemically modified polycondensates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/12—Powdering or granulating
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2361/00—Characterised by the use of condensation polymers of aldehydes or ketones; Derivatives of such polymers
    • C08J2361/20—Condensation polymers of aldehydes or ketones with only compounds containing hydrogen attached to nitrogen
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
    • Y10T428/29—Coated or structually defined flake, particle, cell, strand, strand portion, rod, filament, macroscopic fiber or mass thereof
    • Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Processes Of Treating Macromolecular Substances (AREA)
  • Phenolic Resins Or Amino Resins (AREA)
  • Inks, Pencil-Leads, Or Crayons (AREA)

Abstract

Gegenstand der Erfindung sind nanoskalige Melamin-Formaldehyd-Partikel, wobei diese einen Partikeldurchmesser von 10 bis 95 nm besitzen und Fluoreszenzfarbstoffe enthalten, ein Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung als Trägermaterial zur Herstellung von Biomarkern, Inkjet-Tinten, Fluoreszenzmarkern und/oder als Adsorptionsmaterial für chromatographische Trennungen.

Description

  • Gegenstand der Erfindung sind nanoskalige Melamin-Formaldehyd-Partikel (MF-Partikel) mit einem Partikeldurchmesser von 10 bis 95 nm, die Fluoreszenzfarbstoffe enthalten können und vorzugsweise monodispers sind sowie ein Verfahren zur deren Herstellung.
  • Fluoreszierende Substanzen haben zahlreiche Anwendungen vor allem in der Biochemie. An Biomoleküle kann durch eine chemische Reaktion eine fluoreszierende chemische Gruppe angehängt werden, die dann als sehr sensitiver Marker für dieses Molekül dient. In der Immunologie werden Antikörper mit einer fluoreszierenden chemischen Gruppe versehen, so dass die Orte, an die die Antikörper binden, anhand der Fluoreszenz erkennbar sind. Die Antigen-Konzentration kann damit sogar quantitativ bestimmt werden. Mit fluoreszierenden Markern ist es möglich unterschiedliche Biomoleküle in einer Zelle nachzuweisen. Die Marker fluoreszieren in verschiedenen Farben und so lässt sich die Fluoreszenzverteilung z.B. im Gewebe, unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachten.
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es fluoreszenzmarkierte Nanopartikel mit einem möglichst kleinen Durchmesser (< 100nm) herzustellen. An diesen Partikeln sollte dann Streptavidin immobilisiert werden, um damit dann biotinmarkierte Proteine nachzuweisen. Die Nanopartikel sollten so klein sein, dass sie in Microarrays eingesetzt werden können. Eine möglichst monodisperse Größenverteilung und eine möglichst große Fluoreszenz sollten das Ziel der Partikelsynthese sein.
  • Mit Fluoreszenzfarbstoffen markiertes Streptavidin gibt es bereits, allerdings ist dabei das resultierende Messsignal sehr klein. In einem Nanopartikel (Durchmesser < 100nm) hingegen können viele Fluoreszenzfarbstoff-Moleküle enthalten sein. Somit stünde eine hochempfindliche Methode zum Proteinnachweis zur Verfügung. Das System Biotin-Streptavidin eignet sich besonders gut für solche Nachweise, da es sehr gut untersucht ist und die Affinität zwischen Biotin (Vitamin H) und Streptavidin sehr hoch ist. Die Bindung zwischen Biotin und Streptavidin ist sehr fest, so dass die Bindungspartner nicht dissoziieren, bevor die Messung abgeschlossen ist.
    •
  • Fluoreszierende Melamin-Formaldehyd-Partikel werden, wie vorher erwähnt, in der Diagnostik als Trägermaterialien verwendet und von einer Reihe von Firmen auch vertrieben, z.B. von Sigma-Aldrich oder MicroParticles. Die dabei angebotenen MF-Partikel sind im Bereich von 1 bis 15 μm. Unbekannt sind bisher MF-Partikel, die einen Partikeldurchmesser deutlich kleiner als 1 μm besitzen. Für den Bereich 0.1 bis 3 μm sind vorwiegend Polystyrolbasierende fluoreszierende Mikrokugeln bekannt (z.B. von Merck Estapor), die allerdings den Nachteil haben, dass die kleinsten Durchmesser von etwa 0.1 μm nicht monodispers sind.
  • Melamin-basierende Nanopartikel weisen jedoch gegenüber Polystyrolbasierenden Materialien noch einige andere Vorteile auf. Sie haben z.B. eine höhere Dichte (1.51 g/cm3), sind sehr stabil, können unbegrenzt gelagert werden, können in Wasser resuspendiert werden, sind hitzebeständig bis 200°C und liegen in Wasser monodispers vor. Außerdem können fluoreszierende Farbstoffe in die MF-Partikel einfach eingebaut werden (siehe WO 03/074614). Sie lassen sich nicht auswaschen. Es wird angenommen, dass Farbstoffe in den Partikeln nicht kovalent gebunden werden wie z.B. in Silicapartikeln, sondern nur eingeschlossen werden.
  • Aus der DD-224 602 ist ein Verfahren zur Herstellung monodisperser Melamin-Formaldehyd-Latices mit Teilchengrößen im Bereich von 0.1 bis 15 μm bekannt, wobei die MF-Partikel durch Polykondensation von Melamin und Formaldehyd in wässrigem Medium mit schwach konzentrierter Ameisensäure (0.87 %) hergestellt werden. Weiterhin ist die Funktionalisierung dieser Latices und der Einbau von Farbstoffen, insbesondere Fluoreszenzfarbstoffen, beschrieben.
  • Die Funktionalisierung von MF-Partikeln kann auf zwei Wegen erfolgen. Zum einen kann bei der Polykondensation eine hydrophile Substanz mit der gewünschten Funktionalität zugegeben werden. Diese wird in die Partikel integriert. Es werden sich funktionelle Gruppen auf der Oberfläche befinden, allerdings wird ein Teil dieser Substanz im Partikelinneren eingeschlossen sein. Bei dieser Art der Funktionalisierung ist es schwierig, die Belegung der Oberfläche zu steuern.
  • Zum anderen können die Partikel nachträglich funktionalisiert werden. Auf der Oberfläche der Melaminharzpartikel befinden sich reaktive Gruppen. Diese lassen sich beispielsweise dadurch nachweisen, indem man die Oberfläche mit einem langkettigen Carbonsäurechlorid modifiziert, so dass die Partikel anschließend hydrophob sind.
  • Überraschenderweise konnten nun nanoskalige MF-Partikeln mit einem Partikeldurchmesser von 10 bis 95 nm entwickelt werden, die einen oder mehrere hydrophile metallorganische oder organische Fluoreszenzfarbstoffe enthalten. Bevorzugt besitzen die MF-Partikel einen Durchmesser von 30 bis 50nm und sind monodispers.
  • Melaminharze basieren auf dem 1,3,5-Triamino-2,4,6-triazin Grundkörper. Mit 2–6 Mol Formaldehyd pro Mol Melamin kann ein methyloliertes Melamin hergestellt werden. Da die Methylolmelamine in Wasser wenig beständig sind, werden sie in handelsüblichen Produkten verethert. Mit Methanol veretherte Melamine sind gut wasserlöslich, wohingegen mit Butanol veretherte gut in organischen Lösungsmitteln löslich sind.
  • Das handelsübliche, hier eingesetzte Melamin-Formaldehyd-Harz (Madurit SMW 818 der Fa. Surface Specialties) ist eine 75%ige wässrige Lösung. Das Molverhältnis Melamin zu Formaldehyd liegt im Bereich von 1:2.8 bis 1:3.8 und 45–55% aller Methylolgruppen sind methanolverethert.
  • Die Herstellung von monodispersen Melaminpartikeln ist z.B. in DD-224 602 beschrieben. Sie lassen sich, wie schon erwähnt, während der Polykondensation einfach funktionalisieren, wobei die Polykondensation im Sauren stattfindet. Die Größe der Partikel ist beeinflussbar durch Art und Konzentration des eingesetzten Methylolmelamins, den pH-Wert und die Temperatur bei der Säurezugabe. Höhere Temperaturen, niedriger pH-Wert, Melaminharz mit vielen Methylolgruppen und niedrige Harzkonzentration verschieben jeweils die Reaktion zu kleineren Partikeln hin.
  • Die Polykondensation im Sauren ist auch beschrieben in DE 4019844 , wobei als Säurekatalysator Schwefelsäure verwendet wird.
  • Die erfindungsgemäßen nanoskaligen MF-Partikel werden hergestellt, indem man MF-Harz bei Temperaturen im Bereich zwischen 60 bis 80°C in einer ausreichend großen Wassermenge aufrührt und anschließend mit 98 bis 100%iger Ameisensäure versetzt, so dass Partikel mit einem Durchmesser zwischen 10 und 95 nm entstehen. Ameisensäure hat sich als anwendbarer Kondensationsinitiator erwiesen, weil mit ihr die Ergebnisse reproduzierbar sind. Mit Salzsäure- die einen deutlich höheren pKA-Wert hat- hingegen lassen sich Ergebnisse nicht reproduzieren. Vorzugsweise setzt man 15 bis 20 Gew.% konzentrierte Ameisensäure (also 98 bis 100%ig) zu.
  • Um fluoreszierende nanoskalige MF-Partikel zu erhalten, werden den MF-Partikeln vor der Umsetzung mit konzentrierter Ameisensäure hydrophile metallorganische oder organische Fluoreszenzfarbstoffe zugesetzt.
  • Die Farbstoffe müssen vorher nicht modifiziert werden, da sie in die Partikel eingeschlossen, aber nicht kovalent gebunden werden. Um in die MF-Partikel integriert zu werden, müssen die Farbstoffe lediglich hydrophil sein. Als hydrophile organische Farbstoffe können beispielsweise Fluoreszenzfarbstoffe wie z.B. Rhodamin B und Rhodaminderivate (rot), Fluoreszein und Fluoreszeinderivate (gelb), Aminomethylcoumarin und Coumarinderivate (blau) eingesetzt werden. Als metallorganische Farbstoffe können beispielsweise Terbium3+ Tiron-Komplex (grün) und Europium-tris-dipikolinat (rot) eingesetzt werden.
  • Bevorzugt wird 8-Hydroxy-1,3,6-pyrentrisulfonsäure-Trinatriumsalz eingesetzt, wobei die Partikel dann stark grün fluoreszieren.
  • Je kleiner die Partikel sind, desto größer ist ihre spezifische Oberfläche. Wenn diese Oberfläche dicht mit funktionellen Gruppen belegt ist, kann prinzipiell auch von kleinen MF-Partikeln viel Streptavidin gebunden werden.
  • Bei der Kopplung von Streptavidin an die nanoskaligen MF-Partikel ist es wichtig, dass die Biotinbindekapazität vom Streptavidin erhalten bleibt. Streptavidin kann durch eine Einstufenreaktion oder eine Zweistufenreaktion an Partikel gebunden werden (siehe G.T. Hermanson et al., Immobilized Affinity ligand Techniques (1992)). EDC (N-(3-Dimethylamino-propyl)-N'-ethylcarbodiimid) ist ein gebräuchliches Reagenz, um Proteine an andere Moleküle zu koppeln. In der Einstufenreaktion reagiert EDC mit einer Carboxylgruppe zu einem Esterintermediat, das mit einem primären Amin reagieren kann. Mit NHS (N-Hydroxylsuccinimid) entsteht bei der Zweistufenreaktion ein stabileres Esterintermediat, das anschließend mit dem Protein umgesetzt wird.
  • EDC kann sowohl mit einer Carboxylgruppe auf einem MF-Partikel, als auch mit einer am Streptavidin reagieren. Deshalb können theoretisch auch zwei oder mehr Streptavidinmoleküle miteinander vernetzt werden, diese stünden dann nicht mehr für eine Reaktion mit der MF-Partikeloberfläche zur Verfügung. Um dieser möglichen Quervernetzung vorzubeugen, kann, wie vorher erwähnt, eine Zweistufenreaktion durchgeführt werden. Dabei werden zuerst die nanoskaligen MF-Partikel mit EDC und NHS umgesetzt und die überschüssigen Reagenzien ausgewaschen, so dass EDC nicht mit Streptavidin reagieren kann. Erst danach wird die Streptavidin-Lösung zugegeben. Da nur die Partikeloberfläche aktiviert ist, können die Streptavidinmoleküle auch nur mit dieser reagieren.
  • Nebenbei sei angemerkt, dass es kaum einen Unterschied zwischen der Umsetzung mit EDC (Einstufenreaktion) und der mit EDC/NHS (Zweistufenreaktion) gibt. Mit beiden Methoden wird ungefähr die gleiche Menge Streptavidin an die Oberfläche der nanoskaligen MF-Partikel gebunden.
  • Um zu überprüfen, ob Streptavidin an den Partikeln immobilisiert ist, wird der Partikelsuspension Fluorescein-Biotin zugesetzt. Das ungebundene Fluorescein-Biotin kann in einem Fluoreszenzspektrometer quantitativ bestimmt werden.
  • Die nanoskaligen, vorzugsweise monodispersen und fluoreszierenden MF-Partikel können als Trägermaterial zur Herstellung von Biomarker, Inkjet-Tinten, als Fluoreszenzmarker in und auf Gebrauchsgegenständen aller Art (z.B. Dokumenten und/oder Geldscheinen) und/oder als Adsorptionsmaterial für chromatographische Trennungen verwendet werden, wobei für chromatographische Anwendungen auch die nicht fluoreszierenden MF-Paritkel genügen.
    •
  • Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung näher erläutern ohne sie einzuschränken.
  • Beispiel 1:
  • Farblose nanoskalige Melamin-Formaldehyd-Partikel
  • 450 g Wasser werden auf 70°C erwärmt. Bei 70°C wird das in 50 g Wasser aufgerührte Melamin-Formaldehyd-Harz (15 g Madurit SMW818) zugegeben. Die Lösung bleibt klar. Wenn die Temperatur wieder auf 70°C angestiegen ist werden 2 ml 98–100%ige Ameisensäure zugegeben und es wird noch weitere 20 min bei dieser Temperatur gerührt. Es ist kaum eine Trübung zu erkennen, aber mit Hilfe einer Taschenlampe ist der dem Fac hmann bekannte Tyndalleffekt gut zu beobachten.
  • Die nach der Aufreinigung per Ultrafiltration (30 kDalton Membran) erhaltenen Partikel haben einen im Rasterelektronenmikroskop ausgemessenen mittleren Durchmesser von ca. 40 nm.
  • Beispiel 2:
  • Fluoreszierende nanoskalige Melamin-Formaldehyd-Partikel
  • 450 g Wasser und der 25 mg 8-Hydroxy-1,3,6-pyrentrisulfonsäure-Natriumsalz werden auf 70°C erwärmt. Bei 70°C wird das in 50 g Wasser aufgerührte Harz (15 g Madurit SMW818) zugegeben. Die Lösung bleibt klar. Wenn die Temperatur wieder auf 70°C angestiegen ist werden 2 ml 98–100%ige Ameisensäure zugegeben und es wird noch weitere 20 min bei dieser Temperatur gerührt. Nach ca. 1 min trübt sich der Ansatz leicht.
  • Die nach der Aufreinigung per Ultrafiltration (30 kDalton Membran) erhaltenen Partikel haben einen im Rasterelektronenmikroskop vermessenen Durchmesser von ca. 46 nm.
  • Beispiel 3:
  • Konjugation der Nanopartikel mit Streptavidin über EDC-Lösung (Einstufenreaktion)
  • 1 ml einer 10 Gew.% Melaminpartikel enthaltenden Suspension (= 100 mg Feststoff) werden in ein Eppendorf-Cap eingewogen, in 1 ml 50 mM MES-Puffer (2-Morpholinoethansulfonsäure (Merck) pH 5,5) suspendiert und anschließend in einer Ultrazentrifuge bei 60.000 min–1 abzentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und der Waschvorgang wird wiederholt. Dann werden die Partikel in 1 ml Proteinlösung (10 mg/ml Streptavidin in MES-Puffer) resuspendiert und in ein verschließbares Glasröhrchen überführt. Die Partikel werden 30 Minuten durch Rollen in Suspension gehalten. Dann werden 100 μl EDC-Lösung (10 mg/ml N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid (Merck) in destilliertem Wasser oder MES-Puffer, unmittelbar vor Gebrauch angesetzt) zugegeben. Die Partikel werden über Nacht bei Raumtemperatur in Suspension gehalten. Dabei reagiert das EDC mit den Carboxylgruppen auf der Partikeloberfläche und das Streptavidin mit dem entstehenden Konjugat. Die Probe wird wieder zentrifugiert und der Überstand verworfen. Nach Zugabe von 1 ml Ethanolamin-Lösung (1 M Ethanolamin (Merck), pH 9.0, 25 mM tetra-Natriumdiphosphat-Decahydrat (Merck)) wird die Probe noch eine Stunde gerollt bevor wieder zentrifugiert wird. Ethanolamin reagiert mit den restlichen aktivierten Estern zu Amiden. Danach wird drei mal mit je 1 ml PBS-Puffer (10 mM NaH2PO4 (Merck), pH 7,5, 150 mM NaCl (Merck)) gewaschen. Die Partikel werden ein letztes Mal in PBS-Puffer resuspendiert und können bei 4°C im Kühlschrank aufbewahrt werden.
  • Beispiel 4:
  • Konjugation der Nanopartikel mit Streptavidin über EDC/NHS (Zweistufenreaktion)
  • 1 ml einer 10 Gew.% Melaminpartikel enthaltenden Suspension (= 100 mg Feststoff) werden in ein Eppendorf-Cap eingewogen, in 1 ml 50 mM MES-Puffer (2-Morpholinoethansulfonsäure (Merck) pH 5.5) suspendiert und anschließend in einer Ultrazentrifuge bei 60.000 min–1 abzentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und der Waschvorgang wird wiederholt. Dann werden die Partikel in 1 ml MES-Puffer resuspendiert und in ein verschließbares Glasröhrchen überführt. Es werden 100 μl EDC/NHS-Lösung (100 mg/ml EDC, 16 mg/ml N-Hydroxylsuccinimid (Merck) in MES-Puffer) zugegeben. Die Partikel werden 1 Stunde durch Rollen bei Raumtemperatur in Suspension gehalten, dabei wird das NHS an die Carboxylgruppen auf der Partikeloberfläche gekoppelt. Die Probe wird wieder zentrifugiert und der Überstand wird verworfen. Es wird noch einmal mit 1 ml MES-Puffer gewaschen.
  • Die Partikel werden in 1 ml Protein-Lösung resuspendiert und über Nacht bei Raumtemperatur gerollt. Die Gegenproben werden in 1 ml MES-Puffer (keine Zugabe von EDC/NHS und Proteinlösung) resuspendiert und über Nacht gerollt. Die Probe wird zentrifugiert und nach Zugabe von 1 ml Ethanolamin-Lösung wird die Probe noch eine Stunde gerollt bevor wieder zentrifugiert wird. Ethanolamin reagiert mit den restlichen aktivierten Estern zu Amiden. Danach wird drei mal mit je 1 ml PBS-Puffer gewaschen. Dann werden die Partikel noch einmal in PBS-Puffer resuspendiert und können bei 4°C im Kühlschrank aufbewahrt werden.
  • Beispiel 5:
  • Nachweis der Bindung des Streptavidins an die Nanopartikel über Fluorescein-Biotin
  • Um zu überprüfen, ob Streptavidin an den Partikeln immobilisiert ist, wird der Partikelsuspension Fluorescein-Biotin zugesetzt. Ein Streptavidinmolekül kann 4 Biotinmoleküle binden. Da eine definierte Menge Biotin (M = 244,31 g/mol) zu den mit Streptavidin umgesetzten Partikeln gegeben wird, kann daraus bis auf diesen Faktor 4 die Menge des gebundenen Streptavidins berechnet werden.
  • Von jeder Probe werden 10 μl Suspension (dies entspricht 1 mg Partikel) in ein neues Eppendorf-Cap pipettiert. Den Proben werden nun jeweils 200 μl Biotin-Fluorescein-Lösung (1 gmol/μl in PBS-Puffer) zugesetzt. Sie werden 15 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt und anschließend zentrifugiert. Jetzt werden die Proben auf eine Mikrotiterplatte übertragen um sie im Fluoreszenzspektrometer messen zu können. Dazu werden 125 μl PBS-Puffer in jedem Well vorgelegt und dann 75 μl des Überstandes aus dem Eppendorf-Cap zugegeben. Von jeder Probe wird eine Doppelbestimmung durchgeführt. Als Nullwert werden 200 μl PBS-Puffer gemessen, als Maximalwert 75 μl der Biotin-Fluorescein-Lösung in 125 μl PBS-Puffer. Es wird also das nicht gebundene Biotin bestimmt. Aus diesem Wert kann man die Menge des gebundenen Biotins berechnen, da man durch den Maximalwert weiß, wieviel Biotin auf die Probe gegeben wurde.
  • Um zu untersuchen, wie groß die Hintergrundbindung von Biotin ist, werden nach der Messung die mit Biotin belegten Partikel noch einmal mit 200 μl 1 M NaCl gewaschen und zentrifugiert. 2 mal 75 μl des Überstandes werden wieder in 125 μl PBS-Puffer gemessen. Dieser Wert muss bei der Auswertung von dem Wert des gebundenen Biotins abgezogen werden. Das Biotin, was sich mit 1 M NaCl wieder in Lösung bringen lässt, war nur unspezifisch an der Oberfläche adsorbiert.

Claims (13)

  1. Nanoskalige Melamin-Formaldehyd-Partikel (MF-Partikel), dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Partikeldurchmesser von 10 bis 95 nm besitzen.
  2. Nanoskalige MF-Partikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Partikeldurchmesser von 30 bis 50 nm besitzen und monodispers sind.
  3. Nanoskalige MF-Partikel nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen oder mehrere hydrophile metallorganische oder organische Fluoreszenzfarbstoffe enthalten.
  4. Nanoskalige MF-Partikel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass als hydrophiler Fluoreszenzfarbstoff 8-Hydroxy-1,3,6-pyrentrisulfonsäure-Natriumsalz enthalten ist.
  5. Nanoskalige MF-Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit Streptavidin konjugiert sind.
  6. Verfahren zur Herstellung nanoskaliger MF-Partikel durch Umsetzung von Ameisensäure mit Melamin-Formaldehyd-Harz in wässrigem Medium, dadurch gekennzeichnet, dass man Melamin-Formaldehyd-Harz bei Temperaturen im Bereich zwischen 60 und 80°C in einer ausreichend großen Wassermenge aufrührt und anschließend mit 98 bis 100%iger Ameisensäure versetzt, so dass Partikel mit einem Durchmesser zwischen 10 und 95 nm entstehen.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass monodisperse MF-Partikel mit einem Durchmesser zwischen 30 und 50 nm entstehen.
  8. Verfahren nach den Ansprüchen 6 und/oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass man 15 bis 20 Gew.% konzentrierte Ameisensäure zusetzt.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass den MF-Partikeln vor der Umsetzung mit Ameisensäure hydrophile metallorganische oder organische Fluoreszenzfarbstoffe zugesetzt werden.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass als hydrophiler Fluoreszenzfarbstoff 8-Hydroxy-1,3,6-pyrentrisulfonsäure-Trinatriumsalz eingesetzt wird.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass Streptavidin über eine Einstufen-Reaktion durch Aktivierung mittels N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid) an die Oberfläche der nanoskaligen MF-Partikel gekoppelt wird.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass Streptavidin über eine Zweistufen-Reaktion durch Aktivierung mittels N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid) und N-Hydroxylsuccinimid an die Oberfläche der nanoskaligen MF-Partikel gekoppelt wird.
  13. Verwendung der nanoskaligen MF-Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als Trägermaterial zur Herstellung von Biomarker, Inkjet Tinten, als Fluoreszenzmarker in und auf Gebrauchsgegenständen wie Dokumenten und/oder Geldscheinen und/oder als Adsorptionsmaterial für chromatographische Trennungen.
DE102005022370A 2005-05-10 2005-05-10 Nanoskalige fluoreszierende Melaminpartikel Withdrawn DE102005022370A1 (de)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102005022370A DE102005022370A1 (de) 2005-05-10 2005-05-10 Nanoskalige fluoreszierende Melaminpartikel
JP2008510433A JP2008543982A (ja) 2005-05-10 2006-04-20 ナノスケール蛍光メラミン粒子
EP06724440A EP1879934A1 (de) 2005-05-10 2006-04-20 Nanoskalige fluoreszierende melaminpartikel
PCT/EP2006/003598 WO2006119845A1 (de) 2005-05-10 2006-04-20 Nanoskalige fluoreszierende melaminpartikel
KR1020077028740A KR20080015437A (ko) 2005-05-10 2006-04-20 나노크기 형광 멜라민 입자
US11/914,045 US20080193758A1 (en) 2005-05-10 2006-04-20 Nanoscale Fluorescent Melamine Particles

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102005022370A DE102005022370A1 (de) 2005-05-10 2005-05-10 Nanoskalige fluoreszierende Melaminpartikel

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE102005022370A1 true DE102005022370A1 (de) 2006-11-16

Family

ID=36643380

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE102005022370A Withdrawn DE102005022370A1 (de) 2005-05-10 2005-05-10 Nanoskalige fluoreszierende Melaminpartikel

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20080193758A1 (de)
EP (1) EP1879934A1 (de)
JP (1) JP2008543982A (de)
KR (1) KR20080015437A (de)
DE (1) DE102005022370A1 (de)
WO (1) WO2006119845A1 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105561901A (zh) * 2016-01-12 2016-05-11 南京工程学院 一种单分散蜜胺树脂微球的制备方法

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2630173B1 (de) 2010-10-19 2015-01-07 Borealis Agrolinz Melamine GmbH Kolloidale aminotriazin-aldehydkondensate und ihre verwendung als aldehydfänger
EP2757378B1 (de) * 2011-09-09 2019-03-27 Konica Minolta, Inc. Verfahren zum Nachweis biologischer Stoffe
US20160011179A1 (en) * 2013-03-08 2016-01-14 Konica Minolta, Inc. Resin particles for fluorescent labels
US11054417B2 (en) 2013-06-19 2021-07-06 Konica Minolta, Inc. Fluorescent nanoparticles for biomolecular staining and manufacturing method for same
JP6241239B2 (ja) * 2013-12-05 2017-12-06 コニカミノルタ株式会社 蛍光色素内包ナノ粒子、蛍光色素内包ナノ粒子の製造方法、蛍光標識剤、及び蛍光免疫染色方法
JP6614161B2 (ja) * 2015-01-21 2019-12-04 コニカミノルタ株式会社 蛍光観察に使用する蛍光体集積ナノ粒子
JP6834981B2 (ja) 2015-12-18 2021-02-24 コニカミノルタ株式会社 蛍光物質集積ナノ粒子およびそれを用いた標識剤
JP7001083B2 (ja) * 2019-07-22 2022-01-19 コニカミノルタ株式会社 蛍光観察に使用する蛍光体集積ナノ粒子
DE102020114289A1 (de) 2020-05-28 2021-12-02 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung eingetragener Verein Funktionalisierte Aminoharz-haltige Partikel
CN112143484B (zh) * 2020-09-24 2022-10-21 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种荧光微球活化剂复溶液及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MXPA03002897A (es) * 2000-10-02 2003-06-24 Kimberly Clark Co Medio de registro con nanoparticulas y metodos para hacer los mismos.
DE60239733D1 (de) * 2001-03-02 2011-05-26 Nissan Chemical Ind Ltd Verfahren zur herstellung von kugelförmigen verbundteilchen mit gehärtetem melaminharz
DE10261805A1 (de) * 2002-12-19 2004-07-08 Ami Agrolinz Melamine International Gmbh Kunststoffdispersionen

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105561901A (zh) * 2016-01-12 2016-05-11 南京工程学院 一种单分散蜜胺树脂微球的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR20080015437A (ko) 2008-02-19
JP2008543982A (ja) 2008-12-04
US20080193758A1 (en) 2008-08-14
WO2006119845A1 (de) 2006-11-16
EP1879934A1 (de) 2008-01-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE102005022370A1 (de) Nanoskalige fluoreszierende Melaminpartikel
EP1196780B1 (de) Herstellung und anwendung von lumineszierenden mikro- und nanopartikeln
DE69434649T2 (de) Durch fluoreszierenden polymer markierte konjugate und zwischenprodukte
JP5356204B2 (ja) 蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子の製造方法およびこれを用いた定量方法
Chen et al. Molecularly imprinted polymer as an antibody substitution in pseudo-immunoassays for chemical contaminants in food and environmental samples
US8168447B2 (en) Multiple component nanoparticles for multiplexed signaling and optical encoding
US9465036B2 (en) Particles containing detectable elemental code
DE60316471T2 (de) Sich selbst kalibrierende durchflusstestvorrichtungen
DE10042023A1 (de) Kapseln, die feste Teilchen signalerzeugender Substanzen einkapseln, und deren Verwendung bei Bioassays zum Nachweis von Zielmolekülen in einer Probe
EP0809111A2 (de) Bestimmungsverfahren mit oligomerisierten Rezeptoren
DE102019120455B4 (de) Verfahren zur simultanen Bestimmung verschiedener Analyte in einer Umweltprobe, gestützt auf Kern/Schale-Mikropartikel
KR20130081206A (ko) 표식화 프로브-수용성 담체 복합체
WO1997019354A1 (de) Lagerstabiles partikel, insbesondere träger für trägergebundene reaktionen sowie verfahren zu seiner herstellung
WO2002035228A2 (de) Verfahren und testkit zum nachweis von analyten in einer probe
EP0716304B1 (de) Immunoassays für Haptene und hierfür verwendbare Haptentracer-Antikörper-Komplexe sowie Verfahren zur Herstellung derselben
WO2015124690A1 (de) Zusammensetzung mit fret-paar in definierter geometrie
CA2599975A1 (en) Surfaces coated with target-induced fluorescent compounds for detection of target elements
WO2002014862A2 (de) Verfahren und vorrichtung zur charakterisierung und/oder zum nachweis eines bindungskomplexes
DE102016212844A1 (de) Verfahren und System zum Nachweis von biologischen Zielstrukturen
EP3454063A1 (de) Durchflusszytometrie-messverfahren und kit für dessen durchführung
CN116333721B (zh) 一种用于同步检测PTK7和miRNA-21的比率荧光探针、制备方法及其应用
DE102020001916B3 (de) Mikropartikel für bioanalytische Untersuchungen und Verfahren zum Herstellen eines solchen Mikropartikels
Zhang et al. Synthesis of eco-friendly multifunctional dextran microbeads for multiplexed assays
EP4136449A1 (de) Lateral flow assay
DE112012006372T5 (de) Polymermatrix mit Zielbindungsstelle für Kreatinin und Derivate davon, deren Herstellung und Verwendungen

Legal Events

Date Code Title Description
8139 Disposal/non-payment of the annual fee