DE112012006372T5

DE112012006372T5 - Polymermatrix mit Zielbindungsstelle für Kreatinin und Derivate davon, deren Herstellung und Verwendungen

Info

Publication number: DE112012006372T5
Application number: DE112012006372.4T
Authority: DE
Inventors: Umporn Athikomrattanakul; Nenad Gajovic-Eichelmann
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2012-05-16
Filing date: 2012-11-16
Publication date: 2015-01-29
Also published as: GB2516795A; WO2013170914A1; GB201420371D0; US20150160242A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Polymermatrix mit einer Zielbindungsstelle und ein Verfahren zu deren Herstellung. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Verwendungen der Polymermatrix in der Trennung oder Extraktion von Kreatinin aus komplexen Gemischen, sowie in Verfahren, Kits und Geräten zur Detektion von Kreatinin in Proben.

Description

Hintergrund
Die Kreatininspiegel in biologischen Flüssigkeiten sind ein sehr wichtiger Parameter für die klinische Routinediagnostik. Der normale Konzentrationsbereich von Kreatinin im Serum von gesunden Erwachsenen beträgt 62–124 μM (~0,5–1,5 mg/dL), während er im Urin im Bereich von 25–400 mg/dL (einmalige Sammlung) bzw. 500–2000 mg über 24 Stunden liegt (Walsh, D. A., Dempsey, E., Anal. Chim. Acta, 459:187–198 (2002)). Gegenwärtig verwendet man zur Bestimmung von Kreatinin in klinischen Laboratorien eine spektralphotometrische Technik auf Basis der kolorimetrischen Jaffe-Reaktion von Kreatinin mit alkalischem Pikrat. Vor der Messung ist eine Probenvorbehandlung mit einigen Schritten zur Entfernung von Störungen in Serum oder Plasma notwendig, beispielsweise Zentrifugation, Extraktion und/oder Filtration. Die Kreatininanalyse nach der Jaffe-Methode kann jedoch wegen ihres allgemeinen Mangels an Spezifität und Selektivität immer noch durch Störungen durch endogene Spezies verfälscht werden.
Der Nachweis von Kreatinin in biologischen Flüssigkeiten ist einer der wichtigsten klinischen diagnostischen Parameter. Der Kreatininspiegel ist ein Index für die Bestimmung von Nieren-, Schilddrüsen- und Muskelfunktionen und sogar Myokardinfarkt. Im Fall von Nierenversagen oder Muskelstörung können erhöhte Spiegel von Kreatinin im Blut oder Urin bestimmt werden. Ein Verfahren auf der Basis der Jaffe-Reaktion ist schon 1886 vorgeschlagen worden (Jaffe, M. Z. Z. Physiol. Chem., 10: 391–400 (1886)) und ist seitdem zu einer im Handel verfügbaren Analyse geworden, die heutzutage in klinischen Laboratorien routinemäßig verwendet wird.
Die Reaktion zwischen Kreatinin und Pikrinsäure in alkalischer Lösung führt zur Bildung eines orangeroten Komplexes, der mit einem Spektralphotometer nachgewiesen werden kann. Der Hauptnachteil dieses Verfahrens besteht jedoch in der geringen Selektivität und Spezifität. Die Messung kann durch zahlreiche Störfaktoren leicht beeinträchtigt werden. Die Störungen stammen nicht nur aus anderen Metaboliten wie Bilirubin, Kreatin und Harnsäure, sondern auch von anderen, damit nicht in Zusammenhang stehenden biologischen Verbindungen wie Glucose, Protein oder Acetoacetat, die alle zu falschen Ergebnissen führen können (Weber, J. A., van Zanten, A. P., Clin. Chem., 37: 695–700 (1991); Bishop, M. L., et al., Clinical Chemistry, Principles, Procedures, Correlations, 4. Aufl., Lippincott Williams and Wilkins, New York, 2000, S. 440 (Kapitel 21)).
Es ist über einige zusätzliche Entwicklungen für die Jaffe-Reaktion berichtet worden. Jiugao et al. verwendeten Cellulosenitrat zur Adsorption von Kreatinin (Jiugao, Y., et al., Carbohyd. Polym., 70: 8–14 (2007)), aber das Verfahren litt unter geringen Adsorptionsmengen von Kreatinin; Grabowska et al. bedienten sich eines Durchfluss-Mikrosystems (Grabowska, I., et al., Anal. Chim. Acta, 540: 181–185 (2005)), das durch Glucose in einer Konzentration von 1 g/L in der Probe gestört wurde, und die Analyt-Durchflussrate war im Vergleich zur Fließinjektionsanalyse sehr niedrig. Fossati und Mitarbeiter schlugen ein Verfahren unter Verwendung von drei Enzymen wie Kreatininase, Kreatinase und Sarkosinoxidase oder Kreatinindeiminase zur Katalyse der Hydrolyse von Kreatinin vor. Das Ammoniak- oder Wasserstoffperoxid-Produkt wurde mit einem Analysegerät oder Spektralphotometer oder durch elektrochemische Methoden nachgewiesen (Fossati, P., et al., Clin. Chem. 29: 1494–1496 (1993); Kubo, I., Anal. Chim. Acta, 187: 31–37 (1986); US-PS 5,958,786 ; US 2003/0070548A1 ; US 2009/0045056A1 ; Yadav, S., Kumar, A., Pundir, C. S., Anal. Biochem., 419: 277–283 (2011)). Der Nachteil derartiger enzymatischer verfahren liegt darin, dass sie zeit- und kostenaufwändig sind; außerdem leiden sie an der schlechten Stabilität der Enzyme sowie Störung durch Zerfall von Ammoniak in der Probe.
Kreatinin aus komplexen Lösungen ist mittels HPLC gemessen worden, aber dieses verfahren erfordert eine Probenvorbehandlung, geschultes Personal und eine umfangreiche technische Ausstattung. Des Weiteren ist ein hochspezifischer Antikörper gegen Kreatinin hergestellt und in einem amperometrischen Sensor oder bei der Oberflächenplasmonresonanz angewendet worden (Benkert, A. B., et al., Anal. Chem., 72: 916–921 (2000); Stöcklein, W. F. M., et al., Biosens. Bioelctron., 15: 377–382 (2000)). Das auf Antikörpern basierende verfahren wurde jedoch nie kommerzialisiert, da die Herstellung von Antikörpern teuer ist und zugleich der auf Antikörpern basierende Nachweis von in großer Menge vorliegenden Analyten wie Kreatinin eine große Menge Antikörper pro Analyse erfordert.
Des Weiteren sind molekular geprägte Polymere (molecularly imprinted polymers, MIPs) als künstliche Rezeptoren für Kreatinin beschrieben worden. MIPs können insofern antikörperartige Eigenschaften aufweisen, als sie selektive oder sogar spezifische Bindungsstellen für das Zielmolekül bereitstellen können. MIPs bestehen jedoch nicht aus einem Protein-Rückgrat, sondern aus einem hochvernetzten Polymer. MIPS sind daher in der Regel steife, robuste Materialien, die unter Bedingungen verwendet werden können, unter denen die Verwendung von Biomolekülen wie Antikörpern unmöglich wäre, z. B. in organischen Lösungsmitteln oder bei erhöhten Temperaturen usw. MIPs sind auch kommerziell attraktiv, da sie zu einen viel niedrigeren Preis pro Milligramm als Antikörper synthetisiert werden können.
Der auf MIP basierende Nachweis von Kreatinin wurde unter Verwendung von Verfahren wie UV-Vis-Spektrometrie und/oder HPLC (Sreenivasan, K., Sivakumar, R., J. Appl. Polym. Sci., 66: 2539–2542 (1997); Subat, M, Borovik, A. S., Konig, B., J. Am. Chem. Soc. 126: 3185–3190 (2004); Tsai, H. A., Syu, M. J., Biomaterials, 26: 2759–2766 (2005); Tsai, H. A., Syu, M. J., Anal. Chim. Acta, 539: 107–116 (2005); Hsieh, R. Y., Tsai, H. A., Syu, M. J., Biomaterials, 27: 2083–2089 (2006); Lee, M. H., et al., Desalination, 234: 126–133 (2008); Chang, Y. S., et al., Anal. Chem., 81: 2098–2105 (2009); Gao, B., Li, Y., Zhang, Z., J. Chromatogr. B, 878: 2077–2086 (2010); Lee, M. H., et al., ACS Appl. Mater. Inter., 2: 1729–1736 (2010); Tsai, H. A., Syu, M. J., Chem. Eng. J., 168: 1369–1376 (2011); Li, T. J., et al., Anal. Chim. Acta, 711: 83–90 (2012)), Fluoreszenzerfassung (Subrahmanym, S., et al., Biosens. Bioelectron., 16: 631–637 (2001); Lin, H. Y., Ho, M. S., Lee, M. H., Biosens. Bioelctron., 25: 579–586 (2009); Syu, M. J., Hsu, T. J., Lin, Z. K., Anal. Chem., 82: 8821–8829 (2010)), elektrochemischen Sensoren (Panasyuk-Delaney, T., Mirsky, V. M., Wolfbeis, O. S., Electroanalysis, 14: 221–224 (2002); Lakshmi, D., Prasad, B. B., Sharma, P. S., Talanta, 70: 272–280 (2006); Sharma, P. S., Lakshmi, D., Prasad, B. B., Chromatographia, 65: 419–427 (2007); Patel, A. K., Sharma, P. S., Prasad, B. B., Electroanalysis, 20: 2102–2112 (2008); Huang, C. Y., et al., Biosens. Bioelectron., 24: 2611–2617 (2009); Khadro, B., et al., Procedia Engineering, 5: 371–374 (2010); Reddy, K. K., Gobi, K. V., IPCBEE, 25: 25–29 (2011)) und ionenselektivem Feldeffekttransistor (Soldatkin, A. P., et al., Talanta, 58: 351–357 (2002); Tsai, H. H., et al., Sensor. Actuat. B., 144: 407–412 (2010)) verwirklicht.
Trotz der großen Zahl von Publikationen über MIPs, die bis zu einem gewissen Ausmaß und unter bestimmten Bedingungen Kreatinin binden können, war keines dieser Materialien in der Lage, die analytische Aufgabe des empfindlichen und selektiven Nachweises von Kreatinin in unbehandelten klinischen Proben (Plasma und/oder Urin) in Gegenwart von großen Mengen Kreatin zu lösen. Andere Unzulänglichkeiten des Standes der Technik bei molekular geprägten Polymeren gegenüber Kreatinin waren eine geringe Selektivität, z. B. Störung durch Kreatin und andere Substanzen, geringe Stabilität, schlechte Reproduzierbarkeit, zeitaufwändige Vorschriften und eine allgemeine Unverträglichkeit mit wässrigen Proben, d. h. die meisten MIPs arbeiten nur in organischen Lösungsmitteln. Der letztgenannte Punkt ist ein Knock-out-Kriterium für die meisten diagnostischen Anwendungen und Point-of-Care-Anwendungen.
Beschreibung der Erfindung
Bis heute hat sich keines der obigen analytischen Verfahren als gut genug für den Nachweis von Kreatinin erwiesen, um die standardmäßige Jaffé-Reaktion, die beim klinischen Routinetest verwendet wird, zu ersetzen. Daher wäre es wünschenswert, ein einfaches, schnelles, billiges, zuverlässiges Verfahren zum Ersatz oder zur Verbesserung der analytischen Qualität, insbesondere der Selektivität der Jaffe-Reaktion, zu entwickeln.
Insbesondere wäre es von großem technischen und kommerziellen Wert, Materialien zu konzipieren und zu synthetisieren, die zur Verringerung der Schritte der Probenvorbereitung, Extraktion oder Reinigung verwendet werden können. Noch höherwertiger wäre es, wenn neue Materialien und/oder Verfahren so mit dem Jaffe-Verfahren kombiniert werden könnten, dass die Selektivität beträchtlich verbessert wird.
Gemäß einem ersten Aspekt stellt die Erfindung eine Polymermatrix mit mindestens einer Zielbindungsstelle bereit, wobei

– die Zielbindungsstelle eine funktionelle Gruppe umfasst, die durch die allgemeine Formel (I) wiedergegeben wird:
worin Y für S, O oder NH steht, R₁ und R₂ jeweils unabhängig aus einer Gruppe umfassend Aryl, Heteroaryl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Alkyl, das jeweils substituiert und/oder Teil eines kondensierten Ringsystems sein kann, ausgewählt sind. Substitutionen können beispielsweise Substitutionen von H durch beispielsweise C₁-C₆-Alkyl, das gegebenenfalls durch Halogen, insbesondere F, substituiert ist, sein. Substitutionen können auch beispielsweise Substitutionen von H durch Halogen, insbesondere F, oder NO₂ sein. Substitutionen können auch beispielsweise Substitutionen von H durch NO₂ sein. X₁ und X₂ jeweils unabhängig für eine Gruppe mit einer chemischen Bindung an die Polymermatrix stehen, m und n unabhängig für 0, 1, 2 oder 3 stehen und m + n gleich 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist. X₁ und/oder X₂ können daher für mehrere Substituenten an den Aryl- oder Cycloalkylringen von R₁ und/oder R₂ stehen. Die Zielbindungsstelle ist zur Bindung an ein Zielmolekül, das durch eine der folgenden allgemeinen Formeln (IIa) oder (IIb), die tautomere Formen eines Zielmoleküls wiedergeben können, wiedergegeben wird, geeignet:
worin Z aus CR₄R₄', NR₄'' O oder S ausgewählt ist, R₃, R₃', R₄ und R₄' jeweils unabhängig aus einer Gruppe umfassend Wasserstoff, Aryl, Heteroaryl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, lineares oder verzweigtes Alkyl, das jeweils substituiert und/oder Teil eines kondensierten Ringsystems sein kann, ausgewählt sind, R₄'' aus einer Gruppe bestehend aus einer Stickstoffschutzgruppe, Wasserstoff, Aryl, Heteroaryl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, lineares oder verzweigtes Alkyl, das jeweils substituiert und/oder Teil eines kondensierten Ringsystems sein kann, ausgewählt ist.

Gemäß einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung eine Polymermatrix mit mindestens einer Zielbindungsstelle bereit, wobei

– die Polymermatrix erhältlich ist durch Polymerisation mindestens eines funktionellen Monomers der allgemeinen Formel (Ia)
worin Y für S, O oder NH steht, R₁ und R₂ jeweils unabhängig aus einer Gruppe umfassend Aryl, Heteroaryl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Alkyl, das jeweils substituiert und/oder Teil eines kondensierten Ringsystems sein kann, ausgewählt sind. Substitutionen können beispielsweise Substitutionen von H durch beispielsweise C₁-C₆-Alkyl, das gegebenenfalls durch Halogen, insbesondere F, substituiert ist, sein. Substitutionen können auch beispielsweise Substitutionen von H durch Halogen, insbesondere F, oder NO₂ sein. Substitutionen können auch beispielsweise Substitutionen von H durch NO₂ sein. X₁' und X₂' jeweils unabhängig für eine polymerisierbare Gruppe stehen, m und n unabhängig für 0, 1, 2 oder 3 stehen und m + n gleich 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist. X₁' und/oder X₂' können daher für mehrere Substituenten an den Aryl- oder Cycloalkylringen von R₁ und/oder R₂ stehen. wobei die Polymerisation in Gegenwart eines Zielmoleküls, das durch eine der folgenden allgemeinen Formeln (IIa) oder (IIb) wiedergegeben wird, durchgeführt wird:
worin Z aus CR₄R₄', NR₄'' O oder S ausgewählt ist, R₃, R₃', R₄ und R₄' jeweils unabhängig aus einer Gruppe umfassend Wasserstoff, Aryl, Heteroaryl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, lineares oder verzweigtes Alkyl, das jeweils substituiert und/oder Teil eines kondensierten Ringsystems sein kann, ausgewählt sind, R₄'' aus einer Gruppe bestehend aus einer Stickstoffschutzgruppe, Wasserstoff, Aryl, Heteroaryl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, lineares oder verzweigtes Alkyl, das jeweils substituiert und/oder Teil eines kondensierten Ringsystems sein kann, ausgewählt ist, wobei die Zielbindungsstelle der Polymermatrix zur Bindung an ein Zielmolekül befähigt ist.

Die Bindung eines Zielmoleküls bedeutet im Rahmen der Erfindung die Bindung des Ziels mit der Polymermatrix mit einer messbaren Affinität. Eine messbare Affinität kann beispielsweise durch die Gleichgewichts-Dissoziationskonstante KD (in mol/l) und/oder durch das Verhältnis der kinetischen Geschwindigkeitskonstanten k_a (Assoziationsgeschwindigkeitskonstante) und k_d (Disssoziationsgeschwindigkeitskonstante) gekennzeichnet sein. Vorzugsweise ist die KD < 1 mM. Weiter bevorzugt ist die KD < 500 μM. Noch weiter bevorzugt ist eine KD der Polymermatrix < 100 μM. Noch weiter bevorzugt ist eine KD < 50 μM.
Die polymerisierbaren Gruppen X₁' und X₂' können im Prinzip jede zur Bindung befähigte Gruppierung sein, was die Fixierung der Liganden in der Polymermatrix erlaubt. Hierbei handelt es sich in der Regel um reaktive Gruppierungen, die eine Vernetzungsreaktion eingehen können, beispielsweise mit einem anorganischen und/oder organischen Vernetzer. Bei dieser Vernetzungsreaktion handelt es sich vorzugsweise um eine Polymerisationsreaktion, wobei der Begriff ”Polymerisation” hier so zu verstehen ist, dass er auch eine Polykondensation oder Polyaddition einschließt. So tragen beispielsweise sowohl die polymerisierbaren Gruppen X₁' und X₂' als auch der Vernetzer bzw. die Vernetzer polymerisierbaren Gruppen. Die polymerisierbaren Gruppen X₁' und X₂' können beispielsweise aus der Gruppe umfassend Vinyl-, Acryl-, Methacryl-, Allyl- oder Styrolgruppen oder eine beliebige andere ungesättigte Gruppe, die zur Reaktion über einen Radikalprozess befähigt ist, und chemische Gruppen, die eine Polykondensation, Polyaddition oder Sol-Gel-Reaktion ermöglichen, ausgewählt sein. Beispiele für geeignete polymerisierbare Gruppen sind z. B. Acrylderivate, Methacrylderivate wie Ethylenglykoldimethacrylat oder Trimethylolpropantrimethacrylat, Epoxide, Isocyanate oder Allylderivate.
Die polymerisierbaren Gruppen X₁' und X₂' können beispielsweise ferner eine Spacer-Gruppe enthalten, wobei die Spacer-Gruppe für eine räumliche Trennung der zur Reaktion über einen Radikalprozess befähigten Gruppe oder der Gruppe, die eine Polykondensation, Polyaddition oder Sol-Gel-Reaktion ermöglicht, von der Gruppe R₁ und/oder R₂ sorgt. Bei der Spacer-Gruppe kann es sich beispielsweise um ein gesättigtes oder ungesättigtes, lineares oder verzweigtes Alkyl oder Alkoxy, das gegebenenfalls durch ein oder mehrere aus N, O und S ausgewählte Heteroatome unterbrochen ist, handeln. Beispielsweise kann es sich bei der Spacer-Gruppe um ein Polyethylenglykol handeln.
Die Gruppen X₁ und/oder X₂, die für Gruppen mit einer chemischen Bindung an die Polymermatrix stehen, können sich beispielsweise von den polymerisierbaren Gruppen X₁' und/oder X₂' gemäß obiger Definition ableiten, nachdem die Gruppen X₁' und/oder X₂' durch eine Polymerisationsreaktionen in die Polymermatrix eingebunden worden sind.
Ein kondensiertes Ringsystem, wie in den Definitionen für Substituenten verwendet, kann beispielsweise Naphthyl oder Anthracyl einschließen.
Stickstoffschutzgruppen umfassen beispielsweise Boc, Fmoc, Acyl, Carbamoyl, Sulfonyl wie Tosyl, Benzyl, Benzoyl.
In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung eine Polymermatrix bereit, wobei die Polymerisation in Gegenwart mindestens eines Vernetzers und/oder Initiators durchgeführt wird.
Ein Vernetzer kann beispielsweise ein organischer oder anorganische Vernetzer sein. Ein anorganische Vernetzer kann beispielsweise ein bifunktionelles oder multifunktionelles Organosiloxan sein.
Im Fall eines organischen Vernetzers kann es sich hierbei beispielsweise um ein Acrylderivat, Methacrylderivat wie Ethylenglykoldimethacrylat oder Trimethylolpropantrimethacrylat, oder Allylderivat handeln. Zur Erzielung einer höheren Hydrophilie der Polymerhauptkette können z. B. entsprechende Vernetzer auf Basis von Polyethylenglykol eingesetzt werden. Weitere geeignete Beispiele für Vernetzer sind für den Fachmann ohne Weiteres ersichtlich.
Bei der Polymerisationsreaktion kann es sich beispielsweise um eine RAFT-Polymerisation handeln.
Durch die Polymerisationsreaktion wird eine Polymermatrix gebildet, die zusätzlich zu den funktionellen Gruppen ein anorganisches oder organisches Polymer, z. B. ein Polyurethan, einen Polyharnstoff, einen Polyester, ein Polyamid, einen Aminoplast, ein Epoxidharz, Silikone oder Copolymere oder Mischungen davon umfassen oder im Wesentlichen daraus bestehen kann.
Die Vernetzungsreaktion, insbesondere Polymerisation, kann als Radikalpolymerisation, z. B. lichtinduziert oder thermisch induziert, anionisch oder kationisch, stattfinden.
In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung die Polymermatrix bereit, wobei die funktionelle Gruppe der Formel (I) durch die allgemeine Formel (I') wiedergegeben wird:
worin
R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₅', R₆', R₇', R₈' und R₉' jeweils unabhängig für Wasserstoff, Halogen, Alkyl, Halogenalkyl, NO₂, CN,
stehen,
wobei R₁₀, R₁₁ und R₁₁' unabhängig aus einer Gruppe umfassend Wasserstoff, Alkyl, Aryl, Halogenalkyl, Alkylenaryl und eine Stickstoffschutzgruppe ausgewählt sind,
wobei mindestens zwei der Reste R₅, R₆, R₇, R₈, R₉ oder mindestens zwei der Reste R₅', R₆', R₇', R₈' und R₉' unabhängig einen Teil eines kondensierten Ringsystems bilden können,
mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste R₅, R₆, R₇, R₈, R₉ X₁ umfasst und/oder mindestens einer der Reste R₅', R₆', R₇', R₈' und R₉' X₂ umfasst.
In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung die Polymermatrix bereit, wobei das funktionelle Monomer der Formel (Ia) durch die allgemeine Formel (Ia') wiedergegeben wird:
worin
R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₅', R₈', R₇', R₈' und R₉' jeweils unabhängig für Wasserstoff, Halogen, Alkyl, Halogenalkyl, NO₂, CN,
stehen,
wobei R₁₀, R₁₁ und R₁₁' unabhängig aus einer Gruppe umfassend Wasserstoff, Alkyl, Aryl, Halogenalkyl, Alkylenaryl und eine Stickstoffschutzgruppe ausgewählt sind,
und/oder wobei mindestens zwei der Reste R₅, R₆, R₇, R₈, R₉ oder mindestens zwei der Reste R₅', R₆', R₇', R₈' und R₉' unabhängig einen Teil eines kondensierten Ringsystems bilden können,
mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste R₅, R₆, R₇, R₈, R₉ X₁' umfasst und/oder mindestens einer der Reste R₅', R₆', R₇', R₈' und R₉' X₂' umfasst.
In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung die Polymermatrix bereit, wobei die funktionelle Gruppe der Formel (I') durch die allgemeine Formel (I'') wiedergegeben wird:
In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung die Polymermatrix bereit, wobei das funktionelle Monomer der Formel (Ia') durch die allgemeine Formel (Ia'') wiedergegeben wird:
In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung die Polymermatrix bereit, wobei die funktionelle Gruppe aus der Gruppe umfassend:
ausgewählt ist.
In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung die Polymermatrix bereit, wobei das funktionelle Monomer aus der Gruppe umfassend:
ausgewählt ist.
In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung die Polymermatrix bereit, wobei die funktionelle Gruppe durch die Formel (I''') wiedergegeben wird:
In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung die Polymermatrix bereit, wobei das Monomer durch die Formel (Ia''') wiedergegeben wird:
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird die funktionelle Gruppe der Formel (I) durch die Formel
wiedergegeben.
In weiteren bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird das funktionelle Monomer der Formel (Ia) durch die Formel
wiedergegeben.
In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung die Polymermatrix bereit, wobei es sich bei dem Zielmolekül um Kreatinin handelt.
In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung die Polymermatrix bereit, wobei es sich bei der Polymermatrix um ein Copolymer handelt.
In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung die Polymermatrix bereit, wobei die polymerisierbaren Gruppen X₁' und X₂' aus einer Gruppe umfassend ungesättigte Gruppen, die zur Reaktion über einen Radikalprozess befähigt sind, und chemische Gruppen, die eine Polykondensation, Polyaddition oder Sol-Gel-Reaktion ermöglichen, insbesondere Acrylderivate, Methacrylderivate, Epoxide, Isocyanate und Allylderivate, ausgewählt sind.
In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung die Polymermatrix bereit, wobei X₁ und X₂ aus einer Polymerisationsreaktion einer Gruppe umfassend ungesättigte Gruppen, die zur Reaktion über einen Radikalprozess befähigt sind, und chemische Gruppen, die eine Polykondensation, Polyaddition oder Sol-Gel-Reaktion ermöglichen, insbesondere Acrylderivate, Methacrylderivate, Epoxide, Isocyanate und Allylderivate, stammen.
Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Polymermatrix gemäß obiger Definition bereit, das folgende Verfahrensschritte umfasst:

a) Bereitstellen des mindestens einen Monomers und des mindestens einen Zielmoleküls gemäß obiger Definition,
b) Bilden einer Präpolymerisationsmischung durch Inkontaktbringen des Monomers und des Zielmoleküls,
c) Polymerisieren der Präpolymerisationsmischung zum Erhalt der Polymermatrix.

In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung das Verfahren bereit, bei dem man mindestens einen Vernetzer und/oder Initiator zu der Präpolymerisationsmischung von Verfahrensschritt b) gibt.
In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung das Verfahren bereit, ferner umfassend Verfahrensschritt d) des Entfernens des Ziels von der Polymermatrix.
Gemäß einem vierten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Abtrennung oder Extraktion von Kreatinin aus einem Gemisch, das zusätzliche organische und/oder anorganische Verbindungen umfasst, bereit, das folgende Verfahrensschritte umfasst:

a1) Bereitstellen der Polymermatrix gemäß obiger Definition,
b1) Inkontaktbringen der Polymermatrix mit dem Gemisch und Binden von Kreatin mit der Polymermatrix,
c1) Abtrennen der Polymermatrix mit dem gebundenen Kreatinin von dem Gemisch.

In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung das Verfahren bereit, ferner umfassend Verfahrensschritt d1) des Freisetzens des gebundenen Kreatinins aus der Polymermatrix.
Die Freisetzung der Zielsubstanz aus der Polymermatrix kann beispielsweise durch Waschen mit wässrigen oder organischen Lösungsmitteln oder Mischungen davon bewerkstelligt werden. Wässrige Lösungsmittel können beispielsweise eine hohe Ionenstärke aufweisende, saure oder basische Lösungsmittel enthalten. Die Entfernung kann durch die Temperatur unterstützt werden, z. B. durch Erhitzen der Polymermatrix.
In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung das Verfahren bereit, bei dem es sich bei dem Gemisch um eine biologische Probe handelt.
In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung das Verfahren bereit, bei dem es sich bei der biologischen Probe um Serum oder Urin handelt.
Gemäß einem fünften Aspekt der Erfindung stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Kreatiningehalt in einer Probe unter Verwendung der Polymermatrix gemäß obiger Definition bereit, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

a2) Trennen einer zu analysierenden Probe in eine erste und eine zweite separate Portion,
b2) Verwenden eines Nachweisverfahrens zur Bestimmung eines ersten Kreatiningehaltergebnisses in der ersten Portion der Probe in Abwesenheit der Polymermatrix,
c2) Zugeben der Polymermatrix zu der zweiten Portion der Probe,
d2) Verwenden des gleichen Nachweisverfahrens zur Bestimmung eines zweiten Kreatiningehaltergebnisses in der zweiten Portion der Probe,
e2) Subtrahieren des zweiten Kreatiningehaltergebnisses von dem ersten Kreatiningehaltergebnis zum Erhalt des Kreatiningehalts in der Probe.

Somit wird ein Verfahren zur indirekten qualitativen oder quantitativen Bestimmung des Kreatiningehalts in einer Probe bereitgestellt. Das Prinzip basiert darauf, dass man zunächst ein Brutto-Kreatiningehaltergebnis aus der ersten Probenportion erhält, das heißt ein Ergebnis, welches das Nachweisergebnis des spezifischen Kreatiningehalts und das Nachweisergebnis von Störungen, d. h. das sich aus dem unspezifischen Nachweis von anderen Verbindungen in der Probe ergebende Nachweisergebnis, umfasst. Infolge der Zugabe der Polymermatrix zur zweiten Probenportion wird Kreatinin so durch die Polymermatrix gebunden, dass beispielsweise mindestens ein Teil des Kreatinins keinen Beitrag zum Nachweisergebnis mehr liefert. Dies geschieht beispielsweise auf eine solche Weise, die qualitativ oder quantitativ mit dem Kreatiningehalt in der Probenportion korreliert. Daher stellt das zweite Kreatiningehaltergebnis in Wirklichkeit lediglich die Störungen des Nachweisverfahrens dar. Die Differenz zwischen dem ersten Kreatiningehaltergebnis und dem zweiten Kreatiningehaltergebnis stellt daher eine Subtraktion der Störung des Nachweisverfahrens von dem Brutto-Kreatiningehaltergebnis dar, wobei die Differenz den Kreatiningehalt in der Probe darstellt
In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung das Verfahren bereit, bei dem man das Nachweisverfahren von Verfahrensschritt b2) und d2) aus einer Gruppe umfassend spektralphotometrische Nachweisreaktionen, kolorimetrische Nachweisreaktionen, Fluoreszenz-Nachweisreaktionen oder elektrochemische Nachweisreaktionen auswählt.
In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung das Verfahren bereit, bei dem es sich bei dem Nachweisverfahren um eine kolorimetrische Nachweisreaktion handelt.
In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung das Verfahren bereit, bei dem das Nachweisverfahren auf der Reaktion von Kreatinin mit alkalischem Pikrat basiert und es sich insbesondere bei dem Nachweisverfahren um die Jaffe-Reaktion handelt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Assay-Kit zur Durchführung des obigen Nachweisverfahrens bereitgestellt, umfassend die Polymermatrix gemäß obiger Definition und Mittel zum Nachweisen des Zielmoleküls mit dem obigen Verfahren, wobei für das Nachweisverfahren ein Assay-Kit verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Nachweis von Kreatiningehalt in einer Probe unter Verwendung der Polymermatrix gemäß obiger Definition ohne Verwendung einer weiteren Markierungsgruppe mit der Polymermatrix, dem Kreatinin und der Probe bereit, das folgende Verfahrensschritte umfasst:

a3) Bereitstellen der Polymermatrix,
b3) Inkontaktbringen der Polymermatrix mit der zu analysierenden Probe,
c3) Messen der Wechselwirkung von Kreatinin mit der Polymermatrix.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung soll ”ohne Verwendung einer weiteren Markierungsgruppe mit der Polymermatrix, dem Kreatinin und der Probe” bedeuten, dass keine Markierung der Polymermatrix, des Kreatinins oder der Probe mit einer zusätzlichen Verbindung oder Reportergruppe wie beispielsweise einer fluoreszierenden, chemilumineszierenden, elektrochemisch aktiven oder radioaktiven Verbindung oder einem Katalysator zur Messung der Wechselwirkung des Kreatinins mit der Polymermatrix erforderlich ist. Eine zusätzliche Verbindung oder Reportergruppe soll in diesem Zusammenhang auch ein extern zugegebenes Reagens einschließen, das in Gegenwart oder Abwesenheit von Kreatinin eine messbare Veränderung durchläuft, wie eine Farbänderung, Absorption oder Emission von Licht, Löslichkeitänderung. Daher kann dieser Aspekt der Erfindung auch als ein ”markerfreier Nachweis” bezeichnet werden im Gegensatz zu einem ”markerbasierten Nachweis”, bei dem in der Regel eine exogene Markierungsgruppe zur Anzeige der Anwesenheit oder Abwesenheit eines nachzuweisenden Analyten verwendet wird. Insbesondere ist keine zusätzliche fluoreszierende, chemilumineszierende oder elektrochemisch aktive oder radioaktive Markierungsgruppe oder ein Katalysator an oder in dem Kreatinin, der Polymermatrix und der Probe vorhanden. Vorzugsweise soll der Nachweis von Kreatiningehalt in einer Probe ohne Verwendung einer weiteren Markierungsgruppe mit der Polymermatrix, dem Kreatinin und der Probe die Messung einer inhärenten Eigenschaft der Wechselwirkung des Kreatinins mit der Polymermatrix selbst bedeuten.
So kann beispielsweise Verfahrensschritt c3) die kalorimetrische Messung von durch eine Enthalpieänderung infolge von Adsorption von Kreatinin an der Polymermatrix und/oder Reaktion von Kreatinin mit der Polymermatrix erzeugter Wärme umfassen. Insbesondere kann Verfahrensschritt a3) das Bereitstellen der Polymermatrix in einer gepackten Schüttung mit einem Probeneinlass und einem Probenauslass umfassen, Verfahrensschritt b3) das Leiten der Probe durch die gepackte Schüttung über den Probeneinlass und den Probenauslass umfassen, wodurch die Polymermatrix mit der Probe in Berührung gebracht wird, und Verfahrensschritt c3) das Messen der Probentemperatur vom Probeneinlass und der Probentemperatur vom Probenauslass und das Ableiten des Kreatiningehalts in der Probe aus der Differenz zwischen der Probentemperatur am Probeneinlass und der Probentemperatur am Probenauslass umfassen.
Beispielsweise kann das Inberührungbringen der Polymermatrix mit der Probe in Verfahrensschritt b3) das Bereitstellen der Probe in einem strömenden Medium umfassen. Vorzugsweise hat das strömende Medium eine festgelegte Strömungsrate. Das strömende Medium kann beispielsweise Wasser, Pufferlösung oder organisches Lösungsmittel und Kombinationen davon umfassen.
In einer anderen Ausführungsform des Verfahrens umfasst Verfahrensschritt c3) das Messen einer spektralen Eigenschaft der Polymermatrix in Berührung mit der Probe. Beispielsweise kann das Messen der spektralen Eigenschaft die Messung der Fluoreszenzintensität der Polymermatrix in Berührung mit der Probe umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Polymermatrix eigenfluoreszierend. Beispielsweise nimmt die durch die Polymermatrix abgegebene Fluoreszenz bei Wechselwirkung mit dem Kreatinin ab. Die Fluoreszenzintensität kann beispielsweise mit einer Anregungswellenlänge von 300–340 nm, vorzugsweise 310–330 nm, ganz besonders bevorzugt 315–325 nm, und einer Emissionswellenlänge von 350–400 nm, vorzugsweise 360–390 nm, ganz besonders bevorzugt 365–375 nm, gemessen werden.
Bei dem oben beschriebenen markerfreien Nachweis von Kreatinin gemäß der vorliegenden Erfindung kann auf mühsame Probenvorbereitungsprozeduren und sekundäre Reagentien verzichtet werden, was das in Rede stehende Verfahren zeit- und kosteneffizienter als herkömmliche Verfahren macht. Außerdem werden durch den markerfreien Nachweis Störungen vermieden, die sich aus der Markierung von Kreatinin oder der Probe mit einer exogenen Markierungsverbindung wie einem Fluoreszenzmarker ergeben, wodurch eine höhere Genauigkeit des in Rede stehenden Verfahrens im Vergleich zu markerbasierten Verfahren bereitgestellt wird. Außerdem erlaubt der direkte markerfreie Nachweis der vorliegenden Erfindung die Messung der Wechselwirkung des Kreatinins mit der Polymermatrix in Echtzeit.
Schließlich stellt die vorliegende Erfindung eine Sensorvorrichtung, die zum Nachweis von Kreatiningehalt in einer Probe konfiguriert ist, bereit, umfassend:

– die Polymermatrix gemäß obiger Definition,
– Mittel zum Messen der Wechselwirkung von Kreatinin mit der Polymermatrix,

Hierbei ist ”ohne Verwendung einer weiteren Markierungsgruppe mit der Polymermatrix, dem Kreatinin und der Probe” wie oben beschrieben zu verstehen.
In einer Ausführungsform umfasst das Mittel zum Messen der Wechselwirkung von Kreatinin mit der Polymermatrix eine Vorrichtung, die zur kalorimetischen Messung von durch eine Enthalpieänderung infolge von Adsorption von Kreatinin an der Polymermatrix und/oder Reaktion von Kreatinin mit der Polymermatrix erzeugter Wärme konfiguriert ist.
In einer anderen Ausführungsform umfasst das Mittel zum Messen der Wechselwirkung von Kreatinin mit der Polymermatrix eine Vorrichtung, die zur Messung der Fluoreszenzintensität der Polymermatrix in Berührung mit der Probe konfiguriert ist.
Die generischen Begriffe Polymermatrix und molekular geprägtes Polymer (MIP) können im Folgenden synonym verwendet werden. NIP bedeutet ein nicht geprägtes Polymer, das heißt eine in Abwesenheit des Zielmoleküls hergestellte Polymermatrix.
Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, den Bedarf an einem neuen Verfahren zum Nachweis von Kreatinin zu erfüllen oder bei der Verbesserung der Selektivität des Standardverfahrens zu helfen. Zur Verbesserung der optimalen Bindungsstärke und Erhöhung der Zahl selektiver Bindungsstellen von molekular geprägten Polymeren gegenüber dem Zielmolekül ist es wichtig, das richtige funktionelle Monomer (oder eine Kombination davon) zu wählen. Daher kann das in der vorliegenden Erfindung aus einem neuen maßgeschneiderten funktionellen Monomer hergestellte neue molekular geprägte Polymer die selektive Erkennung von Kreatinin in wässriger Umgebung (z. B. Urin) besser bereitstellen als bei Verwendung anderer im Handel erhältlicher funktioneller Monomere, wie oben in der Literatur erwähnt. Insbesondere eignet sich dieses geprägte Polymer in der vorliegenden Erfindung zur Verwendung als selektive Extraktionsmatrix in Kombination mit dem standardmäßigen kolorimetrischen Verfahren (Jaffé-Reaktion) zum Nachweis von und/oder zur Durchmusterung auf Kreatinin in biologischer Flüssigkeit. Bei der neu entwickelten Vorschrift, die wir als ”indirekte Jaffe-Reaktion” bezeichnen, werden zwei Messungen durchgeführt, und die Differenz dazwischen stellt die störungsfreie Kreatininkonzentrationsmessung bereit: Die erste Messung ist die normale Jaffe-Reaktion, die ein Signal ergibt, das von Kreatinin und einigen Störstoffen, die zuvor nicht separat nachweisbar waren, herrührt. Bei der zweiten Messung wird das erfundene Kreatinin-MIP zu den Jaffe-Reaktionsmischungen gegeben, und das Signal stammt nur von den Störstoffen, da Kreatinin quantitativ durch das MIP gebunden wird und nicht mehr mit Pikrinsäure reagieren kann. Die Differenz zwischen den beiden Messungen ist das gewünschte, störungsfreie Kreatininsignal. Das Störungsproblem bei der Verwendung der Jaffe-Reaktion kann auch unter Verwendung des geprägten Polymers für einen Schritt einer selektiven Extraktion vor der Messung verringert werden. In diesem Fall wird Kreatinin von den Extraktions-MIP isoliert und kann durch die Jaffe-Reaktion in Abwesenheit jeglicher Störstoffe quantitativ bestimmt werden. Dieses Verfahren wird als ”direktes Jaffe-Verfahren mit MIP-abhängigem Festphasenextraktionsschritt” bezeichnet. Das Weiteren kann dieses Material in anderen Formen als in der angegebenen Vorschrift hergestellt und auf einer beliebigen Oberfläche des Aufnehmers für die Sensorapplikation aufgetragen und zur Messung von Kreatinin in einer beliebigen Lösung, wie Serum, Plasma oder Urin, verwendet werden. Es könnte Teil von Produkten und/oder Systemen sein, die bei der Messung einer klinischen Point-of-Care-Überwachung von Kreatinin verwendet werden. Besonders nützlich wird die Integration des neuen MIP in Einmal-Probensammeleinheiten (z. B. Urin- oder Plasma- oder Serum-Sammelkits) sein. Auf diese Weise werden die Sammlung und die Probenvorbehandlung in einer Vorrichtung integriert. Es ist möglich, dass dieses Material zur weiteren Anwendung in höheren Mengen für den industriellen Maßstab entwickelt und hergestellt werden könnte. Es ist möglich, dass dieses Material in akademischen Forschungsprojekten verwendet werden könnte, da es auf verschiedene Messsysteme, wie optische Messung, Chromatographie, elektrochemische Sensoren usw., abgestimmt werden könnte. Außerdem sind die mit der Verwendung von MIP in Zusammenhang stehenden Vorteile hohe Affinität und Selektivität, billige Inhaltsstoffe, einfache Herstellung, langfristige Lagerung, physikalische und chemische Stabilität, so dass es unter verschiedenen Bedingungen verwendet und mehrmals wiederverwendet werden kann, ohne an Effektivität zu verlieren.
Überraschenderweise haben die Erfinder somit festgestellt, dass es möglich ist, molekular geprägte Polymere (MIPs) herzustellen, die speziell für die selektive Erkennung von Kreatinin vorgesehen sind. Daher betraf die vorliegende Erfindung gemäß einem Aspekt ein Verfahren zur Herstellung von geprägtem Polymer (MIP).
Die molekular geprägten Polymere können beispielsweise als Monolith, Film oder Nanopartikel hergestellt werden.
Figuren
Es versteht sich, dass die folgenden Figuren und Beispiele lediglich zur Erläuterung dienen und den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung nicht einschränken sollen.
1 zeigt eine Kreatininbindungsstudie des geprägten Polymers und eines Kontrollpolymers.
2 zeigt durch Titration von PTU (1 mM) mit Kreatinin erhaltene Fluoreszenzemissionsspektren.
3 zeigt eine beispielhafte Ausführungsformen der Herstellung der Polymermatrix/molekular geprägten Polymere.
4 zeigt ein Fließschema der indirekten Jaffe-Reaktion.
5 zeigt den Kreatininnachweis durch Jaffe-Reaktion aus Kreatinin-Standardlösung.
6 illustriert die Selektivität der Polymermatrix/des MIP.
Beispiele
Beispiel 1) Synthese von funktionellem Monomer, 1-(4-Vinylphenyl)-3-(pentafluorphenyl)thioharnstoff, PTU
1-(4-Vinylphenyl)-3-(pentafluorphenyl)thioharnstoff wird synthetisiert und als neuer Rezeptor für neutrale Nitroderivate verwendet wie im früheren Artikel (Athikomrattanakul, U., Promptmas, C., Katterle, M., Tetrahedron Lett., 50: 359–362 (2009)).
Beispiel 2) Synthese von molekular geprägten Polymeren gemäß der nichtkovalenten Methode
In der vorliegenden Erfindung wurden die molekular geprägten Polymere bereitgestellt, die nach der von Mosbach in dem Dokument US-PS 5,110,833 entwickelten nichtkovalenten Prägungsmethode hergestellt werden.
Die Herstellung des geprägten Polymers erfolgt durch Mischen von 0,05655 g Kreatinin (0,5 mmol) und 0,1724 g 1-(4-Vinylphenyl)-3-(pentafluorphenyl)thioharnstoff (PTU, 0,5 mmol) in 5 ml wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO) in einem 10-mL-Glasfläschchen. Die Mischung wird 2 Stunden bei 25 Grad C inkubiert, um die Selbstorganisation der Templat-Monomer-Komplexe zu erlauben. Dann werden 1,7870 g Pentaerythritoltriacrylat (PETRA, 6 mmol) und 127 mg 1-Hydroxycyclohexylphenylketon zu der Mischung gegeben. Die Mischung wird 5 Minuten mit Argongas gespült und dann 2 Stunden bei 4 Grad C inkubiert. Nach der Vorinkubation wird die Polymerisation unter Ultraviolettlicht bei 360 nm über einen Belichtungszeitraum von 6 Stunden initiiert, um einen Monolithen zu bilden.
Das nichtgeprägte Polymer wird aus 0,1725 g PTU (0,5 mmol) in 5 ml wasserfreiem Dimethylsulfoxid in einem 10-mL-Glasfläschchen hergestellt. Die Lösung wird 2 Stunden bei 25 Grad C inkubiert, wonach 1,7890 g Pentaerythritoltriacrylat (PETRA, 6 mmol) und 129 mg 1-Hydroxycyclohexylphenylketon zu der Lösung gegeben werden. Die Mischung wird 5 Minuten mit Argongas gespült und dann 2 Stunden bei 4 Grad C inkubiert. Nach der Vorinkubation wird die Polymerisation unter Ultraviolettlicht bei 366 nm über einen Belichtungszeitraum von 6 Stunden initiiert, um einen Monolithen zu bilden.
Der geprägte Monolith und der nichtgeprägte Monolith werden in einer Ultrazentrifugenmühle (Retsch, ZM200) gemahlen und dann gesiebt. Die Teilchengröße liegt zwischen 25 und 75 Mikron. Die Polymere werden zur Templatentfernung in einer Soxhlet-Apparatur über Nacht mit heißem Methanol gewaschen und vor der Verwendung im nächsten Schritt 4 h bei 60 Grad C getrocknet. Der Verlauf der Templatentfernung wird mit einem UV-Vis-Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 230 nm überwacht.
Beispiel 3) Messung von Kreatinin-Standardlösung durch Jaffe-Reaktion
Aus Kreatinin-Standardstammlösung (20 mg/dl aus Kreatinin-Assay-Kit, Cayman, USA) werden Kreatinin-Standardlösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen von 0 bis 5 mg/dl (0 bis 442 μM) in 200 mM Natriumboratpuffer, pH 8,2, hergestellt.
Die Kreatininkonzentration jeder Konzentration wird durch Jaffe-Reaktion unter Verwendung von Kreatinin-Assay-Kit-Reagens von Cayman, USA, analysiert. Der Überstand (15 μL) von ungebundenen Verbindungen in jedem Röhrchen wird genommen und in eine Mikroplatte mit 96 Vertiefungen (F-bottom, Greiner) überführt. Der Überstand wird mit 100 μL des Reaktionspuffers (aus Kit) und 100 μL des Farbreagens (aus Kit) versetzt. Die Farbe des Überstands wird entwickelt, wonach die Extinktion bei 495 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts (FLUOStar, Omega) nach einer und sieben Minuten analysiert wird. Die durchschnittliche Extinktion jeder Konzentration des Analyten kann durch Subtrahieren der Extinktionsablesung bei einer Minute von der Extinktionsablesung bei sieben Minuten berechnet werden. Dann wird durch Subtrahieren der durchschnittlichen Extinktion von der Extinktion einer Blindprobe (0 mg/dL) die bereinigte Analyt-Extinktion erhalten. Die Standardkurve für Kreatinin wird aufgetragen und mittels linearer Regression gefittet. Der y-Achsenabschnitt und die Steigung werden aus der linearen Gleichung erhalten und zur Berechnung der Kreatininkonzentration in der Probe verwendet.
Beispiel 4) Evaluierung der Kreatininerkennung durch die geprägten Polymere in wässriger Lösung
Es werden Kreatinin-Standardlösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen von 0,010 bis 5 mM in 200 mM Natriumboratpuffer, pH 8,2, hergestellt. Der Analyt (500 μL) jeder Konzentration wird zu 10 mg des geprägten Polymers in jedem Eppendorfröhrchen gegeben. Die Mischung wird unter kontinuierlichem Schütteln 24 h bei 25 Grad C inkubiert, um zu gewährleisten, dass das Gleichgewicht erreicht ist, wonach in 10 Minuten bei 10.000 U/min zentrifugiert wird. Der Überstand (15 μL) von ungebundenen Verbindungen in jedem Röhrchen wird genommen und in eine Mikroplatte mit 96 Vertiefungen (F-bottom, Greiner) überführt. Der Überstand wird mit 100 μL des Reaktionspuffers (aus Kit) und 100 μL des Farbreagens (aus Kit) versetzt. Die Farbe des Überstands wird entwickelt, wonach die Extinktion bei 495 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts nach einer und sieben Minuten analysiert wird. Die Konzentration des ungebundenen Analyten wird unter Verwendung einer Kalibrationskurve von Kreatinin-Standardlösung bestimmt. Die Menge des an das geprägte Polymer gebundenen Analyten (B, μmol/g) wird durch Subtrahieren der Konzentration des ungebundenen Analyten von der Anfangskonzentration evaluiert. Jeder Assay wird im Dreifachversuch bestimmt.
Das Ergebnis wird durch 1 veranschaulicht. Unter der verwendeten analytischen Bedingung wird bedeutende Erkennung durch das geprägte Polymer für Kreatinin bei einer Konzentration über 50 μM (0,57 mg/dL) beobachtet. Die Selektivitätsfaktor- oder Prägefaktorwert wird zur Evaluierung der Erkennung von Kreatinin auf den Matrices bestimmt.
Beispiel 5) Evaluierung der Kreatininerkennung durch das geprägte Polymer in einer echten Probe (Urin)
Eine Urinprobe von einem der Autoren wird 2 Stunden vor dem Test gesammelt. Es werden mit verschiedenen Kreatininkonzentrationen von 5,62, 10,66, 26,45, 53,04 und 80,75 mg/dL versetzte Teile der Urinprobe hergestellt. Die Kreatininkonzentration in der Urinprobe mit und ohne zugesetztes Kreatinin wurde durch Jaffe-Reaktion vor der Zugabe zu dem geprägten Polymer bestimmt.
Die Urinprobe (500 μL) mit und ohne zugesetztes Kreatinin wird zu 10 mg des geprägten Polymers in jedem Eppendorfröhrchen gegeben. Die Mischung wird unter kontinuierlichem Schütteln bei 25 Grad C inkubiert. Der Überstand jeder Probe wird 4 und 24 h gesammelt und dann mittels Jaffe-Reaktion analysiert. Nach 50-facher Verdünnung werden 15 μL der verdünnten Urinprobe mit dem Kit-Reagens farbentwickelt, wonach die Extinktion bei 495 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts analysiert wird. Die Konzentration des ungebundenen Kreatinins in Urin wird unter Verwendung einer Kalibrationskurve von Kreatinin-Standardlösung bestimmt. Die an das geprägte Polymer gebundene Kreatininkonzentration wird durch Subtrahieren der Konzentration des ungebundenen Analyten von der Anfangskonzentration evaluiert. Jeder Assay wird im Dreifachversuch bestimmt.
Die Bindungskapazität des geprägten Polymers hängt von der erhöhten Konzentration von Kreatinin ab.
Beispiel 6) Kreatininerkennung und -selektivität des geprägten Polymers in einer echten Probe (Urin)
Verschiedene Störungen werden mit verschiedenen Konzentrationen zu Urinproben gegeben, beispielsweise Kreatinin (4,2, 24, 42, 79 mM), Glucose (45, 78, 146 mM), Bilirubin (3, 10, 20, 30 mM), Albumin (10,7, 17,5, 27,4, 38,3 mg/mL) und Harnsäure (13,9, 31,1, 84,3, 157 mM).
Die Kreatininkonzentration in der Urinprobe mit verschiedenen Störungen wird durch Jaffe-Reaktion vor der Zugabe zu dem geprägten Polymer bestimmt. Danach werden 500 μL der Urinprobe mit Störung zu 10 mg des geprägten Polymers in jedem Eppendorfröhrchen gegeben. Die Mischung wird unter kontinuierlichem Schütteln bei 25 Grad C inkubiert. Der Überstand jeder Probe wird 4 und 24 h gesammelt und dann mittels Jaffe-Reaktion analysiert. Nach 50-facher Verdünnung werden 15 μL der verdünnten Urinprobe mit dem Kit-Reagens farbentwickelt, wonach die Extinktion bei 495 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts analysiert wird. Die Konzentration des ungebundenen Kreatinins in Urin wird unter Verwendung einer Kalibrationskurve von Kreatinin-Standardlösung bestimmt. Die an das geprägte Polymer gebundene Kreatininkonzentration wird durch Subtrahieren der Konzentration des ungebundenen Analyten von der Anfangskonzentration evaluiert. Jeder Assay wird im Dreifachversuch bestimmt.
Die Bindungskapazität des geprägten Polymers für Kreatinin der Urinprobe wird beobachtet, und es wird festgestellt, dass das geprägte Polymer für Kreatinin selektiver und spezifischer ist als für die anderen Störungen.
Beispiel 7) Verwendung von Material als stationäre Phase für die Probentrennung
Das MIP gemäß der Erfindung, das für Kreatinin selektiver ist, kann als stationäre Phase zur Abtrennung und/oder Isolierung des Zielanalyten verwendet werden. Diese Anwendung basiert auch auf der Tatsache, dass das geprägte Polymer eine bessere Retention für die Templatmoleküle als andere hat. Daher betrifft die Erfindung die Verwendung von MIP zum Packen in der Festphasenextraktionskartusche (SPE-Kartusche, SPE = Solid Phase Extraction) und dann zur Probenvorbereitung und -trennung oder zum Aufkonzentrieren von Kreatinin in einer beliebigen Lösung, wie einer wässrigen Lösung, Serum, Plasma oder Urin. Neben dieser besonders fabelhaften Anwendung kann das MIP in der vorliegenden Erfindung auch zur direkten Messung von Kreatinin mittels HPLC in einer HPLC-Säule gepackt werden.
Beispiel 8) Verwendung von Material als Erkennungsmatrix mit Fluoreszenzeffekt für das Kreatinin
Die funktionelle Gruppe I''' bzw. das funktionelle Monomer Ia''', die bzw. das in der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, besitzt Eigenfluoreszenzeigenschaften, die durch Kreatinlösung gelöscht werden können, wie in 2 gezeigt. Es ist denkbar, dass das Material Fluoreszenzeinheiten enthält. Somit betrifft die Erfindung auch die Verwendung der geprägten Polymere als Erkennungselement, das in anderen Formen hergestellt und auf einer beliebigen Oberfläche der Aufnehmerbeschichtungen für die Sensorapplikation aufgetragen werden kann. Durch die vorliegende Erfindung hergestellte optische Sensoren werden eine quantitative Messung von Kreatininspiegeln über die Änderungen der Fluoreszenzeigenschaften der Materialien bereitstellen.
Beispiel 9) Verwendung des Materials als Erkennungsmatrix mit markerfreien Messungen
Die vorliegende Erfindung kann bei markerfreien Messungen zum Zielnachweis angewendet werden. Beispielsweise sind markerfreie Messungen auf Basis von Kalorimetrie unter Verwendung eines Thermistors als Vorrichtung zur Messung der Bindung zwischen MIPs und dem spezifischen Ziel eingeführt worden. Bei einem Thermistor kann es sich beispielsweise um eine Durchflussvorrichtung handeln. Ein Durchflussthermistor kann einen Füllkörperschüttungsreaktor umfassen, beispielsweise in Form einer Mikrosäule. Am Eingang und Ausgang des Füllkörperschüttungsreaktors können Temperatursonden zur Messung der Temperatur vorliegen.
In einem Durchflussthermistor kann die Temperaturdifferenz zwischen dem Eingang und Ausgang kontinuierlich aufgezeichnet werden und hängt von der durch eine Enthalpieänderung infolge von Adsorption und/oder Reaktion im Reaktor erzeugten Wärme, der Gesamtzahl von Produktmolekülen und der Wärmekapazität des Systems ab.
Dieses Prinzip wird von der Gruppe um Danielsson beschrieben (Ramanathan, K., Danielsson, B., Biosens. Bioelectron., 16: 417–423 (2001)). Für einen gegebenen Adsorptions- und/oder Reaktionsprozess zwischen einem Analyten und einem Sorptionsmittel oder Katalysator in einem gegebenen strömenden Medium, z. B. Wasser, Pufferlösung, organischem Lösungsmittel, bei der festgelegten Strömungsrate hängt die Temperaturdifferenz nur von der Konzentration des Analyten ab. Faktisch kann die Konzentration eines Analyten in Echtzeit ohne die Verwendung eines Markers direkt gemessen werden.
Im vorliegenden Beispiel wurde ein Füllkörperschüttungsreaktor hergestellt, indem die Polymermatrix mit der funktionelle Gruppe I''' der vorliegenden Erfindung als selektive Erkennungsmatrix in einer Mikrosäule mit Probeneinlass und Probenauslass eines Flusskalorimeters bereitgestellt wurde. Das Bindungsphänomen zwischen dem Kreatinin und dem geprägten Polymer wurde anhand der thermometrischen Antwort der Probe am Probeneinlass und am Probenauslass des Flusskalorimeters nachgewiesen. Die thermometrische Antwort des Kalorimeters erlaubte den Nachweis des Kreatinins in mikromolaren Konzentrationen.
Daher kann die Kombination eines Flusskalorimeters oder einer Temperatursonde mit der Polymermatrix der vorliegenden Erfindung, z. B. in einer Füllkörperschüttungssäule bereitgestellt, zum markerfreien Nachweis von Kreatinin verwendet werden.
Außerdem erlaubt der markerfreie Nachweis die Herstellung von markerfreien Messvorrichtungen zum Nachweis von Kreatinin. Beispielsweise kann ein Biosensor zum markerfreien Nachweis von Kreatinin hergestellt werden.

Claims

Polymermatrix mit mindestens einer Zielbindungsstelle, wobei – die Zielbindungsstelle eine funktionelle Gruppe umfasst, die durch die allgemeine Formel (I) wiedergegeben wird:
worin Y für S, O oder NH steht, R₁ und R₂ jeweils unabhängig aus einer Gruppe umfassend Aryl, Heteroaryl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Alkyl, das jeweils substituiert und/oder Teil eines kondensierten Ringsystems sein kann, ausgewählt sind, X₁ und X₂ jeweils unabhängig für eine Gruppe mit einer chemischen Bindung an die Polymermatrix stehen, m und n unabhängig für 0, 1, 2 oder 3 stehen und m + n gleich 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist, wobei die Zielbindungsstelle zur Bindung an ein Zielmolekül, das durch eine der folgenden allgemeinen Formeln (IIa) oder (IIb) wiedergegeben wird, geeignet ist:
worin Z aus CR₄R₄', NR₄'' O oder S ausgewählt ist, R₃, R₃', R₄ und R₄' jeweils unabhängig aus einer Gruppe umfassend Wasserstoff, Aryl, Heteroaryl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, lineares oder verzweigtes Alkyl, das jeweils substituiert und/oder Teil eines kondensierten Ringsystems sein kann, ausgewählt sind, R₄'' aus einer Gruppe bestehend aus einer Stickstoffschutzgruppe, Wasserstoff, Aryl, Heteroaryl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, lineares oder verzweigtes Alkyl, das jeweils substituiert und/oder Teil eines kondensierten Ringsystems sein kann, ausgewählt ist.
Polymermatrix mit mindestens einer Zielbindungsstelle, wobei – die Polymermatrix erhältlich ist durch Polymerisation mindestens eines funktionellen Monomers der allgemeinen Formel (Ia)
worin Y für S, O oder NH steht, R₁ und R₂ jeweils unabhängig aus einer Gruppe umfassend Aryl, Heteroaryl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Alkyl, das jeweils substituiert und/oder Teil eines kondensierten Ringsystems sein kann, ausgewählt sind, X₁' und X₂' jeweils unabhängig für eine polymerisierbare Gruppe stehen, m und n unabhängig für 0, 1, 2 oder 3 stehen und m + n gleich 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist, wobei die Polymerisation in Gegenwart eines Zielmoleküls, das durch eine der folgenden allgemeinen Formeln (IIa) oder (IIb) wiedergegeben wird, durchgeführt wird:
worin Z aus CR₄R₄', NR₄'' O oder S ausgewählt ist, R₃, R₃', R₄ und R₄' jeweils unabhängig aus einer Gruppe umfassend Wasserstoff, Aryl, Heteroaryl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, lineares oder verzweigtes Alkyl, das jeweils substituiert und/oder Teil eines kondensierten Ringsystems sein kann, ausgewählt sind, R₄'' aus einer Gruppe bestehend aus einer Stickstoffschutzgruppe, Wasserstoff, Aryl, Heteroaryl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, lineares oder verzweigtes Alkyl, das jeweils substituiert und/oder Teil eines kondensierten Ringsystems sein kann, ausgewählt ist, wobei die Zielbindungsstelle der Polymermatrix zur Bindung an ein Zielmolekül befähigt ist.
Polymermatrix nach Anspruch 2, wobei die Polymerisation in Gegenwart mindestens eines Vernetzers und/oder Initiators durchgeführt wird.
Polymermatrix nach Anspruch 1, wobei die funktionelle Gruppe der Formel (I) durch die allgemeine Formel (I') wiedergegeben wird:
worin R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₅', R₆', R₇', R₈' und R₉' jeweils unabhängig für Wasserstoff, Halogen, Alkyl, Halogenalkyl, NO₂, CN,
stehen, wobei R₁₀, R₁₁ und R₁₁' unabhängig aus einer Gruppe umfassend Wasserstoff, Alkyl, Aryl, Halogenalkyl, Alkylenaryl und eine Stickstoffschutzgruppe ausgewählt sind, wobei mindestens zwei der Reste R₅, R₆, R₇, R₈, R₉ oder mindestens zwei der Reste R₅', R₆', R₇', R₈' und R₉' unabhängig einen Teil eines kondensierten Ringsystems bilden können, mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste R₅, R₆, R₇, R₈, R₉ X₁ umfasst und/oder mindestens einer der Reste R₅', R₆', R₇', R₈' und R₉' X₂ umfasst.
Polymermatrix nach Anspruch 2, wobei das funktionelle Monomer der Formel (Ia) durch die allgemeine Formel (Ia') wiedergegeben wird:
worin R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₅', R₆', R₇', R₈' und R₉' jeweils unabhängig für Wasserstoff, Halogen, Alkyl, Halogenalkyl, NO₂, CN,
stehen, wobei R₁₀, R₁₁ und R₁₁' unabhängig aus einer Gruppe umfassend Wasserstoff, Alkyl, Aryl, Halogenalkyl, Alkylenaryl und eine Stickstoffschutzgruppe ausgewählt sind, und/oder wobei mindestens zwei der Reste R₅, R₆, R₇, R₈, R₉ oder mindestens zwei der Reste R₅', R₆', R₇', R₈' und R₉' unabhängig einen Teil eines kondensierten Ringsystems bilden können, mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste R₅, R₆, R₇, R₈, R₉ X₁' umfasst und/oder mindestens einer der Reste R₅', R₆', R₇', R₈' und R₉' X₂' umfasst.
Polymermatrix nach Anspruch 1 oder 4, wobei die funktionelle Gruppe der Formel (I') durch die allgemeine Formel (I'') wiedergegeben wird:
Polymermatrix nach Anspruch 2, 3 oder 5, wobei das funktionelle Monomer der Formel (Ia') durch die allgemeine Formel (Ia'') wiedergegeben wird:
Polymermatrix nach einem der Ansprüche 1, 4 oder 6, wobei die funktionelle Gruppe aus der Gruppe umfassend:
ausgewählt ist.
Polymermatrix nach einem der Ansprüche 2, 3, 5 oder 7, wobei das funktionelle Monomer aus der Gruppe umfassend:
ausgewählt ist.
Polymermatrix nach Anspruch 1, 4, 6 oder 8, wobei die funktionelle Gruppe durch die Formel (I''') wiedergegeben wird:
Polymermatrix nach Anspruch 2, 3, 5, 7 oder 9, wobei das Monomer durch die Formel (Ia''') wiedergegeben wird:
Polymermatrix nach Anspruch 1, wobei die funktionelle Gruppe der Formel (I) durch
wiedergegeben wird.
Polymermatrix nach Anspruch 2, wobei das funktionelle Monomer der Formel (Ia) durch
wiedergegeben wird.
Polymermatrix nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem Zielmolekül um Kreatinin handelt.
Polymermatrix nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der Polymermatrix um ein Copolymer handelt.
Polymermatrix nach einem der Ansprüche 2, 3, 5, 7, 9, 11 oder 13, wobei die polymerisierbaren Gruppen X₁' und X₂' aus einer Gruppe umfassend ungesättigte Gruppen, die zur Reaktion über einen Radikalprozess befähigt sind, und chemische Gruppen, die eine Polykondensation, Polyaddition oder Sol-Gel-Reaktion ermöglichen, insbesondere Acrylderivate, Methacrylderivate, Epoxide, Isocyanate und Allylderivate, ausgewählt sind.
Polymermatrix nach einem der Ansprüche 1, 4, 6, 8, 10 oder 12, wobei X₁ und X₂ aus einer Polymerisationsreaktion einer Gruppe umfassend ungesättigte Gruppen, die zur Reaktion über einen Radikalprozess befähigt sind, und chemische Gruppen, die eine Polykondensation, Polyaddition oder Sol-Gel-Reaktion ermöglichen, insbesondere Acrylderivate, Methacrylderivate, Epoxide, Isocyanate und Allylderivate, stammen.
Verfahren zur Herstellung einer Polymermatrix gemäß einem der Ansprüche 1–17, das folgende Verfahrensschritte umfasst: a) Bereitstellen des mindestens einen Monomers nach einem der Ansprüche 2, 5, 7, 9, 11 oder 13 und des mindestens einen Zielmoleküls nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 12, b) Bilden einer Präpolymerisationsmischung durch Inkontaktbringen des Monomers und des Zielmoleküls, c) Polymerisieren der Präpolymerisationsmischung zum Erhalt der Polymermatrix.
Verfahren nach Anspruch 18, bei dem man mindestens einen Vernetzer und/oder Initiator zu der Präpolymerisationsmischung von Verfahrensschritt b) gibt.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, ferner umfassend Verfahrensschritt d) des Entfernens des Ziels von der Polymermatrix.
Verfahren zur Abtrennung oder Extraktion von Kreatinin aus einem Gemisch, das zusätzliche organische und/oder anorganische Verbindungen umfasst, das folgende Verfahrensschritte umfasst: a1) Bereitstellen der Polymermatrix gemäß einem der Ansprüche 1–17, b1) Inkontaktbringen der Polymermatrix mit der Mischung und Binden von Kreatin mit der Polymermatrix, c1) Abtrennen der Polymermatrix mit dem gebundenen Kreatinin von dem Gemisch.
Verfahren nach Anspruch 21, ferner umfassend Verfahrensschritt d1) des Freisetzens des gebundenen Kreatinins aus der Polymermatrix.
Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, bei dem es sich bei dem Gemisch um eine biologische Probe handelt.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, bei dem es sich bei der biologischen Probe um Serum oder Urin handelt.
Verfahren zum indirekten qualitativen oder quantitativen Nachweis von Kreatiningehalt in einer Probe unter Verwendung der Polymermatrix gemäß einem der Ansprüche 1–17, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: a2) Trennen einer zu analysierenden Probe in eine erste und eine zweite separate Portion, b2) Verwenden eines Nachweisverfahrens zur Bestimmung eines ersten Kreatiningehaltergebnisses in der ersten Portion der Probe in Abwesenheit der Polymermatrix, c2) Zugeben der Polymermatrix zu der zweiten Portion der Probe, d2) Verwenden des gleichen Nachweisverfahrens zur Bestimmung eines zweiten Kreatiningehaltergebnisses in der zweiten Portion der Probe, e2) Subtrahieren des zweiten Kreatiningehaltergebnisses von dem ersten Kreatiningehaltergebnis zum Erhalt des Kreatiningehalts in der Probe.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, bei dem man das Nachweisverfahren von Verfahrensschritt b2) und d2) aus einer Gruppe umfassend spektralphotometrische Nachweisreaktionen, kolorimetrische Nachweisreaktionen, Fluoreszenz-Nachweisreaktionen oder elektrochemische Nachweisreaktionen auswählt.
Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, bei dem es sich bei dem Nachweisverfahren um eine kolorimetrische Nachweisreaktion handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 25–27, bei dem das Nachweisverfahren auf der Reaktion von Kreatinin mit alkalischem Pikrat basiert und es sich insbesondere bei dem Nachweisverfahren um die Jaffe-Reaktion handelt.
Assay-Kit zur Durchführung des Nachweisverfahrens nach einem der Ansprüche 25–27, umfassend – die Polymermatrix gemäß einem der Ansprüche 1–17 – Mittel zum Nachweisen des Zielmoleküls mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 25–28, wobei für das Nachweisverfahren ein Assay-Kit verwendet wird.
Verfahren zum Nachweis von Kreatiningehalt in einer Probe unter Verwendung der Polymermatrix gemäß einem der Ansprüche 1–17 ohne Verwendung einer weiteren Markierungsgruppe mit der Polymermatrix, dem Kreatinin und der Probe, das folgende Verfahrensschritte umfasst: a3) Bereitstellen der Polymermatrix, b3) Inkontaktbringen der Polymermatrix mit der zu analysierenden Probe, c3) Messen der Wechselwirkung von Kreatinin mit der Polymermatrix.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei Verfahrensschritt c3) die kalorimetrische Messung von durch eine Enthalpieänderung infolge von Adsorption von Kreatinin an der Polymermatrix und/oder Reaktion von Kreatinin mit der Polymermatrix erzeugter Wärme umfasst.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei Verfahrensschritt a3) das Bereitstellen der Polymermatrix in einer gepackten Schüttung mit einem Probeneinlass und einem Probenauslass umfasst, Verfahrensschritt b3) das Leiten der Probe durch die gepackte Schüttung über den Probeneinlass und den Probenauslass umfasst, wodurch die Polymermatrix mit der Probe in Kontakt gebracht wird, und Verfahrensschritt c3) das Messen der Probentemperatur vom Probeneinlass und der Probentemperatur vom Probenauslass und das Ableiten des Kreatiningehalts in der Probe aus der Differenz zwischen der Probentemperatur am Probeneinlass und der Probentemperatur am Probenauslass umfasst.
Verfahren nach Anspruch 30, bei dem Verfahrensschritt c3) das Messen einer spektralen Eigenschaft der Polymermatrix in Berührung mit der Probe umfasst.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, bei dem das Messen der spektralen Eigenschaft die Messung der Fluoreszenzintensität der Polymermatrix in Berührung mit der Probe umfasst.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, bei dem die Fluoreszenzintensität mit einer Anregungswellenlänge von 300–340 nm, vorzugsweise 310–330 nm, ganz besonders bevorzugt 315–325 nm, und einer Emissionswellenlänge von 350–400 nm, vorzugsweise 360–390 nm, ganz besonders bevorzugt 365–375 nm, gemessen wird.
Sensorvorrichtung, die zum Nachweis von Kreatiningehalt in einer Probe konfiguriert ist, umfassend: – die Polymermatrix gemäß einem der Ansprüche 1–17, – Mittel zum Messen der Wechselwirkung von Kreatinin mit der Polymermatrix, wobei das Messen der Wechselwirkung von Kreatinin mit der Polymermatrix ohne Verwendung einer weiteren Markierungsgruppe mit der Polymermatrix, dem Kreatinin und der Probe erfolgt.
Sensorvorrichtung nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei das Mittel zum Messen der Wechselwirkung von Kreatinin mit der Polymermatrix eine Vorrichtung umfasst, die zur kalorimetischen Messung von durch eine Enthalpieänderung infolge von Adsorption von Kreatinin an der Polymermatrix und/oder Reaktion von Kreatinin mit der Polymermatrix erzeugter Wärme konfiguriert ist.
Sensorvorrichtung nach Anspruch 36, wobei das Mittel zum Messen der Wechselwirkung von Kreatinin mit der Polymermatrix eine Vorrichtung umfasst, die zur Messung der Fluoreszenzintensität der Polymermatrix in Berührung mit der Probe konfiguriert ist.