CN112724166A - 一种水溶性荧光探针及其合成方法和用于检测抗生素的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化学分析检测技术领域，具体介绍了一种水溶性荧光探针的合成方法以及用于检测抗生素的用途。本发明通过2.4‑二甲基吡咯、对甲酰基苯甲酸甲酯、三氟乙酸，DDQ，三乙胺，三氟化硼乙醚络合物等原料，在温和的反应条件下制得了荧光探针，并用于检测食品、环境等样品中的抗生素含量，如罗红霉素，四环素，土霉素。该检测方法具有灵敏度高，选择性好，检测时间短等优点。
Description
技术领域
本发明属于化学分析检测技术领域，具体介绍了一种水溶性荧光探针及其合成方法和用于检测抗生素的用途。
背景技术
抗生素是一种生理活性物质，主要作用是抗细菌感染，可以杀灭和抑制侵入生物体内的致病性细菌，使感染得到有效控制，最终能使机体痊愈。抗生素的种类有很多，包括四环素类、大环内酯类、β内酰胺类等。土霉素(Oxytetracycline，OTC)和四环素(Tetracycline,TET)都属于四环素类抗生素，主要作为兽药用于动物感染性疾病治疗。罗红霉素是大环内酯类抗生素的一种，广泛应用于人体细菌感染疾病，对细菌感染引起的呼吸道感染，咽喉炎以及肺炎有很好的治愈效果。过量使用抗生素会导致在生物体内大量残留，机体造成严重的损伤。抗生素长期使用会导致病菌产生抗药性，引起生命体免疫能力下降，增加死亡率等。随着对环境保护以及健康问题逐渐重视，抗生素的检测越来越重要，抗生素的检测方法成为了重要的研究内容。
由于抗生素的含量相对较低，抗生素检测一般都是基于高灵敏度的大型仪器。主要包括色谱法及其联用技术、酶免疫分析法、毛细管电泳法、液相色谱-串联质谱法等。这些检测方法往往需要大型精密仪器且检测步骤复杂且繁琐，检测时间长，实用性差，需要专业的工作人员。因此，设计一种高效快速检测抗生素的方法就显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水溶性荧光探针及其合成方法，并将其用于检测抗生素，简化复杂的抗生素检测技术。
一种水溶性荧光探针，以氟硼吡咯(BODIPY)为荧光检测基团，其结构如下：
一种水溶性荧光探针的合成方法，包括以下步骤：
(1)在氮气环境保护下，称取2.4-二甲基吡咯和对甲酰基苯甲酸甲酯溶于适量二氯甲烷，加入三氟乙酸，常温下充分搅拌，得混合液；
步骤(1)中，所述2.4-二甲基吡咯、对甲酰基苯甲酸甲酯的摩尔比例为2:1；2.4-二甲基吡咯和三氟乙酸的用量比例为4mmol：400μL；搅拌时间为12h。
(2)在步骤(1)的混合液中加入DDQ，反应搅拌一段时间，加入三乙胺，再充分反应一段时间，加入三氟化硼乙醚络合物，再反应一段时间即可停止反应；
步骤(2)中，所述DDQ、对甲酰基苯甲酸甲酯的摩尔比例为1:1；
三乙胺、三氟化硼乙醚络合物摩尔比例为1:1；
DDQ、三乙胺的摩尔比例为1:2；
加入DDQ后反应时间为3-5h，加入三乙胺后反应时间为20min，加入三氟化硼乙醚络合物后反应时间为12h。
(3)将步骤(2)得到的反应溶液用饱和食盐水洗涤，二氯甲烷萃取数次，收集有机相黄绿色溶液；
(4)将黄绿色溶液蒸发浓缩，硅胶柱层析分离，收集亮绿色荧光溶液并蒸发浓缩后，进行酸化处理得到目标产物水溶性荧光探针，COOH-BODIPY荧光探针。
步骤(4)中，所述硅胶柱层析分离时，采用的淋洗剂为石油醚和二氯甲烷的混合液，所述石油醚和二氯甲烷的体积比为4:1。
具体合成路线为：
本发明所述荧光探针用于检测抗生素方法，包括以下步骤：
(1)绘制标准工作曲线：配置一定浓度的罗红霉素，四环素，以及土霉素标准溶液。向石英荧光比色皿中加入磷酸缓冲溶液和空白荧光探针样品，向其中依次加入等量的抗生素标准溶液，测试空白探针以及每次加入抗生素后的荧光强度；
空白荧光探针的荧光强度为F0，加入抗生素样品后荧光强度为F，强度比值为F0/F，以不同的抗生素浓度C与对应的荧光比值作图，绘制标准工作曲线。
所述荧光强度测定参数为：激发光狭缝为5nm，发射峰狭缝为5nm，激发光波长为465nm。
所述荧光探针与磷酸缓冲溶液组成的混合物中，荧光探针的摩尔浓度为3.3×10- 5mol/L。
所述荧光探针与磷酸缓冲溶液组成的混合物中，磷酸缓冲溶液的摩尔浓度为10mmol/L，pH＝7.0。
为了确保荧光检测的准确性，加入样品后3-5min后检测荧光强度。
本发明采用以上技术方案，使用本发明合成的水溶性荧光探针检测抗生素，COOH-BODIPY检测抗生素的原理为：在465nm激发波长的条件下，水溶性COOH-BODIPY在505nm左右有强发射峰。当加入抗生素样品后，羧基会与抗生素中的基团结合，导致荧光淬灭。
本发明的有益效果为：
本发明合成了一种简单，廉价，反应条件温和的荧光探针并用于检测食品，环境等样品中的抗生素含量。该检测方法具有灵敏度高，选择性好，检测时间短等优点。
附图说明
图1实施例1样品的核磁共振图谱；
图2荧光探针中加入不同浓度的土霉素标准溶液后荧光强度变化趋势(A)及线性关系(B)；
图3荧光探针中加入不同浓度的四环素标准溶液后荧光强度变化趋势(A)及线性关系(B)；
图4荧光探针中加入不同浓度的罗红霉素标准溶液后荧光强度变化趋势(A)及线性关系(B)；
图5荧光探针在不同pH值缓冲溶液中，与抗生素作用前后荧光强度变化趋势；
图6荧光探针与抗生素滴定过程中荧光强度随时间的变化趋势图。
具体实施方式
实施例1
(1)在氮气环境保护下，取2.4-二甲基吡咯410μL(4mmol)和对甲酰基苯甲酸甲酯328mg(2mmol)溶于适量二氯甲烷，加入400μL三氟乙酸，常温下充分搅拌12h，得混合液。
(2)在步骤(1)的混合液中加入DDQ454mg(2mmol)，反应搅拌3-5h。加入三乙胺5ml(4mmol)，充分反应20min。加入三氟化硼乙醚络合物5ml(4mmol)，反应12h即可停止反应。
(3)将上述得到的反应溶液用饱和食盐水洗涤，二氯甲烷萃取三次，收集有机相黄绿色溶液；
(4)将黄绿色溶液蒸发浓缩，硅胶柱层析分离，收集亮绿色荧光溶液并蒸发浓缩后，进行酸化处理得到目标产物水溶性荧光探针，COOH-BODIPY荧光探针265mg，产率78％。如图1所示，1H NMR(400MHz,DMSO)δ(ppm)12.21(s,1H),8.19-8.17(d,J＝8.0Hz,2H),7.61-7.59(d,J＝8.0Hz,2H),6.57(s,2H),2.47(s,6H),1.66(s,6H).
所述荧光探针硅胶柱层析分离采用淋洗剂为石油醚和二氯甲烷的混合液，所述石油醚和二氯甲烷的体积比为4:1。
实施例2(BODIPY检测OTC)：
配置浓度梯度为0μM、10μM、20μM、30μM、40μM土霉素标准溶液。向5ml石英荧光比色皿中加入磷酸缓冲溶液和空白荧光探针样品33μM，向其中依次加入等量的土霉素标准溶液，测试空白探针以及每次加入土霉素后的荧光强度，如图2(A)所示。
空白荧光探针的荧光强度为F0，加入土霉素样品后荧光强度为F，强度比值为F0/F，以不同的土霉素浓度C与对应的荧光比值作图，绘制标准工作曲线，如图2(B)所示。建立的线性公式如下：Y＝0.973+0.02X(R2＝0.9897)，其中Y为空白荧光探针的荧光强度与加入土霉素样品后荧光强度的比值，X为加入土霉素的浓度C。
荧光强度测定参数为：激发光狭缝为5nm，发射峰狭缝为5nm，激发光波长为465nm。
加入土霉素标准溶液3-5min后测试荧光强度。
所述荧光探针与磷酸缓冲溶液组成的混合物中，磷酸缓冲溶液的摩尔浓度为10mmol/L，pH＝7.0。
实施例3(BODIPY检测TET)：
配置浓度梯度为0μM、16.67μM、33.33μM、50μM、66.67μM四环素标准溶液。向5ml石英荧光比色皿中加入磷酸缓冲溶液和空白荧光探针样品33μM，向其中依次加入等量的四环素标准溶液，测试空白探针以及每次加入四环素后的荧光强度,如图3(A)所示。
空白荧光探针的荧光强度为F0，加入四环素样品后荧光强度为F，强度比值为F0/F，以不同的四环素浓度C与对应的荧光比值作图，绘制标准工作曲线，如图3(B)所示。建立的线性公式如下：Y＝1.03+0.02X(R2＝0.9784)，其中Y为空白荧光探针的荧光强度与加入四环素样品后荧光强度的比值，X为加入四环素的浓度C。
荧光强度测定参数为：激发光狭缝为5nm，发射峰狭缝为5nm，激发光波长为465nm。
加入四环素标准溶液3-5min后测试荧光强度。
所述荧光探针与磷酸缓冲溶液组成的混合物中，磷酸缓冲溶液的摩尔浓度为10mmol/L，pH＝7.0。
实施例4(BODIPY检测RM)：
配置浓度梯度为0μM、27μM、54μM、81μM、108μM、135μM罗红霉素标准溶液。向5ml石英荧光比色皿中加入磷酸缓冲溶液和空白荧光探针样品33μM，向其中依次加入等量的罗红霉素标准溶液，测试空白探针以及每次加入罗红霉素后的荧光强度,如图4(A)所示。
空白荧光探针的荧光强度为F0，加入罗红霉素样品后荧光强度为F，强度比值为F0/F，以不同的罗红霉素浓度C与对应的荧光比值作图，绘制标准工作曲线，如图4(B)所示。建立的线性公式如下：Y＝0.98+0.02X(R2＝0.9961)，其中Y为空白荧光探针的荧光强度与加入罗红霉素样品后荧光强度的比值，X为加入罗红霉素的浓度C。
荧光强度测定参数为：激发光狭缝为5nm，发射峰狭缝为5nm，激发光波长为465nm。
加入罗红霉素标准溶液3-5min后测试荧光强度。
所述荧光探针与磷酸缓冲溶液组成的混合物中，磷酸缓冲溶液的摩尔浓度为10mmol/L，pH＝7.0。
实施例5：
探究荧光探针在不同pH值缓冲溶液中，与抗生素作用前后荧光强度,如图5所示。
将BODIPY(3.3×10-5mol/L)溶解在不同pH的缓冲溶液中(2，3，4，5，6，7)，记录5min后，荧光探针的荧光强度变化。以pH为横坐标，荧光强度为纵坐标，研究荧光强度与pH的变化关系。如图所示，pH在2-5时，荧光较稳定，pH＞5时，荧光强度逐渐降低。因此，该探针可通过保持溶液酸度来维持较为稳定的荧光强度。
实施例6：
荧光探针与抗生素滴定过程中荧光强度随时间的变化，如图6所示。
将BODIPY(3.3×10-5mol/L)溶解在不同pH＝7的磷酸缓冲溶液中，以反应时间为横坐标，荧光探针的荧光强度为纵坐标，探究荧光变化与反应时间的变化关系。如图所示，当pH＝7时，反应时间2min后，探针的荧光强度几乎保持不变。因此利用BODIPY检测抗生素检测时间在3-5min左右，检测较为快速。
Claims (8)
1.一种水溶性荧光探针，以氟硼吡咯BODIPY为荧光检测基团，其结构如下：
2.一种水溶性荧光探针的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在氮气环境保护下，称取2.4-二甲基吡咯和对甲酰基苯甲酸甲酯溶于适量二氯甲烷，加入三氟乙酸，常温下充分搅拌，得混合液；
(2)在步骤(1)的混合液中加入DDQ，反应搅拌一段时间，加入三乙胺，再充分反应一段时间，加入三氟化硼乙醚络合物，再反应一段时间即可停止反应；
(3)将步骤(2)得到的反应溶液用饱和食盐水洗涤，二氯甲烷萃取数次，收集有机相黄绿色溶液；
(4)将黄绿色溶液蒸发浓缩，硅胶柱层析分离，收集亮绿色荧光溶液并蒸发浓缩后，进行酸化处理得到目标产物水溶性荧光探针，COOH-BODIPY荧光探针。
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤(1)中，所述2.4-二甲基吡咯、对甲酰基苯甲酸甲酯的摩尔比例为2:1；2.4-二甲基吡咯和三氟乙酸的用量比例为4mmol：400μL；搅拌时间为12h。
4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤(2)中，所述DDQ、对甲酰基苯甲酸甲酯的摩尔比例为1:1；三乙胺、三氟化硼乙醚络合物摩尔比例为1:1；DDQ、三乙胺的摩尔比例为1:2。
5.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤(2)中，加入DDQ后反应时间为3-5h，加入三乙胺后反应时间为20min，加入三氟化硼乙醚络合物后反应时间为12h。
6.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤(4)中，所述硅胶柱层析分离时，采用的淋洗剂为石油醚和二氯甲烷的混合液，所述石油醚和二氯甲烷的体积比为4:1。
7.将权利要求1所述的水溶性荧光探针用于检测抗生素的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述抗生素为罗红霉素，四环素或土霉素。
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| CN113831912A (zh) * | 2021-10-20 | 2021-12-24 | 广东石油化工学院 | 一种基于自身荧光增强的土霉素比率荧光探针及制备与应用 |
| CN115850720A (zh) * | 2022-12-26 | 2023-03-28 | 成都师范学院 | 一种锌基金属有机框架材料荧光传感器的制备方法和应用 |
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