CN115974812B - 一种无损监测鱼肉新鲜度的荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及食品安全检测技术领域，具体涉及一种无损监测鱼肉新鲜度的荧光探针，以2‑(2‑羟基苯基)苯并噻唑为荧光团母体，苯甲酸酯基为特异性识别基团，基于光诱导电子转移和激发态分子内质子转移响应机理，设计合成的荧光开启型探针在纯水体系中可以识别多种胺类物质，并可用于活细胞内荧光成像。该探针具有合成路线简单、响应快速、检测限低、Stokes位移大、特异性识别、荧光开启等优点。负载荧光探针的凝胶指示标签制备过程简便，对多种挥发性胺具有良好的响应，识别后达到荧光开启效果。将凝胶指示标签置于鱼肉包装的顶空环境中，可以实时监测鱼肉新鲜度，无需复杂的前处理及破坏样品，抗干扰能力强，结果准确可靠。
Description
技术领域
本发明涉及食品安全检测技术领域，具体涉及一种无损监测鱼肉新鲜度的荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
新鲜度是反映鱼肉品质、决定其商品价值和加工适性的重要属性。目前，鱼肉新鲜度评价方法主要有物理化学指标评价、微生物检测、感官评价、仿生技术、生物和电化学传感器及光谱技术等，但通常存在样品前处理复杂、样品需要被破碎、主观性强、仪器昂贵、重复性差、耗时等问题，不适合大规模现场操作等问题。鱼肉新鲜度可由总挥发性盐基氮(TVB-N)的含量来评估，TVB-N主要包括三甲胺、二甲胺、二乙胺、尸胺、腐胺和精胺等，此类物质具有挥发性，含量越高，表明鱼肉腐败程度越严重，新鲜度越差。因此，挥发性胺类物质的含量是反映鱼肉新鲜度的重要指标，可通过对其监测来评价鱼肉新鲜度。
近年来，荧光探针分析法以其操作简单、响应快速、灵敏度高、选择性好、可实时无损监测等显著优势，引起了广泛的关注，但用于监测鱼肉新鲜度的荧光探针还鲜有报道。文献Zhu,B.,et al.Dyes and Pigments,2021,186:108963中公开了基于香豆素衍生物开发了一种识别二胺的荧光探针，该探针只能识别二胺，而对鱼肉腐败释放的其它胺类无法识别，并且制备的试纸条监测鱼肉新鲜度时，需要将鱼肉和试纸条一起浸泡在水中，无法做到无损监测。因此，有必要发展快速高效、可实时无损监测鱼肉新鲜度的新方法，这对于提高水产品新鲜度评价效率、提升品质监管水平以及保证食品质量安全具有重要的现实意义。
发明内容
针对现有技术中的技术问题，本发明的目的在于提供一种无损监测鱼肉新鲜度的荧光探针及其制备方法与应用，以具有激发态分子内质子转移(ESIPT)性质的2-(2-羟基苯基)苯并噻唑(HBT)为母体，苯甲酸酯基为特异性识别胺的反应基团，基于光诱导电子转移(PET)和ESIPT响应机理，设计合成了一系列荧光开启(OFF-ON)型探针，在纯水体系中可以识别多种胺类物质，识别胺后探针具有明显的荧光开启效果，响应速度快至2min，检测限低至19.9nM，斯托克斯(Stokes)位移为135nm，并可用于活细胞内识别胺后荧光成像。该探针具有合成路线简单、响应快速、检测限低、特异性识别、荧光开启等优点。负载荧光探针的凝胶指示标签制备过程简便，对多种挥发性胺具有良好的响应，识别后达到荧光开启效果。将凝胶指示标签置于鱼肉包装的顶空环境中，无需复杂的前处理及破坏样品，便可以实时无损监测鱼肉新鲜度。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种无损监测鱼肉新鲜度的荧光探针，结构式为：其中R1基团为氢、氟或硝基，R2基团为氢、氟或硝基，R3基团为氢、氟或硝基。
在上述技术方案基础上，结构式为以下的一种：
探针1：探针2：/>探针3：探针4：/>探针5：
本发明中的荧光探针以具有ESIPT性质的HBT荧光团为母体，该类荧光团分子结构中拥有氢键受体和供体，容易形成分子内氢键，光激发后，在激发态会发生从氢键供体到受体的质子转移，产生互变异构体，形成新的氢键，表现出大的Stokes位移。氢键供体被强吸电子基团即F、NO2保护后，由于PET效应，会导致荧光猝灭；识别底物后，保护基团离去，从而发出荧光。基于苯甲酸酯基易与胺类物质发生氨解反应，选择苯甲酸酯基作为特异性反应活性基团，其中，苯甲酸酯基中羰基碳的正电性对反应活性有很大影响，与羰基相连基团的吸电子能力越强，羰基碳的正电性就越强，反应活性也会越高，从而提高反应速率。这种基于氢键供体“保护-去保护”策略，将PET与ESIPT机理结合所设计的荧光开启(OFF-ON)型探针，可以最大限度地减少自吸收，避免自猝灭和自荧光引起的测量误差，表现出明显的荧光变化和大的Stokes位移，比其它类型的荧光探针表现出更优异的性能。
具体的，本发明中的荧光探针利用具有强吸电子性质的硝基和氟，将探针的荧光猝灭，探针在识别胺类物质后，苯甲酸酯基与胺发生氨解反应，酯键断开，保护基团脱除，释放出羟基，生成具有ESIPT性质的HBT，从而发出蓝色荧光，达到“OFF-ON”的识别效果。
第二方面，本发明提供了一种无损监测鱼肉新鲜度的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：将2-(2-羟基苯基)苯并噻唑、取代苯甲酸和4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于干二氯甲烷中，在0℃下搅拌均匀；然后将N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)的二氯甲烷溶液滴加至上述溶液中，室温下搅拌16h；反应结束后，过滤除去沉淀，收集滤液并旋蒸，粗产物经柱层析纯化得到最终产物；根据选择的取代苯甲酸的不同，得到结构式不同的荧光探针。优选的，在上述技术方案基础上，所述柱层析纯化时所用溶剂为乙酸乙酯与石油醚且体积比为1:20。
在上述技术方案基础上，所述取代苯甲酸为4-硝基-2-氟苯甲酸、2-硝基-4-氟苯甲酸、5-硝基-2-氟苯甲酸、2-硝基-5-氟苯甲酸、2,4-二硝基苯甲酸中的一种。
在上述技术方案基础上，所述2-(2-羟基苯基)苯并噻唑、取代苯甲酸和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:1.2:0.1；所述2-(2-羟基苯基)苯并噻唑与N,N-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1.5。
第三方面，本发明提供了一种凝胶指示标签的制备方法，包括以下步骤：将所述荧光探针溶于二甲亚砜中，然后与加热的琼脂溶液混合均匀，并快速转移至培养皿中，冷却凝固后，得到负载荧光探针的凝胶指示标签。
第四方面，本发明提供了一种无损监测鱼肉新鲜度的荧光探针在溶液体系中检测胺类物质的应用。在上述技术方案基础上，所述荧光探针应用于活细胞中胺类物质的荧光成像；所述荧光探针细胞毒性小，可以快速渗透到细胞膜内对细胞内的胺类进行检测并荧光成像。
本发明提供了一种负载荧光探针的凝胶指示标签在挥发性胺检测中的应用。在上述技术方案基础上，所述负载荧光探针的凝胶指示标签应用于无损监测鱼肉新鲜度，将负载荧光探针的凝胶指示标签放置于鱼肉包装的顶空环境中，随着鱼肉腐败程度的增加，凝胶指示标签的荧光开启，发出蓝色荧光。优选的，所述负载荧光探针的凝胶指示标签在大黄鱼腐败以及三文鱼腐败监测中的应用。随着鱼肉腐败程度的增加，所述负载荧光探针的凝胶指示标签的荧光逐渐从无色变为蓝色，用于鱼肉新鲜度监测。具体的，在4℃(冷藏)和25℃(室温)密闭条件下，随着鱼肉腐败程度增加，在紫外灯照射下，负载荧光探针的凝胶指示标签的荧光逐渐从无色变为蓝色；指示标签无荧光时表明鱼肉为新鲜品，指示标签为蓝色弱荧光时表明鱼肉为合格品，指示标签为蓝色强荧光时表明鱼肉为不合格品。
本发明提供的技术方案产生的有益效果在于：
1.本发明中荧光探针合成简便，结构简单；采用具有ESIPT性质的HBT荧光团为母体，基于苯甲酸酯基的氨解反应，选择苯甲酸酯基作为荧光探针识别胺类物质的活性作用基团，利用氟与硝基作为荧光猝灭基团，基于PET与ESIPT响应机理，设计合成了多种取代基不同的荧光开启(OFF-ON)型探针，可以识别多种胺类物质，应用范围广泛，识别胺后探针具有明显的荧光开启效果，响应速度快至2min，检测限低至19.9nM，Stokes位移为135nm。在水溶液中随着胺浓度的增加，在460nm处蓝色荧光逐渐增强。荧光探针毒性小，可用于活细胞中识别胺后荧光成像。
2.本发明中负载荧光探针的凝胶指示标签制备简单便捷；所述凝胶指示标签置于胺溶液上方熏蒸时，荧光颜色由无色变为蓝色；将凝胶指示标签置于鱼肉包装的顶空环境中，尤其是大黄鱼以及三文鱼，随着鱼肉腐败程度的增加，标签荧光开启，先由无色变为蓝色弱荧光，最后发出蓝色强荧光，可以实时无损监测鱼肉新鲜度。
附图说明
图1是本发明荧光探针1的1H NMR谱图；
图2是本发明荧光探针1的13C NMR谱图；
图3是本发明荧光探针1的高分辨质谱图；
图4是本发明荧光探针2的1H NMR谱图；
图5是本发明荧光探针2的13C NMR谱图；
图6是本发明荧光探针2的高分辨质谱图；
图7是本发明荧光探针3的1H NMR谱图；
图8是本发明荧光探针3的13C NMR谱图；
图9是本发明荧光探针3的高分辨质谱图；
图10是本发明荧光探针4的1H NMR谱图；
图11是本发明荧光探针4的13C NMR谱图；
图12是本发明荧光探针4的高分辨质谱图；
图13是本发明荧光探针5的1H NMR谱图；
图14是本发明荧光探针5的13C NMR谱图；
图15是本发明荧光探针5的高分辨质谱图；
图16是本发明荧光探针1与尸胺反应后纯化得到的产物HBT的1H NMR谱图；
图17是本发明荧光探针1与尸胺的反应液的高分辨质谱图；
图18是本发明荧光探针1与反应产物HBT的前线分子轨道图；
图19是本发明荧光探针1和荧光探针2与尸胺反应前后紫外吸收谱图；
图20是本发明荧光探针1与不同胺作用前后的荧光谱图和紫外灯照射下的照片；
图21是本发明荧光探针2与不同胺作用前后的荧光谱图和紫外灯照射下的照片；
图22(a)是本发明荧光探针1与不同浓度的尸胺作用前后的荧光发射光谱变化图，(b)是本发明荧光探针2与不同浓度的尸胺作用前后的荧光发射光谱变化图；
图23(a)是本发明荧光探针1识别尸胺的检测限图，(b)是本发明荧光探针2识别尸胺的检测限图；
图24(a)是本发明荧光探针1和荧光探针2加入尸胺后荧光强度随时间变化的响应图，(b)是本发明荧光探针1和荧光探针2加入尸胺前后在不同pH下的荧光强度变化图；
图25是负载本发明荧光探针1的琼脂糖凝胶指示标签在5种不同浓度的胺熏蒸后的荧光颜色变化图；
图26(a)是大黄鱼鱼肉在4℃下的TVB-N值，pH随贮藏时间的变化图，(b)是大黄鱼鱼肉在4℃下的硫代巴比妥酸值(TBA)和菌落总数(TVC)随贮藏时间的变化图；
图27是大黄鱼鱼肉在4℃下随着贮藏时间的延长，鱼肉的TVB-N含量与对应的负载本发明荧光探针1的凝胶指示标签在紫外光照射下的颜色照片；
图28是在4℃下随着贮藏时间的延长，大黄鱼鱼肉的TVB-N含量与对应的负载本发明荧光探针1的凝胶指示标签在紫外光照射下的颜色之间的关系柱状图；
图29是大黄鱼鱼肉在25℃下的TVB-N值和pH随贮藏时间的变化图；
图30是大黄鱼鱼肉在25℃下随着贮藏时间的延长，鱼肉的TVB-N含量与对应的负载本发明荧光探针1的凝胶指示标签在紫外光照射下的颜色照片；
图31是在25℃下随着贮藏时间的延长，大黄鱼鱼肉的TVB-N含量与对应的负载本发明荧光探针1的凝胶指示标签在紫外光照射下的颜色之间的关系柱状图；
图32是三文鱼鱼肉在4℃下的TVB-N值和pH随贮藏时间的变化图；
图33是三文鱼鱼肉在4℃下随着贮藏时间的延长，鱼肉的TVB-N含量与对应的负载本发明荧光探针1的凝胶指示标签在紫外光照射下的颜色照片；
图34(a)是本发明不同浓度的荧光探针1在MCF-7细胞中孵育24h后的细胞活力变化图，(b)是本发明不同浓度的荧光探针1在MCF-7细胞中对不同浓度的尸胺的荧光成像图；
图35是本发明荧光探针3和荧光探针4与尸胺反应前后紫外吸收谱图；
图36是本发明荧光探针3与不同胺作用前后的荧光谱图和紫外灯照射下的照片；
图37是本发明荧光探针4与不同胺作用前后的荧光谱图和紫外灯照射下的照片；
图38(a)是本发明荧光探针3与不同浓度的尸胺作用前后的荧光发射光谱变化图，(b)是本发明荧光探针4与不同浓度的尸胺作用前后的荧光发射光谱变化图；
图39(a)是本发明荧光探针3识别尸胺的检测限图，(b)是本发明荧光探针4识别尸胺的检测限图；
图40(a)是本发明荧光探针3和荧光探针4加入尸胺后荧光强度随时间变化的响应图，(b)是本发明荧光探针3和荧光探针4加入尸胺前后在不同pH下的荧光强度变化图；
图41是负载本发明荧光探针3的琼脂糖凝胶指示标签在不同种类的胺以及4种不同浓度的胺熏蒸后的荧光颜色变化图；
图42(a)是大黄鱼鱼肉在4℃下的TVB-N值，pH随贮藏时间的变化图，(b)是大黄鱼鱼肉在4℃下的硫代巴比妥酸值(TBA)和菌落总数(TVC)随贮藏时间的变化图；
图43是大黄鱼鱼肉在4℃下随着贮藏时间的延长，鱼肉的TVB-N含量与对应的负载本发明荧光探针3的凝胶指示标签在紫外光照射下的颜色照片；
图44是在4℃下随着贮藏时间的延长，大黄鱼鱼肉的TVB-N含量与对应的负载本发明荧光探针3的凝胶指示标签在紫外光照射下的颜色之间的关系柱状图；
图45是大黄鱼鱼肉在25℃下随着贮藏时间的延长，鱼肉的TVB-N含量与对应的负载本发明荧光探针3的凝胶指示标签在紫外光照射下的颜色照片；
图46是在25℃下随着贮藏时间的延长，大黄鱼鱼肉的TVB-N含量与对应的负载本发明荧光探针3的凝胶指示标签在紫外光照射下的颜色之间的关系柱状图；
图47(a)是本发明不同浓度的荧光探针3在MCF-7细胞中孵育24h后的细胞活力变化图，(b)是本发明不同浓度的荧光探针3在MCF-7细胞中对不同浓度的尸胺的荧光成像图；
图48是本发明荧光探针5与尸胺反应前后紫外吸收谱图；
图49是本发明荧光探针5与不同胺作用前后的荧光谱图和紫外灯照射下的照片；
图50(a)是本发明荧光探针5与不同浓度的尸胺作用前后的荧光发射光谱变化图，(b)是本发明荧光探针5识别尸胺的检测限图；
图51(a)是本发明荧光探针5加入尸胺后荧光强度随时间变化的响应图，(b)是本发明荧光探针5加入尸胺前后在不同pH下的荧光强度变化图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的内容，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。需要理解的是，如无特别说明，本发明中的各种原料均可以通过市售得到。
实施例1
本实施例提供了一种无损监测鱼肉新鲜度的荧光探针，结构式为
本实施例中上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
将2-(2-羟基苯基)苯并噻唑1mmol、取代基的苯甲酸1.2mmol以及4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.1mmol溶解于20mL二氯甲烷中，0℃下搅拌均匀；然后将N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)的二氯甲烷溶液滴加至上述溶液中，室温下搅拌16h；反应结束后，过滤除去沉淀，收集滤液并旋蒸，粗产物经柱层析即乙酸乙酯/石油醚(v/v)为1:20进行纯化，得到最终产物即荧光探针1。
本实施例中的取代苯甲酸为4-硝基-2-氟苯甲酸，制备得到荧光探针1，具体的合成路线如下所示：
所述荧光探针1的1H NMR谱图如图1所示；具体的结构表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.51(s,1H),8.40(s,1H),8.29(d,J＝27.2Hz,2H),8.10(s,1H),7.74(d,J＝9.9Hz,2H),7.61(d,J＝9.9Hz,2H),7.47(d,J＝20.4Hz,2H)。
所述荧光探针1的13C NMR谱图如图2所示；具体的结构表征数据为：13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ162.74,162.65,161.23,161.18,160.12,153.10,151.82,151.72,147.71,134.77,134.45,132.85,130.80,128.04,127.24,126.30,125.75,124.79,123.69,123.60,123.24,122.63,120.19,120.15,113.78,113.51。
所述荧光探针1的高分辨质谱图如图3所示；具体的分子量表征数据为：HRMS forC20H11FN2O4SNa+[M+Na]+Calcd:417.0321，Found:417.0316。
实施例2
本实施例提供了一种无损监测鱼肉新鲜度的荧光探针，结构式为
本实施例中荧光探针的制备方法与实施例1不同的是，所述取代苯甲酸采用2-硝基-4-氟苯甲酸，制备得到荧光探针2。
所述荧光探针2的1H NMR谱图如图4所示；具体的结构表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.42(dd,J＝8.8,5.4Hz,1H),8.33-8.17(m,2H),8.14(d,J＝7.9Hz,1H),7.91(dd,J＝10.4,7.0Hz,2H),7.74(t,J＝7.7Hz,1H),7.53(ddt,J＝26.9,18.4,7.5Hz,4H)。
所述荧光探针2的13C NMR谱图如图5所示；具体的结构表征数据为：13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ165.52,162.74,153.16,147.32,135.05,132.91,131.03,128.42,128.32,128.22,127.26,126.31,125.88,123.92,123.12,122.77,121.00,120.77,118.35,118.08。
所述荧光探针2的高分辨质谱图如图6所示；具体的分子量表征数据为：HRMS forC20H12FN2O4S+[M+H]+Calcd:395.0496，Found:395.0731。
实施例3
本实施例提供了一种无损监测鱼肉新鲜度的荧光探针，结构式为
本实施例中荧光探针的制备方法与实施例1不同的是，所述取代苯甲酸采用5-硝基-2-氟苯甲酸，制备得到荧光探针3。
所述荧光探针3的1H NMR谱图如图7所示；具体的结构表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.99(dt,J＝5.5,2.5Hz,1H),8.69(dt,J＝8.0,3.7Hz,1H),8.26(d,J＝7.8Hz,1H),8.12(d,J＝7.8Hz,1H),7.81(t,J＝9.6Hz,1H),7.73(t,J＝8.0Hz,2H),7.66-7.57(m,2H),7.51-7.42(m,2H)。
所述荧光探针3的13C NMR谱图如图8所示；具体的结构表征数据为：13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ166.39,162.83,153.17,147.68,144.33,134.77,132.84,131.73,131.61,130.86,128.47,128.07,127.24,126.31,125.76,124.85,123.17,122.66,119.91,119.67。
所述荧光探针3的高分辨质谱图如图9所示；具体的分子量表征数据为：HRMS forC20H12FN2O4S+[M+H]+Calcd:395.0496，Found:395.0750。
实施例4
本实施例提供了一种无损监测鱼肉新鲜度的荧光探针，结构式为
本实施例中荧光探针的制备方法与实施例1不同的是，所述取代苯甲酸采用2-硝基-5-氟苯甲酸，制备得到荧光探针4。
所述荧光探针4的1H NMR谱图如图10所示；具体的结构表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.39-8.30(m,1H),8.25(d,J＝7.8Hz,1H),8.14(dd,J＝12.6,7.9Hz,2H),7.96(d,J＝8.1Hz,1H),7.85(t,J＝8.5Hz,1H),7.75(d,J＝7.9Hz,1H),7.55(ddt,J＝31.3,15.4,7.7Hz,4H)。
所述荧光探针4的13C NMR谱图如图11所示；具体的结构表征数据为：13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ162.60,162.26,153.15,147.48,134.89,134.31,134.21,132.89,130.91,128.15,127.24,126.30,125.86,124.15,123.32,122.66,121.01,120.79,113.27,112.99。
所述荧光探针4的高分辨质谱图如图12所示；具体的分子量表征数据为：HRMS forC40H25F2N4O10S2 +[2M+2H2O-H]-Calcd:823.0986，Found:823.0932。
实施例5
本实施例提供了一种无损监测鱼肉新鲜度的荧光探针，结构式为
本实施例中荧光探针的制备方法与实施例1不同的是，所述连有不同取代基的苯甲酸采用2,4-二硝基苯甲酸，制备得到荧光探针5。
所述荧光探针5的1H NMR谱图如图13所示；具体的结构表征数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.95(d,J＝2.2Hz,1H),8.85(dd,J＝8.5,2.2Hz,1H),8.58(d,J＝8.5Hz,1H),8.23(dd,J＝7.8,1.6Hz,1H),8.14(dd,J＝7.9,0.7Hz,1H),8.02-7.96(m,1H),7.76(dd,J＝1.6,0.7Hz,1H),7.62(d,J＝1.3Hz,1H),7.58-7.51(m,2H),7.48(ddd,J＝8.3,7.2,1.3Hz,1H)。
所述荧光探针5的13C NMR谱图如图14所示；具体的结构表征数据为：13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ162.88,162.28,153.34,150.10,148.57,147.12,134.83,133.04,132.76,131.21,130.27,128.94,128.45,127.33,126.39,125.79,124.00,123.52,122.66,120.52。
所述荧光探针5的高分辨质谱图如图15所示；具体的分子量表征数据为：HRMS forC40H22N6O12S2Na+[2M+Na]+Calcd:865.0738，Found:865.0903。
实施例6
本实施例提供了荧光探针识别胺的反应机理，以荧光探针1为例，反应机理如下：
荧光探针1中的硝基和氟为强吸电子基，两者的协同吸电子作用使苯甲酸酯基中羰基碳的正电性增强，反应活性提高，苯甲酸酯基容易与尸胺发生氨解反应，酯键断开，4-硝基-2-氟苯甲酸基保护基团脱除，释放出羟基，生成产物HBT和N-(5-氨基戊基)-4-硝基-2-氟苯甲酰胺。为了确定反应机理，反应液通过柱层析纯化，得到荧光产物，通过核磁共振氢谱进行结构表征，如图16所示，确认荧光产物为HBT；此外，测试了探针加入尸胺后反应液的高分辨质谱，如图17所示，在m/z＝228.0487和m/z＝270.1252处出现新峰，是产物HBT[M+H]+(理论值为228.0478)和N-(5-氨基戊基)-4-硝基-2-氟苯甲酰胺[M+H]+(理论值为270.1248)相对应的峰；证实荧光探针1与尸胺发生了氨解反应，生成了具有ESIPT性质的HBT，从而发出蓝色荧光，达到“OFF-ON”的识别效果。
实施例7
本实施例提供了荧光探针识别胺的响应机理，以荧光探针1为例，响应机理如下：
如图18所示，采用密度泛函理论(DFT)和含时密度泛函理论(TD-DFT)计算方法，提供了荧光探针1和HBT的前线分子轨道图。对于荧光探针1，HOMO的分子轨道分布主要局域在2-(2-羟基苯基)苯并噻唑环上，LUMO的分子轨道分布主要局域在4-硝基-2-氟苯甲酸基团上，S1态为电荷转移态，光激发后，伴随着从4-硝基-2-氟苯甲酸基团到2-(2-羟基苯基)苯并噻唑环的完全电荷转移，PET过程同时发生，因此，探针1的荧光被猝灭。对于HBT，主要的跃迁S1→S0对应于LUMO→HOMO，分子轨道分布离域在HBT共轭体系上，这表明S1态是局域激发态，光激发电子可以通过辐射跃迁直接从LUMO回落至HOMO，从而发射出荧光。因此，可以根据荧光探针与胺反应后“关-开”的荧光信号变化，从而达到识别胺的目的。
实施例8
本实施例对荧光探针1与荧光探针2的光谱性质进行测试，具体如下：
1.紫外吸收光谱测试
称取纯化后的荧光探针1与荧光探针2，分别溶于二甲亚砜，配制成1mM的探针分子储备液，取上述溶液于纯水中稀释，配制成10μM的探针溶液，向溶液中加入尸胺，分别测试加胺前后的紫外吸收光谱。如图19所示，加入尸胺后紫外光谱发生明显变化，紫外吸收峰从325nm移至375nm。结果表明，在尸胺的作用下，荧光探针的酯基发生氨解反应，导致探针分子结构发生改变。
2.选择性测试
向10μM的荧光探针溶液中，分别加入50mM的尸胺、精胺、腐胺、二乙胺、二甲胺、三乙胺、苯乙胺、正丙胺、酪胺、氨水、三甲胺、异丙胺和肼，测试荧光探针的选择性。如图20和图21所示，荧光探针在纯水体系中无荧光，识别胺后荧光开启，在460nm处出现了荧光发射，荧光探针对大部分胺响应明显，加胺后荧光强度显著增强，发出蓝色荧光。结果表明，荧光探针在水溶液中，可以识别多种胺类物质，识别范围较广。
3.滴定实验
向10μM的荧光探针溶液中，分别加入0-750μM的尸胺，测试溶液的荧光强度与尸胺浓度之间的关系。如图22(a)和(b)所示，随着尸胺浓度的增加，460nm处的荧光强度逐渐增强，当加入750μM的尸胺时，荧光强度不再变化，说明此时达到了饱和。
4.检测限测试
将荧光强度与尸胺的浓度进行线性拟合，发现荧光强度与尸胺浓度呈良好的线性关系(R2>0.99)。如图23(a)和(b)所示，根据方程LOD＝3S/K(其中S是空白溶液的标准偏差，K是标准曲线的斜率)，计算出荧光探针1和荧光探针2对尸胺的检测限分别为24.4nM和739.2nM，表明荧光探针的检测限低，具有较高的灵敏度，在实际应用中具有重要的价值。
5.响应时间测试
测试荧光探针水溶液的荧光强度随时间的变化，结果如图24(a)所示，当加入750μM的尸胺后，探针荧光强度随着时间的延长逐渐增强，荧光探针1和荧光探针2分别在4min和55min后荧光强度达到最大值且保持平稳，表明荧光探针对尸胺响应快速。
6.pH测试
为了证实荧光探针的实用性，考察了不同pH的影响。如图24(b)所示，在pH为2-9时，探针几乎没有荧光，说明探针在酸性、中性及弱碱性条件下具有良好的稳定性。当加入750μM的尸胺后，在pH为4-9时，荧光强度在460nm处显著增强，表明探针具有较宽的pH适用范围。
实施例9
由实施例8可知，荧光探针1的识别效果优于荧光探针2，因此，本实施例中选取荧光探针1作为应用测试的荧光探针，具体分析如下：
1.在可视化无损监测鱼肉新鲜度中的应用
将5.9mg荧光探针1溶于0.5mL二甲亚砜中，加入到15mL加热的2％的琼脂糖溶液中，两者混合均匀并快速转移至培养皿中，冷却凝固后，得到负载荧光探针1的琼脂糖凝胶指示标签，将其分割成直径1cm的凝胶指示标签，用于可视化无损监测鱼肉新鲜度。
(1)选取部分胺类物质，具体为二甲胺、氨水、三甲胺、三乙胺、尸胺；用蒸馏水稀释至1mM、5mM、10mM、15mM和20mM，取1mL胺溶液至5mL的离心管中，将上述琼脂糖凝胶指示标签放于离心管的盖内，一个小时后，观察凝胶指示标签在365nm紫外灯照射下的荧光变化。如图25所示，由于尸胺的挥发性较弱，因此荧光变化不明显，其它四种挥发性胺均能使凝胶指示标签荧光开启，并且随着胺浓度的增加，荧光逐渐增强。
(2)在90mm培养皿中放入新鲜的大黄鱼鱼肉和琼脂糖凝胶指示标签，将其密封并保证两者不接触，分别于4℃和25℃储存。根据中国食品安全国家标准GB 2733-2015和GB/T18108-2019，鲜海水鱼的TVB-N值≤15mg/100g时为优级品，15-30mg/100g时为合格品，＞30mg/100g时为腐败品。
在4℃贮藏条件下，每天记录凝胶指示标签的荧光变化，并测定TVB-N、pH、硫代巴比妥酸值(TBA)和菌落总数(TVC)等新鲜度指标，以验证凝胶指示标签的准确性。如图26(a)和(b)所示，随着贮藏时间的延长，四种新鲜度指标均呈现上升趋势。如图27和图28所示，通过凝胶指示标签的荧光变化与相应TVB-N值的对比，发现第5天TVB-N值为14.65mg/100g，此时为一级新鲜度，凝胶指示标签无荧光；第10天TVB-N值为24.36mg/100g，为二级新鲜度，凝胶指示标签呈现蓝色弱荧光；第11天TVB-N值达到34.53mg/100g，此时大黄鱼已经腐败，凝胶指示标签发出蓝色强荧光。
在25℃贮藏条件下，每隔2个小时记录凝胶指示标签的荧光变化，同时测定TVB-N和pH等新鲜度指标，以验证凝胶指示标签的准确性。如图29所示，随着贮藏时间的延长，两种新鲜度指标均呈现上升趋势。如图30和图31所示，通过凝胶指示标签的荧光变化与相应TVB-N值的对比，发现贮藏16h时TVB-N值为12.56mg/100g，此时为一级新鲜度，凝胶指示标签无荧光；22h时TVB-N值为26.32mg/100g，为二级新鲜度，凝胶指示标签呈现蓝色弱荧光；24h时TVB-N值达到35.00mg/100g，此时大黄鱼已经腐败，凝胶指示标签发出蓝色强荧光。
(3)在90mm培养皿中放入新鲜的三文鱼鱼肉和琼脂糖凝胶指示标签，将其密封并保证两者不接触，放置于4℃条件下储存。记录凝胶指示标签的荧光变化，并测定TVB-N和pH等新鲜度指标，以验证凝胶指示标签的准确性。如图32所示，随着贮藏时间的延长，两种新鲜度指标均呈现上升趋势。如图33所示，通过凝胶指示标签的荧光变化与相应TVB-N值的对比，发现第1天TVB-N值为13.90mg/100g，此时为一级新鲜度，凝胶指示标签无荧光；第6天TVB-N值为28.62mg/100g，为二级新鲜度，凝胶指示标签呈现蓝色弱荧光；第7天TVB-N值达到51.79mg/100g，此时三文鱼已经腐败，凝胶指示标签发出蓝色强荧光。
2.在活细胞中检测胺类物质的荧光成像
为了考察荧光探针1在生物学方面的潜在应用，使用CCK-8试剂盒在MCF-7细胞中对荧光探针1进行了细胞毒性测试。如图34(a)所示，当荧光探针1的浓度在0-50μM时，细胞在24小时的存活率接近80％，表明荧光探针1对活细胞的毒性较小，并且具有良好的生物相容性。
将MCF-7细胞与10μM的荧光探针1在37℃下孵育30min，如图34(b)所示，可以看到在暗场中几乎无荧光。然后用PBS缓冲液洗涤3次，加入不同浓度的尸胺(10、100、500和1000μM)并孵育30min，随着尸胺浓度的增加，绿色通道中荧光逐渐增强，表明荧光探针1可以渗透细胞膜，能够对活细胞中的胺类物质进行荧光成像。同时，从明场中可以观察到，细胞形态完整且没有发生明显变化，这也说明荧光探针1对活细胞的毒性低，在生物系统中也具有潜在的应用价值。
实施例10
本实施例对荧光探针3与荧光探针4的光谱性质进行测试，具体如下：
1.紫外吸收光谱测试
称取纯化后的荧光探针3与荧光探针4，分别溶于二甲亚砜，配制成1mM的探针分子储备液，取上述溶液于纯水中稀释，配制成10μM的探针溶液，向溶液中加入尸胺，分别测试加胺前后的紫外吸收光谱。如图35所示，加入尸胺后紫外光谱发生明显变化，紫外吸收峰从290/340nm移至375nm。结果表明，在尸胺的作用下，荧光探针的酯基发生氨解反应，导致探针分子结构发生改变。
2.选择性测试
向10μM的荧光探针溶液中，分别加入50mM的尸胺、精胺、腐胺、二乙胺、二甲胺、三乙胺、苯乙胺、正丙胺、酪胺、氨水、三甲胺、异丙胺和肼，测试荧光探针的选择性。如图36和图37所示，荧光探针在纯水体系中无荧光，识别胺后荧光开启，在460nm处出现了荧光发射，荧光探针对大部分胺响应明显，加胺后荧光强度显著增强，发出蓝色荧光。结果表明，荧光探针在水溶液中，可以识别多种胺类物质，识别范围较广。
3.滴定实验
向10μM的荧光探针溶液中，分别加入0-750μM的尸胺，测试溶液的荧光强度与尸胺浓度之间的关系。如图38(a)和(b)所示，随着尸胺浓度的增加，460nm处的荧光强度逐渐增强，当加入750μM的尸胺时，荧光强度不再变化，说明此时达到了饱和。
4.检测限测试
将荧光强度与尸胺的浓度进行线性拟合，发现荧光强度与尸胺浓度呈良好的线性关系(R2>0.99)。如图39(a)和(b)所示，根据方程LOD＝3S/K(其中S是空白溶液的标准偏差，K是标准曲线的斜率)，计算出荧光探针3和荧光探针4对尸胺的检测限分别为30.8nM和518.2nM，表明荧光探针的检测限低，具有较高的灵敏度，在实际应用中具有重要的价值。
5.响应时间测试
测试荧光探针水溶液的荧光强度随时间的变化，结果如图40(a)所示，当加入750μM的尸胺后，探针荧光强度随着时间的延长逐渐增强，荧光探针3和荧光探针4分别在3min和60min后荧光强度达到最大值且保持平稳，表明荧光探针对尸胺响应快速。
6.pH测试
为了证实荧光探针的实用性，考察了不同pH的影响。如图40(b)所示，在pH为2-9时，探针几乎没有荧光，说明探针在酸性、中性及弱碱性条件下具有良好的稳定性。当加入750μM的尸胺后，在pH为4-9时，荧光强度在460nm处显著增强，表明探针具有较宽的pH适用范围。
实施例11
由实施例10可知，荧光探针3的识别效果优于荧光探针4，因此，本实施例中选取荧光探针3作为应用测试的荧光探针，具体分析如下：
1.在无损监测鱼肉新鲜度中的应用
将5.9mg荧光探针1溶于0.5mL二甲亚砜中，加入到15mL加热的2％的琼脂糖溶液中，两者混合均匀并快速转移至培养皿中，冷却凝固后，得到负载荧光探针3的琼脂糖凝胶指示标签，将其分割成直径1cm的凝胶指示标签，用于无损监测鱼肉新鲜度。
(1)将负载荧光探针3的凝胶指示标签分别暴露于各种胺的水溶液(50mM)产生的蒸汽中，如图41所示，凝胶指示标签对二甲胺、二乙胺、三甲胺和三乙胺等挥发性胺类具有较好响应，荧光明显增强。选取部分胺类物质，具体为二甲胺、二乙胺、三甲胺和三乙胺；用蒸馏水稀释至1mM、5mM、10mM和20mM，取1mL胺溶液至5mL的离心管中，将上述琼脂糖凝胶指示标签放于离心管的盖内，一个小时后，观察凝胶指示标签在365nm紫外灯照射下的荧光变化。结果显示，四种挥发性胺均能使凝胶指示标签荧光开启，并且随着胺浓度的增加，荧光逐渐增强。
(2)在90mm培养皿中放入新鲜的大黄鱼鱼肉和琼脂糖凝胶指示标签，将其密封并保证两者不接触，分别于4℃和25℃储存。根据中国食品安全国家标准GB 2733-2015和GB/T18108-2019，鲜海水鱼的TVB-N值≤15mg/100g时为优级品，15-30mg/100g时为合格品，＞30mg/100g时为腐败品。
在4℃贮藏条件下，每天记录凝胶指示标签的荧光变化，并测定TVB-N、pH、硫代巴比妥酸值(TBA)和菌落总数(TVC)等新鲜度指标，以验证凝胶指示标签的准确性。如图42(a)和(b)所示，随着贮藏时间的延长，四种新鲜度指标均呈现上升趋势。如图43和图44所示，通过凝胶指示标签的荧光变化与相应TVB-N值的对比，发现鱼肉的初始TVB-N值为6.65mg/100g，此时为一级新鲜度，凝胶指示标签无荧光；第3天TVB-N值为15.03mg/100g，为二级新鲜度，凝胶指示标签呈现蓝色弱荧光；第5天TVB-N值达到41.99mg/100g，此时大黄鱼已经腐败，凝胶指示标签发出蓝色强荧光。
在25℃贮藏条件下，每隔2个小时记录凝胶指示标签的荧光变化，同时测定TVB-N和pH等新鲜度指标，以验证凝胶指示标签的准确性。如图29所示，随着贮藏时间的延长，两种新鲜度指标均呈现上升趋势。如图45和图46所示，通过凝胶指示标签的荧光变化与相应TVB-N值的对比，发现鱼肉的初始TVB-N值为7.56mg/100g，此时为一级新鲜度，凝胶指示标签无荧光；18h时TVB-N值为15.85mg/100g，为二级新鲜度，凝胶指示标签呈现蓝色弱荧光；24h时TVB-N值达到35.00mg/100g，此时大黄鱼已经腐败，凝胶指示标签发出蓝色强荧光。
2.在活细胞中检测胺类物质的荧光成像
为了考察荧光探针3在生物学方面的潜在应用，使用CCK-8试剂盒在MCF-7细胞中对荧光探针3进行了细胞毒性测试。如图47(a)所示，当荧光探针3的浓度在0-50μM时，细胞在24小时的存活率约70％，表明荧光探针3对活细胞的毒性较小，并且具有良好的生物相容性。
将MCF-7细胞与10μM的荧光探针3在37℃下孵育30min，如图47(b)所示，可以看到在暗场中几乎无荧光。然后用PBS缓冲液洗涤3次，加入不同浓度的尸胺(10、100、500和750μM)并孵育30min，随着尸胺浓度的增加，绿色通道中荧光逐渐增强，表明荧光探针3可以渗透细胞膜，能够对活细胞中的胺类物质进行荧光成像。同时，从明场中可以观察到，细胞形态完整且没有发生明显变化，这也说明荧光探针3对活细胞的毒性低，在生物系统中具有潜在的应用价值。
实施例12
本实施例中对荧光探针5的光谱性质进行测试，具体如下：
1.紫外吸收光谱测试
称取纯化后的荧光探针5，溶于二甲亚砜，配制成1mM的探针分子储备液，取上述溶液于纯水中稀释，配制成10μM的探针溶液，向溶液中加入尸胺，测试加胺前后的紫外吸收光谱。如图48所示，加入尸胺后紫外光谱发生明显变化，出现两个新的紫外吸收峰335nm和377nm。结果表明，在尸胺的作用下，荧光探针的酯基发生氨解反应，导致探针分子结构发生改变。
2.选择性测试
向10μM的荧光探针溶液中，分别加入50mM的尸胺、精胺、腐胺、二乙胺、二甲胺、三乙胺、苯乙胺、正丙胺、酪胺、氨水、三甲胺、异丙胺和肼，测试荧光探针的选择性。如图49所示，荧光探针在纯水体系中无荧光，识别胺后荧光开启，在460nm处出现了荧光发射，荧光探针对大部分胺响应明显，加胺后荧光强度显著增强，发出蓝色荧光。结果表明，荧光探针在水溶液中，可以识别多种胺类物质，识别范围较广。
3.滴定实验
向10μM的荧光探针溶液中，分别加入0-700μM的尸胺，测试溶液的荧光强度与尸胺浓度之间的关系。如图50(a)所示，随着尸胺浓度的增加，460nm处的荧光强度逐渐增强，当加入700μM的尸胺时，荧光强度不再变化，说明此时达到了饱和。
4.检测限测试
将荧光强度与尸胺的浓度进行线性拟合，发现荧光强度与尸胺浓度呈良好的线性关系(R2>0.99)。如图50(b)所示，根据方程LOD＝3S/K(其中S是空白溶液的标准偏差，K是标准曲线的斜率)，计算出荧光探针5对尸胺的检测限为19.9nM，表明荧光探针的检测限低，具有较高的灵敏度，有一定的实际应用价值。
5.响应时间测试
测试荧光探针水溶液的荧光强度随时间的变化，结果如图51(a)所示，当加入700μM的尸胺后，探针荧光强度随着时间的延长逐渐增强，荧光探针5在2min后荧光强度达到最大值且保持平稳，表明荧光探针对尸胺响应快速。
6.pH测试
为了证实荧光探针的实用性，考察了不同pH的影响。如图51(b)所示，在pH为2-10时，探针几乎没有荧光，说明探针在酸性、中性及弱碱性条件下具有良好的稳定性。当加入700μM的尸胺后，在pH为4-10时，荧光强度在460nm处显著增强，表明探针具有较宽的pH适用范围。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (9)
1.一种无损监测鱼肉新鲜度的荧光探针，其特征在于，结构式为以下的一种：
探针1：，探针2：/>，
探针3：，探针4：/>，
探针5：。
2.一种根据权利要求1所述的无损监测鱼肉新鲜度的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将2-(2-羟基苯基)苯并噻唑、取代苯甲酸和4-二甲氨基吡啶溶于干二氯甲烷中，在0℃下搅拌均匀；然后将N,N-二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液滴加至上述溶液中，室温下搅拌16 h；反应结束后，过滤除去沉淀，收集滤液并旋蒸，粗产物经柱层析纯化得到最终产物；根据取代苯甲酸的不同，得到结构式不同的荧光探针。
3.根据权利要求2所述的一种无损监测鱼肉新鲜度的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述取代苯甲酸为4-硝基-2-氟苯甲酸、2-硝基-4-氟苯甲酸、5-硝基-2-氟苯甲酸、2-硝基-5-氟苯甲酸、2,4-二硝基苯甲酸中的一种。
4.根据权利要求2所述的一种无损监测鱼肉新鲜度的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述2-(2-羟基苯基)苯并噻唑、取代苯甲酸和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:1.2:0.1；所述2-(2-羟基苯基)苯并噻唑与N,N-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1.5。
5.一种凝胶指示标签的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1中所述的荧光探针溶于二甲亚砜中，然后与加热的琼脂糖溶液混合均匀，并快速转移至培养皿中，冷却凝固后，得到负载荧光探针的凝胶指示标签。
6.一种无损监测鱼肉新鲜度的荧光探针非疾病诊断及治疗目的的应用，其特征在于，根据权利要求1所述的荧光探针应用于溶液体系中检测胺类物质。
7.根据权利要求6中所述的一种无损监测鱼肉新鲜度的荧光探针的应用，其特征在于，所述荧光探针应用于活细胞中胺类物质的荧光成像。
8.一种无损监测鱼肉新鲜度的荧光探针的应用，其特征在于，根据权利要求5制备得到的负载荧光探针的凝胶指示标签应用于挥发性胺的检测。
9.根据权利要求8所述的一种无损监测鱼肉新鲜度的荧光探针的应用，其特征在于，所述负载荧光探针的凝胶指示标签应用于无损监测鱼肉新鲜度，将负载荧光探针的凝胶指示标签放置于鱼肉包装的顶空环境中，随着鱼肉腐败程度的增加，凝胶指示标签的荧光开启，发出蓝色荧光。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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