CN115926788B - 一种检测Fe2+和Fe3+碳点的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测Fe²⁺和Fe³⁺的碳点及制备方法和应用，属于发光碳纳米材料制备技术领域。本发明通过5‑氨基邻二氮菲和水杨酸溶剂热合成了碳点。当该碳点浓度为0.1mg/mL时，其荧光强度随Fe²⁺浓度增大而增强，为增强型，随Fe²⁺浓度增大而减弱，为猝灭型，在0‑50μM内均呈现良好的线性关系；而该碳点溶液的颜色的变化亦能区分Fe²⁺和Fe³⁺。同时，碳点可检测混合铁溶液和细胞中Fe²⁺和Fe³⁺的浓度变化。因此，该探针提供了一种同时检测Fe²⁺和Fe³⁺浓度动态变化的有效方法，具有良好的应用前景。

Description

一种检测Fe2+和Fe3+碳点的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种双模式碳点及制备方法和在Fe²⁺和Fe³⁺同时检测中的应用，属于荧光碳纳米材料制备技术领域。

背景技术

铁是地壳中第二丰富的金属元素，在各种生物和环境系统中发挥着重要作用。在生理学上，Fe²⁺和Fe³⁺作为氧化还原对在人类和生物有机体中发挥着重要作用。在Fenton反应中，Fe²⁺与过氧化氢相互作用生成活性氧(ROS)时，Fe2⁺会转化为Fe³⁺。当Fe2⁺浓度过量时，ROS会不断积累，会对细胞造成氧化损伤，导致一系列疾病的发生。为了诊断这种情况，开发探针检测饮用水和细胞系统中的Fe²⁺的浓度甚至同时监测Fe²⁺和Fe³⁺浓度的动态变化具有重要意义。目前，研究人员开发了一系列Fe²⁺或Fe³⁺的检测方法，如循环伏安法、原子吸收光谱法、电感耦合等离子光谱法等。这些技术需要复杂的样品制备过程和昂贵仪器的使用，不适合实时监测，而在荧光检测方法中，以荧光强度的增强或猝灭作为输出信号来指示铁离子的动态变化，不仅简单方便，响应快速，而且灵敏度高，选择性好，易于实时监测。有机小分子、金属有机骨架(MOF)、量子点等材料已被用于检测Fe²⁺或Fe³⁺浓度，但实际应用中面临一些问题亟需解决。例如，Phen Green SK和Calcein是目前应用最广泛的荧光探针，但前者选择性不高，对其它金属离子也能响应，无法表达铁的动态变化；而后者只能特异性识别Fe³⁺却不能适用于Fe²⁺的检测，且无法识别因Fe²⁺和Fe³⁺浓度的动态变化而引起的总铁变化。

碳点以其高水溶性、耐光漂白、优异的生物相容性、易于合成和化学修饰等优点，已被人们所熟知，广泛应用于生物成像、传感、药物传递、光催化等领域。目前，用碳点来检测Fe3+离子的报道已经有很多，但这类碳点信号对Fe3+离子的响应多是荧光猝灭的，而这种猝灭的荧光信号易受到环境干扰，产生较大的测量误差，导致较低的响应分辨率。同时，用碳点来检测Fe²⁺离子的报道却极少，特别是信号增强的碳点。例如，Shanshan Wei等(Asensitive“ON-OFF”fluorescent probe based on carbon dots for Fe²⁺detection andcell imaging)用聚乙烯亚胺和N，N-二甲基甲酰胺作为原料，通过水热法制备了一种蓝色碳点，利用其荧光强度的减弱与Fe²⁺离子浓度的相关性对Fe²⁺进行检测。Sai Jin Xiao等(Fluorescent carbon dots：facile synthesis at room temperature and itsapplication for Fe²⁺sensing)以PEG400为碳源和钝化剂，通过调控NaOH的量制备了对Fe^{2 +}离子有增强响应的碳点。尽管如此，此碳点能检测的范围较窄，仅能检测在0.5～2.0μmol·L^-1范围的Fe²⁺离子。此外，多模式检测能为监测Fe²⁺和Fe3+的动态变化提供更高的可靠度，而碳点基多模式检测Fe²⁺和Fe³⁺的材料鲜有报道。Xiaobo Sun等(Colorimetric andflfluorimetric dual mode detection of Fe²⁺in aqueous solution based on a arbondots/phenanthroline system)利用碳点和邻二氮菲体系实现对Fe²⁺浓度的荧光-比色双模式检测，但该体系的荧光响应仍是猝灭的，且无法区分Fe²⁺和Fe³⁺。同时，邻二氮菲作为一种检测Fe²⁺的比色试剂，也可被用来作为制备测铁碳点的原料。如smith等利用邻二氮菲的混合物可实现对生物体中亚铁含量的测定，但这种方法依然只是比色法，灵敏度不高，且单模式检测受生物背景环境影响较大。Anam Iqbal等(Carbon dots prepared by solid statemethod via citric acid and 1，10-phenanthro1ine for selective and sensingdetection ofFe²⁺and Fe³⁺)以邻二氮菲和柠檬酸为原料利用固相法合成了荧光碳点，可测定Fe²⁺和Fe³⁺，但碳点响应信号都是荧光猝灭的，无法测定混合铁溶液中的各自含量，亦不能应用于细胞内铁的动态变化。CN113201335A通过邻二氮菲和水杨酸在固相合成中制备碳点，但此碳点仅对Cd离子浓度有很好的增强响应，可Fe²⁺和Fe³⁺不响应，这说明制备方法的细微区分严重影响碳点的性能。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种荧光-比色双模式检测Fe²⁺和Fe³⁺的碳点材料的合成方法及其应用。本发明利用溶剂热法制备的碳点作为双模式探针，其简单的制备方法具有大量合成的特点，制备的碳点不仅水溶性好、生物毒性小，而且可区分Fe²⁺和Fe³⁺，并监测Fe²⁺和Fe³⁺的动态变化，灵敏度高。

一种荧光-比色双模式检测Fe²⁺和Fe³⁺碳点的制备方法，包括以下步骤：

(1)将5-氨基邻二氮菲和水杨酸溶于甲醇的水溶液中，然后将该溶液在185-215℃条件下反应3.5-5.5h，得到碳化混合物；

(2)以乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂作为洗脱剂，在层析柱中对步骤(1)得到的碳化混合物进行分离纯化，收集大量组分，除去溶剂后，干燥得到固体粉末，即所述碳点。

所述步骤(1)中5-氨基邻二氮菲和水杨酸的摩尔比为(22-33)∶1；甲醇的水溶液中，甲醇与水的体积比可以是任意比，但以二者体积相当为宜，比如甲醇与水的体积比为0.8-1.2∶1。

所述步骤(2)中洗脱剂中的乙酸乙酯可以用丙酮、乙醚、乙酸丁酯、苯、氯仿等低极性溶剂代替，甲醇可以用乙醇、丙醇、丁醇、正戊醇等醇类溶剂代替。步骤(2)中纯化是进行柱层析纯化；所述柱层析纯化过程中所用展开剂为乙酸乙酯与甲醇的混合体系，其中乙酸乙酯与甲醇也可以用适当的二氯甲烷、石油醚、甲醇、正己烷等溶剂代替，乙酸乙酯与甲醇的体积比以1∶2-4为宜。

所述步骤(2)中干燥是进行旋转蒸发干燥或真空冷冻干燥。

此外，本发明还包括一种双模式碳点进行检测混合铁溶液和细胞中Fe²⁺和Fe³⁺浓度的动态变化的应用。

本发明具有以下有益的技术效果：1)本发明的碳点是通过简单的溶剂热法合成的，邻二氮菲的结构在碳化的过程中得以保留，制备的碳点粒径分布均匀，方法简单，可以大量制备，成本低；2)本发明所得的碳点的荧光对Fe²⁺的响应是增强型的，而对Fe³⁺的响应是猝灭型的；同时利用碳点溶液的颜色变化也可以定量区分Fe²⁺和Fe³⁺；3)本发明所得的碳点可检测Fe²⁺/Fe³⁺混合溶液中的Fe²⁺/Fe³⁺浓度比例的变化，方便快捷，灵敏度高；4)本发明所得的碳点还可以检测细胞内Fe²⁺和Fe³⁺浓度的变化。

附图说明

图1为实施例1的碳点的透射电子显微镜(TEM)照片；

图2为实施例1的碳点的紫外光谱图；

图3为实施例1的碳点的荧光谱图；

图4为实施例1的碳点在加入不同浓度的Fe²⁺、Fe³⁺离子后的荧光光谱图(a，b)及标准曲线图(c，d)；

图5为实施例1的碳点在加入不同浓度的Fe²⁺、Fe³⁺离子后的紫外吸收光谱图(a，c)及日光下的照片(b，d)；

图6为碳点检测混合铁溶液中铁的动态变化；

图7为碳点检测A549癌细胞和MC3T3-E1正常细胞中铁的动态变化；

图8对比例1制备得到的碳点检测Fe²⁺的荧光光谱图；

图9对比例2制备得到的碳点检测Fe²⁺的荧光光谱图；

图10为对比例3制备得到的碳点检测Fe²⁺的荧光光谱图；

图11为对比例4制备得到的碳点检测Fe²⁺的荧光光谱图；

图12为对比例5制备得到的碳点检测Fe²⁺的荧光光谱图；

图13为对比例6制备得到的碳点检测Fe²⁺的荧光光谱图；

图14为对比例7制备得到的碳点检测Fe²⁺的荧光光谱图；

图15为对比例8制备得到的碳点检测Fe²⁺的荧光光谱图；

图16为对比例9制备得到的碳点检测Fe²⁺的荧光光谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

实施例1

1)碳点的制备及表征：

将0.2g的水杨酸和0.01g的5-氨基-邻二氮菲(摩尔比＝28：1)溶解于20mL甲醇与水的混合溶液中(1∶1，v/v)，然后将其转移到50mL的水热釜中，提前将烘箱温度升至200℃，然后将水热釜放入烘箱中，保温5h后拿出水热釜。冷却至室温后，将产物进行柱层析纯化，所用展开剂为乙酸乙酯与甲醇的混合体系(1∶2，v/v)，在硅胶柱上得到的第二个组分为目标碳点，将其旋转蒸发干燥后溶于水中，再真空冷冻干燥即得到碳点粉末。

将所得碳点粉末溶解在超纯水中，滴在超薄铜网上，观察其形貌。碳点透射电子显微镜(TEM)图如图1所示，可见，制备的碳点颗粒分散均匀。

将所制备的碳点进行紫外光谱测试，结果如图2所示。碳点在240nm处和290nm处有强的吸收，分别归因于芳香环的C＝C发生的π-π*跃迁，和C＝N/C＝O发生的n-π*跃迁，说明碳核有大的sp²共轭体系。

将所制备的碳点的发光性能通过荧光光谱仪进行测试，结果如图3所示。碳点的最大激发波长为300nm，最大发射峰位于410nm。

2)检测前的准备工作：

配制5％的盐酸羟胺溶液，0.02mol/L的NaHc/HAc缓冲液(pH＝4)备用。

3)检测Fe²⁺、Fe³⁺

将所得碳点粉末溶于0.02mol/L的NaHc/HAc缓冲液中配制成0.1mg/mL浓度的探针溶液，取3mL探针溶液于石英比色皿中，滴加30μL盐酸羟胺溶液，逐渐等体积滴加0.01mol/LFe²⁺的标准溶液，使探针溶液中Fe²⁺浓度不断增大，检测其吸收光谱和荧光光谱。

将所得碳点粉末溶于0.02mol/L的NaHc/HAc缓冲液中配制成0.1mg/mL浓度的探针溶液，取3mL探针溶液于石英比色皿中，逐渐等体积滴加0.01mol/L Fe³⁺的标准溶液，使探针溶液中Fe³⁺浓度不断增大，检测其吸收光谱和荧光光谱。

所制备的碳点对Fe²⁺的荧光响应结果如图4a所示，随着Fe²⁺浓度的不断增加，碳点410nm处的荧光强度逐渐增强；图4c的结果表明Fe²⁺的浓度在0-50μM内有良好的线性关系。

所制备的碳点对Fe³⁺的荧光响应结果如图4b所示，随着Fe³⁺浓度的不断增加，碳点410nm处的荧光强度逐渐减弱；图4d的结果表明Fe³⁺的浓度在0-50μM内有良好的线性关系。

所制备的碳点对Fe²⁺的比色响应结果如图5a所示，随着Fe²⁺浓度的不断增加，碳点512nm处的吸收强度逐渐增强，附图中表明Fe²⁺在0-50μ M的浓度内有良好的线性关系；图5b的结果表明，随着Fe²⁺浓度的不断增加，碳点的颜色变化可用肉眼明显观测到。

所制备的碳点对Fe³⁺的比色响应结果如图5c所示，随着Fe³⁺浓度的不断增加，碳点512nm处的吸收强度逐渐增强，附图中表明Fe³⁺在0-50μM的浓度内有良好的线性关系；图5d的结果表明，随着Fe³⁺浓度的不断增加，碳点的颜色变化可用肉眼明显观测到。

实施例2

将0.2g的水杨酸和0.01g的5-氨基-邻二氮菲(摩尔比＝28：1)溶解于20mL甲醇与水的混合溶液中(1∶1，v/v)，然后将其转移到50mL的水热釜中，提前将烘箱温度升至190℃，然后将水热釜放入烘箱中，保温5h后拿出水热釜。冷却至室温后，将产物进行柱层析纯化，所用展开剂为乙酸乙酯与甲醇的混合体系(1∶2，v/v)，在硅胶柱上得到的第二个组分为目标碳点，将其旋转蒸发干燥后溶于水中，再真空冷冻干燥即得到碳点粉末。

实施例3

将0.2122g的水杨酸和0.01g的5-氨基-邻二氮菲(摩尔比＝30：1)溶解于20mL甲醇与水的混合溶液中(1∶1，v/v)，然后将其转移到50mL的水热釜中，提前将烘箱温度升至200℃，然后将水热釜放入烘箱中，保温5h后拿出水热釜。冷却至室温后，将产物进行柱层析纯化，所用展开剂为乙酸乙酯与甲醇的混合体系(1∶2，v/v)，在硅胶柱上得到的第二个组分为目标碳点，将其旋转蒸发干燥后溶于水中，再真空冷冻干燥即得到碳点粉末。

实施例4

采用实施例1制备的碳点，检测混合铁溶液中的Fe²⁺和Fe³⁺浓度的动态变化。保持溶液中Fe²⁺和Fe³⁺总浓度为50μM不变，改变Fe²⁺和Fe³⁺浓度的浓度比，分别配制了10μμM Fe^{2 +}/40μM Fe³⁺、20μM Fe²⁺/330μM Fe³⁺、30μM Fe²⁺/20μM Fe³⁺、35μM Fe²⁺/15μM Fe³⁺、40μM Fe²⁺/10μM Fe³⁺和45μM Fe²⁺/5μM Fe³⁺的混合铁溶液。

将所得碳点粉末溶于0.02mol/L的NaHc/HAc缓冲液中配置成0.1mg/mL浓度的探针溶液，取3mL探针溶液于石英比色皿中，滴加30μL盐酸羟胺溶液，逐渐等体积滴加上述混合铁溶液，检测其荧光光谱，并记录其颜色的变化。

所制备的碳点对混合铁浓度的比色响应结果如图6a所示，随着Fe²⁺浓度的不断增加，碳点溶液的颜色逐渐增强，颜色变化可用肉眼明显观测到。所制备的碳点对混合铁浓度的荧光响应结果如图6b所示，溶液中全是Fe³⁺时，碳点的荧光强度猝灭，随着溶液中Fe²⁺浓度的不断增加，碳点410nm处的荧光强度逐渐增强；直至加入的铁全是Fe²⁺时，碳点溶液的荧光强度最大。图6c的结果表明内与碳点的荧光强度有良好的线性关系。

实施例5

采用实施例1制备的碳点，检测不同细胞中铁的动态变化。所制备的碳点对A549癌细胞中铁浓度的荧光响应结果如图7a-e所示，在A549细胞培养过程中加入0.1mg/mL碳点溶液，利用荧光显微镜记录细胞的生存情况；再加入40μM Fe³⁺后继续培养，所得图片可以看出细胞显示的荧光强度减弱，随后加入不同浓度的抗坏血酸，由于抗坏血酸具有还原性，会把Fe³⁺还原成Fe²⁺，此时细胞显示的荧光强度又增强。

所制备的碳点对MC3T3-E1正常细胞中铁浓度的荧光响应结果如图7a1-e1所示，在MC3T3-E1细胞培养过程中加入0.1mg/mL碳点溶液，利用荧光显微镜记录细胞的生存情况；再加入20μM Fe³⁺后继续培养，所得图片可以看出细胞显示的荧光强度减弱，随后加入不同浓度的抗坏血酸，由于抗坏血酸具有还原性，会把Fe³⁺还原成Fe²⁺，此时细胞显示的荧光强度又增强。

对比例1

参考实施例1，称取0.0967g的水杨酸和0.01g的5-氨基邻二氮菲(摩尔比＝14∶1)，溶解于20mL甲醇与水的混合溶液中(1∶1，v/v)，其他实验步骤不变，所得到的碳点最大发射峰位于600nm，对Fe²⁺无增强响应。光谱如图6所示。

对比例2

参考实施例1，称取0.1450g的水杨酸和0.01g的5-氨基邻二氮菲(摩尔比＝21∶1)，溶解于20mL甲醇与水的混合溶液中(1∶1，v/v)，其他实验步骤不变，所得到的碳点最大发射峰位于440nm，对Fe²⁺无增强响应。光谱如图7所示。

对比例3

参考实施例1，称取0.2417g的水杨酸和0.01g的5-氨基邻二氮菲(摩尔比＝35∶1)，溶解于20mL甲醇与水的混合溶液中(1∶1，v/v)，其他实验步骤不变，所得到的碳点最大发射峰位于410nm，对Fe²⁺增强响应差。光谱如图8所示。

对比例4

参考实施例1，称取0.2g的水杨酸和0.01g的5-氨基邻二氮菲(摩尔比＝28∶1)，溶解于20mL甲醇与水的混合溶液中(1∶1，v/v)，然后将其转移到50mL的水热釜中，提前将烘箱温度升至180℃，然后将水热釜放入烘箱中，其他实验步骤不变，所得到的碳点最大发射峰位于430nm，对Fe²⁺无增强响应。光谱如图9所示。

对比例5

参考实施例1，称取0.2g的水杨酸和0.01g的5-氨基邻二氮菲，溶解于20mL甲醇与水的混合溶液中(1∶1，v/v)，然后将其转移到50mL的水热釜中，提前将烘箱温度升至220℃，然后将水热釜放入烘箱中，其他实验步骤不变，所得到的碳点最大发射峰位于460nm，对Fe²⁺无增强响应。光谱如图10所示。

对比例6

参考实施例1，称取0.2g的水杨酸和0.01g的5-氨基邻二氮菲，溶解于20mL甲醇与水的混合溶液中(1∶1，v/v)，然后将其转移到50mL的水热釜中，提前将烘箱温度升至200℃，然后将水热釜放入烘箱中，保温3.5h，其他实验步骤不变，所得到的碳点最大发射峰位于410nm，对Fe²⁺无增强响应。光谱如图11所示。

对比例7

参考实施例1，称取0.2g的水杨酸和0.01g的5-氨基邻二氮菲，溶解于20mL甲醇与水的混合溶液中(1∶1，v/v)，然后将其转移到50mL的水热釜中，提前将烘箱温度升至200℃，然后将水热釜放入烘箱中，保温5.5h，其他实验步骤不变，所得到的碳点最大发射峰位于410nm，对Fe²⁺无增强响应。光谱如图12所示。

对比例8

参考实施例1，称取0.2g的水杨酸和0.01g的5-氨基邻二氮菲，溶解于20mL甲醇与水的混合溶液中(2∶1，v/v)，其他实验步骤不变，所得到的碳点最大发射峰位于460nm，对Fe²⁺无增强响应。光谱如图13所示。

对比例9

参考实施例1，称取0.2g的水杨酸和0.01g的5-氨基邻二氮菲，溶解于20mL甲醇与水的混合溶液中(1∶2，v/v)，其他实验步骤不变，所得到的碳点最大发射峰位于460nm，对Fe²⁺无增强响应。光谱如图14所示。

由上述实施例和对比例可以看出，碳点制备方法中反应条件(原料、用量、制备温度等)的微小改变，都会对碳点的性能产生极大影响。正是用本发明制备所得的碳点才可以定量区分Fe²⁺和Fe³⁺并检测Fe²⁺/Fe³⁺浓度比例的变化，

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.一种检测Fe²⁺和Fe³⁺碳点的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：

（1）将5-氨基邻二氮菲和水杨酸溶于甲醇的水溶液中，然后将该溶液在185-215 ℃条件下反应，反应时间大于3.5h，且小于5.5 h，得到碳化混合物；

（2）以乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂作为洗脱剂，在层析柱中对步骤（1）得到的碳化混合物进行分离纯化，收集大量组分，除去溶剂后，干燥得到固体粉末，即所述碳点；

步骤（1）中所述5-氨基邻二氮菲和水杨酸的摩尔比为22-33:1；甲醇与水的体积比为0.8-1.2：1。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纯化是进行柱层析纯化。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述柱层析纯化所用展开剂为乙酸乙酯与甲醇的混合体系，乙酸乙酯与甲醇的体积比为1:2-4。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述干燥是进行旋转蒸发干燥或真空冷冻干燥。

5.一种根据权利要求1-4制备的碳点的应用，其特征在于，该碳点进行检测混合铁溶液和细胞中Fe²⁺和Fe³⁺浓度的动态变化。