CN104583226A - 通过图案化转移片材的试剂靶向递送 - Google Patents

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Abstract

将固定在平面支持物上离散位置中的分子物质(如凝胶或印迹膜上的蛋白条带或者膜上斑点或点形式的物质)与通过平面支持物上方放置的多孔亲水性转移片材施加的结合试剂发生反应，该片材具有至少一个以阻隔为侧向边界的区域，有边界的区域内留存有结合试剂。将有边界的区域置于平面支持物上的区域的正上方，如果支持物上存在分子物质，则预期这些物质存留在该平面支持物上的区域中。随后将结合试剂递送至支持物以与物质接触。随后以改善的效率实现结合试剂的靶向递送。

Description

通过图案化转移片材的试剂靶向递送
相关申请的交叉参考
本申请根据35U.S.C.§1.119(e)的规定，要求2012年7月25日提交的美国临时申请号61/675,451的权益，该申请内容通过引用全文纳入本文。
发明背景和概述
1.技术领域
本发明涉及生物结合试验的领域，具体而言涉及将结合成员或其他试剂转移至膜、凝胶或其他平面支持物上的点、条带或其他空间阵列，用于检测、鉴定和定量的目的。
2.现有技术说明
通常将在平板凝胶上已通过电泳分离的蛋白、核酸或其他生物物质转移至硝酸纤维素、尼龙、聚二氟乙烯或类似材料的膜上以用于鉴定和定量，原因在于与凝胶相比，这些步骤更易于在膜上操作。常用的转移技术是电印迹，其中凝胶和膜的平坦表面直接接触且电流横向通过凝胶和膜，从而通过与凝胶内物质移动相类似的方式转移物质。当该物质是DNA片段时，转移称为Southern印迹，该名称来源于其最初使用者英国生物学家Edwin M.Southern。类似地，RNA片段的转移称为Northern印迹，蛋白或多肽的转移称为Western印迹。其他示例是针对翻译后修饰的“Eastern”印迹和针对蛋白相互作用的“Far Western”印迹。
所有这些类型的电印迹都可以湿、干或半干的形式进行。在湿印迹中，凝胶和膜在层叠体中彼此覆盖，该层叠体浸没于容器中的转移缓冲溶液内，该容器壁上安装有导线或板状电极。随后对电极施加电压以使溶质从凝胶迁移至膜。在半干印迹中，使用了用转移缓冲液湿润的滤纸，且层叠体的顶部和底部含有该滤纸，凝胶和膜位于滤纸之间以形成“印迹夹心”。随后使电极直接接触湿润滤纸的暴露表面。干电印迹不使用除凝胶中残留缓冲液以外的液体缓冲液。湿、干和半干电印迹以及相关材料和设备的描述可参见Margalit等(英杰公司(Invitrogen))的美国专利申请公开号US 2006/0272946 A1(2006年12月7日公开)、US 2006/0278531 A1(2006年12月14日公开)和US 2009/0026079A1(2009年1月29日公开)；Littlehales(美国伯内特公司(American Bionetics))的美国专利号4,840,714(1989年6月20日授权)；Dyson等(阿莫仙国际公司(Amersham International))的美国专利号4,889,606(1989年12月26日授权)；Schuette(生命科技公司(Life Technologies,Inc.))的美国专利号5,013,420(1991年5月7日授权)；Chan等(雅培实验室(Abbott Laboratories))的美国专利号5,356,772(1994年10月18日授权)；Camacho(胡夫科学仪器公司(Hoefer Scientific Instruments))的美国专利号5,445,723(2005年8月29日授权)；Boquet(BC公司(Bertin&Cie))的美国专利号5,482,613(1996年1月9日授权)；以及Chen(威泰克企业股份有限公司(Wealtec Enterprise Co.,Ltd.))的美国专利号6,592,734(2003年1月15日授权)。
无论电印迹是以湿、干或是半干形式进行，均使用检测试剂进一步处理所得电印迹以在可通过适用于生物物质本身的方法检测的印迹中呈现该物质。例如，在Southern和Northern印迹中，该检测试剂是通过检测荧光或化学发光染料来监测的杂交探针。在Western印迹中，该检测试剂可包括一抗并随后使用二抗以检测抗体，该二抗被荧光团、发色团或酶标记。或者，可使用检测剂(如生物素或亲和素/链霉亲和素)标记二抗，该检测剂是否存在是可以检测的。在Far Western印迹和Eastern印迹中使用了生物化学技术人员已知的类似或相似方法。
生物试验中还使用了除电印迹以外的空间阵列。例如，结合试验可以直接在平板凝胶以及质谱目标、ELISA板和已经以规则间隔或不规则间隔的二维阵列形式沉积在膜或其他支持物表面的蛋白、核酸或其他生物物质上进行，该沉积是通过静电喷雾、真空沉积、针点样法(pin spotting)和其他方法进行的。
在所有这些空间阵列中，应用于点的结合试剂(包括检测试剂、杂交探针、抗体或其他物质)是这些步骤成本的重要组分，且由于结合发生的条带或点仅占据支持物表面积的一小部分，浪费了大量体积的任意给定试剂。限制成本的一种方式是使用高度稀释形式的结合试剂，但需要延长接触时间，这限制了给定时间内可完成的分析数目。
概述
现在已发现，通过使用转移片材上侧向限定区域中含有结合试剂的多孔亲水性转移片材，可高效地将结合试剂应用于点样在平坦表面上的物质。该片材可由阻隔侧向限定。合适的阻隔包括疏水性阻隔(如蜡阻隔)或由多孔亲水性转移片材的气相或液相硅烷化形成的阻隔。合适的阻隔还包括不可透过阻隔。这类不可透过阻隔包括包含塑料、聚合物或树脂的阻隔。在一些情况下，该不可透过阻隔是支持亲水性转移片材的框架，该转移片材悬浮于框架内。
在一些情况下，该阻隔由疏水性(如蜡或硅烷化纤维素)和不可透过阻隔的组合构成。例如，在一些情况下，多孔亲水性转移片材被不可透过(如塑料或树脂)阻隔框架围绕并由蜡或硅烷化纤维素阻隔进一步细分。
随后在使结合试剂向表面转移的条件下使转移片材与平坦表面接触，从而应用于经点样物质。结合成员可通过扩散充满限定的区域而不跨过阻隔，并在接触具有经点样表面的转移片材后，结合成员将其接触限于点或者包括该点、与该区域对准的小面积区域。从片材至点的转移可通过简单扩散发生，或可通过多种已知方法中的任意一种(如电印迹)诱导。例如，为使试剂针对印迹膜上所需位点处感兴趣的分析物，需放置多孔片材使得限定区域与膜上分析物(如果存在)所占据的位置对准。对准可通过多种已知方式实现，如对准膜和多孔片材上的标记或特征。
在一些实施方式中，可以定向的方式递送试剂，使得转移片材在侧向限定区域中含有结合试剂并将结合试剂转移至不与转移片材的侧向限定区域垂直对准的平坦表面的侧向限定区域。例如，限定该侧向限定区域的阻隔可形成一个或多个通道以在转移期间指导结合试剂的流动。作为另一个示例，可从转移片材通过一个或多个额外的具有偏移侧向限定亲水性区域的亲水性片材至平坦表面来影响转移。作为另一个替代方案，各自具有仅部分穿透各转移片材的侧向限定区域的第一和第二转移片材可相对放置以建立垂直通道。随后该垂直通道可使来自第一转移片材的结合试剂转移至不与第一转移片材对准的平面支持物上的区域。
该限定区域可以是毫米大小的比例(如10mm或更少)、微米大小(100微米或更少)甚至亚微米大小，且其宽度可基本等于：电印迹中单个泳道、横跨一系列平行泳道的单个条带、一部分泳道(其中具有不同检测试剂的两个或多个区域可置于单个泳道的不同片段上)或限制与印迹膜上感兴趣的特定区域接触的任何小区域。对于凝胶或含有具有潜在兴趣的分子物质的条带或点的任何其他表面上的应用也是如此。在一些情况下，限定区域的宽度基本相当于电印迹中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多条泳道的宽度。
该转移片材可含有任何大小的圆形、矩形、方向等限定区域的阵列。例如，该转移片材可以是圆形限定区域的阵列。在一些情况下，圆形限定区域的阵列是适用于一种或多种结合试剂转移至微量滴定或ELISA板(例如6、12、24、48、96、384或1536孔微量滴定或ELISA板)的一个或多个孔的尺寸。类似地，还可将各限定区域细分成较小区域用于将试剂复合递送至各点、孔或阵列中的位置。
使用该方法，无再需要使用结合试剂涂覆整个经点样表面，且该方法可使用少得多的量的结合试剂发生结合反应。该方法还允许使用不同结合试剂或使用不同浓度或稀释的同一结合试剂处理经点样表面的不同区域。多孔片材的不同区域中两种或多种结合试剂的使用使得用户能够同时检测不同的经点样物质，例如通过不同反应检测物质，而不同浓度或稀释的同一结合试剂的使用使得用户能够通过同时进行的测试确定给定样品中给定分析物的最适当稀释。其他用途和优势对本领域技术人员而异显而易见。
疏水性蜡阻隔可由以下方式形成：手动绘制、打印或针对多孔片材表面在蜡中形成所需区域的轮廓，随后加热该片材以使蜡溶解，导致其透过片材的厚度。因此，可形成任何形状、尺寸或数目的轮廓并在单个步骤中进行多种结合反应(包括单个反应和不同反应之间的比较)。
疏水性阻隔还可通过气相或液相硅烷化形成。例如，可将转移片材置于罩(mask)中，使转移片材的各区域接触硅烷化试剂(如三甲基氯硅烷)。随后可使硅烷化试剂接触片材和形成的一个或多个侧向限定区域。随后可使侧向限定区域接触含有结合试剂的水溶液，从而制备含有水基结合试剂的转移片材，该水基结合试剂可逆地固定在以阻隔为边界的侧向限定区域中。
在一些实施方式中，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包含容器和其中的1、2、3、4或更多个多孔亲水性片材，该多孔亲水性片材各自具有1、2、3、4或更多个以疏水性或不可透过阻隔为边界的侧向限定区域。在一些情况下，该多孔亲水性片材各自具有1、2、3、4或更多种可逆地固定于其上的结合试剂。该结合试剂可以是抗体。该侧向限定区域的宽度基本相当于电印迹中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多条泳道的宽度。可将容器构造为保护多孔亲水性片材免于接触光照和/或水分。
在一些情况下，该试剂盒还包含转移缓冲液，如Western印迹转移缓冲液。在一些情况下，该试剂盒还包含转移缓冲液的组分。在一些情况下，该试剂盒还包含转移增强试剂，如表面活性剂、环糊精、多元醇、单糖、多糖、有机溶剂、聚集修饰蛋白、无序的肽序列、氨基酸、氧化还原剂、冻干保护剂、低温保护剂或离液剂。
通过以下说明书，不难了解其它目的、实施方式、特征和优点。
所选实施方式的详细描述
对于水基结合试剂(如抗体、核酸探针和许多其他类型的试剂)，该多孔片材可以是亲水性吸附材料的片材，该亲水性吸附材料是例如常规的实验室印迹纸或滤纸或任何亲水形式的纤维素、聚酯或纤维素-聚酯掺混物。纤维素纸的一个示例是Whatman层析纸(美国新泽西州皮斯卡特维的GE医疗保健公司(GE Healthcare))。适用于片材的聚酯的示例是以下述商标售卖的那些：VWR(英国莱斯特郡的VWR国际公司(VWR International))；和(美国佐治亚州拉格朗日的米尔肯公司(Milliken&Company))； 和MIRACLE(美国新泽西州马瓦的ITW台维公司(ITW-Texwipe Company))；以及和VALUSEALTM(美国马萨诸塞州大巴灵顿的伯克希尔公司(Berkshire Corporation))。适用的聚酯-纤维素掺混物的示例是以下述商标售卖的那些：和(美国马萨诸塞州大巴灵顿的伯克希尔公司)；C1擦拭器和(美国南卡罗来纳州斯巴达堡市康泰克公司(Contec))；以及(美国新泽西州马瓦的ITW台维公司)。
用于形成蜡阻隔的蜡可以是在温度升高时可流动且在室温(20-25℃)下不可流动的任何蜡。示例是石蜡、微结晶蜡、热固性蜡、动物蜡(如蜂蜡、羊毛脂和牛油)、植物蜡(如大豆蜡、巴西棕榈蜡、坎台里蜡和棕榈蜡)、矿物蜡(如纯地蜡和褐煤蜡)、石油蜡和合成蜡(如烯键式聚合物、氯化萘和费-托蜡(Fischer-Tropsch wax))。除正链烷烃和异链烷烃外，石蜡组合物还可含有少量的环烷烃或烯烃或上述两者。可使用的蜡在约60℃至约150℃(或一些情况下约75℃至约125℃)的温度范围内变得可流动(即具有熔点)。表现出这种方式的蜡制剂和组合物是本领域技术人员已知的。
用于形成疏水性阻隔的硅烷化试剂可以是与亲水性转移片材反应的任何硅烷化试剂。例如，如果亲水性转移片材含有纤维素，可使用硅烷化纤维素骨架的羟基的硅烷化试剂。示例性硅烷化试剂包括但不限于三甲基氯硅烷、三甲基硅烷、六甲基二硅胺烷。硅烷化试剂还包括三乙氧基硅烷(R-Si(C2H5O)3)，其中R是例如乙烯基、甲基丙烯基、氨基丙基、氟烷基或硫代乙基。其它合适的硅烷化试剂对于本领域技术人员是显而易见的。
蜡或其他限定试剂(如硅化物试剂或不可透过阻隔)可施涂于多孔片材的一侧或两侧，但大多数情况下在一侧施涂即已足够。该限定试剂可作为液体施涂。该液体可通过手或其他设备施涂。在一些情况下，将该液体喷涂或倒在转移片材上。喷涂可使用喷墨打印机或类似设备实现。在一些情况下，该液体在施涂后硬化以形成不可透过和/或疏水性阻隔。或者，该限定试剂可作为气体施涂。例如，硅烷化试剂、蜡、塑料、树脂或聚合物可作为气体施涂，其在转移片材上浓缩或与转移片材发生反应。或者，该限定试剂可作为固体施涂。例如，蜡可如本文所述作为固体施涂。在一些情况下，覆盖转移片材以保护各区域不暴露于限定试剂，且该限定试剂与转移片材接触。
蜡的施涂可通过手(使用常规的蜡笔(crayon)或蜡钢笔(wax pen))或通过蜡印刷机(wax printer)实现。蜡钢笔是本领域已知的且通常包括具有含有热蜡的容器、喷嘴和把手的外壳。可通过倾斜外壳使液化的蜡通过喷嘴来施涂热蜡，且该外壳配备有阀门以在打印线的末端停止蜡的流动。蜡印刷机同样是本领域已知的且通常通过使用印刷头的热转移印刷来运行，该印刷头包括非常小的加热元件阵列，其受软件控制独立激活以对蜡进行局部加热至高于其熔点，从而将蜡释放至印刷介质。市售可得的蜡印刷机的示例包括Phaser8560DN(日本的富士施乐有限公司(Fuji Xerox,Ltd.))和CALCOMPCOLORMASTERPLUS热蜡转移印刷机(美国加利福尼亚州福特希尔兰奇的数控绘图有限公司(CalComp Graphics,LLC))。蜡印刷机及其用途的描述可参见Kroon(泰克公司(Tektronix,Inc.))的美国专利号5,957,593(1999年9月28日)；Lin(施乐公司(Xerox Corporation))的美国专利号8,206,664(2012年6月26日)；Lu,Y.,等，“Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost,portable bioassay(用于低成本便携式生物试验的使用蜡的纸基微流体快速原型制作)”Electrophoresis 2009,30,1497-1500；以及Carrilho,E.,等，“UnderstandingWax Printing:A Simple Micropatterning Process for Paper-Based Microfluidics(理解蜡印刷机：用于纸基微流体的简单微成像过程)”Anal.Chem.,2009,81(16),7091-7095。施涂的蜡线宽度(加热前)可变化并且在本发明中不重要，前提是该线中蜡的含量足以透过多孔片材并对片材内水性流体的侧向流动形成阻隔。
一旦施涂，即可通过将蜡加热至其熔点以上来使蜡透过多孔片材的厚度以填充各孔并对水性流体流动形成侧向阻隔。施涂的蜡的含量应完全透过片材的厚度，并且蜡熔化时熔化的蜡的侧向流动(即与片材的平坦表面平行的方向)是最小的或至少限于沿所施涂蜡线长度基本均匀的较小距离，使得形成的以蜡阻隔为边界的区域是已知且受控制的。还可通过加热程度(包括对蜡加热的温度和加热持续的时间长度)控制该方式的阻隔形成。通过常规反复试验可容易地确定最佳温度和持续时间，但在大多数情况下可通过加热至高于蜡熔点至少5摄氏度(且在许多情况下高于蜡熔点约5至约50摄氏度或高于蜡熔点约10至约30摄氏度)来获得有用的结果。最适当的加热时间取决于温度，温度越高所需时间越短。通常，约15秒至约20分钟(或在许多情况下为约30秒至约10分钟)的加热时间可提供有用的结果。加热可通过常规方式实现，包括辐射加热、传导加热、对流加热和微波加热。可使用诸如加热板或常规烘箱这么简单的设备实现有效的结果。
疏水性或不可透过阻隔的最佳宽度可根据以阻隔为边界的区域大小以及片材的厚度变化，且可容易地通过常规测试确定。在大多数情况下，该宽度的范围是约30微米至约3mm，约100微米至约1mm，或约200微米至约5mm，或10mm。
该阻隔可沿片材的外周形成，此时由阻隔限定的片材的区域是除沿片材边缘的细条外片材的整个长度和宽度(或对于圆形片材而言的直径)。例如，该类型的片材可形成为印迹膜表面上并排排列的一系列单个细条。可通过试剂供应商制备使用不同检测试剂或不同稀释度的检测试剂预先加载的细条，并由用户对其进行选择和组合以符合实验或分析的特定需求。或者，可在单个片材中形成多个区域(以平行泳道或点阵列的形式)，通过疏水性阻隔使各区域彼此分离。各区域可由供应商预先加载为标准阵列或由用户在使用时加载以对各区域进行调节以符合用户的个人需求。
因此，可以多种方法获得和使用本文所述图案化和携带试剂的多孔片材。这些方法包括购买具有预先形成的阻隔并使用来自供应商的检测试剂预先加载的多孔片材，以及购买具有预先形成的阻隔并随后在使用时使用检测试剂浸渍有边界区域的多孔片材，以及购买不具有阻隔或检测试剂而是允许用户在使用时形成阻隔并加入试剂的多孔片材。在一些实施方式中，预先加载的片材可由用户选择并与洗脱剂接触以提供单剂量的结合试剂。
多孔片材可以含有一片或多片(例如至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、60、75、100或更多片)的试剂盒的形式提供或购买。该试剂盒还可含有一种或多种结合试剂(例如在独立的容器内或浸渍至一个或多个片材)。在一些实施方式中，其中储存有结合试剂的片材可在室温(例如至少8、10、12、14、16、18、20、22、24、25、27、28或30℃)下储存至少约1、2、3、4、5、6、7天或1、2、3、4、5、6、7周或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月或更久。该片材可各自含有一个或多个本文所述侧向限定区域。
该试剂盒可含有一个或多个片材，其宽度基本相当于电印迹中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多条泳道的宽度。或者或另外，该试剂盒可含有一个或多个具有侧向限定区域的片材，所述侧向限定区域的宽度基本相当于电印迹中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多条泳道的宽度。在一些情况下，该试剂盒可含有一个或多个片材，其与一个或多个点、孔或阵列位置的形状和/或大小基本相当。在其他情况下，该试剂盒可含有一个或多个具有侧向限定区域的片材，所述侧向限定区域与一个或多个点、孔或阵列位置的形状和/或大小基本相当。例如，该试剂盒可含有一个或多个具有6、12、24、48、96、384或1536个侧向限定区域的片材，用于将一种或多种结合试剂递送至微量滴定板的6、12、24、48、96、384或1536个孔中的一个或多个。
此外，用户可将设计递交给供应商以进行片材的定制生产。定制的片材可含有特定的阻隔模式。或者或另外，定制的片材可含有用户特定的结合试剂。该结合试剂可对用户特定的目标(如目标蛋白或对照蛋白(例如肌动蛋白、微管蛋白、GAPDH等))具有特异性或与之结合。
该试剂盒可包含容器，其中一个或多个多孔亲水性片材由生产商或供应商递送或由用户储存。在一些情况下，该容器被构造为保护多孔亲水性片材免于接触水分和/或光照。在一些情况下，该容器被构造为保护多孔亲水性片材免于变干。示例性容器包括具有密封盖的铝箔袋(foil pouch)或塑料盘，所述密封盖可由终端用户撕去。
在一些实施方式中，该试剂盒可包含转移缓冲液，转移缓冲液浓缩液(例如2x、3x、4x、5x、10x、100x转移缓冲液)或转移缓冲液的一种或多种组分。在一些情况下，该试剂盒可含有一种或多种转移增强剂。在一些情况下，一种或多种转移增强剂可以转移缓冲液组分的形式提供。合适的转移增强剂包括但不限于本文所述的去垢剂或表面活性剂(阳离子型、阳离子型、离子型、两性离子型或非离子型)、环糊精、单糖、多糖、多元醇、有机溶剂、聚集修饰蛋白、无序的肽序列、氨基酸、氧化还原剂、冻干保护剂、低温保护剂和离液剂。
该试剂盒可通过本文所述方法中任意一种来使用。例如，可获得(如购买或生产)试剂盒并从中获得多孔亲水性片材。在一些情况下，随后可使用一种或多种结合试剂浸渍来自试剂盒的多孔亲水性片材。在一些情况下，随后可将一个或多个侧向限定区域印在来自试剂盒的多孔亲水性片材上。或者，可获得来自已经含有一种或多种结合试剂或侧向限定区域的试剂盒的多孔亲水性片材。在一些情况下，该多孔亲水性片材随后可用于将一种或多种结合试剂转移至平面支持物(如western印迹膜)。
从片材至膜的转移可通过简单扩散、毛细作用、真空印迹或电转移进行。简单扩散可通过在不带间插片(intervening sheet)的情况下使带有试剂的多孔片材与印记膜简单接触来实现。取决于材料及其量和片材的厚度，扩散转移可以在例如约5分钟至约3小时(或在许多情况下约30分钟至约2小时)的时间段内完成。通过将一叠湿纸(即使用水或水性缓冲溶液湿润的纸)置于带有试剂的片材上并将一叠干纸置于膜下，或者使用任何多孔亲水性材料代替层叠的纸，从而实现毛细印迹。毛细作用使水从上层通过带有试剂的片材和膜进入下层，溶解试剂使其通过携带试剂的片材并使试剂沉积在膜中(在膜中试剂与分析物偶联)。可一次或多次替换干和湿的片材以增加效率。如毛细印迹中那样将一叠湿纸置于带有试剂的片材上并在膜下方施加真空(或部分真空)，从而进行真空印迹。此时水或水性缓冲液在压力差的作用下通过片材，如毛细印迹中那样溶解并沉积试剂，但速率更快。将电极置于带有试剂的片材上和膜下，需要时放置湿润的间插片，以进行电印迹。对电极施加电压，从而在与转移方向平行的方向上跨接触片材形成电压差，该电压差具有极性，使得检测试剂跨片材与膜之间界面进行电泳迁移。带有电荷的结合试剂会在该电压差下迁移且该方法可与印迹方法类似，所述印迹方法中印记膜上的物质转移至来自介质的膜(其中最初时其彼此分离)，例如在其中进行单向或双向电泳的平板凝胶，此外还与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳类似。因此，可将使用缓冲溶液湿润的吸收材料的片材置于多孔片材-印记膜叠层的两个外侧上并对与缓冲液润湿的外部片材接触的电极施加电压以使电流通过叠层。
还可通过包含不使抗体变性的两性离子型表面活性剂来增强结合试剂(如单抗和二抗)的转移。例如，该两性离子型表面活性剂可包含于转移缓冲溶液中或在多孔亲水性片材上变干。用于增强来自多孔亲水性转移片材的结合试剂的转移的其他组合物包括环糊精、非离子型表面活性剂、离子型表面活性剂、单糖、多糖、多元醇、有机溶剂、聚集修饰蛋白、无序的肽序列、氨基酸、氧化还原剂、冻干保护剂、低温保护剂和离液剂。
环糊精包括但不限于：α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、(2,3,6-三-O-甲基)-β-环糊精、(2,3,6-三-O-甲基)-β-环糊精、(2-羟基)丙基-β-环糊精、(2-羟基)丙基-γ-环糊精、无规甲基-β-环糊精、无规甲基-γ-环糊精、羧基甲基-β-环糊精、羧基甲基-γ-环糊精、6-单脱氧-6-单氨基-β-环糊精、磺基丁基-β-环糊精、6-氨基-6-脱氧-β-环糊精、乙酰β-环糊精、琥珀酰α-环糊精、琥珀酰β-环糊精、琥珀酰γ-环糊精、(2,3,6-三-O-苯甲酰)-β-环糊精、琥珀酰-(2-羟基丙基)-β-环糊精和琥珀酰-(2-羟基丙基)-γ-环糊精。环糊精还包括含有一种或多种前述环糊精分子的环糊精聚合物。其他环糊精是本领域已知的且包括例如cyclodextrin.com上描述的那些。环糊精的示例性浓度包括但不限于约1mM、2mM、2.5mM、5mM、7.5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、50mM、75mM或100mM。
非离子型表面活性剂包括聚乙烯-去水山梨糖醇脂肪酸酯、聚乙烯-聚丙二醇和聚氧乙烯-硬脂酸酯。聚乙烯-去水山梨糖醇脂肪酸酯包括聚乙烯(20)-去水山梨糖醇酯(Tween 20TM)和聚氧乙烯(20)-去水山梨糖醇单油酸酯(Tween80TM)。聚乙烯-聚丙二醇包括聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，例如以商品名或PoloxamerTM售卖的那些。聚氧乙烯-硬脂酸酯包括以商标MyrjTM售卖的那些。聚氧乙烯单月桂基醚包括以商标BrijTM售卖的那些，如Brij-35。非离子型表面活性剂的示例性浓度包括但不限于约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、0.75％、1％、2％、2.5％、5％、7.5％和约10％w/w、w/v或v/v。
离子型表面活性剂包括阴离子型表面活性剂和阳离子型表面活性剂。本发明中使用的阴离子型表面活性剂包括但不限于皂(包括碱金属皂，如脂族羧酸(通常是脂肪酸)的钠、钾和铵盐，如硬脂酸钠)。其他阴离子型表面活性剂包括有机胺皂，如脂族羧酸(通常是脂肪酸)的有机胺盐(如三乙醇胺硬脂酸酯)。本发明中使用的阳离子型表面活性剂包括但不限于铵盐，如十八烷基氯化铵和季铵化合物(如苯扎氯铵)。离子型表面活性剂还包括烷基硫酸的钠、钾和铵盐，如十二烷基硫酸钠和辛基硫酸钠。离子型表面活性剂的示例性浓度包括但不限于约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、0.75％、1％、2％、2.5％、5％、7.5％和约10％w/w、w/v或v/v。
两性离子型表面活性剂包括与同一分子相连的阳离子和阴离子中心。阳离子部分基于例如伯胺、仲胺或叔胺或者季铵阳离子。阴离子部分可包括磺酸盐，如CHAPS(3[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基(dimethylammonio)]-1-丙磺酸盐中那样。其他阴离子基团是椰油酰胺丙基羟基磺基甜菜碱所示的磺基甜菜碱和甜菜碱(如椰油酰胺乙基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱或月桂酰胺丙基甜菜碱)。两性离子型表面活性剂的示例性浓度包括但不限于约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、0.75％、1％、2％、2.5％、5％、7.5％和约10％w/w、w/v或v/v。
非去垢剂磺基甜菜碱(NDSB)具有无法聚集以形成胶束的短疏水性基团和磺基甜菜碱亲水性基团，因此不认为NDSB是去垢剂。NDSB包括但不限于NDSB 256、NDSB 221、NDSB 211、NDSB 201、NDSB 195、3-(4-叔丁基-1-吡啶内鎓)-1-丙磺酸盐、3-(1-吡啶内鎓)-1-丙磺酸盐、3-(苯基二甲基铵)丙磺酸盐和二甲基乙基铵丙磺酸盐。NDSB的示例性浓度包括但不限于约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、0.75％、1％、2％、2.5％、5％、7.5％和约10％w/w、w/v或v/v。
多元醇是具有多个羟基功能基团的化合物。在一些情况下，多元醇可通过多种机制修饰蛋白的聚集或变性行为。例如，在一些情况下，多元醇可通过与蛋白骨架进行热力学不利的相互作用以使平衡移向折叠状态。或者，在一些情况下，多元醇可结合并稳定蛋白的折叠状态。
多元醇可包括单糖，如蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、木糖醇、赤藓糖醇、葡萄糖、半乳糖、棉子糖和海藻糖。多元醇还可包括多糖，如葡聚糖、淀粉、羟乙基淀粉和含有本文所述单糖的聚合物。多元醇还可包括甘油、乙二醇、聚乙二醇、季戊四醇丙氧基化物和季戊四醇丙氧基化物及其组合。
有机溶剂包括但不限于已知抑制一种或多种蛋白变性、展开或聚集的那些有机溶剂。多种合适的有机溶剂是本领域已知的。例如，有机溶剂可包括乙醇、丁醇、丙醇、苯酚、二甲基甲酰胺、2-甲基-2,4-戊二醇、2,3-丁二醇、1,2-丙二醇、1,6-己二醇和二甲亚砜。
聚集修饰蛋白包括抑制一种或多种蛋白变性、展开或聚集的本领域已知的蛋白。聚集修饰蛋白包括但不限于白蛋白。白蛋白是水溶性、在浓盐溶液中中度可溶并经受热变性的蛋白。白蛋白包括血清白蛋白(例如牛、马或人血清白蛋白)和卵清蛋白(例如鸡蛋清白蛋白)。聚集修饰蛋白还包括酪蛋白、明胶、泛素、溶菌酶和胚胎发生晚期丰富(LEA)蛋白。LEA蛋白包括LEA I、LEA II、LEA III、LEA IV、LEA V和非典型LEA蛋白。LEA蛋白是本领域已知的并描述于例如Goyal K.,等，Biochemical Journal 288(pt.1),151-57,(2005)。
用于增强来自多孔亲水性转移片材的结合试剂转移的组合物包括氨基酸。在一些情况下，该氨基酸可起氧化还原功能以对固定在基质上的蛋白维持适当的氧化潜能。合适的氧化还原性氨基酸包括半胱氨酸和胱氨酸。其他氨基酸用于通过非氧化还原方法减少变性或聚集。例如，已证明精氨酸、甘氨酸、脯氨酸和牛磺酸可减少蛋白聚集。
其他氧化还原试剂可用于增强来自多孔亲水性转移片材的结合试剂的转移。例如，除半胱氨酸和胱氨酸以外的氧化还原剂可用于优化其上固定有蛋白的基质中的还原潜能。其他的氧化还原剂包括巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、三(2-羧基乙基)膦、谷胱甘肽、氧化谷胱甘肽及其氧化衍生物，以及Cu2+。
用于增强来自多孔亲水性转移片材的结合试剂转移的其他组合物还可包括冻干保护剂、低温保护剂或离液剂。在一些情况下，该离液剂是脲、硫脲、胍、氰酸盐/酯、硫氰酸盐/酯、三甲基铵、四甲基铵、铯、铷、硝酸盐、乙酸盐/酯、碘化物、溴化物、三氟乙酸盐/酯或高氯酸盐/酯。在某些条件下，如在低浓度下，离液剂可减少蛋白聚集。其他转移增强组合物包括三甲基胺N-氧化物。
用于增强来自多孔亲水性转移片材的结合试剂转移的组合物还包括盐。盐包括但不限于盐酸、硫酸和磷酸的钠、钾、镁和钙盐。用于增强来自多孔亲水性转移片材的结合试剂转移的组合物还包括缓冲剂。示例性缓冲剂包括但不限于三(羟基甲基)甲胺(TRIS)、TAPSO、MES、HEPES、PIPES、CAPS、CAPSO、MOPS、MOPSO、和磷酸钠或磷酸钾、碳酸钠或碳酸钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾、柠檬酸钠或柠檬酸钾、乙酸钠或乙酸钾、或硼酸钠或硼酸钾缓冲剂。
用于增强来自多孔亲水性转移片材的结合试剂转移的组合物可以任何合适的浓度提供，如本文所述浓度。在一些情况下，该浓度指转移过程期间转移增强组合物的浓度。在一些情况下，将结合试剂提供至亲水性转移片材，或者将结合试剂从亲水性转移片材中作为含有结合试剂和一种或多种转移增强组合物的水性溶液递送。在一些情况下，可使溶液接触亲水性转移片材并任选进行干燥。或者，含有结合试剂和任选的转移增强组合物的亲水性转移片材可与溶剂(例如水或经缓冲的水溶液)接触，并从中递送结合试剂。在一些情况下，该溶剂和一种或多种转移增强组合物是转移缓冲液(如Western印迹转移缓冲液)的组分。溶剂或水性结合试剂溶液中转移增强组合物的示例性浓度包括但不限于该溶液的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、4％、5％、10％、20％或约25％或更高的w/v。其他的示例性浓度包括但不限于约1μM、5μM、10μM、25μM、50μM、75μM、100μM、150μM、200μM、300μM、500μM、750μM、1mM、5mM、10mM、25mM、50mM、100mM、150mM、200mM、300mM、500mM和1M。
在一些情况下，在多孔亲水性转移片材上提供用于增强来自多孔亲水性转移片材的结合试剂转移的组合物。含有用于增强来自多孔亲水性转移片材的结合试剂转移的组合物的示例性组合物包括含有约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％，或约10％、20％，或约25％(以重量计)一种或多种转移增强组合物的多孔亲水性转移片材。
用于增强来自多孔亲水性转移片材的结合试剂转移的组合物可以任意合适组合的形式提供。例如，在一些情况下，可使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种前述蛋白转移增强组合物以增强从亲水性转移片材的转移。在一些情况下，在使亲水性转移片材接触含有结合试剂的溶液前，基质含有转移增强组合物且溶液含有不同的转移增强组合物。在其他情况下，转移片材含有转移增强组合物且结合试剂溶液含有相同的转移增强组合物。在一些情况下，在使亲水性转移片材接触含有结合试剂的溶液前，亲水转移片材含有转移增强组合物且含有结合试剂的溶液不含转移增强组合物。在一些情况下，在使转移片材接触含有结合试剂的溶液前，溶液含有转移增强组合物且基质不含。
在一些实施方式中，该亲水性转移片材含有一种或多种转移增强组合物的梯度。在一些情况下，可逆地固定在亲水性转移片材上的一种或多种结合试剂可因此以不同的效率进行转移，该效率基于其在梯度中的位置。因此，亲水性转移片材可转移不同浓度的结合试剂。
如上文所述，保留在阻隔内的结合试剂是水基的(即悬浮或溶解于水溶液中)并可包括一种或多种生物剂(如抗体和酶)或检测剂(如亲和素、链霉亲和素、生物素、亲和标签(如6xHis或GST)、酶底物、荧光化合物、比色化合物、化学发光化合物和放射性化合物)。相反地，结合试剂可以是抗原且平坦表面上的分子物质可以是抗体。某些检测方案需要连续使用试剂，且在这些情况下，可使用具有本文所述限定试剂区域的多孔片材来完成一种或多种应用，而在平面支持物的整个表面上进行其他应用，或者可通过连续使用适当浸渍的片材完成全部应用。该选择通常取决于哪种试剂的成本最高。因此，当检测方案涉及使用一抗和二抗时，一抗可应用于整个平面支持物，随后通过使用仅针对二抗的限定多孔片材以使二抗仅应用于以疏水阻隔为边界的区域。相反地，一抗可应用于多孔片材上以疏水阻隔为边界的区域，随后将二抗应用于平面支持物的整个区域。使用抗体以外的结合试剂的类似方法对本领域技术人员而言显而易见。该试剂也可以干燥形式(例如冻干形式、空气干燥形式等)留存在片材中直至准备使用。完全使用以阻隔为边界的区域形成且预加载冻干或干燥试剂的片材可以购买并储存并由用户在使用的时间点润湿。
点样或固定在平面支持物上的蛋白或其他物质通常是生物样品的组分，且在这些情况下支持物含有生物样品的一种或多种空间分离的组分，支持物上组分的空间分离和特定位置是组分本身以及其分离或应用于支持物的方式的特征。在许多情况下，支持物是印迹膜且空间分离是在样品上进行电泳过程的结果。在这些情况下，感兴趣的组分(如果存在于样品中)会占据膜上特定位置，借助电泳条件或通过与已知组合物的标准品进行比较，该位置是已知的。因此，组分(如果存在)通常会位于进行电泳的凝胶中沿其长度已知距离的条带中。可通过本文所述方法使样品的单个组分接触结合试剂，或使多个组分接触试剂，或使数个样品的单个组分接触试剂。
在一些情况下，可放置多孔片材使得含有结合试剂的以阻隔为边界的区域对准印记膜上感兴趣的组分存在的位置，前提是所述组分最初存在于样品中。此时“对准”指当片材与膜垂直叠放时处于正上方或正下方。或者，一种或多种片材中由阻隔形成的微通道可指导结合试剂从转移片材流向平面支持物上的特定区域，该区域不是含有结合试剂的转移片材的正上方或正下方区域。
当平面支持物是印迹膜且该平面支持物上的物质是来自凝胶的电泳转移结果时，该凝胶和印迹膜可以是任何不规则或规则形状，如椭圆形或圆形，但通常是矩形。矩形凝胶的长度和宽度可以广泛变化，且厚度通常显著小于例如长度或宽度的10％或更小(在许多情况下小于长度或宽度的2％或更小)。可使用多种组成的凝胶，包括琼脂凝胶、淀粉凝胶、琼脂糖凝胶和丙烯酰胺凝胶，以及两种或多种不同聚合物的复合凝胶。该印迹膜也可以是各种材料，例如是纸、纤维素衍生物(如硝酸纤维素、乙酸纤维素或硝化纤维)、尼龙或基于尼龙的材料，或者聚偏二氟乙烯(PVDF)和基于PVDF的材料，以及这些材料的活化或衍生形式(如表面带电的衍生物)。
可进行分析的样品通常包括生物样品，其示例是血浆、血清、尿液和脑脊液。当分子物质阵列是通过电泳分离形成且平面支持物是凝胶(在其中进行分离)或印迹膜(凝胶中分离的物质转移至其中)时，可通过多种形式的电泳中的任意一种完成分离，包括单向平板或毛细电泳、双向电泳和等电聚焦。所有电泳操作步骤可以实验室常用且本领域熟知的传统方法进行，包括将样品加载到凝胶上，安排和应用电极和电极缓冲液，以及对合适极性的电极通电。
在结合试剂是染料的系统中，可使用多种核酸染料和蛋白染料中的任意染料。示例是SYPRO染料、考马斯染料、直接蓝染料和铜基染料。
在使用抗体作为检测试剂的系统中，许多这类系统依次使用一抗和二抗。可使用五种类型中的任意一种，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。还可使用抗体片段，如使用木瓜蛋白酶处理IgG生成的Fab片段、使用胃蛋白酶处理IgG生成的F(ab')2和使用弱还原溶液处理F(ab')2生成的单价Fab'片段。可使用单克隆或多克隆抗体。抗体还可包括单链抗体、双抗体(diantibody)或小抗体(miniantibody)。本发明的抗体还可包括重链二聚体，例如来自驼科动物或鲨鱼的抗体。由于驼科动物或鲨鱼中重链二聚体IgG的VH区不必与轻链发生疏水性相互作用，通常与轻链接触的重链区域转变为亲水性氨基酸残基。重链二聚体IgG的VH结构域为VHH(驼科动物)或VNAR(鲨鱼)结构域。本发明中使用的抗体还包括单结构域抗体(dAb)和纳米抗体(参见例如Cortez-Retamozo等，Cancer Res.64:2853-2857,2004)。
结合特定蛋白或蛋白类型的抗体可用作一抗，而结合其他抗体的抗体可用作二抗。因此，从一个哺乳动物物种中生成的抗体可用作一抗，而从第二个哺乳动物物种中生成且结合第一哺乳动物物种的那些抗体的抗体可用作二抗。这些物种可以是兔、小鼠、山羊、绵羊等。
其他结合试剂可包括粘合素(affimer)、脂质运载蛋白(如抗运载蛋白)、硫氧还蛋白A、胆汁三烯结合蛋白或含有锚蛋白重复、葡萄球菌蛋白A的Z结构域或纤连蛋白III型结构域的蛋白。
在结合试剂是或包含酶的系统中，可使用多种酶和比色或发荧光酶底物。酶和比色或发荧光酶底物的组合的示例是氧化还原酶(如辣根过氧化物酶)和底物(如3,3'-二氨基联苯胺(DAB)和3-氨基-9-乙基咔唑(AEC))，其生成用于区分的颜色(分别是棕色和红色)。生成可检测产物的其他比色氧化还原酶底物是2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、邻苯二胺(OPD)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、邻联二茴香胺、5-氨基水杨酸、4-氯-1-萘酚。发荧光底物的示例是高香草酸、4-羟基-3-甲氧基苯乙酸、还原型吩噁嗪、还原型苯并噻嗪、还原型二氢呫吨、二氢荧光素和二氢若丹明。其他酶-底物组合是酸性或碱性磷酸酶与以下物质的组合：5-溴-6-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)、6-氯-3-吲哚磷酸盐、5-溴-6-氯-3-吲哚磷酸盐、磷酸对硝基苯酯、磷酸邻硝基苯酯、4-甲基伞形基(umbelliferyl)磷酸酯、6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆酰基(methylcoumarinyl)磷酸酯、荧光素二磷酸酯、3-O-甲基荧光素磷酸酯、试卤灵磷酸酯或9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)磷酸酯(DDAO磷酸酯)。其他酶是糖苷酶，特别是β-糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶和β-葡糖苷酶。这些酶的底物包括5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)、邻硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)、对硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷、试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷、荧光素二半乳糖苷(FDG)、荧光素二葡糖苷酸及其结构变体、4-甲基伞形基β-D-吡喃半乳糖苷、羧基伞形基β-D-吡喃半乳糖苷和氟化香豆素β-D-吡喃半乳糖苷。其他酶是水解酶(如乙酰胆碱酯酶和肽酶)、氧化酶(如葡萄糖氧化酶和细胞色素氧化酶)以及还原酶。所有这些酶的底物是本领域技术人员已知的。
实施例1
使用黑色蜡笔标记厚度为0.18mm的1号沃特曼色谱纸条(美国新泽西州皮斯卡特维的GE医疗保健公司)以勾画出3-4mm宽且50mm长的矩形通道。将该纸条置于加热板上20-30秒以熔化蜡笔蜡并使其穿透纸。随后将纸冷却，使蜡硬化成阻隔，延伸纸的厚度并限定通道的轮廓。随后使用抗-β-半乳糖苷酶兔IgG(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life TechnologiesCorporation))加载四张纸条上的通道，分别使用1:200、1:800、1:3200和1:12,800的稀释度，各通道中加载50μL。
单独地，使用β-半乳糖苷酶加载8.6cm x6.7cmx0.1cm的聚丙烯酰胺平板凝胶，在四条泳道中每条加载0.1μg。300V下在凝胶中进行电泳，持续25分钟。随后使用TURBOTM转移系统(伯乐公司(Bio-RadLaboratories,Inc.))通过Western印迹将所得β-半乳糖苷酶条带从凝胶转移至PVDF膜上(25V下反应3分钟)，随后使用罗克兰封闭缓冲液(美国宾夕法尼亚州吉尔伯茨维尔的罗克兰免疫化学公司(Rockland ImmunochemicalsInc.))处理一小时以对膜进行封闭。
随后将含有抗-β-半乳糖苷酶兔IgG的经浸渍纸条置于膜上，在各泳道上放置一个纸条从而对各泳道使用不同的稀释度，抗-β-半乳糖苷酶兔IgG此时作为一抗。随后将合并的纸条和膜置于使用Tris-甘氨酸浸泡的垫之间并放回TURBOTM转移系统，使其接触0.3安培的电流3分钟。随后将纸条和膜从转移系统中移出，将纸条从膜中移出，整个膜使用含有吐温20的Tris-缓冲盐水(TTBS)清洗并随后使用10mL、1:200稀释的作为二抗的ALEXA488山羊抗兔IgG(生命技术公司)处理。
观察后，在所有四个条带中获取β-半乳糖苷酶条带的可检测图像。
实施例2
如实施例1中所述在1号沃特曼色谱纸条中形成以蜡为边界的通道并使用1:20和1:40稀释的实施例1的二抗代替一抗浸渍通道，对各通道使用50μL。使用1:40稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体浸渍额外的纸条。使用β-半乳糖苷酶加载与实施例1相同尺寸的聚丙烯酰胺平板凝胶，在三条泳道中各加载0.1μg，进行电泳并将所得β-半乳糖苷酶条带转移至PVDF膜上，如实施例1中所述。
随后使用1:5000稀释的作为一抗的抗-β-半乳糖苷酶兔IgG处理整个膜一小时，随后清洗，之后将二抗的纸条置于单个泳道上。随后将覆盖有纸条的膜放回TURBOTM转移系统，使其在0.3安培的电流下运行3分钟。随后将纸条和膜从转移系统中移出，将纸条从膜中移出，使用处理伯乐公司的IMMUN-STARTM化学发光试剂盒处理含有HRP标记抗体的区域。观察后，在所有条带中获取β-半乳糖苷酶条带的可检测图像。
实施例3
如实施例1和2中所述在1号沃特曼色谱纸条中形成以蜡为边界的通道并使用含有一抗和二抗的混合物浸渍通道。所有混合物中的一抗都是1:400抗-β-半乳糖苷酶，同时使用了三种不同二抗，各混合物中使用一种，如下所示：ALEXA488山羊抗兔IgG、ALEXA546山羊抗兔IgG和ALEXA647山羊抗兔IgG，所有二抗均为1:200稀释。应用于相应通道的各混合物体积是20微升。将纸条置于PVDF印迹膜(其上已印迹有来自电泳凝胶的β-半乳糖苷酶条带)的单个泳道上并置于TURBOTM转移系统中，使其在0.1安培的电流下运行5分钟。当纸条和膜从转移系统中移出并且纸条从膜中移出，此时二抗上三种不同颜色的标记各自均以不同条带的形式在膜上可见。
在所附的权利要求书中，术语“一个”或“一种”用来表示“一个(种)或多个(种)”。在述及步骤或要素时，其前导术语“包含”及其变化形式例如“包括”和“含有”旨在表示其它步骤或要素的增加是可任选且不被排除的。本说明书中引用的所有专利、专利申请和其它公开的参考材料都通过引用全文纳入本文中。当本说明书的内容与本发明引用的任何参考材料或任何现有技术之间存在矛盾之处的时候，以本说明书为准。所述矛盾之处包括现有技术对词或词组的定义与本说明书对相同的词或词组明确给出的定义之间的任何差异。

Claims (22)

1.一种通过使水基结合试剂接触分子物质以确定所述分子物质是否固定在平面支持物上的方法，所述方法包括：
(a)使所述平面支持物与具有侧向限定区域的多孔亲水性片材接触，所述侧向限定区域以疏水性或不可透过的阻隔为边界并将所述水基结合试剂保留在所述侧向限定区域内，同时将所述侧向限定区域对准所述平面支持物上可能固定了所述物质的点；
(b)使所述水基结合试剂从所述多孔亲水性片材的所述侧向限定区域向所述点转移；以及
(c)检测所述水基结合试剂与所述分子物质之间发生的任何结合反应，以所述结合作为所述点中存在所述分子物质的指示。
2.如权利要求1所述的方法，所述阻隔是疏水性的。
3.如权利要求2所述的方法，所述疏水性阻隔是蜡或硅烷化转移片材。
4.如权利要求3所述的方法，所述硅烷化转移片材包含硅烷化纤维素。
5.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)是通过扩散进行的。
6.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)是通过毛细印迹进行的。
7.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)是通过真空印迹进行的。
8.如权利要求1所述的方法，所述平面支持物是印迹膜且步骤(b)是通过电泳转移进行的，其中，将第一缓冲溶液湿润的吸收材料片材置于所述印迹膜中与所述多孔亲水性片材接触一侧相对的一侧，并将第二缓冲溶液湿润的吸收材料片材置于所述多孔亲水性片材中与所述印迹膜接触一侧相对的一侧，从而形成转移叠层，并使电流以导致所述转移的方向通过所述转移叠层。
9.如权利要求1所述的方法，所述结合试剂是通过免疫结合结合所述分子物质的抗体。
10.如权利要求1所述的方法，所述结合试剂是携带下列物质的试剂：比色标记、发荧光标记、化学发光标记和放射性标记。
11.一种制备水基结合试剂转移片材的方法，所述水基结合试剂可逆地固定在以阻隔为边界的侧向限定区域中，所述方法包括
提供多孔亲水性转移片材；
使所述转移片材接触硅烷化试剂形成以硅烷化转移片材阻隔为边界的侧向限定区域；以及
使所述侧向限定区域接触含有结合试剂的水溶液，
从而制备具有水基结合试剂的转移片材，所述水基结合试剂可逆地固定在以阻隔为边界的侧向限定区域中。
12.如权利要求11所述的方法，所述硅烷化试剂是三甲基氯硅烷。
13.如权利要求11所述的方法，所述结合试剂是抗体。
14.如权利要求11所述的方法，所述方法还包括使所述侧向限定区域接触含有第二结合试剂的第二水溶液。
15.如权利要求14所述的方法，所述第二结合试剂是抗体。
16.如权利要求11所述的方法，所述多孔亲水性转移片材包含纤维素。
17.如权利要求11所述的方法，所述转移片材在接触所述硅烷化试剂前被遮蔽。
18.试剂盒，包含容器和其中的1、2、3、4或更多个多孔亲水性片材，所述多孔亲水性片材各自具有1、2、3、4或更多个以疏水性或不可透过的阻隔为边界的侧向限定区域。
19.如权利要求18所述的试剂盒，所述多孔亲水性片材各自具有1、2、3、4或更多种可逆地固定于其上的结合试剂。
20.如权利要求18所述的试剂盒，所述多孔亲水性片材的侧向限定区域的宽度基本相当于电印迹中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多条泳道的宽度。
21.如权利要求18所述的试剂盒，所述容器被构造为保护所述多孔亲水性片材免于接触光照和/或水分。
22.如权利要求18所述的试剂盒，所述试剂盒还包含转移缓冲液。
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