KR20200049388A

KR20200049388A - 페스트균의 f1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20200049388A
Application number: KR1020180132600A
Authority: KR
Inventors: 이규철; 김민정; 김건우
Original assignee: 한국수자원공사
Priority date: 2018-10-31
Filing date: 2018-10-31
Publication date: 2020-05-08
Also published as: KR102244123B1

Abstract

본 발명은 페스트균의 F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 페스트균의 F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주, 상기 단일클론항체를 포함하는 페스트균 검출용 조성물, 키트, 및 상기 단일클론항체를 이용한 페스트균 검출방법에 관한 것이다.

Description

페스트균의 F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도{Monoclonal antibody specifically binding to capsule protein F1 in Yersinia pestis, Hybridoma cell line procuding the same and use thereof}

전세계적으로 IS 테러 및 북한의 화생방 실전 훈련 실시 등으로 대외적으로 위기감이 고조되고 있고, 국내에서도 농약 등 독극물을 이용한 불특정 다수에 대한 민간 사고가 발생하고 있으나, 생물작용제(Biological agent)와 같은 유해물질에 의한 테러 등의 위기 상황의 발생 시 유해물질을 신속하게 분석하여 즉각적인 의사결정을 내릴 수 있는 시스템은 구축되어 있지 않은 실정이다.

2001년 9월 미국 세계무역센터 테러와 우편물에 탄저균을 이용한 생물테러가 발생한 이후 전세계적으로 테러에 대한 공포와 우려가 확산 되었으며 세계 각국에서 자국민 보호를 위한 대응 방안 마련에 고심하고 있다. 생물무기는 재래식 무기에 비해 경제적으로 저렴하고 쉽게 은닉하여 살포할 수 있으며, 살포가 이루어진 후 환자 발생에 있어 시간적으로 차이가 있으므로 초기에 감지하기가 어렵고, 극미량으로 치사량이 되며, 한번 오염되면 스스로 번식·확산하는 특성을 지니고 있다. 또한 생물무기는 폭로시 일정기간의 잠복기가 있어 즉각적으로 증상이 나타나지 않기 때문에 오염지역을 확인하기가 쉽지 않고 감염 사실을 확인했을 때는 이미 넓은 지역, 많은 사람들에게 전파시킨 후일 가능성이 높다. 이러한 생물무기의 특성과 북한 및 이라크를 둘러싼 국제정세, APEC, G20 및 G50과 같은 대규모 행사 개최 등으로 인하여 생물테러 발생 가능성과 우려가 증가하는 실정이므로 현재 우리나라는 생물테러 가능성이 높은 탄저, 두장, 보툴리눔 독소증, 페스트, 바이러스성 출혈열을 법정 전염병으로 지정하여 관리하고 있다.

이들 중 페스트균(Yersinia pestis)은 흑사병을 일으키는 균으로 쥐에서 벼룩을 매개로서, 또는 환자의 객담을 통해서 사람에 감염된다. 페스트균은 현재 주로 아시아, 아프리카, 아메리카 대륙에 부분적으로 분포해 있다. 흑사병은 진단이 늦어지는 경우 사망률이 높고, 발병 초기에 치료를 시작하는 것이 효과적이므로, 조기에 정확하게 진단하는 것이 매우 중요하다.

따라서, 흑사병의 발병 유무를 정확하고 신속하게 확인할 수 있고, 페스트균을 이용한 생물테러의 발생 시 신속하게 대처하여 이를 통해 먹는 물의 안전성을 확보하기 위한 시스템으로서 페스트균만을 특이적으로 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있다.

한편, 대한민국 공개특허 제10-2017-0034648호에는 시프로플록사신 항생제에 대해 내성을 보이는 페스트균 검출을 위한 PNA 프로브가 개시되어 있으나, 상기 프로브는 GryA (DNA gyrase A) 유전자에 특이적인 것으로 이를 이용하여 항생제 내성 페스트균 변이주를 진단하는 방법만을 개시하고 있어, 페스트균을 신속하고 정확하게 검출하기 위한 방법이 여전히 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 페스트균의 F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하여 페스트균을 검출 및/또는 진단할 수 있는 단일클론항체를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 페스트균 (Yersinia pestis) F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포를 제공하는데 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적은 전술한 단일클론항체를 포함하는 페스트균 (Yersinia pestis) 검출용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전술한 단일클론항체를 이용한 페스트균 (Yersinia pestis) 검출방법을 제공하는 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 하이브리도마 세포주 1F9 (기탁번호 KCTC18725P) 또는 하이브리도마 세포주 1H7 (기탁번호 KCTC18724P)에 의해 생산되는, 페스트균 (Yersinia pestis) F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.

본 발명은 또한, 페스트균 F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 기탁번호 KCTC18725P인 하이브리도마 세포주 1F9 또는 기탁번호 KCTC18724P인 하이브리도마 세포주 1H7을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 페스트균 F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는 페스트균 검출용 조성물 및 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 포획항체; 및 검출항체; 를 포함하는 페스트균(Yersinia pestis) 검출용 측면유동분석(Lateral flow immunoassay) 키트로서, 상기 포획항체는 하이브리도마 세포주 1F9 (기탁번호 KCTC18725P)에 의해 생산되는, 페스트균 (Yersinia pestis) F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체이고, 상기 검출항체는 하이브리도마 세포주 1H7 (기탁번호 KCTC18724P)에 의해 생산되는, 페스트균 F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체인 페스트균 검출용 측면유동분석 키트를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 측면유동분석 키트는 샘플 패드 (sample pad), 컨쥬게이트 패드 (conjugate pad), 니트로셀룰로스 멤브레인 (nitrocellulose membran), 흡수 패드 (absorbent pad) 및 금나노입자를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 페스트균 F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 분리된 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는 페스트균 검출방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 초유, 관절액, 타액, 분변, 세포 배양 상등액 및 식품으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 항원-항체 복합체의 형성은 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블로팅(Western Blotting), 면역형광(Immunofluorescence), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry staining), 유세포분석법(Flow cytometry), 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법 (Immunodiffusion assay), 측면유동면역분석법 (Lateral flow immunoassay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay) 및 단백질 칩(Protein Chip)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에 의해 확인될 수 있다.

본 발명은 또한, 전술한 페스트균 검출용 측면유동분석 키트를 이용한 페스트균 검출방법을 제공한다.

본 발명에 따른 단일클론항체는 페스트균의 F1 캡슐 단백질과의 높은 특이 결합을 통해 약 10ng/ml 농도의 F1 캡슐 단백질을 포함하는 샘플에서도 페스트균을 검출할 수 있어, 페스트균 검출용 키트 및 페스트균 검출방법에 유용하다. 본 발명의 단일클론항체 및 키트를 이용하여 생물 무기 중 미국 질병관리본부 카테고리 B에 해당하는 페스트균을 신속하고 정확하게 분석검출함으로써 생물 무기에 의한 사고에 신속하게 대처할 수 있으며 이를 통해 식수의 안전성 확보가 가능하다.

도 1은 페스트균 F1 유전자 서열을 클로닝하기 위한 pBHA 벡터 맵을 도시한 것이다.
도 2는 페스트균 F1 캡슐 단백질을 발현하기 위한 pET21 벡터 맵을 도시한 것이다.
도 3은 페스트균 F1 재조합 유전자를 전기영동을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 페스트균 F1 캡슐 단백질의 과잉 발현 유도 전과 후의 수용성 및 불용성 단백질을 전기영동을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 과잉 발현 후 수득한 페스트균 F1 수용성 단백질로부터 정제한 F1 재조합 항원을 전기영동을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 단일클론항체 1F9, 1H7, 3H5 및 1E6을 이용하여 측면유동면역분석법으로 페스트균 검출을 수행한 결과를 나타낸 것이다.

상술한 바와 같이, 페스트균(Yersinia pestis) 감염으로 발병하는 흑사병은 진단이 늦어지는 경우 사망률이 높고, 발병 초기에 치료를 시작하는 것이 효과적이므로, 조기에 정확하게 진단하는 것이 매우 중요하다. 이에 따라, 흑사병의 발병 유무를 정확하고 신속하게 확인할 수 있고, 페스트균을 이용한 생물테러의 발생 시 신속하게 대처하여 이를 통해 먹는 물의 안전성을 확보하기 위한 시스템으로서 페스트균을 특이적으로 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 페스트균의 F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하여 페스트균을 검출 및/또는 진단할 수 있는 단일클론항체를 제공함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다. 본 발명에 따른 단일클론항체는 페스트균의 F1 캡슐 단백질과의 높은 특이 결합을 통해 약 10ng/ml 농도의 F1 캡슐 단백질을 포함하는 샘플에서도 페스트균을 검출할 수 있어, 페스트균 검출용 키트 및 페스트균 검출방법에 유용하다. 본 발명의 단일클론항체 및 키트를 이용하여 생물 무기 중 미국 질병관리본부 카테고리 B에 해당하는 페스트균을 신속하고 정확하게 분석검출함으로써 생물 무기에 의한 사고에 신속하게 대처할 수 있으며 이를 통해 식수의 안전성 확보가 가능하다.

이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B"의 기재는, "A 또는 B, 또는, A 및 B"를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.

본 발명은 하이브리도마 세포주 1F9 (기탁번호 KCTC18725P) 또는 하이브리도마 세포주 1H7 (기탁번호 KCTC18724P)에 의해 생산되는, 페스트균 (Yersinia pestis) F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포 및 이의 제조방법을 제공한다.

본 명세서에서, '페스트균 F1 캡슐 단백질'은 단백질 그 자체, 그의 유전자 재조합 단백질, 이들의 인공변이체 및 돌연변이체뿐만 아니라 단백질의 천연 형태 및 이의 기능적 등가물을 포함한다.

본 발명의 페스트균 F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 융합 방법(fusion method)에 의해 제조될 수 있다(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조). 단일클론항체를 분비하는 '하이브리도마'를 만들기 위해 융합되는 두 세포 집단 중 하나의 집단은 페스트균 F1 캡슐 단백질을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주동물의 세포를 이용하고, 나머지 하나의 집단으로는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 집단의 세포들을 폴리에틸렌글리콜과 같은 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있는 방법에 의해 융합시키고 나서 항체-생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 수득하고 나서, 페스트균 F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주를 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 또는 웨스턴블럿 분석법으로 선별하고, 표준 기술에 따라 시험관내에서 또는 생체내에서 대량으로 배양한다. 상기 생체내 대량배양은 하이브리도마 세포주를 마우스의 복강에 주사하여 고농도의 항체 생산을 유도한 후, 복수액(ascites)에서 분리하는 것을 의미한다.

상기 하이브리도마 세포주가 생산하는 단일클론항체는 정제하지 않고 사용하거나, 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용할 수 있다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 항원 컬럼 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액(ascites)에서 분리할 수 있다.

본 발명에 따른 단일클론항체를 생산하는 10종의 하이브리도마 중 최종 선별된 2종의 하이브리도마를 각각 1F9 및 1H7로 명명하고 이를 2018년 10월 25일자로 한국생명공학연구원(Korean Collection for Type Cultures, KCTC) 생물자원센터(Biological Resource Center, BRC)에 기탁하였고, 하이브리도마 세포주 1F9는 기탁번호 KCTC18725P로, 하이브리도마 세포주 1H7는 기탁번호 KCTC18724P로 기탁되었다. 본 발명에서 '하이브리도마 세포주 1F9'와 '하이브리도마 세포주 1H7'이 생산하는 단일클론항체를 각각 '1F9'및 '1H7'로 명명하였다.

항원을 검출하기 위해 단일클론항체를 사용하는 경우의 이점은 단일 에피토프를 인지함으로써 특정한 상호작용을 갖는다는 것이다. 이와 같이 항원과 항체간의 상호작용에 관여하는 에피토프를 맵핑(mapping)하기 위해 다양한 접근 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 파아지 디스플레이 펩타이드 라이브러리를 사용하여 바이오패닝, 항원 폴리펩타이드를 프로테아제로 분해하여 생성된 단편을 면역블럿팅하여 스크리닝함으로써 에피토프 서열을 포함하는 단편을 결정, 활성화된 막 또는 폴리에틸렌 핀과 같은 고체상에 고정된 펩타이드 어레이를 스크리닝, 에피토프 서열내의 각각의 아미노산 서열 잔기의 중요성을 가용성 펩타이드를 사용한 경쟁적 ELISA 검정방법 등이 있다.

본 발명에 따른 단일클론항체는 IgG, IgA, IgM, IgE, 및 IgD 이소타입으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, IgG 이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 '단일클론항체'란 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 통상적으로, 상이한 에피토프(항원결정기)들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론 항체와는 다르게, 단일클론 항체는 항원상의 단일 결정기에 대해서 지시된다. 단일클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마 배양에 의해 합성되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 장점을 갖는다. 본 명세서에서는 페스트균 F1 캡슐 단백질에 대한 항체로서, 전체 항체 형태일 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다(cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed.,Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).

항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2, 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루고 있다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 국제 공개특허 WO 88/10649, WO 88/106630, WO88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. dsFv(이쇄 Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 scFv(단쇄 Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C 말단에서 바로 연결되어 있어서 dsFv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다.

이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 본 발명에서 항체는 바람직하게는 Fab 형태이거나 전체 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.

또한, 본 발명의 항체는 키메릭 항체 또는 키메릭 항체의 면역원성을 더욱 감소시키기 위한 인간화 항체(humanized antibody) 또는 CDR-이식항체 (CDR-grafted antibody) 일 수 있다.

키메릭(chimeric) 항체란 항체 가변영역(variable domain)은 인간 이외의 동물(예를 들면, 마우스, 토끼, 가금류 등)에서 유래하고, 항체 불변 영역(constant domain)은 인간에서 유래한 항체를 의미한다. 이러한 키메릭 항체는 당업계에 공지된 유전자 재조합 등의 방법으로 제조될 수 있다.

인간화 항체(humanized antibody) 또는 CDR-이식항체 (CDR-grafted antibody)는 동물유래 단일클론 항체의 높은 친화도와 특이성은 유지하도록 하고 인체 내에서의 면역유발능을 감소시키기 위하여, 동물 유래 단일클론 항체의 항원결합영역(Complementarity determining region; CDR)을 인간항체에 이식시켜 제조되는 항체를 의미하며, 항원에 대한 친화도와 인체 내에서의 면역유발 정도를 고려하여 인간화시키는 정도를 선택할 수 있다.

본 발명은 또한, 페스트균 F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는 페스트균(Yersinia pestis) 검출용 조성물 및/또는 키트를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 측면유동분석 키트는 샘플 패드 (sample pad), 컨쥬게이트 패드 (conjugate pad), 니트로셀룰로스 멤브레인 (nitrocellulose membran), 흡수 패드 (absorbent pad) 및 금나노입자를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 측면유동분석 키트는 샘플 패드 (sample pad), 컨쥬게이트 패드 (conjugate pad), 니트로셀룰로스 멤브레인 (nitrocellulose membran) 및 흡수 패드 (absorbent pad)가 순차적으로 연결된 구조를 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 측방 유동 분석 스트립 센서는 샘플 패드, 컨쥬게이트 패드, 멤브레인 및 흡수 패드가 순차적으로 연결된 구조를 포함하고, 상기 컨쥬게이트 패드에는 나노입자와 상기 항원에 결합하는 검출항체가 연결된 나노입자-검출항체 컨쥬게이트가 포함되어 있으며, 상기 멤브레인상에는 상기 컨쥬게이트 패드로부터 상기 흡수 패드 방향으로 테스트 라인, 항원 라인 및 콘트롤 라인이 순차적으로 형성되어 있고, 상기 테스트 라인에는 상기 항원에 결합하는 포획항체가 고정되어 있으며, 상기 항원 라인에는 상기 항원이 고정되어 있고, 상기 콘트롤 라인에는 상기 검출항체에 결합하는 2차 항체가 고정되어 있을 수 있다.

본 발명의 키트에 있어서, 상기 “샘플 패드”는 분석을 행할 샘플을 수용하여 확산 흐름이 가능한 패드를 의미하며, 분석을 행할 샘플을 수용하여 함유하기에 충분한 다공성을 갖는 물질로 구성된다. 이러한 다공성 물질로는 섬유성 종이, 셀룰로오스 물질로 된 미세 기공 멤브레인, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 유도체, 니트로셀룰로오스, 유리섬유, 천연발생의 면(cotton), 나일론과 같은 직물 또는 다공성 겔 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 키트에서 상기 “컨쥬게이트 패드”는 샘플 패드로부터 확산되어 이동되는 샘플을 수용하며, 동시에 나노입자와 항원에 결합하는 검출항체가 연결된 “나노입자-검출항체 컨쥬게이트”가 포함되어 있는 패드이다. 컨쥬게이트 패드는 샘플 패드와 마찬가지로 확산 흐름이 가능한 물질로 구성된다.

상기 컨쥬게이트 패드에 포함된 “나노입자-검출항체 컨쥬게이트”의 나노입자는 검출가능한 표지로서 작용하는 나노입자를 의미한다. 상기 나노입자는 바람직하게는 금속의 나노입자이며, 상기 금속으로는 예를 들어 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 팔라듐(Pd), 이리듐(Ir), 로듐(Rh), 루테늄(Ru)의 귀금속; 티타늄(Ti), 지르코늄(Zr), 하프늄(Hf), 바나듐(V), 나이오븀(Nb), 탄탈럼(Ta), 크로뮴(Cr), 몰리브데늄(Mo), 텅스텐(W), 루테늄(Ru), 오스뮴(Os)의 전이금속; 철(Fe), 니켈(Ni), 코발트(Co)등의 금속; 산화마그네슘(MgO), 이산화티타늄(TiO₂), 오산화바나듐(V₂O₅), 산화아연(ZnO)의 금속산화물 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 나노입자는 가장 바람직하게는 금(Au) 나노입자이다.

상기 검출항체는 분석하고자하는 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 결합 특이성을 보유한다면 항체의 단편도 포함하는 의미이다.

상기 검출항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 모노클로날 항체를 사용한다. 본 발명에서는 단일클론항체 1H7을 검출항체로 사용하였다.

상기 나노입자와 검출항체의 결합은 예컨대 이온결합, 공유결합, 금속결합, 배위결합, 수소결합, 및 반데르발스결합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 키트에서 상기 “멤브레인”은 샘플 물질이 통과할 수 있는 다양한 물질로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 천연, 합성, 또는 합성에 의해 변형된 천연 발생 물질, 예를 들어 폴리사카라이드(예: 셀룰로오스 물질, 종이, 셀룰로오스 아세테이트 및 니트로셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체); 폴리에테르 술폰; 폴리에틸렌; 나일론; 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF); 폴리에스테르; 폴리프로필렌; 실리카; 비닐 클로라이드, 비닐 클로라이드-프로필렌 공중합체 및 비닐 클로라이드-비닐 아세테이트 공중합체와 같은 중합체와 함께 다공성 중합체 매트릭스에 균일하게 분산된 무기 물질, 예를 들어 불활성화된 알루미나, 규조토, MgSO₄, 또는 다른 무기 미분 물질; 자연 발생(예: 면) 및 합성(예: 나일론 또는 레이온) 천; 다공성 겔, 예를 들어 실리카겔, 아가로스, 덱스트란 및 젤라틴; 중합체 필름, 예를 들어 폴리아크릴아미드; 등의 물질로부터 형성될 수 있다.

바람직하게는 상기 멤브레인은 중합체 물질, 예를 들어 니트로셀룰로오스, 폴리에테르술폰, 폴리에틸렌, 나일론, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리에스테르 및 폴리프로필렌을 포함한다.

본 발명의 키트에서 상기 “흡수패드”는 상기 멤브레인의 말단에 또는 그 가까이에 인접해서 위치할 수 있다. 흡수 패드는 일반적으로 전체 멤브레인을 통해 이동하는 유체 샘플을 받아들인다. 흡수 패드는 멤브레인을 통한 모세관 작용 및 유체의 확산 유동을 촉진하는 데 도움을 줄 수 있다.

본 발명의 키트는 상기한 샘플 패드, 컨쥬게이트 패드, 멤브레인 및 흡수 패드가 동일한 지지체상에 순차적으로 연결되어 구성된다. 상기 지지체는 상기한 샘플 패드, 컨쥬게이트 패드, 멤브레인 및 흡수 패드를 지지 및 운반할 수 있다면 어떠한 물질로도 형성될 수 있으나, 일반적으로 상기 멤브레인을 통해 확산하는 샘플의 유체가 지지체를 통해 누출되지 않도록 액체 불투과성인 것이 바람직하다. 예컨대, 유리; 중합체물질 예를 들어 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리부타디엔, 폴리비닐클로라이드, 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 에폭시드, 메타크릴레이트 및 폴리멜라민 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 키트에서 상기 멤브레인상에는 상기 컨쥬게이트 패드로부터 상기 흡수 패드 방향으로 테스트 라인(test line), 항원 라인(antigen line) 및 콘트롤 라인(control line)이 순차적으로 형성되어 있다.

본 발명의 키트에서 상기 “테스트 라인”에는 상기 항원에 결합하는 포획항체가 고정되어 있다. 본 발명에서는 단일클론항체 1F9를 포획항체로 사용하였다.

본 발명의 키트에서, 상기 “항원 라인”에는 상기 항원이 고정되어 있다. 바람직하게는 상기 항원 라인에 고정된 항원은 멤브레인상에 고정된 포획항체를 매개로 하여 고정된다. 상기 항원 라인에서 항원을 멤브레인상에 직접 고정시키기 보다는 포획항체상에 결합시켜 고정시키게 되면 나노입자-검출항체와의 결합이 용이하게 되도록 항원을 적절한 방향으로 노출시킬 수 있어, 결과적으로 키트의 항원 검출 성능을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 키트에서, 상기 “콘트롤 라인”에는 상기 검출항체에 결합하는 2차 항체가 고정되어 있다. 콘트롤 라인의 2차 항체는 나노입자-검출항제 또는 나노입자-검출항체-항원 복합체에 결합하여 이에 대한 검출 신호를 발생시킨다.

본 명세서에서 용어 “항원”은 농도 또는 존재 여부를 분석하고자 하는 대상물질을 지칭하는 의미이며, 예컨대 페스트균 또는 이의 F1 캡슐 단백질을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 페스트균 검출용 키트에 사용되는 단일클론항체는 이 항체가 페스트균 F1 캡슐 단백질을 선별적으로 인지할 수 있는 한, 단일클론항체의 단편도 사용할 수 있다. 이러한 항체 단편은 F(ab')₂, Fab, Fab', Fv 단편 등을 포함할 수 있다.

페스트균 검출용 키트는 본 발명의 단일클론항체가 부착된 단백질 칩 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 페스트균 검출용 키트에는 페스트균 F1 캡슐 단백질을 선별적으로 인지하는 단일클론항체 또는 이의 단편 및 면역학적 분석에 사용되는 도구/시약이 포함될 수 있다.

상기 면역학적 분석에 사용되는 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제 등이 포함된다. 또한, 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.

적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 페스트균 검출용 키트에 사용하기 위한 검정 시스템은, 이에 한정되는 것은 아니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 및 플로우-쓰로우(flowthrough) 디바이스 등을 포함한다.

본 발명은 또한, 단일클론항체를 분리된 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는 페스트균(Yersinia pestis) 검출방법을 제공한다.

본 발명의 페스트균 검출방법에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 초유, 관절액, 타액, 분변, 세포 배양 상등액 및 식품으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 페스트균 감염 또는 존재 여부를 확인하고자 하는 시료라면 제한없이 사용될 수 있다.

본 발명의 페스트균 검출방법에 있어서, 상기 용어 '항원-항체 복합체'는 상기 생물학적 시료에서 페스트균의 존재 여부를 확인하기 위한 페스트균 F1 캡슐 단백질과 이를 인지하는 단일클론항체의 결합물을 의미한다.

상기 항원-항체 복합체는 검출 표지체(detection label)를 이용하여 검출할 수 있다. 예컨대, 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미세입자(microparticle), 레독스 분자 또는 방사선동위원소 등에서 선택될 수 있으며, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 효소는 예컨대, β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물질에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물질에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미세입자에는 콜로이드 금, 금나노입자, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K₄W(CN)₈, [Os(bpy)₃]²⁺, [RU(bpy)₃]² ⁺ 또는 [MO(CN)₈]⁴ ^- 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I 또는 ¹⁸⁶Re 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.

상기 항원-항체 복합체의 형성은 비색법(colorimetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment), 또는 섬광계수법(scintillation counting method) 등을 사용하여 검출할 수 있다. 예컨대, 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블로팅(Western Blotting), 면역형광(Immunofluorescence), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry staining), 유세포분석법(Flow cytometry), 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법 (Immunodiffusion assay), 측면유동면역분석법 (Lateral flow immunoassay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay) 및 단백질 칩(Protein Chip) 등의 방법에 의해 검출할 수 있다.

보다 구체적으로, 소량의 목적 단백질을 회수하는데 유용한 면역침강법(immune precipitation) 및 면역블롯팅을 통해 검출할 수 있다.

가장 구체적으로, 항원-항체 복합체를 효소면역측정법(ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 검출할 수 있다. 상기 ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지를 하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.

상기 ELISA 검출방법에 따라, 생물학적 시료는 고체 지지체, 예를 들어 마이크로타이터 플레이트, 멤브레인, 테스트 스트립 등에 코팅된 본 발명의 단일클론 항체와 접촉된다. 구체적 일례로서, 마이크로타이터 플레이트의 웰을 본 발명의 단일클론 항체로 코팅하고 점유되지 않은(nonoccupied) 결합 부위를 예를 들어 BSA로 차단한 후, 코팅된 플레이트의 웰을 시료 샘플과 인큐베이션하고, 이어서 항원-항체 복합체의 존재를 결정할 수 있다. 항원-항체 복합체의 존재는 항원-항체 복합체의 항원에 대해 특이적인 항체, 예를 들어 페스트균 F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 다클론항체를 사용하여 확인할 수 있다. 상기 단일클론항체 또는 다클론항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출 표지를 갖지 않는 경우 이들 단일클론항체 또는 다클론항체를 검출할 수 있는 또 다른 항체로 처리하여 확인할 수 있다.

구체적 예시로서, 지지체에 부착된 포획 단일클론항체를 생물학적 시료와 반응시키고 이어서 페스트균 F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 결합시켜 이로부터 검출 표지 신호를 측정하거나 이들 복합체에 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지를 갖는 2차 항체를 첨가하여 이로부터 검출 표지 신호를 측정하여 페스트균을 검출할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따라, 전술한 측면유동분석 키트를 이용하여 페스트균을 검출할 수 있다.

이상에서 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시 예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시 예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.

페스트균 단일클론 항체 제작을 위한 면역원 개발

1-1. 페스트균 캡슐 단백질(capsule protein) F1 유전자 합성

페스트균 F1 유전자 서열은 하기 표 1과 같으며, ㈜바이오니아에 유전자 합성을 의뢰하여 pBHA 벡터(도 1)에 클로닝된 페스트균 F1 플라스미드 DNA를 얻었다. 유전자 합성시 단백질 발현 벡터로 클로닝을 위해 5’ 말단에는 HindIII( AAGCTT ) 제한효소를, 3’ 말단에는 XhoI( CTCGAG ) 제한효소를 추가하여 합성하였다.

유전자 이름	염기서열	서열번호
페스트균 캡슐 단백질 F1	AAGCTT GCA GAT TTA ACT GCA AGC ACC ACT GCA ACG GCA ACT CTT GTT GAA CCA GCC CGC ATC ACT CTT ACA TAT AAG GAA GGC GCT CCA ATT ACA ATT ATG GAC AAT GGA AAC ATC GAT ACA GAA TTA CTT GTT GGT ACG CTT ACT CTT GGC GGC TAT AAA ACA GGA ACC ACT AGC ACA TCT GTT AAC TTT ACA GAT GCC GCG GGT GAT CCC ATG TAC TTA ACA TTT ACT TCT CAG GAT GGA AAT AAC CAC CAA TTC ACT ACA AAA GTG ATT GGC AAG GAT TCT AGA GAT TTT GAT ATC TCT CCT AAG GTA AAC GGT GAG AAC CTT GTG GGG GAT GAC GTC GTC TTG GCT ACG GGC AGC CAG GAT TTC TTT GTT CGC TCA ATT GGT TCC AAA GGC GGT AAA CTT GCA GCA GGT AAA TAC ACT GAT GCT GTA ACC GTA ACC GTA TCT AAC CAA GAA CTCGAG	1

1-2. 유전자 재조합 플라스미드 제작

단백질 발현벡터는 6개의 히스티딘이 포함되어 있는 pET21b 벡터 (Merck)를 선정하였다. 페스트균 F1과 pET21 플라스미드 DNA를 뉴클레오젠 (Nucleogen)사의 플라스미드 정제 미니 키트 (Plasmid Purification Mini Kit)를 이용하여 순수정제한 후 TAKARA의 HindIII, XhoI 제한효소와 반응버퍼를 넣고 37℃에서 3시간 동안 절단반응을 하였다. 제한효소 절단반응이 완료된 페스트균 F1과 단백질 발현 벡터 pET21은 1% 아가로스 겔 전기영동을 한 후 DNA 사이즈 마커와 비교하여 페스트균 F1은 450bp, pET21 벡터는 5443bp에서의 유전자 산물을 잘라낸 후 뉴클레오젠사의 겔 추출 키트 (Gel extraction Kit)를 이용하여 DNA를 순수분리하였다.

정제가 끝난 페스트균 F1과 pET21 벡터는 DNA 정량을 실시하였으며, 페스트균 F1과 pET21 벡터 DNA의 몰농도를 5:1의 비율로 NEB사의 T4 DNA 리가아제 (ligase)를 사용하여 25℃에서 2시간 이상 반응시켰다. 라이게이션 (ligation)이 완료된 반응물을 E.coli (DH5α)에 형질전환한 후 항생제 암피실린이 포함된 LB 평판배지에 도말하여 37℃의 배양기에서 16시간 동안 배양하였다. 생성된 단일 콜로니를 LB 액체배지에서 키워 플라스미드 DNA를 순수분리하였다. 순수 분리한 페스트균 F1 유전자 재조합 DNA는 다시 HindIII, XhoI 제한효소로 절단하여 pET21 벡터와 페스트균 F1이 분리된 것을 최종 확인하였다 (도 3).

1-3. 페스트균 캡슐 단백질 F1의 과잉 발현

페스트균 F1 유전자와 단백질 발현 벡터 pET21b가 라이게이션된 클론을 확인한 후 페스트균 F1 재조합 유전자 플라스미드 DNA를 순수 정제하였으며, 정제된 페스트균 F1 재조합 DNA는 단백질의 과잉 발현을 유도하기 위해 재조합 단백질 발현을 위한 수용 균주인 BL21(DE3)에 형질전환하였다.

형질전환은 BL21(DE3)의 항체 반응 능력이 있는 세포 (competent cell)를 녹인 후 페스트균 F1 재조합 DNA 1ul를 BL21(DE3) 세포에 넣고 잘 섞어 주었다. 42℃로 맞춰진 히트 블록 (Heat Block)에 세포를 넣고 90초간 열 충격을 준 후 꺼내어 세포를 항생제 암피실린이 포함된 LB 평판배지에 도말하여 37℃ 배양기에서 16시간 이상 배양하였다. 생성된 단일 콜로니를 항생제가 들어간 LB 배지에 접종하여 배양한 후 LB 배지에서 충분히 자란 배양액을 새로운 LB 배지에 1%가 되도록 접종하여 배양한 후 페스트균 F1 재조합 단백질이 BL21(DE3) 균주에서 발현되는 것을 유도하기 위해 세포가 O.D 600의 값이 0.8 수준으로 자랐을 때 IPTG(최종 농도 0.5mM)를 첨가하고 25℃ 배양기에서 3시간 동안 추가 배양하여 페스트균 F1 단백질의 과잉발현을 유도하였다.

과잉발현이 끝난 BL21(DE3) 세포를 원심분리로 수확하였으며 수확한 세포를 용해 버퍼로 현탁하고, 초음파 파쇄를 통하여 분해시킨 후 세포 추출물을 원심분리하여 상층액을 취하여 수용성 단백질을 분리하였으며, 상층액을 취하고 남은 펠릿을 다시 8M 우레아 (Urea)가 포함된 용해 버퍼로 펠릿이 모두 풀어질 때까지 충분히 풀어준 후 원심 분리하여 상층액을 얻어 불용성 단백질을 분리하였다.

페스트균 F1 재조합 단백질 과잉 발현 유도 전과 유도 후의 수용성 단백질, 불용성 단백질을 각각 5배로 농축된 SDS 샘플 로딩 버퍼와 혼합하여 끓는 물에 5분간 끓인 후 샘플을 SDS-PAGE로 전기영동을 하였다. 쿠마씨 블루 (Coomassie Blue)로 염색하여 확인한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 페스트균 F1 재조합 단백질이 약 21kDa의 크기로 과잉 발현된 것을 확인하였고, 대부분의 단백질이 수용성 단백질의 형태로 과잉 발현된 것을 확인하였다.

1-4. 페스트균 캡슐 단백질 F1 항원 정제

페스트균 F1 재조합 단백질을 순수하게 분리를 하기 위해 친화 크로마토그래피를 실시하였다. 친화 크로마토그래피는 Ni-NTA 컬럼을 사용하였다. 먼저 Ni-NTA 컬럼을 완충액으로 충분히 세척하여 평형화 시킨 후 니켈 컬럼에 과잉발현이 끝나고 파쇄하여 얻은 페스트균 F1 수용성 단백질 용액을 흘려보내 컬럼에 페스트균 F1 단백질이 흡착되도록 하였다. 20mM 이미다졸이 포함된 세척액을 충분히 흘려보내 페스트균 F1 단백질 이외의 비특이 단백질을 컬럼에서 제거시켰다. 다시 완충액으로 평형화시킨 후 250mM 이미다졸이 포함된 용출액을 흘려보내 컬럼에 흡착되어 있는 페스트균 F1 재조합 항원을 용출시켰다. 정제한 페스트균 F1 재조합 항원을 SDS-PAGE 전기영동 후 쿠마씨 블루 용액으로 염색하여 확인하였다 (도 5).

페스트균의 F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 생산

2-1. 생쥐의 면역

항체 생산을 위한 면역화된 생쥐를 얻기 위하여, 앞서 정제한 페스트균 F1 재조합 항원을 1mg/ml의 농도로 희석한 후에 항원과 동일한 부피의 FCA (Freund's complete adjuvant, Sigma 사)를 유화될 때까지 혼합시켜 에멀젼(emulsion)을 제조한 후 생후 6~8주령의 BALB/c 생쥐의 발바닥에 주사하였다. 최초 면역을 실시한 후 2주 간격으로 3회 추가 면역을 실시하였으며 추가면역에는 FCA 대신 FIA(Freund’s incomplete adjuvant, Sigma 사)와 페스트균 F1 항원을 혼합하여 에멀젼을 제조하여 사용하였다.

2-2. 세포 융합

최종 면역을 마친 마우스를 1주일간 더 사육하고 CO₂ 가스를 사용하여 희생시켰다. 희생된 마우스를 고정하고 수술용 가위와 핀셋을 이용하여 슬와부의 림프절(popliteal lymphnode)을 적출하였다. 적출한 림프절을 멸균된 RPMI 1640 배지로 세척하고 그라인딩 후 40 μm 메쉬(SPL 사)에 걸러 지방을 제거하고 림프절 세포를 회수하였다. 회수한 림프절 세포를 1,200rpm으로 3분간 원심분리하여 침전시킨 후 RPMI 1640 배지로 2회 세척 후 같은 배지 20ml로 재현탁하여 잘 풀어주었다.

회수한 림프절 세포와 배양한 SP2/0 골수종 세포를 트립토판 블루 용액(Sigma 사)으로 염색하고 현미경으로 관찰하여 살아있는 세포를 측정하였다. SP2/0 골수종 세포와 림프절 세포의 비율이 1:5가 되도록 각 세포를 혼합한 후 1,200rpm으로 3분간 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 흡입으로 상층액을 제거하고 침전된 세포가 들어있는 튜브를 가볍게 쳐서 세포를 잘 섞어주었다. 50%(w/v) PEG 1500(Invitrogen 사) 용액 1 ml을 1 분간 천천히 첨가한 후 RPMI 1640 배지 1 ml을 30 초간, 3 ml을 30 초간, 17 ml을 1 분간 천천히 첨가한 다음 10 ml을 더하여 주었다. 세포를 1,200 rpm에서 5 분간 원심분리하여 침전시키고 흡입으로 상층액을 제거한 다음 침전된 세포를 HAT(hypoxanthine, aminopterin, thymidine)가 함유된 RPMI 1640 배지에 부유시킨 뒤 4개의 96 웰 플레이트(SPL 사)에 웰 당 100μl 씩 분주하고 HAT가 포함된 RPMI 1640 배지를 웰 당 200μl씩 추가한 후 37℃, 5% CO₂ 존재하에서 배양하며 세포의 증식과 상태를 지속적으로 관찰하였다.

2-3. 단일클론항체를 생산하는 융합세포의 선별

페스트균 F1 항원에만 특이적으로 반응하는 융합 세포들을 선정하기 위해 정제된 페스트균 F1 단백질을 항원으로 이용한 ELISA 방법으로 선별하였다. 페스트균 F1 단백질을 100 ㎍/ml의 농도가 되도록 50mM 탄산수소나트륨 버퍼 (pH 9.6)에 희석한 후 96 웰 면역플레이트 (SPL사)에 100 ㎕ 분주하여 4 ℃에서 16 시간 밤새 코팅하였다. 플레이트 표면에 부착시킨 후 부착되지 않은 항원은 PBS-0.05% Tween 20 용액으로 세척하여 제거하였다. 각 웰에 융합세포주를 배양한 후 얻은 상등액을 100 ㎕씩 가하고 1 시간 동안 반응시킨 후 PBS-0.05% Tween 20 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하고 여기에 염소에서 얻은 생쥐의 IgG를 인식하는 항체와 HRP (horseradish peroxidase, Sigma)의 복합체 100 ㎕를 가하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨 다음 PBS-0.05% Tween 20 용액으로 충분히 세척하였다. 세척이 끝난 각각의 웰에 HRP의 기질용액 TMB 용액을 넣어 반응시킨 후 약 10 분 경과 후에 0.16 M H₂SO₄용액으로 반응을 정지한 후 반응 정도를 ELISA 판독기를 사용해 파장 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

웰 플레이트의 흡광도가 높은 웰을 선별하여 새로운 96-웰 플레이트에 한계희석법으로 희석한 후 5~7일간 추가적으로 배양을 하고 ELISA를 수행하여 페스트균 F1 항체를 생산하는 세포를 분리, 확립하였다. 최종적으로 선별한 클론은 1E6, 1F9, 1G4, 1H7, 2G1, 3E5, 3H1, 3H5, 4G5, 4H2 총 10종이며, 단일클론항체를 분비하는 세포주 BALB/c 생쥐의 복강에 주사하여 복수(ascites)를 만들었으며, 만들어진 복수로부터 단일클론항체를 정제하였다.

ELISA 테스트 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

측면유동면역분석법 (Lateral flow immunoassay)을 통한 항원-항체 반응 확인

본 실시예에서는 상기 실시예 2-3에서 최종 선별된 10종의 단일클론항체 중 1E6, 1F9, 1H7 및 3H5 4종의 단일클론항체를 이용하여 측면유동면역분석법으로 페스트균 검출하는 테스트를 수행하였다.

페스트균 검출용 스트립 테스트(strip test)는 샘플 패드 (sample pad), 컨쥬게이트 패드 (conjugate pad), 니트로셀룰로스 멤브레인 (nitrocellulose membrane), 흡수 패드 (absorbent pad)의 4가지 패드로 구성되며 검출 신호의 표지자로는 20nm 금 나노입자를 사용하였다. 금 나노입자와 항체를 결합시킨 복합체를 검출기로 사용하였으며, 페스트균 F1 정제 단백질을 100 ng/ml 및 10 ng/ml의 농도로 희석한 후 샘플 패드에 주입시켜 주어 포획항체 (capture antibody)와 결합하여 검출 신호를 확인하였다.

검출항체와 포획항체는 각각 하기 표 3에 나타난 바와 같이 조합하여 테스트를 수행하였다.

	테스트 1	테스트 2	테스트 3
포획항체	1F9	3H5	1H7
검출항체	1H7	1H7	1E6

그 결과, 테스트 1의 단일클론항체 조합이 페스트균 검출에 가장 효과적임을 확인하였다(도 6).

한국생명공학연구원

KCTC18724P

20181025

한국생명공학연구원

KCTC18725P

20181025

<110> KOREA WATER RESOURCES CORPORATION <120> Monoclonal antibody specifically binding to capsule protein F1 in Yersinia pestis, Hybridoma cell line procuding the same and use thereof <130> 1064375 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 462 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Capsule protein F1 gene <400> 1 aagcttgcag atttaactgc aagcaccact gcaacggcaa ctcttgttga accagcccgc 60 atcactctta catataagga aggcgctcca attacaatta tggacaatgg aaacatcgat 120 acagaattac ttgttggtac gcttactctt ggcggctata aaacaggaac cactagcaca 180 tctgttaact ttacagatgc cgcgggtgat cccatgtact taacatttac ttctcaggat 240 ggaaataacc accaattcac tacaaaagtg attggcaagg attctagaga ttttgatatc 300 tctcctaagg taaacggtga gaaccttgtg ggggatgacg tcgtcttggc tacgggcagc 360 caggatttct ttgttcgctc aattggttcc aaaggcggta aacttgcagc aggtaaatac 420 actgatgctg taaccgtaac cgtatctaac caagaactcg ag 462

Claims

하이브리도마 세포주 1F9 (기탁번호 KCTC18725P)에 의해 생산되는, 페스트균 (Yersinia pestis) F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체.
하이브리도마 세포주 1H7 (기탁번호 KCTC18724P)에 의해 생산되는, 페스트균 (Yersinia pestis) F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체.
제1항의 단일클론항체를 생산하는 기탁번호 KCTC18725P인 하이브리도마 세포주 1F9.
제2항의 단일클론항체를 생산하는 기탁번호 KCTC18724P인 하이브리도마 세포주 1H7.
제1항 또는 제2항에 따른 단일클론항체를 포함하는 페스트균(Yersinia pestis) 검출용 조성물.
제1항 또는 제2항에 따른 단일클론항체를 포함하는 페스트균(Yersinia pestis) 검출용 키트.
포획항체; 및
검출항체; 를 포함하는 페스트균(Yersinia pestis) 검출용 측면유동분석(Lateral flow immunoassay) 키트로,
상기 포획항체는 하이브리도마 세포주 1F9 (기탁번호 KCTC18725P)에 의해 생산되는, 페스트균 (Yersinia pestis) F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체이고,
상기 검출항체는 하이브리도마 세포주 1H7 (기탁번호 KCTC18724P)에 의해 생산되는, 페스트균 F1 캡슐 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체인 페스트균 검출용 측면유동분석 키트.
제7항에 있어서, 상기 측면유동분석 키트는 샘플 패드 (sample pad), 컨쥬게이트 패드 (conjugate pad), 니트로셀룰로스 멤브레인 (nitrocellulose membran), 흡수 패드 (absorbent pad) 및 금나노입자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 페스트균 검출용 측면유동분석 키트.
제1항 또는 제2항의 단일클론항체를 분리된 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는 페스트균(Yersinia pestis) 검출방법.
제9항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 초유, 관절액, 타액, 분변, 세포 배양 상등액 및 식품으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 페스트균 검출방법.
제9항에 있어서, 상기 항원-항체 복합체의 형성은 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블로팅(Western Blotting), 면역형광(Immunofluorescence), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry staining), 유세포분석법(Flow cytometry), 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법 (Immunodiffusion assay), 측면유동면역분석법 (Lateral flow immunoassay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay) 및 단백질 칩(Protein Chip)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에 의해 확인되는 것을 특징으로 하는 페스트균 검출방법.
제7항 또는 제8항에 따른 측면유동분석 키트를 이용한 페스트균 검출방법.