CN103421723B - 一种植物乳杆菌及其在黄酒酿造中的应用 - Google Patents
一种植物乳杆菌及其在黄酒酿造中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种植物乳杆菌及其在黄酒酿造中的应用，属于食品生物技术领域，该菌株命名为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），该菌株系从米浆水中筛选得到，并于2013年9月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8097。本发明得到的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）及其直投式发酵剂可用于黄酒的酿造，使生产过程可控，受季节性影响小，操作简单、方便，对于黄酒酿造工艺的革新具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种乳酸菌，特别是一种植物乳杆菌及其在黄酒酿造中的应用。
背景技术
黄酒作为我国宝贵的物质遗产，与啤酒、葡萄酒一起被称为世界三大古酒，享有“国酒”的美誉。黄酒至今已有5000年的历史，据《国语》和《吕氏春秋》两部史书记载，春秋战国时代南方越国已有酿酒与饮酒的习俗，而《诗经》中“十月获稻，为此春酒”的记载表明我国黄酒当时已形成了秋收—冬酿—春饮的季节性生产技艺，且流传至今。经过五千年的发展，如今黄酒已经具有了独特的酿造工艺和源远流长的酒文化。
黄酒生产中都要对原料米进行浸渍，机械化黄酒生产（以下简称机黄）浸米时间较短2～4d，浸米温度高20～35℃；传统黄酒是在低温15℃或以下浸米，浸米时间为16～20d。浸米浆水中的有机酸主要是由乳酸杆菌发酵而产生的乳酸，乳酸杆菌主要来源于周围环境微生物菌群和从米带入，浸米浆水中的乳酸杆菌的种类和比例，决定着发酵醪液中的乳酸杆菌的种类和比例，随着配料加入浆水，浸米浆水中的乳酸杆菌直接接入发酵醪，浸米浆水中的乳酸调节发酵醪液的低pH值、酸性环境、随配料加入和饭带入的乳杆菌素，有选择性地选择正常有益乳酸杆菌的生长繁殖，浸米浆水中发酵产物和自溶产物及其丰富，如各种氨基酸、维生素、核苷酸等非常丰富，促进发酵醪中酵母和正常有益乳酸杆菌的快速生长繁殖，抑制其它乳酸杆菌和有害细菌的繁殖生长，因此，在开放条件下，确保发酵正常和顺利完成，即浸米浆水也是决定能否营正常发酵和发酵能否顺利完成的关键因素之一。但是长时间的浸米工艺却给黄酒生产带来了不少了难题。一方面，传统黄酒的浸米需要占用大量的浸米场地和浸米容器，并且浸米主要是在露天环境下进行的，这样在浸米过程会网罗空气中的所有微生物，在经过长时间的浸米后，导致浸米浆水中既存在有益微生物又存在有害微生物；另一方面，经过长时间浸米后，原料米表面的糊粉层会进入到米浆水中，并随米浆水进入发酵醪中，糊粉层中的蛋白质会在麦曲混合酶及其他酶系的作用下产生大量的氨基酸，而大量的氨基酸会使黄酒的口感粗糙，甚至影响风味。第三，长时间的浸米会产生大量的含有高浓度BOD5（25000mg/L）、CODCr（60000mg/L）的浸米浆水，据统计，生产1吨黄酒，将产生2吨浸米浆水，一个年产5万吨的黄酒企业，至少产生10万吨的米浆废水。若将这些浸米浆水进行处理，又会产生巨大的费用：每年对浸米浆水的处理费用高达22.5万元；处理设施投入需要200多万元；设备折旧加上运行费用，每年要支出40多万元。
所以，针对传统黄酒浸米浆水存在的上述问题，有必要通过一定的方式摒弃对传统黄酒浸米浆水的使用，但是目前无法解决在摒弃使用浸米浆水后能保证黄酒发酵顺利进行的问题。
发明内容
本发明提供了一种植物乳杆菌，该菌株具有良好的酿造效果，分类学命名为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），于2013年9月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8097，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本菌株采集自浙江绍兴某黄酒酿造企业排放的米浆水。将采集的进行梯度稀释（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7）对样品进行稀释，用无菌移液枪各取0.2mL不同浓度的稀释液，均匀涂布在固态番茄汁碳酸钙培养基、改进M17培养基和MRS培养基上，在30℃的恒温培养箱中倒置培养2-3d。固态番茄汁碳酸钙培养基：牛肉膏10g，酵母膏10g，蛋白胨10g，葡萄糖5g，吐温800.5g，番茄汁200g，碳酸钙20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH6.5-6.8，115℃灭菌20min；改进M17培养基：植物蛋白胨5g，胰蛋白胨5g，酵母提取物2.5g，牛肉提取物5g，乳糖3g，抗坏血酸0.5g，K2HPO45g，甘油1%，MgSO4·7H2O0.25g，磷酸甘油二钠1.9g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，溴甲酚紫0.04g，pH6.8-7.0，121℃灭菌15min；MRS固态培养基：蛋白胨10g，琼脂1.5%-2.0%，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸二铵2g，K2HPO42g，MgSO4·7H2O0.1g，MnSO4·H2O0.05g，葡萄糖20g，无水乙酸钠5g，吐温801.0mL，蒸馏水1000mL，pH6.2-6.4，115℃灭菌20min。
本发明提供的植物乳杆菌生物学特征为：本发明菌株接触酶实验呈阴性、革兰氏染色呈阳性，不产生吲哚，不还原硝酸盐，能利用葡萄糖、半乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、棉籽糖、海藻糖、山梨糖、木糖、阿拉伯糖、纤维二糖。该菌株在显微镜下观察，从图1和图2可以看出，菌株菌落为圆形、乳白色、边缘光滑、透明。经革兰氏染色后镜检观察：菌株为小短杆状，成对出现。
本发明还提供了一种应用上述植物乳杆菌酿造黄酒的方法。在实验室条件下将植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）活化培养与扩大培养，然后，在不改变其它传统黄酒工艺的前提下（前发酵温度30℃，时间5-7d；后发酵温度20℃，时间23-25d），将扩大培养的菌液接种到黄酒发酵醪液中。本方法不仅能够减少黄酒传统酿造工艺中的浸米工艺以及减少酿造过程中米浆水的排放量，并且较好地保持了黄酒的风味品质，与传统工艺黄酒品质差别不大。
所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）应用于黄酒酿造可以采用直接接种的方法，这种方法实现了乳酸菌酿造黄酒工艺的可控性，操作简单、投入小。
本发明提供的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）可进一步制备成直投式发酵剂。具体如下：利用自动发酵罐对植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）进行高密度培养，发酵罐各部分经过灭菌后，设置培养温度30℃、pH6.1-6.2及转速l00r/mim，加入培养基并接入菌种，进行发酵13-14小时，然后经浓缩，冷冻干燥制成直投式发酵剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：（1）提供了新的乳酸杆菌属菌株：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）；（2）从废米浆水中筛选到植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），不会对人体、生态环境造成损害，符合安全规定；（3）植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）可用于黄酒酿造；（4）植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）酿造黄酒，生产过程可控，受季节性影响小，操作简单、方便。
提取FH0201总DNA，采用细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增，PCR扩增体系（25μL）：10×PCR Buffer2.5μL；25mM MgCl22μL；2.5mM dNTP1μL；10μM引物各0.5μL；模板（基因组）2.5μL；5U/μL TaqDNA聚合酶0.2μL，加水至25μL。
PCR扩增程序：95℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃延伸5min，降温至12℃，取出产物。
序列测定工作由扩增后的PCR产物送样测序，测序由英潍捷基（上海）贸易有限公司完成，16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
16SrDNA测序结果与NCBI中数据比对，菌株与Lactobacillus sp IV-145有96%的同源性，综合认定为是植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。
附图说明
图1为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）在M17培养基培养基上的菌落特征
图2为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的菌体形态
具体实施方式
实施例1菌株分离纯化
分别取10g米浆水于90mL的无菌水中，振荡摇匀，用无菌移液枪吸取1mL混合液于9mL的无菌水中，振荡均匀，重复此操作，按梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7）对样品进行稀释，用无菌移液枪各取0.2mL不同浓度的稀释液。
均匀涂布在固态番茄汁碳酸钙培养基、改进M17培养基和MRS培养基上，每个梯度三个平行，在30℃的恒温培养箱中倒置培养2-3d。然后挑取具有溶钙圈，能使溴甲酚紫变黄，乳白或灰白，中间凸起的单个菌落。分离的乳酸菌单菌落很可能不是由单一的菌组成，要得到单纯的乳酸菌，须经过多次纯化。
番茄汁碳酸钙培养基和改进M17培养基主要用来分离乳酸球菌，MRS固态培养基主要用来分离乳酸杆菌，为了避免分离失败，将初步认定的乳酸菌菌同时划线于三种培养基，然后在30℃的恒温培养箱中倒置培养2-3d，观察并记录平板上单个菌落的形态特征，包括菌落的颜色、大小、边缘情况等。
选取分离培养后具有类似乳酸菌形态的菌落进行革兰氏染色，观察形态特征。
吸取适量3%的过氧化氢滴于类似乳酸菌菌落的表面，观察有无气泡产生。
实验证明菌株接触酶实验呈阴性、革兰氏染色呈阳性，不产生吲哚，不还原硝酸盐，能利用葡萄糖、半乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、棉籽糖、海藻糖、山梨糖、木糖、阿拉伯糖、纤维二糖。该菌株在显微镜下观察，从图1和图2可以看出，菌株菌落为圆形、乳白色、边缘光滑、透明。经革兰氏染色后镜检观察：菌株为小短杆状，成对出现。
实施例2菌株鉴定
（一）生理生化鉴定
对分离得到的乳酸菌进行需氧、氧化酶、糖醇类发酵、明胶、硝酸盐还原、吲哚等生理生化特征的鉴定，鉴定方法均参照《常见细菌系统鉴定手册》。
（二）分子生物学鉴定
采用16S rDNA基因法对分离筛选的菌进行分子生物学的鉴定。根据原核生物体16SrDNA基因序列的高度保守性设计通用引物，以分离菌的DNA为模板扩增出细菌的16S rDNA基因片段，测定分离菌的16S rDNA基因序列，同GenBank中的基因序列进行同源性比对，以此确定分离菌的种属。
采用常规方法进行16S rDNA扩增，将扩增后的PCR产物送样测序，测序由英潍捷基（上海）贸易有限公司完成。
16SrDNA测序结果与NCBI中数据比对，菌株与Lactobacillus sp IV-145有96%的同源性，综合认定为是植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。
实施例3发酵酿造黄酒
（一）菌液的制备
将植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）接种至活化培养基中活化48h，待用；利用自动发酵罐对植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）进行高密度培养，发酵罐各部分经过灭菌后，设置培养温度30℃、pH6.1-6.2及转速l00r/mim，加入培养基并接入菌种，进行发酵13-14小时，然后经25000g离心30min冷冻离心制备高密度菌液。
（二）直投式发酵剂的制备
在每一冻干瓶中吸1mL灭菌的10%脱脂乳作为悬浮基质，冻干保护剂为：脱脂奶粉10%，甘油30mL·L-1，麦芽糊精100g·L-1，海藻糖250g·L-1，L-谷氨酸钠30g·L-1；115℃高压蒸汽灭菌15min；取1mL菌体细胞移入冻干瓶中，充分混匀制成菌悬液；然后将制备好的菌悬液置于-76℃超低温冰箱预冻120-150min；预冻后，迅速转移至真空冻干机样品架，冻干12h，得到植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）粉。
（三）直投菌酿造黄酒
将冻干直投式发酵剂接种黄酒发酵醪中发酵。干粉投入的量根据存活菌数计数结果，使起始浓度与液体发酵剂按0.5%-2%的接种量接入发酵醪中起始浓度相同，然后按黄酒发酵工艺进行发酵（前发酵温度30℃，时间5-7d；后发酵温度20℃，时间23-25d），最后对黄酒的各项理化指标进行检测。
结果检测如下：
成品黄酒检测理化指标：
氨基酸态氮≥0.6g/L 糖（以葡萄糖计）20-50g/L
总氨基酸≥13mg/mL 总酸（以乳酸计）≤4.7g/L
酒精度（20℃）≥12%vol pH值3.5-4.5
非糖固形物≥14g/L。
可以理解，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
Claims (3)
1.一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，其特征在于，命名为植物乳杆菌，于2013年9月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8097，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌在制备直投式发酵剂中的应用。
3.权利要求1所述的植物乳杆菌在黄酒酿造中的应用。
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