CN102144540A

CN102144540A - 一种铁皮石斛组培菌根化种苗生产方法

Info

Publication number: CN102144540A
Application number: CN 201010581919
Authority: CN
Inventors: 赵兴兵; 张苏锋; 梁经军; 高正龙; 吴维佳; 黄生云; 崔晓娟; 李�杰
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-12-10
Filing date: 2010-12-10
Publication date: 2011-08-10

Abstract

一种铁皮石斛组培菌根化种苗生产方法，其步骤分为：(1)采用固体或液体培养基对菌根真菌进行培养，菌根真菌采用菌根真菌LP1为毛壳菌属(Chaetomiumsp.)；(2)菌根细菌的培养，菌根细菌DP6为固氮菌(Azotobactersp.)；(3)铁皮石斛组培苗培养；(4)组培苗的水培炼苗。采用本发明提供的铁皮石斛组培菌根化苗的生产方法，不仅促进铁皮石斛组培种苗生长，而且组培苗明显粗壮。移栽后，成活率可达95%以上，生长量大，新芽分蘖多且长势迅猛，抗逆性强。与不接菌根真菌和细菌组培的铁皮石斛苗对照组相比，接菌的铁皮石斛苗比对照植株根系发达，植株节间明显膨大，鲜重提高10~20%。

Description

一种铁皮石斛组培菌根化种苗生产方法

技术领域

本发明涉及一种铁皮石斛种苗生产方法，尤其涉及一种铁皮石斛组培菌根化种苗生产方法。

背景技术

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)属珍稀濒危高附加值药材，其养生保健治疗效果确切，在《道藏》、《神农本草经》、《本草纲目》、《现代中药大辞典》、2010年版《中华人民共和国药典》等医药典籍中均有记载。唐开元年道家经典著作《道藏》收录中华九大仙草(铁皮石斛、天山雪莲、三两重人参、百二十年首乌、花甲之茯苓、苁蓉、深山灵芝、海底珍珠、冬虫夏草)，因铁皮石斛滋阴补虚效果显著，被列为“中华九大仙草”之首位。李时珍《本草纲目》记载：“强阴益精。久服，厚肠胃，补内绝不足，平胃气，长肌肉，逐皮肤邪热痱气，脚膝疼冷痹弱，定智除惊，轻身延年。益气除热，健阳，逐皮肤风痹，骨中久冷，补肾益力。治发热自汗，痈疽排脓内塞。” 在2010年版《中华人民共和国药典》一部中单列，与其它环草石斛、马鞭石斛、黄草石斛、金钗石斛和鼓槌石斛等普通石斛种类区分，其功能与主治：“益胃生津，滋阴清热。用于阴伤津亏，口干烦渴，食少干呕，病后虚热，目暗不明。”

因属濒危、珍稀、高附加值的资源性药材，铁皮石斛被列入《国家重点保护野生药材物种名录》(1987年)、《中国植物红皮书》(1992年)、《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附录II。2010年，铁皮石斛生产技术及产业化再次被列入国家重点新产品计划和国家火炬计划的优先发展技术领域。铁皮石斛作为一种常用中药材，市场需求量较大，如何解决需求与资源之间的矛盾惟一的途径是人工栽培，采用植物组培技术。随着组织培养技术的发展和应用，铁皮石斛的组培技术已经基本成熟，但是组培无菌苗移入自然条件下成活率低，易染杂菌，这些都和缺少与之共生的菌根真菌有关。在自然状态下，兰科植物要与真菌共生形成菌根，才能使兰科植物健壮的生长。根据这个特点，我们自1992年开始从事铁皮石斛菌根真菌的分离、培养及铁皮石斛组培苗的菌根化方法的研究。

发明内容

本发明目的在于提供一种铁皮石斛组培菌根化种苗生产方法，使用该方法不仅促进铁皮石斛组培种苗生长，而且组培苗明显粗壮，种植成活率高。

本发明采用的方法是先分别培养菌根真菌和细菌，再将菌根真菌及细菌与铁皮石斛茎诱导出的原球茎小芽共生培养，具体方法如下：

(1)菌根真菌的培养

将菌根真菌LP1菌株自低温保藏的斜面试管菌种活化后，接于PDA平皿中，于23~28℃(优选24~26℃)恒温培养10~15 d(优选11~13 d)，在菌落边缘打孔成菌片(优选Φ=8 mm)，并以小块接入固体培养基或液体培养基；菌根真菌LP1为毛壳菌属(Chaetomium sp.)，该菌种保藏于中国药用微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CPCC 480286；

菌根真菌的固体培养基含有木质素、纤维素、碳、氮等营养素，由选自原料棉籽壳、木屑、碎玉米芯、阔叶树锯末、麦麸中的一种或几种组成，加水，水量为原料的150~200 wt%(优选160~180 wt%)；高压灭菌后分别接入经培养所得菌根真菌LP1，每100 g培养基接2~3片菌片；真菌用试管、锥形瓶或培养瓶等器皿静置暗培养，待菌丝大部分或全部长满培养基时取出备用；

菌根真菌的液体培养基含有葡萄糖、无机盐类成分和天然添加物；菌根真菌的液体培养基用水配制，其中葡萄糖18~22 g/L(优选20 g/L)，KH₂PO₄18~22 g/L(优选20 g/L)，MgSO₄1.2~1.8 g/L(优选1.5 g/L)，维生素B₁8~12 mg/L(优选10 mg/L)，天然物：麦麸25~35 g/L (优选30 g/L)(煮汁)或马铃薯180~220 g/L(优选200 g/L)(使用其浸出液)，培养基pH 值为5.6~6.5(优选pH=6.0)；高压灭菌后接入经培养所得菌根真菌LP1，每100 mL培养基接入1~2片菌片；真菌用三角瓶或其他容器通气暗培养，盛装量为50%，置于23~25℃振荡，转速100~120 rpm，培养20~30 d后收获；培养结束后得到液态菌根真菌，可直接使用或用匀浆机打碎培养产物备用；

(2)菌根细菌的培养

配制无氮培养基：葡萄糖8~12g/L(优选10 g/L)，NaCl 0.18~0.22 g/L(优选0.2 g/L)，KH₂PO₄0.18~0.22 g/L(优选0.2 g/L)，CaSO₄·2H₂O 0.08~0.12g/L(优选0.1 g/L)，MgSO₄0.18~0.22g/L(优选0.2g/L)，CaCO₃4~6 g/L(优选5 g/L)，其余为水；调节pH值为6.9~7.2(优选7.0)，于120℃高压灭菌20 min后，放入4℃冰箱备用，保存不超过半年；

将菌根细菌DP6自低温保藏的斜面试管菌种活化后，接于上述配制的无氮培养基中，20～30℃水浴静止培养16 h，或者20～30℃(优选25℃)水浴摇床，转速100~120 rpm培养8~10 h(优选9 h)；菌根细菌DP6为固氮菌(Azotobacter sp.)，保藏于中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CFCC1605；

(3)铁皮石斛组培苗培养

本步骤在培养室中培养，温度为23~27℃，采用组培特定光谱节能灯(红光：波长640~650 nm，蓝光：波长450~460 nm)作为光源，每天光照10~14 h(优选12 h)；取野生的生长一年的铁皮石斛的茎进行灭菌处理，将灭菌的石斛茎切成带有茎节的段，接种于诱导培养基 (1/2-1)N6+BA 2.5 mg/L，诱导茎节发芽；将芽接种于培养基(1/2-1)N6+BA 2.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L，诱导出大量原球茎；将原球茎接种于培养基(1/2-1)N6+BA 1.5 mg/L+NAA 1.2 mg/L+5 wt%香蕉汁，诱导原球茎分化成小芽；将小芽接种于培养基(1/2-1)N6+BA 1.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+7.5 wt%香蕉汁中，在此培养基中同时加入备好的液体菌根真菌1.5~3.0 mL/L或固体菌根真菌1.5~3.0 g/L，以及细菌培养液1~2 mL/L，在此培养基中小芽生长成小植株；再加入培养液BA 0.75 mg/L+NAA 2.0 mg/L+10 wt%香蕉汁+蔗糖3 wt%+液体菌根真菌1.5~3.0 mL/L或固体菌根真菌1.5~3.0 g/L+细菌培养液1~2 mL/L，其pH=5.8，待小芽生长成中植株；最后加入培养液BA 0.5 mg/L+NAA 2.5 mg/L+12.5% wt香蕉汁+3 wt%蔗糖+液体菌根真菌1.5~3.0 mL/L或固体菌根真菌1.5~3.0 g/L+细菌培养液1~2 mL/L，其pH=5.8，待中植株生长成大植株；

(4)组培苗的水培炼苗

营养液由以下组分构成：硝酸钾1.0～1.2 wt‰(优选1.1 wt‰)，硫酸铵0.18～0.22 wt‰(优选0.2 wt‰)，硝酸铵0.08～0.12 wt‰(优选0.1 wt‰)，硫酸镁0.1～0.14 wt‰(优选0.12 wt‰)，磷酸二氢钾0.08～0.12 wt‰(优选0.10 wt‰)，氯化钙0.04～0.08 wt‰(优选0.06 wt‰)，硫酸锰0.01～0.03 wt‰(优选0.02 wt‰)，硫酸亚铁0.02～0.04 wt‰(优选0.03 wt‰)，硫酸锌0.004～0.006 wt‰(优选0.005 wt‰)，其余为水；

将得到的铁皮石斛培养苗取出，用15~20℃(优选17℃)的清水冲洗，沥去多余水分，栽种于架在营养液槽上的打好小孔的泡沫板的孔隙中，将营养液注入营养液槽中，使营养液浸没根系的40~60%，开动营养液槽的循环水泵，流速4~6 m/s；通风，风速0.3~0.5 m/s，进行种苗炼化；18~22 d后，铁皮石斛种苗根系发达，再生根增多，茎长长增粗，叶片变绿，变厚，即可以拔出进行大田移栽。

采用本发明提供的铁皮石斛组培菌根化苗的生产方法，不仅促进铁皮石斛组培种苗生长，而且组培苗明显粗壮。移栽后，成活率可达95%以上，生长量大，新芽分蘖多且长势迅猛，抗逆性强。与不接菌根真菌和细菌组培的铁皮石斛苗对照组相比，接菌的铁皮石斛苗比对照植株根系发达，植株节间明显膨大，鲜重有所提高，一般提高10~20%。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

(1)菌根真菌的培养

本实施例采用菌根真菌LP1自低温保藏的斜面试管菌种活化一次后，转接与PDA平皿中，25℃恒温培养12 d时，用Φ=8 mm的打孔器分别在平皿中的菌落边缘打孔成菌片，以小块接入固体培养基；

真菌菌株培养采用固体培养，菌根真菌的固体培养基原料采用棉籽壳与阔叶树锯末按重量比1:1混合，加水量为原料的170 wt%；高压灭菌后分别接入上述真菌，每100 g培养基接2片菌片(Φ=8 mm)；真菌用锥形瓶静置暗培养，待菌丝大部分或全部长满培养基时取出，得到固体菌根真菌；

(2)菌根细菌的培养

配制无氮培养基：葡萄糖10 g/L，NaCl 0.2 g/L，KH₂PO₄0.2 g/L，CaSO₄·2H₂O 0.1 g/L，MgSO₄0.2 g/L，CaCO₃5 g/L，其余为水，调节pH值为7.0，于120℃高压灭菌20 min后，放入4℃冰箱备用，保存不超过半年；

将菌根细菌DP6自低温保藏的斜面试管菌种活化后，接于上述配制的无氮培养基中，25℃水浴摇床，转速120 rpm，培养9 h；菌根细菌DP6为固氮菌(Azotobacter sp.)，目前保藏于中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CFCC1605；

(3)铁皮石斛组培菌根化苗的生产

本步骤在培养室中培养，温度为25±1℃，采用组培特定光谱节能灯(红光：波长645 nm，蓝光：波长455 nm)作为光源，每天光照12 h；取野生的生长一年的铁皮石斛的茎进行灭菌处理，将灭菌的石斛茎切成带有茎节的段，接种于诱导培养基 (1/2-1)N6+BA 2.5 mg/L，诱导茎节发芽；将芽接种于培养基(1/2-1)N6+BA 2.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L，诱导出大量原球茎；将原球茎接种于培养基(1/2-1)N6+BA 1.5 mg/L+NAA 1.2 mg/L+5 wt%香蕉汁，诱导原球茎分化成小芽；将小芽接种于培养基(1/2-1)N6+BA 1.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+7.5 wt%香蕉汁中，在此培养基中同时加入备好的固体菌根真菌2.0 g/L，以及细菌培养液2.0 mL/L，在此培养基中小芽生长成小植株；再加入培养液BA 0.75 mg/L+NAA 2.0 mg/L+10 wt%香蕉汁+蔗糖3 wt%+固体菌根真菌2.0 g/L+细菌培养液2.0 mL/L，其pH=5.8，待小芽生长成中植株；最后加入培养液BA 0.5 mg/L+NAA 2.5 mg/L+12.5% wt香蕉汁+3 wt%蔗糖+固体菌根真菌2.0 g/L+细菌培养液2.0 mL/L，其pH=5.8，待中植株生长成大植株；

(4)组培苗的水培炼苗

按如下比例配制营养液：硝酸钾1.1 wt‰，硫酸铵0.2 wt‰，硝酸铵0.1 wt‰，硫酸镁0.12 wt‰，磷酸二氢钾0.10 wt‰，氯化钙0.06 wt‰，硫酸锰0.02 wt‰，硫酸亚铁0.03 wt‰，硫酸锌0.005 wt‰，其余为水；

将得到的铁皮石斛培养苗取出，用17±1℃的清水冲洗，沥去多余水分，栽种于架在营养液槽上的打好小孔(Φ=5 mm)的泡沫板(厚5 mm)的孔隙中，将营养液注入营养液槽中，使营养液浸没根系的50%，开动营养液槽的循环水泵，流速5米/秒；通风，风速0.4 m/s，进行种苗炼化；19 d后，铁皮石斛种苗根系发达，再生根增多，茎长长增粗，叶片变绿，变厚，即可以拔出进行大田移栽。

实验设置对照组和接菌组，对照组植株生长过程不添加菌根真菌和细菌，其余所有步骤与接菌组相同。

实验结果如表1。

实施例2

本实施例基本操作同实施例1，不同之处是：

1、本实施例用的菌株LP1真菌菌株，不采用DP6细菌菌株。

2、菌根真菌采用液体培养培养基。培养基的配制：用水配制，葡萄糖20 g/L，KH₂PO₄ 20 g/L，MgSO₄1.5 g/L，维生素B₁ 10 mg/L，天然物：麦麸30 g/L(煮汁)，培养基pH=6.0。高压灭菌后接入上述真菌，每100 mL培养基接入2片菌片(Φ=8 mm)。真菌用三角瓶振荡通气暗培养，三角瓶装量50%，转速100 rpm，25℃培养25 d收获。培养结束后用匀浆机打碎培养产物，得到液体菌根真菌。

铁皮石斛组培菌根化苗的生产过程中菌根真菌添加为液体菌根真菌2 mL/L。

实验结果如表1：

“*”表示与对照组相比差异达显著水平，“**”表示与对照组相比差异达极显著水平。

从表1的实验结果可以看出，实施例1的效果要优于实施例2的效果，表明，同时使用菌根真菌LP1和细菌DP6对铁皮石斛组培苗生长的促进效果要优于仅使用菌根真菌LP1的效果。菌根真菌LP1和细菌DP6显著促进铁皮石斛组培苗生长，接菌组培的铁皮石斛比对照植株节间明显膨大，根系更发达，叶片数更多，接菌的铁皮石斛平均鲜重增长率均高于对照，成活率也明显增高。为以后菌根真菌应用于铁皮石斛规范化、规模化种植，提供了科学依据。本发明方法简单，投资少，不施任何肥料和农药，生产出的铁皮石斛为绿色产品。

Claims

1.一种铁皮石斛组培菌根化种苗生产方法，其特征在于步骤如下：

(1)菌根真菌的培养

将菌根真菌LP1菌株自低温保藏的斜面试管菌种活化后，接于PDA平皿中，于23~28℃恒温培养10~15 d，在菌落边缘打孔成菌片，并以小块接入固体培养基或液体培养基；菌根真菌LP1为毛壳菌属(Chaetomium sp.)，该菌种保藏于中国药用微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CPCC 480286；

菌根真菌的固体培养基含有木质素、纤维素、碳、氮等营养素，由选自原料棉籽壳、木屑、碎玉米芯、阔叶树锯末、麦麸中的一种或几种组成，加水，水量为原料的150~200 wt%；高压灭菌后分别接入经培养所得菌根真菌LP1，每100 g培养基接2~3片菌片；真菌用试管、锥形瓶或培养瓶等器皿静置暗培养，待菌丝大部分或全部长满培养基时取出备用；

(2)菌根细菌的培养

配制无氮培养基：葡萄糖8~12g/L，NaCl 0.18~0.22 g/L，KH₂PO₄0.18~0.22 g/L，CaSO₄·2H₂O 0.08~0.12g/L，MgSO₄0.18~0.22g/L，CaCO₃4~6 g/L，其余为水；调节pH值为6.9~7.2，于120℃高压灭菌20 min后，放入4℃冰箱备用，保存不超过半年；

将菌根细菌DP6自低温保藏的斜面试管菌种活化后，接于上述配制的无氮培养基中，20～30℃水浴静止培养16 h，或者20～30℃水浴摇床，转速100~120 rpm培养8~10 h；菌根细菌DP6为固氮菌(Azotobacter sp.)，保藏于中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CFCC1605；

(3)铁皮石斛组培苗培养

(4)组培苗的水培炼苗

2.根据权利要求1所述的铁皮石斛栽培种植菌根化生产方法，其特征在于所述将菌根真菌管经菌种活化后，接于PDA平皿中，于24~26℃恒温培养11~13 d。

3.根据权利要求1所述的铁皮石斛栽培种植菌根化生产方法，其特征在于所述菌根真菌的固体培养基的加水量为原料的160~180 wt%。

4.根据权利要求1所述的铁皮石斛栽培种植菌根化生产方法，其特征在于所述菌根真菌的液体培养基用水配制，其中葡萄糖20 g/L，KH₂PO₄20 g/L，MgSO₄ 1.5 g/L，维生素B₁ 10 mg/L，天然物：麦麸30 g/L(煮汁)或马铃薯200 g/L(使用其浸出液)，培养基pH 值为6.0。

5.根据权利要求1所述的铁皮石斛栽培种植菌根化生产方法，其特征在于所述配制无氮培养基：葡萄糖10 g/L，NaCl 0.2 g/L，KH₂PO₄ 0.2 g/L，CaSO₄·2H₂O 0.1 g/L，MgSO₄0.2g/L，CaCO₃5 g/L，其余为水，调节pH值为7.0。

6.根据权利要求1所述的铁皮石斛栽培种植菌根化生产方法，其特征在于所述菌根细菌DP6自低温保藏的斜面试管菌种活化后于无氮培养基中水浴摇床培养时，温度为25℃，培养9 h。

7.根据权利要求1所述的铁皮石斛栽培种植菌根化生产方法，其特征在于所述铁皮石斛组培苗培养时，每天光照12 h。

8.根据权利要求1所述的铁皮石斛栽培种植菌根化生产方法，其特征在于所述营养液由以下组分构成：硝酸钾1.1 wt‰，硫酸铵0.2 wt‰，硝酸铵0.1 wt‰，硫酸镁0.12 wt‰，磷酸二氢钾0.10 wt‰，氯化钙0.06 wt‰，硫酸锰0.02 wt‰，硫酸亚铁0.03 wt‰，硫酸锌0.005 wt‰，其余为水。

9.根据权利要求1所述的铁皮石斛栽培种植菌根化生产方法，其特征在于所述组培苗的水培炼苗时，将前述步骤得到的铁皮石斛培养苗取出，用17℃的清水冲洗，沥去多余水分。