CN116987597A - 以油菜毛状根为寄主的根肿菌离体培养体系创建及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物组织培养技术领域，涉及以油菜毛状根为寄主的根肿菌离体培养体系创建及应用。首先诱导油菜毛状根；随后提取根肿菌休眠孢子悬浮液并消毒；将消毒后的根肿菌加入到人工培养基中，与毛状根共培养；对根肿菌与毛状根共培养体系中的培养基类型、碳源及浓度、培养基pH值、根肿菌接种量的培养条件进行系统优化，筛选出最适合根肿菌与毛状根共培养的培养条件；提取毛状根中的休眠孢子接种油菜植株，鉴定毛状根中根肿菌的致病性；通过传代培养根肿菌在油菜毛状根中的传代稳定性。本发明的发明点在于：组织培养体系中的培养基为MS半固体培养基+3.38％蔗糖+3％葡萄糖，pH5.89；接种量为1.96mL/L.培养基。
Description
技术领域
本发明属于植物离体培养技术领域，具体涉及以油菜毛状根为寄主的根肿菌离体培养体系的构建及应用。
背景技术
根肿病是一种由原生动物有孔虫界寄生病原菌根肿菌(Plasmodiophorabrassicae Woron)引起的世界性重要土传病害，主要危害十字花科植物(Dixon G R.Theoccurrence and economic impact of Plasmodiophora brassicae and clubrootdisease.J Plant Growth Regul.,2009,28:194-202.)。感染根肿菌的植株根部会逐渐膨大形成大小不一的肿瘤，使植株对水分、营养元素的吸收和运输受阻，影响植物生长，导致作物的产量和质量受到严重损失。根肿菌休眠孢子抗逆性极强，它可以在酸性土壤中存活10年以上，被污染的土壤在此期间不再适合种十字花科作物，严重制约了十字花科作物的可持续性发展(Dixon G R.Plasmodiophora brassicae(Clubroot):a plant pathogenthat alters host growth and productivity.J Plant Growth Regul.,2009,28(3):193-193.)。近年来，根肿病已开始严重威胁到我国油菜等十字花科作物主产区的正常生产，给我国农业经济发展和农民增收带来巨大损失。因此，根肿菌的研究迫在眉睫。
目前全世界关于根肿菌的致病机制、与寄主的互作机理等基础研究比较落后，这主要与它的专性活体寄生性有关。大多数植物病原菌可以在培养基中保存和传代，为其生活史、基因组和致病机制等基础研究提供了很大的便利。作为专性活体寄生病原菌，根肿菌不能离开宿主独自生长，这为抗根肿菌基础研究的开展带来了极大的困难。自根肿病的相关研究开展以来，根肿菌的培养主要依靠活体植物培养法。活体植物培养法是获得根肿菌休眠孢子的常用方法，大多选用基因组小、易转化且周期短的模式植物拟南芥为寄主。该方法能够获取大量成熟孢子，但是仍存在一些弊端，如培养过程中易受外界环境影响及杂菌污染、不能长期保存菌种等(Luo H C,et al.An improved culture solution techniquefor Plasmodiophora brassicae infection and the dynamic infection in the roothair.Australas Plant Path,2014,43:53-60；Donald E C and Porter I J；Asano T,Kageyama K.Growth and movement of secondary plasmodia of Plasmodiophorabrassicae in turnip suspension-culture cells.Plant Pathol.,2006,55(1):145-151.)。鉴于根肿菌活体植物培养存在的上述缺陷，有必要构建根肿菌的离体培养体系，促进油菜抗根肿病研究的开展。毛状根是由发根农杆菌诱导、能够在无激素培养基上自主生长的、多根毛、多分枝的无向地性的不定根。以毛状根为寄主培养根肿菌，能够有效避免环境中的杂菌污染，实现根肿菌的传代和保存；另一方面，毛状根具有根的结构，为根肿菌完成生活史提供了必要条件。因此毛状根是理想的根肿菌离体培养寄主。
近年来，毛状根已成为植物根部寄生病原微生物培养及理论研究的良好材料，如利用毛状根建立丛枝菌根真菌培养体系、利用毛状根培养根瘤菌，获得更多根瘤、利用毛状根培养根结线虫，便于筛选目的抗虫基因等。关于油菜毛状根在根肿菌培养中的应用，早期一些研究者也进行了探索，但目前还没有成功的报道。Graveland等尝试利用甜菜、油菜、甘蓝等植物诱导毛状根进行根肿菌培养，但发病率低且未观察到成熟的休眠孢子(GravelandR,Dale P and Mithen R.Gall development in hairy root cultures infected withPlasmodiophora brassicae.Mycol Res.,1992,96:225-228.)。Asano等在芜菁毛状根进行根肿菌培养观察到毛状根肿瘤，但是该方法存在传代过程中发病率下降等缺点，故至今没有在根肿菌研究中应用(Asano T,Kodama A and Kageyama K.Susceptibility of hairyroot lines of Brassica species to Plasmodiophora brassicae and in an in vitrosubculture system.J Gen Plant Pathol.,2006,72(2):85-91.)。见表1。
表1利用Asano T等(2006)的方法进行根肿菌培养的结果
综上，目前仍然缺乏稳定高效的根肿菌离体培养和保存方法，为抗根肿菌的致病机制、与寄主的互作机理等基础研究的开展带来了极大的困难。另一方面，根肿菌存在明显的致病力分化现象，单一或小数生理小种的抗性品种在生产上很容易被淘汰，而根肿菌单孢分离技术难度大，加之无法长期稳定保存，严重影响了油菜抗根肿病育种的进展。因此，建立成熟的根肿菌离体培养体系对全面、深入开展根肿菌的基础研究，加快油菜抗根肿病育种进程，保证我国食用植物油的供给安全具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，利用油菜毛状根构建并优化根肿菌离体培养体系，并检测毛状根所培养的根肿菌的致病能力及传代能力，以期建立成熟的可以长期保存根肿菌的离体培养体系，为推动根肿菌的基础研究及抗病品种培育提供便利的培养方法。
本发明的总体技术方案如下所述：
首先诱导油菜毛状根；随后提取根肿菌休眠孢子悬浮液并对其进行消毒；将消毒后的根肿菌加入到人工培养基中，与毛状根共培养；对根肿菌与毛状根共培养体系中的培养基类型、碳源及浓度、培养基pH值、根肿菌接种量的培养条件进行系统优化，筛选出最适合根肿菌与毛状根共培养的培养条件；提取毛状根中的休眠孢子接种油菜植株，检测毛状根中根肿菌的致病性；最后，通过传代培养实验分析混合生理小种及单一生理小种根肿菌在油菜毛状根中的传代稳定性，证明根肿菌与油菜毛状根的共培养体系的可应用性。
本发明的具体步骤是：
首先将油菜品种westar(原种来自加拿大，一种公开使用的油菜品种，数据来自华中农业大学油菜数据中心：http://ibi.hzau.edu.cn/rapedata/variety/varis/identified.php？id＝601093)的种子进行消毒，并接种到MS+3％浓度的蔗糖，pH为5.8的固体培养基中，获得油菜无菌苗；活化发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)Ar1193(购自上海唯地生物技术有限公司)，并用其侵染油菜无菌苗的子叶及下胚轴进行毛状根的诱导，获得毛状根。利用碱裂解及抗生素法对根肿菌进行消毒，获得无菌且有活性的根肿菌休眠孢子。随后通过单因素、响应面等方法筛选根肿菌与毛状根共培养的最佳培养条件，即将消毒的休眠孢子(浓度为3×108/L的休眠孢子悬浮液，接种量为1.96mL/L(培养基))加入至MS+3.38％蔗糖(百分浓度)+3％葡萄糖(百分浓度)，pH为5.89的半固体培养基中，在该条件下根肿菌与毛状根共培养并结瘤。提取毛状根肿瘤中的休眠孢子，接种油菜植株，通过观察植株根肿大的情况检测该体系下培养的根肿菌的致病性。最后，将单根带肿瘤的毛状根转移至培养平板上传代培养(培养条件同上)，考察每一代结瘤效果，分析根肿菌在油菜毛状根中的传代稳定性，证明该体系的可应用性。
本发明的优点：
(1)以毛状根为寄主培养根肿菌便于控制培养条件，随时观察根肿菌的侵染状态，同时便于抗病基因的功能研究，有利于推动根肿菌基础研究的发展。
(2)以毛状根为寄主培养根肿菌便于对不同生理小种长期保存，避免了在大田中污染，同时有利于不同油菜品种的精准抗性鉴定。
附图说明
图1：本发明的技术路线框图。
图2：消毒后根肿菌休眠孢子杂菌及活性检测：附图标记说明：图2中的A图是根肿菌休眠孢子消毒后平铺在MS平板上7天后无杂菌生长；图2中的B图图是根肿菌休眠孢子消毒后的活性检测，黑色的圆点为无活性孢子，透明的圆点为活性孢子。
图3：不同培养基类型及状态对毛状根与根肿菌共培养中毛状根肿瘤大小的影响。
图4：培养基pH值、蔗糖浓度、接种量对根肿菌与毛状根共培养中毛状根肿瘤大小的影响。附图标记说明：图4中的A图是培养基pH对根肿菌与毛状根共培养中毛状根肿瘤大小的影响；图4中的B图是蔗糖浓度对根肿菌与毛状根共培养中毛状根肿瘤大小的影响；图4中的C图是接种量对根肿菌与毛状根共培养中毛状根肿瘤大小的影响。
图5：毛状根与根肿菌共培养体系的毛状根肿瘤大小的响应面及等高线分析。附图标记说明：图5中的A图是培养基pH和根肿菌接种量对根肿菌与毛状根共培养中毛状根肿瘤大小的影响；图5中的B图是蔗糖浓度和根肿菌接种量根肿菌与毛状根共培养中对毛状根肿瘤大小的影响；图5中的C图是培养基pH和蔗糖浓度对根肿菌与毛状根共培养中毛状根肿瘤大小的影响。
图6：碳源筛选后毛状根肿瘤细胞的组织观察。附图标记说明：图6中的A图是在碳源为3.89％浓度蔗糖时根肿菌与毛状根共培养后毛状根肿瘤细胞的组织观察；图6中的B图是在碳源为3.89％浓度蔗糖+3％浓度葡萄糖时根肿菌与毛状根共培养后毛状根肿瘤细胞的组织观察。
图7：毛状根与根肿菌共培养体系中毛状根被侵染后根变肿大形成的毛状根肿瘤表型。附图标记说明：图7中的A图是优化后毛状根肿瘤的大小；图7中的B图是优化前毛状根肿瘤的大小。
图8：毛状根中提取的休眠孢子接种油菜植株30天后油菜根部的表型。
图9：毛状根肿瘤传代第一代的表型。
图10：毛状根所培养的根肿菌传代能力检测。附图标记说明：图10中的A图、图10中的B图和图10中的C图是混合根肿菌生理小种传代能力检测结果；图10中的D图、图10中的E图和图10中F图为单一根肿菌生理小种2号、4号、7号、11号的传代能力检测结果。
具体实施方式
实施例1：油菜毛状根的诱导和培养
(1)无菌苗的获得
首先选取饱满的油菜种子westar(同前所述，常规品种，但实施本发明不限于该品种)，用无菌水冲洗3-5次后，置于75％的酒精中浸泡消毒30s，随后用无菌水冲洗3-5次。然后用25％的84消毒液(有效氯含量为5％-6.5％)浸泡8min左右，无菌水冲洗3-5次。再用无菌滤纸将种子表面的水分吸干，然后将油菜种子接种于MS+3％浓度蔗糖，pH为5.8的固体培养基上，在光照1200lx，光、暗周期12h/24h，室温条件下培养，选择生长10d的无菌幼苗作为试验材料。
(2)发根农杆菌的培养及制备
将不同的发根农杆菌Ar1193(购自上海唯地生物技术有限公司，但实施本发明不限于该菌株)接种在LB(分别含有500mg/L的Rif)固体培养基(分别含有500mg/L的Rif)上，于28℃恒温培养箱中进行暗培养活化；约48h后挑取平板上的单菌落接种于10mL LB液体培养基中(含有500mg/L的Rif)，28℃，150rmp黑暗条件下摇床震荡培养；取1mL活化后的菌液，加入到100mL LB液体培养基(含有500mg/L的Rif)中，继续活化，摇菌至OD600为0.5-0.6时菌液生命力最旺盛，侵染能力最强，此时的菌液即可作为活化完成。将活化后的农杆菌菌液在5000rpm的条件下离心10min，倒掉液体培养基，用100mL MS培养液重悬浮，并添加100μmol/L的乙酰丁香酮，即可以用于侵染植物外植体。
(3)毛状根的诱导和培养
在无菌条件下，在油菜无菌苗子叶基部切下子叶，茎段切取约1cm左右，分别接种于不含任何激素的MS+3％蔗糖(百分浓度)，pH为5.8的固体培养基上预培养2d。将预培养后的外植体放入重悬浮的农杆菌菌液中浸泡10min，取出后吸干多余的菌液，置于加有100μmol/L乙酰丁香酮的MS+3％浓度蔗糖，pH为5.8的固体培养基上黑暗条件下共培养3d。共培养之后用含有500mg/L的头孢(抗生素)的无菌水冲洗外植体，再转入含有500mg/L的头孢(抗生素)的MS+3％浓度蔗糖，pH为5.8的固体培养基上，28℃黑暗条件下培养诱导毛状根。每7d继代培养1次，遂渐降低抗生素的浓度，完全除菌后去除抗生素继续培养。
实施例2：根肿菌休眠孢子的表面消毒
1.根肿菌休眠孢子悬浮液制备
提取方法参照考文献(Schwelm A,et al.The Plasmodiophora brassicaegenome reveals insights in its life cycle and ancestry of chitinsynthases.Sci Rep,2015,5:11153)：洗净的油菜病根，削去表面腐烂组织，用70％的乙醇处理5min，10％的过氧化氢溶液浸泡2h，无菌水充分冲洗5次。将肿大的根部切成小块，加入无菌水在匀浆机中匀浆4min，用8层纱布过滤掉植物碎片，将滤液在2500×g离心10min，弃上清液，用无菌水悬浮沉淀，重复清洗5次。弃上清，用10ml的50％(w/v)蔗糖溶液悬浮沉淀，2500×g离心15min，小心收集含有休眠孢子的上清液到另一个无菌离心管中，加入等量的无菌水，充分混匀后2500×g离心15min，弃上清液，用无菌水悬浮休眠孢子沉淀，重复该步骤5次，以充分洗净休眠孢子中的蔗糖。最后用血球计数板统计浓度。
2.根肿菌休眠孢子表面消毒
本试验采用碱裂解法及抗生素法对休眠孢子进行消毒，以确保休眠孢子完全无菌。碱裂解法参照文献(Yang Y,et al.Alkaline treatment of resting spores priorto DNA extraction improves the purity of Plasmodiophora brassicae DNA.JMicrobiol Methods,2018,149:120-122.)报道的方法：将休眠孢子悬浮液在2500×g离心15min，弃上清液，在沉淀中加入20mM Tris(三羟甲基氨基甲烷)(pH＝7.5)悬浮至休眠孢子浓度为1.5×108/L，然后在悬浮液中加入4ml的2mol/L NaOH与1％ SDS(十二烷基硫酸钠)混合液，颠倒数次后，室温下静置5min，最后加入2ml NaAC(pH＝5.2)，混合均匀，2500×g离心15min，去上清，无菌水清洗5遍。抗生素法：将碱裂解后的休眠孢子悬浮液在2500×g下离心15min，收集沉淀，悬浮于浓度为2％的氯胺-T溶液，室温处理20min，用无菌水离心清洗5次。清洗后的休眠孢子悬浮于抗生素溶液中(1000ppm硫酸抗敌素，1000ppm盐酸万古霉素，6000ppm头孢噻肟钠)，25℃黑暗环境处理24h，用无菌水清洗5次。取1mL消毒后的休眠孢子悬浮液滴在LB平板上，三天后观察是否有杂菌。最后用血球计数板统计浓度，用台盼蓝染色法检测消毒后休眠孢子的活性，并用无菌水稀释到3×108/L以供接种用(见图2)。
实施例3：根肿菌与油菜毛状根的共培养条件的优化
1.培养基类型及培养基状态的筛选
为了获得更理想的结瘤效果，申请人对共培养条件进行了优化。首先以毛状根肿瘤直径为考察指标，利用单因素试验对培养基类型及培养基状态进行了筛选，其它培养条件为：3％蔗糖(百分浓度)，pH为5.8，接种量1mL/L(培养基)，结果显示(见图3)，在几种培养基中，MS培养基培养的毛状根肿瘤直径最大，在三种培养基状态下，半固体培养基培养的结瘤效果优于固体及液体培养基，因此本发明选择MS半固体培养基为共培养的培养基。
2.培养基pH值、蔗糖浓度、接种量的筛选
随后利用Design-expert 8.0.6软件设计响应面试验，对培养条件中的培养基的pH值、蔗糖浓度、接种量的进行优化。首先利用单因素试验对三种自变量取值进行筛选(图4)，在单因素试验的基础上，设计Box-behnken试验因素水平表(见表2)。采用Box-BehnkenDesign建立数学模型，以毛状根肿瘤直径为指标，选取培养基pH值、接种量及蔗糖浓度为自变量进行三因素三水平的响应面试验(图5)。结果显示：三种因素之间均存在交互作用，对毛状根肿瘤直径的影响顺序为：接种量与蔗糖浓度>培养基pH与蔗糖浓度>接种量与培养基pH值。当培养基pH值在5.4-5.89之间，根肿菌接种量在0.5-1.96ml之间时，两者存在明显的增效作用，毛状根肿瘤直径随着数值增大而增大；当蔗糖浓度在3％-3.38％(百分浓度)之间，根肿菌接种量在0.5-1.96ml之间时，两者存在明显的增效作用，毛状根肿瘤直径随着数值增大而增大，pH和蔗糖浓度对毛状根肿瘤大小的影响；当蔗糖浓度在3％-3.38％(百分浓度)之间，根培养基pH值在5.4-5.89之间时，两者存在明显的增效作用，毛状根肿瘤直径随着数值增大而增大。因此，通过响应面实验，我们获得最终优化条件为：MS半固体培养基,培养基pH值5.89，接种量1.96mL/L，蔗糖浓度为3.38％。
表2：Box-behnken试验因素水平表
3.碳源种类及浓度的筛选
在对以上培养条件优化后，申请人获得了最优的结瘤表型，因此下一步本发明对毛状根肿瘤增殖进行了组织学观察。取毛状根肿瘤试材放于FAA固定液中过夜固定后按照水洗、脱水、透明、包埋、切片步骤后制成石蜡切片，再经甲苯胺蓝染色后中性树胶封片，利用相差显微镜进行组织学观察。结果发现：毛状根肿瘤细胞中的孢子多数停留在次生原质团阶段(见图6中的A图)，该结论与前人研究结果一致，这也是限制该培养体系应用的原因之一(Graveland R,Dale P and Mithen R.Gall development in hairy root culturesinfected with Plasmodiophora brassicae.Mycol Res.,1992,96:225-228.)。通过文献查找申请人发现碳源是微生物生命活动的物质基础，糖类等碳水化合物对病原物的生长发育必不可少(Bezrutczyk M,Yang J,Eom J,Prior M,Sosso D,Hartwig T,Szurek B,OlivaR,Vera-Cruz C,White F F,Yang B,Frommer W B.Sugar flux and signaling in plant–microbe interactions.Plant Journal,2018,93(4):675-685.).因此，本发明在以蔗糖(浓度为3.38％)为基础糖的情况下(其它条件为本说明书前面所述的优化后的条件)，考察了额外添加葡萄糖和果糖对根肿菌成熟度的影响。在试验中发现，三种糖同时添加会加快毛状根死亡；添加蔗糖(浓度为3.38％，百分浓度)和不同浓度的果糖(1％-5％，百分浓度)毛状根生长缓慢，而添加蔗糖(浓度为3.38％，百分浓度)和1％-3％葡萄糖(百分浓度)后毛状根生长变快，葡萄糖浓度超过3％(百分浓度)则毛状根会褐化并停止生长，虽然毛状根肿瘤大小及数量无明显变化，但是对毛状根肿瘤进行组织学观察时发现添加3％的葡萄糖(百分浓度)细胞中休眠孢子数量明显多于1％和2％浓度(见图6中的B图)。因此，结合结瘤效果及毛状根肿瘤细胞中休眠孢子的数量，最终确定根肿菌与毛状根共培养条件为：MS半固体培养基，培养基pH值5.89，蔗糖3.38％(百分浓度)，葡萄糖3％(百分浓度)，接种量1.96mL/L(培养基)。
根据优化后的，重复三次试验，结瘤结果见(表3)和(图7)。
表3:优化前后结瘤结果对比
实施例4：根肿菌致病性及传代稳定性的检测
为了验证利用该培养体系长期保存根肿菌不同生理小种的目的是否可行，因此需要确定在毛状根中培养的根肿菌是否具有致病能力及稳定传代能力。
1.根肿菌致病能力的检测
将与根肿菌共培养30天的毛状根取出(培养条件：MS半固体培养基,培养基pH值5.89，蔗糖浓度3.38％，葡萄糖浓度3％，接种量1.96mL/L.培养基)，制备根肿菌休眠孢子悬浮液，用枪头注射在培养了7天的油菜幼苗根部，30天后观察到油菜根部有不同大小的肿根产生(图8)，说明该体系下培养的根肿菌仍具有侵染能力，可以应用于根肿菌不同生理小种的保存。
2.根肿菌传代能力的检测
将毛状根与根肿菌共培养30天，挑取带有肿瘤的毛状根接到新的培养基上(培养条件同上)，每个平板接种1-2根，30天后，发现结瘤的毛状根长出很多新根，并且周围的新根已经变粗并出现毛状根肿瘤(图9)。将结瘤的新根取出，每个平板接种1-2根，继续培养，连续多代，统计每一代发病率、结瘤时间、肿瘤直径、孢子浓度是否有明显变化。结果显示(图10)，连续继代3代后，无论是混合的根肿菌(见图10中的A图,图10中的B图和图10中的C图),还是单一的根肿菌生理小种(生理小种2号、4号、7号和11号，见图10中的D图、图10中的E图和图10中的F图)结瘤效果都没有明显变化)，统计孢子浓度结果见表4。在本发明的体系下连续继代三次孢子浓度没有降低，说明泵发明的根肿菌可以长期稳定在毛状根中保存。
表4：在优化后的条件下连续继代3次的休眠孢子数(个/mL)
综上所述，经过一系列培养条件优化与结果验证，在MS半固体培养基,培养基pH值5.89，蔗糖为3.38％(百分浓度)，葡萄糖为3％(百分浓度)，接种量为1.96mL/L.培养基的条件下，根肿菌在毛状根中培养既可以得到理想的结瘤效果及足够的休眠孢子量，又可以保证根肿菌的致病力及连续传代的稳定性，证明本发明可以用来根肿菌的基础研究及根肿菌不同生理小种的长期保存。同样地本发明可在根肿菌离体培养中应用和在筛选鉴定油菜对根肿病抗性中的应用。本发明的专用培养基也可在鉴定油菜对根肿病抗性中的应用。
Claims (5)
1.一种以油菜毛状根为寄主的根肿菌的离体培养方法，其特征在于，
(1)将油菜种子进行消毒，并接种到MS+3％浓度的蔗糖，pH为5.8的固体培养基中，获得油菜无菌苗；
(2)活化发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)，并用其侵染油菜无菌苗的子叶及下胚轴进行毛状根的诱导，获得毛状根；
(3)利用碱裂解法及抗生素法对根肿菌进行消毒，获得无菌且有活性的根肿菌休眠孢子；
(4)即将消毒后的休眠孢子以浓度为3×108/L的休眠孢子悬浮液，加入量为1.96mL/L培养基加入至MS+3.38％浓度蔗糖+3％浓度葡萄糖，pH为5.89的半固体培养基中，使根肿菌与毛状根共培养并结瘤；
(5)提取毛状根肿瘤中的休眠孢子，接种油菜实生根，通过观察油菜根肿大的情况鉴定根肿菌的致病性。
2.专用于以油菜毛状根为寄主的根肿菌离体培养方法的培养基，其特征在于，
培养基组分及其配比如下所述：
MS半固体培养基：MS+3.38％浓度蔗糖+3％浓度葡萄糖，pH为5.89。
3.权利要求1所述的以油菜毛状根为寄主的根肿菌离体培养方法在根肿菌离体培养中的应用。
4.权利要求1所述的以油菜毛状根为寄主的根肿菌离体培养方法在筛选鉴定油菜对根肿病抗性中的应用。
5.权利要求2所述的专用于以油菜毛状根为寄主的根肿菌离体培养方法的培养基在鉴定油菜对根肿病抗性中的应用。
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2023
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